Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC VgwzmXLxtqkwJkcpQQbcVBn S0066-782X2017001500516 10.5935/abc.20170164 S0066-782X2017005021102 Acute Coronary Syndrome Coronariopatia Aguda Protective Effect of Ischemic Preconditioning on Myocardium Against Remote Tissue Injury Following Transient Focal Cerebral Ischemia in Diabetic Rats Kumas Meltem 1 Altintas Ozge 2 Karatas Ersin 3 Kocyigit Abdurrahim 4 BezmiAlem Vakif University Vocational School of Health Services Medical Laboratory Techniques Turquia BezmiAlem Vakif University - Vocational School of Health Services - Medical Laboratory Techniques; - Turquia Bezmiâlem Vak?f Üniversitesi Kirklareli State Hospital Neurology Clinic Turquia Kirklareli State Hospital, Neurology Clinic; - Turquia Gebze Technical University Department of Molecular Biology and Genetics Turquia Gebze Technical University, Department of Molecular Biology and Genetics;- Turquia Bezmialem Vakif University Medical Faculty Medical Biochemistry Department Turquia Bezmialem Vakif University - Medical Faculty - Medical Biochemistry Department - Turquia Bezmiâlem Vak?f Üniversitesi Mailing Address: Ozge Altintas Kirklareli State Hospital, Kirklareli - Turkey. E-mail: dr.ozgealtintas@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research, Obtaining financing and Writing of the manuscript: Kumas M, Altintas O; Acquisition of data: Altintas O; Analysis and interpretation of the data: Kumas M, Altintas O, Karatas E, Kocyigit A; Statistical analysis: Kumas M, Karatas E; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Kumas M, Altintas O, Karatas E.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 13 11 2017 12 2017 109 6 516 526 23 01 2017 20 06 2017 31 07 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Remote ischemic preconditioning (IPreC) could provide tissue-protective effect at a remote site by anti-inflammatory, neuronal, and humoral signaling pathways.

 Objectives:

The aim of the study was to investigate the possible protective effects of remote IPreC on myocardium after transient middle cerebral artery occlusion (MCAo) in streptozotocin- induced diabetic (STZ) and non-diabetic rats.

 Methods:

48 male Spraque Dawley rats were divided into eight groups: Sham, STZ, IPreC, MCAo, IPreC+MCAo, STZ+IPreC, STZ+MCAo and STZ+IPreC+MCAo groups. We induced transient MCAo seven days after STZ-induced diabetes, and performed IPreC 72 hours before transient MCAo. Remote myocardial injury was investigated histopathologically. Bax, Bcl2 and caspase-3 protein levels were measured by Western blot analysis. Total antioxidant status (TAS), total oxidant status (TOS) of myocardial tissue were measured by colorimetric assay. Oxidative stress index(OSI) was calculated as TOS-to-TAS ratio. For all statistical analysis, p values < 0.05 were considered significant.

 Results:

We observed serious damage including necrosis, congestion and mononuclear cell infiltration in myocardial tissue of the diabetic and ischemic groups. In these groups TOS and OSI levels were significantly higher; TAS levels were lower than those of IPreC related groups (p < 0.05). IPreC had markedly improved histopathological alterations and increased TAS levels in IPreC+MCAo and STZ+IPreC+MCAo compared to MCAo and STZ+MCAo groups (p < 0.05). In non-diabetic rats, MCAo activated apoptotic cell death via increasing Bax/Bcl2 ratio and caspase-3 levels. IPreC reduced apoptotic cell death by suppressing pro-apoptotic proteins. Diabetes markedly increased apoptotic protein levels and the effect did not reversed by IPreC.

 Conclusions:

We could suggest that IPreC attenuates myocardial injury via ameliorating histological findings, activating antioxidant mechanisms, and inducing antiapoptotic activity in diabetic rats.

 Keywords: Ischemic Preconditioning Myocardial Middle Cerebral Artery Rats Diabetes Mellitus Experimental BezmiAlem Vakif University 3.2015/31 This study was funded by BezmiAlem Vakif University, project nº 3.2015/31. Introduction

Ischemic preconditioning (IPreC) has been described to reduce the ischemia- reperfusion injury by triggering transient, brief episodes of ischemia to target organs. IPreC can be induced locally when the preconditioning stimulus is applied to the same tissue or can be a protection at distant tissues, a phenomenon known as remote IPreC (rIPreC).1 The rIPreC can primarily apply to a target organ, but if a brief ischemia is induced in non-target tissue, confers protection at a remote site such as the brain, non-infarcted adjacent myocardial tissue, lung, kidney, intestine, or skeletal muscle. rIPreC produces a similar degree of tissue protection as IPreC1-5 does. Recent studies indicated that brief ischemia-reperfusion induced in further tissue could provide tissue-protective effect at a remote site by anti-inflammatory, neuronal, and humoral signaling pathways.1,6

Several studies have shown that hyperglycemia causes endothelial dysfunction in the blood-barriers and diabetic cardiomyopathy.7-9 Clinical studies have demonstrated that hyperglycemia increased the size of ischemic infarct area and caused poor clinical outcome after stroke.10

Oxidative stress is a principal parameter for evaluating ischemia/reperfusion injuries in patients with diabetes mellitus.11-12 Myocardial cells also undergo death in response to hyperglycemia and ischemia/reperfusion injury.13 In the current study, we postulated that there is a possible remote effect of cerebral ischemic preconditioning on the myocardium.

The current database shows the connection between heart disease and acute stroke. Cardiac arrhythmia, myocardial dysfunction and serum cardiac enzyme elevation are known to develop after acute stroke onset.14 Acute ischemic cerebrovascular events can induce various myocardial changes. The cardiac lesions are not seen earlier than six hours after the acute cerebral event, nor later than two weeks, cardiac injury occur as a result of intense activation of the sympathetic nervous system.15

Diabetes is an important modifiable risk factor for stroke, especially ischemic strokes. In this study, we hypothesized that ischemic preconditioning could play a crucial role on cardio-neuroprotection, which was triggered by hyperglycemia. Therefore, we aimed to evaluate the effect of remote ischemic preconditioning on myocardial tissue after transient intraluminal middle cerebral ischemia reperfusion injury in diabetic and non-diabetic rats.

 Methods Animals

All animals were obtained from the Experimental Animal Research Laboratory at Bezmialem Vakif University, Istanbul, Turkey. Animals had free access to food and water at controlled room temperature (22-25°C) under a 12:12-h day/night cycle for the duration of the study. During the surgical procedures, body temperature was monitored using a Nimomed® infrared thermometer.

 Induction of experimental diabetes mellitus by Streptozotocin in rats

Streptozotocin (STZ) induces diabetes within 3 days by destroying the pancreatic beta cells.16,17 Streptozotocin solution (STZ, Sigma Chemical Corp., Germany) was prepared in 0.1mol/L citrate buffer, pH 4.5, immediately before use. Diabetes was induced in rats by a single injection of STZ at the dose of 50 mg/kg of the body weight intraperitoneally and they were fed normally thereafter. Insulin was not administered. The other group of animals received an equal volume of saline solution. Blood glucose concentrations were monitored before STZ injection, at the 6th hour after STZ injection and on the 3rd day after STZ injection using an ACCU-CHEK®(Active Glucometer, Roche Diagnostics GmbH, Germany). The blood samples were collected from the rat’s dorsal pedal veins. Rats with a glucose concentration exceeding 300 mg/dL were considered diabetic.18,19 All rats became diabetic after STZ injection. According to published experimental research, about six hours later, hypoglycemia occurs with high levels of blood insulin. 11 In order to counteract the initial hypoglycemia after STZ injection, we included the option for rats to take 10% dextrose in drinking water supplied to them approximately 6 hours post STZ injection, in addition to their normal water, for the first 24 hours.

 Ischemic preconditioning (IPreC)

Ischemic preconditioning (IPreC) involved three cycles of 10 minutes of reperfusion and 10 minutes of occlusion of unilateral-left proximal internal carotid artery.5 IPreC was performed 72 hours before transient MCAo and 4-days after on STZ-induced diabetic rats. The animals were anesthetized with ketamine (4 mg/100 g) and xylazine (1.5 mg/100 g) by intramuscular injection and placed on an operation plate in the supine position. Their heads and limbs were fixed. After shaving and sterilization, a cervical median incision (3-4 cm long) was made. Precervical fascia and muscle were isolated with forceps, and fascia and muscle on the inside of the sternocleidomastoid were dissociated. Arterial pulses were visible. Tissues surrounding the artery were carefully dissociated, without injury to the vagus nerve. The left common carotid artery and the left external carotid artery were exposed through a midline neck incision. First, the left internal carotid artery (ICA) was occluded by a micro clamp. Then, the micro clamp was removed to restore blood flow after 10 minutes of reperfusion, followed by 10 minutes of occlusion. After removing the micro clamp, we observed that the left ICA was reinjected anterogradely. Sham-surgery controls were operated with the same procedures without artery occlusion.

 Middle cerebral artery occlusion (MCAo)

The most common stroke model, due to its relevance to human stroke, is focal MCAo.20,21In the present study, we induced a 3-hour transient proximal MCAo followed by 3-hour of reperfusion to cause remote ischemia-reperfusion injury to measure the level of oxidative stress markers to verify whether they were associated with myocardial tissue damage and the possible protective effect of ischemic preconditioning. Focal cerebral ischemia was induced using an endovascular middle cerebral arterial occlusion technique, as described previously.20,21 The sham operation consisted of the same manipulation but without introduction of the monofilament.

 Study design

Power analysis was used to estimate sample size. The sample size was calculated to be forty-eight with a 3% margin of error at a significance level of 0.05 for the 80% power value (Type I error = 0.05; statistical power = 0.80). Forty-eight male Sprague-Dawley rats (450-500 g; 10-12 months old) were divided into eight groups; Sham operated group (n = 6), STZ-induced diabetic (STZ) rat group (n = 6), MCAo group (n = 6), Ischemic-preconditioning (IPreC) group (n = 6), Ischemic-preconditioning (IPreC) + MCAo group (n = 6), Diabetic (STZ) Ischemic-preconditioning (IPreC) group (n = 6), Diabetic (STZ) MCAo group (n = 6) and Diabetic (STZ) Ischemic-preconditioning (IPreC) + MCAo group (n = 6).

A 3-hour transient proximal MCAo was induced in the experiment groups (MCAo, IPreC+ MCAo, STZ+ MCAo, STZ+ IPreC+ MCAo). We induced transient MCAo seven days after STZ-induced diabetes and performed IPreC 72 hours before transient MCAo to assess whether IPreC could have a protective effect on the remote tissue. All animals were sacrificed at 6th hour after 3-hour of occlusion followed by 3-hour of reperfusion. From each rat brain, total hemispheric infarct volumes were evaluated in coronal brain specimens due to analyze,2,3,5 triphenyltetrozolium chloride (TTC) - staining changes on basal ganglia and cortex, which are the localizations of the ischemic core in this model. In addition, all animals were weighed every day during the study period using a digital scale. Blood glucose concentrations were monitored before STZ injection, at the 6th hour after STZ injection, on the 3rd day after STZ injection and after the rats were sacrificed.

 Assessment of infarct volume

Infarct volumes were calculated using TTC- stained brain sections, as described previously5. After the sacrifice, the brains were removed inmediately, and cut into 2-mm coronal sections. Samples were then incubated for 30 min in a 2% solution of TTC at 37°C and fixed by immersion in 10% buffered formalin solution. Five brain sections per animal were stained with TTC and then photographed. Cerebral infarct volumes were assessed by using the image analysis program of Adobe Photoshop CS5 extended (version 12.1).

 Tissue homogenization

Left ventricle was cut up into appropriately small pieces for analysis (300mg) and placed into microcentrifuge tubes than washed 3x with 1ml PBS and aspirated. Stainless steel beads (1.6mm blend) used for homogenization with NP-40 lysis buffer (2 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol and 0.2% NP-40 plus a protease inhibitor cocktail). After homogenization, homogenates were centrifuged at 19.700 x g for 30 minutes at +4ºC. Supernatant was used as protein samples.

 Measurement of total oxidant status

Myocardial TOS level was measured using a novel automated method developed by Erel.22 Oxidants present in a sample oxidize the ferrous ion of an o-dianisidine complex to ferric ion. Oxidation is enhanced by glycerol, which is abundant in the reaction medium, and the ferric ion forms a colored complex with xylenol orange under acidic conditions. Color intensity, which can be measured spectrophotometrically, is associated with the total level of oxidants present. Hydrogen peroxide is used to calibrate the assay and results are expressed in terms of micromoles of hydrogen peroxide equivalent per liter (mmol H2O2 equiv. /l).

 Measurement of total antioxidant status

Myocardial TAS level was measured using another novel automated method developed by Erel.23 It involves production of the hydroxyl radical, which is a potent biological reactant. A ferrous ion solution (Reagent 1) is mixed with hydrogen peroxide (Reagent 2). Radicals produced by the hydroxyl radical, including the brown dianisidinyl radical cation, are also potent in biological terms. Thus, it is possible to measure the antioxidative capacity of a sample in terms of inhibition of free radical reactions initiated by production of the hydroxyl radical. Variation in assay data is very low (less than 3%) and results are expressed as mmol Trolox equiv./l. Results were given for 1mg total protein in tissue.

 Measurement of oxidative stress index (OSI)

The OSI level was the myocardial TOS-to-myocardial TAS ratio, but TAS values were changed to mmol/l. Each OSI was calculated as follows: OSI (arbitrary units) = TOS (mmol H2O2/l)/TAS (mmol Trolox/l).24

Histopathological analysis

Left ventricle was also evaluated for histopathological analysis. Sections were stained with hematoxylin-eosin and Masson’s trichrome methods. We used hematoxylin-eosin stain for routine detection of pathological alterations including necrosis, congestion, and infiltration. Masson’s trichrome method was chosen for determining fibrosis on myocardium if any. Sections were examined and scored by an observer who was blind to the identification of the groups using a Nikon Eclipse i5 light microscope with a Nikon DS-Fi1c camera, and Nikon NIS Elements version 4.0 image analysis systems (Nikon Instruments Inc., Tokyo, Japan). Myocardial damage was scored in terms of necrosis, congestion, and mononuclear cell infiltration. Each data was scored as: 0: absent, 1: minimal, 2: moderate, 3: severe damage.

 Western Blot

Total membrane protein was extracted from the homogenized tissue samples as follows. Heart tissues of all groups were homogenized in lysis buffer (2 mM Tris-Cl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 % glycerol and 0.2% NP-40 plus protease inhibitor cocktail) for 30 min on ice. Then homogenates were centrifuged, (Beckman Coulter, Krefeld, Germany) at 19.700 x g for 10 min at 4°C, and the final supernatant was used as the total membrane protein. Gel samples were made by adding 100 µl Laemmli sample buffer containing 2% SDS (Santa Cruz, Paso Robles, CA) to a 10 mg total protein. The protein concentration was measured using Bradford method 40 micrograms of total protein from each sample was loaded onto 8%-12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide electrophoresis (PAGE) gel for separation. The separated protein was transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, Billerica, MA). After incubation in 5% skim milk for 2 h at room temperature to block nonspecific binding, the PVDF membrane was reacted for 16 h at 4°C. The rabbit anti-rat caspase 3, Bax and Bcl-2 monoclonal antibodies were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). All antibodies diluted 1:1000 in tris-buffered saline plus Tween 20 (TBST: 20 mM Tris HCl, 137 mM NaCl and 0.1% Tween-20, pH 7.6) containing 5% skim milk powder. The membrane then was washed with tris-buffered saline plus Tween (TBST: 20 mM Tris HCl, 137 mM NaCl and 0.1% Tween-20, pH 7.6) three times for 10 min each time and incubated with horseradish peroxidase (HRP) labeled anti-rabbit IgG antibodies diluted 1:5000 in TBS containing 5% skim milk powder (Santa Cruz). Finally, the PVDF membrane was washed three times with TBST for 10 min each time, reacted with Pierce ECL Western blotting substrate (Thermo Scientific) and visualized using the Fussion Fx7 Imaging System (Vilber Lourmat SA, France). The b-actin antibody (Santa Cruz) was used as a loading control. For semiquantitative analysis, the grayscales of Caspase-3, Bax, Bcl-2 and b-actin bands were measured using Image J software. The ratio of Caspase 3, Bax, Bcl-2 to b-actin were calculated.

 Statistical analysis

Normality of the all data was tested with Kolmogorov-Smirnov D test. Since they were normally distributed (Kolmogorov-Smirnov D test, p ≥ 0.05), parametric test ANOVA (post-hoc: Tukey’s HSD) was used for multiple comparisons. Continuous measurements are expressed as mean and standard deviation (mean ± 2SD) for each group. P values < 0.05 were considered statistically significant. All statistical analyses and bar charts were done with SPSS 20.0 (IBM, New York, USA), MS Office Excel, and Graph Pad Prism 6.

 Results Assessment of oxidative stress parameters

The lowest mean myocardial TAS value was detected in 0.96 ± 0.15 (mean ± 2SD) STZ+ MCAo group, whereas the highest values were measured as 1.58 ± 0.56 and 1.57 ± 0.88 in sham and IPreC+ MCAo groups, respectively. Inducing ischemia reperfusion injury significantly decreased myocardial TAS in all related groups when compared to sham and IPreC groups (p = 0.003 and p = 0.042, respectively.). Moreover, ischemic preconditioning significantly increased the mean myocardial TAS value after ischemia- reperfusion injury in non-diabetic rats (IPreC+ MCAo vs. MCAo (1.07 ± 0.30), p = 0.008), whereas the protective effect did not appear in diabetic rats (STZ+ MCAo+ IPreC (1.13 ± 0.50) vs. STZ+ MCAo (0.96 ± 0.30), p > 0.05).

The mean myocardial TOS levels of STZ and MCAo groups were 12.79 ± 1.12 and 12.74 ± 1.54, respectively. Thus, those levels of IPreC (11.17 ± 1.26) and sham (11.05 ± 1.56) groups were similar. The result could indicate that ischemic preconditioning does not exceed the threshold for tissue damage. Besides, a clinical study was reported that diabetes might prevent ischemic preconditioning.25In contrast, we found that ischemic preconditioning lowered the oxidant capacity in diabetic rats (STZ vs. IPreC+ STZ (11.62 ± 1.74), p = 0.036). Similarly, IPreC significantly reduced the mean myocardial TOS level in both diabetic and non-diabetic rats which underwent middle cerebral artery occlusion (MCAo vs. IPreC+ MCAo (10.96 ± 1.72), p < 0.001; STZ+ MCAo (12.81±1.46) vs. STZ+ MCAo+ IPreC (12.33 ± 0.58), p = 0.04).

In all study groups, the highest OSI value, which is determined based on myocardial TOS/TAS ratio, were detected as 12.15 ± 4.26 and 13.61 ± 5.28 in MCAo and STZ+ MCAo groups, respectively. Both diabetic and non-diabetic rats that were induced ischemia-reperfusion injury, significantly demonstrated lower OSI values following IPreC, in comparison with non-IPreC related ones (MCAo vs. IPreC+ MCAo, p= 0.005 and STZ+ MCAo vs. STZ+ IPreC+ MCAo, p = 0.037).

Mean levels of myocardial total antioxidant status (TAS, Figure 1 A), total oxidant status (TOS, Figure 1 B) and calculated oxidative stress index (OSI: TOS/TAS, Figure 2) for all groups is shown in bar charts.

Mean myocardial TAS (Total antioxidant status) and TOS (Total oxidant status) levels in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, <bold>#</bold>p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, <bold>δ</bold>p < 0.05 vs. STZ group. One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion)

Mean OSI (Oxidative stress index) values in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion)

Histopathology of myocardium

Histologic architecture of cardiac tissues of IPreC group was similar to that of the sham group (Figure 3(1)). Cardiac tissues of ischemic and diabetic groups showed severe histopathological alterations including congestion, necrosis and mononuclear cell infiltration. Mean congestion score (MCS) of myocardial tissue were similar between STZ and MCAo groups (p > 0.05, 2.00 ± 1.42, 2.00 ± 1.26, respectively). The highest mean myocardial congestion value was scored in STZ+ MCAo group (2.50 ± 1.10). Remote IPreC decreased myocardial congestion score in IPreC+ MCAo (1.85 ± 0.76) (Figure 3 (2a)) and STZ+ IPreC+ MCAo (1.87 ± 1.78) (Figure 3 (2b)) groups when compared to MCAo and STZ+MCAo groups, respectively. Those of differences were not found statistically significant among groups (p > 0.05).

(1) Normal histological view of cardiac myofibrils in IPreC group. (Longitudinal section, Masson Trichrome stain, Magnification: 40X). (2) Congestion in IPreC+ MCAo (A) and STZ+ IPreC+ MCAo (B) groups. Overview of myofibril is nearly normal appearance. (Longitudinal section, A. H-E stain, B. Masson Trichrome stain, Magnification: 20X). (3) Eosinophilic stained areas show necrotic myofibrils that are lack of nuclei (arrow-heads) in STZ group. Arrows indicate that spaces between cardiac myofibrils. These spaces indicate necrotic area, and probably interstitial edema. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Transverse section, H-E stain, Magnification: 20X).

Necrotic fibrils rarely appeared in myocardial tissue of IPreC and sham groups. Mean necrosis score (MNS) of myocardium in IPreC group was recorded as 2.00 ± 1.26. That score was not found significantly different from that of the sham group (p > 0.05). Diabetes and ischemia caused extensive coagulative necrosis throughout cardiac parenchyma, in comparison with sham group (p = 0.001, p < 0.001, respectively). Following ischemia-reperfusion injury in diabetic rats, the myocardial fibrils and the nuclei of myocytes became poorly visible, almost disappeared (Figure 3 (3)) and spaces between myocardial fibrils became larger probably indicating interstitial edema (Figure 4 (b)). The highest MNS was detected as 2.66 ± 1.04 in STZ+ MCAo group. Again, there are consistent differences between the IPreC+ MCAo and STZ+ IPreC+ MCAo groups and the MCAo and STZ+ MCAo groups regarding the mean necrosis score (p < 0.001, for both).

(a) Congestion (arrows) destroyed myofibrils in STZ+ MCAo group. Cardiac myofibrils are separated from each other along with congestive area. These areas probably seem to be necrotic areas accompanied by interstitial edema. (Transverse section, H-E stain, Magnification: 20X). (b) Mononuclear cell infiltration, congestion and interstitial edema in necrotic areas (arrows) destroyed cardiac myofibrils in STZ+ MCAo group (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Longitudinal section, H-E stain, Magnification: 20X).

Mononuclear cell infiltration was mostly observed around the necrotic areas accompanied by interstitial edema in ischemic groups including MCAo and STZ+ MCAo groups (Figure 4 (b)). The highest mean infiltration scores (MIS) were recorded in MCAo and STZ+ MCAo group. Infiltration severely destroyed myofibrils and degenerated myocardium in MCAo (Figure 5 A) and STZ+ MCAo groups (Figure 5 B). Remote ischemic preconditioning reduced mononuclear cell infiltration in the myocardial parenchyma after MCAo in diabetic and non-diabetic rats compared with non-preconditioned controls (MCAo (2.16 ± 1.5) vs. IPreC+ MCAo (0.57 ± 0.46), p = .013 and STZ+ MCAo (2.83 ± 0.82) vs. STZ+ IPreC+ MCAo (1.57 ± 1.06), p < .001). Among STZ, IPreC and STZ+ IPreC groups, there was no significant difference regarding MIS (p > 0.05).

A) Degenerated myocardium caused by mononuclear cell infiltration (arrows) in MCAo group. B) Severely myodegeneration with interstitial edema, necrosis (arrows) and congestion (arrow-heads), in STZ+ MCAo group. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Longitudinal section, H-E stain, Magnification: 10X)

As a result, inducing remote ischemic preconditioning stimuli below the damage threshold, could suppress cellular inflammatory and oxidative response to ischemic injury and diabetes, which could prevent remote cardiac injury.

Myocardial injury scores as mean congestion score, mean necrosis score, and mean mononuclear cell infiltration score for all study groups is shown in Figure 6(a), 6 (b) and 6 (c), respectively.

A) Mean congestion scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. B) Mean necrosis scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group. C) Mean mononuclear cell infiltration scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group (One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion)

Western Blot analysis

In MCAo group, Bax/Bcl2 ratio was 1.18 ± 0.26, and that ratio was found as 0.72 ± 0.3 in IPreC group (p = 0.026) and 0.09 ± 0.06 in sham group (p < 0.001). Bax/Bcl2 ratio markedly reduced in IPreC+ MCAo group compared to MCAo group (p < 0.001).

Caspase 3 level was higher in MCAo (1.29 ± 0.12) group in comparison with both sham (0.35 ± 0.06) and IPreC (0.82 ± 0.30) groups (p < 0.001). Therefore, that level was lower in IPreC+ MCAo group (0.52 ± 0.02, p < 0.001). IPreC suppressed apoptosis progress in non-diabetic ischemic rats.

Myocardial apoptosis was severely induced by diabetes in all diabetic study groups including STZ, STZ+ IPreC, STZ+ MCAo and STZ+ IPreC+ MCAo groups. The highest Bax/Bcl2 ratio and caspase 3 protein levels were detected in those groups. Diabetes alone mostly induced apoptotic cell death via activated Bax and Caspase-3 proteins, and suppressed Bcl-2 activity. Preconditioning did not show any protective effect against apoptosis in diabetic groups. Western blots analysis and mean Bax/Bcl-2 ratio and caspase 3 levels of all groups were shown in Figure 7 and 8, respectively.

A) Western blot analysis of Bax and Bcl 2 proteins in cardiac tissues of all groups. B) Mean ratio of Bax/Bcl 2 levels in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. One way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion).

<bold>A.</bold> Western blot analysis of Caspase 3 protein in cardiac tissues of all groups. <bold>B.</bold> Mean Caspase 3 levels in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion)

Ischemic preconditioning reduces the total infarct volume

We did not observe any infarct area on the TTC-stained brain sections of STZ, Sham, IPreC and STZ+ IPreC groups. Ischemic preconditioning before cerebral ischemia significantly reduced infarction size compared with the other groups [IPreC+ MCAo (27.26 ± 20.04 mm3) vs. MCAo (109.07 ± 30.56 mm3) p < 0.001; STZ+ IPreC+ MCAo (38.70 ± 19.18 mm3) vs. STZ+ MCAo (165.87 ± 82 mm3) p < 0.001, respectively]. Also, we detected that ischemic preconditioning could improve the ischemic injury in diabetes [STZ+ IPreC+ MCAo vs. MCAo p < 0.001].

 Discussion

Cardiovascular disorders including hypertension, cardiac arrhythmias, release of biomarkers of cardiac injury, and left ventricular dysfunction are mostly seen following many types of brain injury such as trauma, ischemic stroke, and subarachnoid hemorrhage.14,26,27 Neurogenic cardiac injury increases risk of mortality and morbidity.28,29 Neurological injury affects cardiac tissue via catecholamine release and inflammation. Both of them cause cardiac cell death.30 Diabetes is an important modifiable risk factor for stroke, especially ischemic strokes. It was stated in previous studies that hyperglycemia also caused cardiomyopathy and resulted in similar cardiovascular complications with ischemia.7,8,12

Early response of myocardial cells against hyperglycemia is cardiac cell death.13 Two types of cell death including necrosis and apoptosis are detected in cardiomyocytes of diabetic animals.31 Necrosis is an uncontrolled cell death in response to oxidative stress. It causes ATP depletion and rapidly changes plasma membrane integrity, which accompanies inflammation and seriously damages not only related cells but also neighboring cells.32,33 In current study, we tried to evaluate remote cardiac injury following middle cerebral occlusion in diabetic rats. We observed extensive necrotic areas on myocardium of STZ and MCAo groups, especially in STZ+ MCAo groups. Moreover, inflammation and edema were seen around the necrotic areas in those groups. The highest mean necrotic score was detected in STZ+ MCAo group compared to other groups (p < 0.05). IPreC is effective in reducing MCAo-induced cardiac damage by suppressing necrotic cell death. The lower scores were recorded in remote ischemic preconditioning groups. However, mean necrosis scores of STZ and STZ+ IPreC groups were nearly similar with each other. We could report that remote ischemic preconditioning decreases the rate of necrosis induced by ischemia, even though inducing of diabetes abolish the protective effect.

The possible explanation for the result might be activation of antioxidative defense system. Oxidative stress is a primary determiner of cerebral and myocardial injuries during cerebral and myocardial ischemia/reperfusion in patients with diabetes mellitus.11,12 Diabetics and STZ induced-experimental animal models exhibit high oxidative stress due to b-cell dysfunction resulted in glucose toxicity; hence the activity of the antioxidant defense system is damaged by diabetes.11,34 TAS, TOS, and OSI are widely used in studies to determine oxidative stress activity. TOS indicates the concentration of all free oxidant radicals caused by diabetes and ischemia against to oxidative damage. Conversely, TAS is an important marker to determine the activities of antioxidant defense system against cell damage.5 In the current study, TOS levels were severely higher in MCAo and STZ-induced groups rather than sham and IPreC groups, whereas the lowest TAS levels were detected in those groups (p<0.001). We observed that OSI was higher in diabetic and ischemic groups compared to IPreC groups (p < 0.001). IPreC inhibited oxidative stress in both diabetic and non-diabetic rats. Myocardial TAS markedly was activated by preconditioning in diabetic and ischemic groups.

Histopathological scores of other parameters including congestion and cell infiltration also decreased in IPreC+ MCAo and STZ+ IPreC+ MCAo groups. IPreC improved histopathological alterations in diabetic and ischemic groups.

In contrast to necrosis, apoptosis is a physiologically programmed cell death; removes only damaged cells without provoking inflammation and damaging other neighboring cells.33,35 Experimental and human based studies showed that myocardial apoptosis increases both diabetes and STZ-induced diabetes.36-38Thus, cardiac myocytes of diabetic myocardium are more vulnerable to apoptosis than non-diabetics.37-39Apoptosis of cardiac myocytes is commonly seen in various cardiovascular disease including diabetic cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemia/reperfusion injury.36 Preconditioning is a protective mechanism against ischemia/reperfusion-induced organ injury. Ischemic preconditioning markedly reduces DNA fragmentation and apoptotic cell death in myocytes.31 Balance on pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 proteins regulate the mitochondrial cell death pathway.39-41 Bcl-2 is important in cell survival via suppressing apoptotic cell death and protects cardiac myocytes against various stress factors. Conversely, Bax is activated by oxidative stress and overexpression of Bax protein causes apoptotic cell death.42 Caspase-3 plays a pivotal role in the execution of apoptosis, activation of caspase-3 alone was sufficient to cause cell death in cardiac muscle.43 Caspase-3 activation is mostly involved in hyperglycemia induced apoptotic cell death in the myocardium.11 IPreC inhibits apoptosis by altering balance between pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins, and inhibiting caspase activity.44,45 In our study, we found that remote ischemic preconditioning decreased the Bax/Bcl2 ratio and caspase 3 activity following ischemia-reperfusion injury (IPreC+ MCAo vs. MCAo group, p < 0.001). Hence, myocardial injury score in STZ-induced diabetic rats was detected as high as MCAo rats. Unlikely non-diabetic rats, remote IPreC did not play a role on inhibiting the apoptotic cell death in diabetic rats.

 Conclusion

As a conclusion, cerebral ischemic preconditioning attenuates myocardial injury via ameliorating histological findings, and activating antioxidant mechanism, and inducing anti-apoptotic activity in and diabetic rats. Preconditioning has also anti-apoptotic effect in non-diabetic rats, whereas it has not same effect in diabetic rats. We could suggest that the reason is that preconditioning process was applied after the Streptozotocin injection, thus apoptosis was already induced by diabetes before preconditioning process. As a result, we could assume that remote IPreC might not be shown protective effect against apoptosis in diabetic rats. Further experimental studies could be done to determine possible mechanisms that may explain the loss of ischemic preconditioning in diabetic hearts; vascular and biochemical changes on myocardium associated with STZ-induced hyperglycemia could be evaluated at different time intervals after remote ischemic preconditioning.

Sources of Funding

This study was funded by BezmiAlem Vakif University, project nº 3.2015/31.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 Acknowledgments

All procedures were approved by the Animal Care and Use Committee at Bezmialem Vakif University and performed in accordance with institutional guidelines (Decision no: 2015-60). This work was supported by the Scientific Research Project Foundation founded by Bezmialem Vakif University (3.2015/31).

 References 1 Gassanov N, Nia AM, Caglayan E, Er F. Remote ischemic preconditioning and renoprotection: from myth to a novel therapeutic option? J Am Soc Nephrol. 2014;25(2):216-24. doi: 10.1681/ASN.2013070708. Gassanov N Nia AM Caglayan E Er F Remote ischemic preconditioning and renoprotection from myth to a novel therapeutic option? J Am Soc Nephrol 2014 25 2 216 224 10.1681/ASN.2013070708 2 Durukan A, Tatlisumak T. Preconditioning-induced ischemic tolerance: a window into endogenous gearing for cerebroprotection. Exp Transl Stroke Med. 2010;2(1):2. doi: 10.1186/2040-7378-2-2. Durukan A Tatlisumak T Preconditioning-induced ischemic tolerance a window into endogenous gearing for cerebroprotection Exp Transl Stroke Med 2010 2 1 2 2 10.1186/2040-7378-2-2 3 Bhuiyan MI, Kim YJ. Mechanisms and prospects of ischemic tolerance induced by cerebral preconditioning. Int Neurourol J. 2010;14(4):203-12. doi: 10.5213/inj.2010.14.4.203. Bhuiyan MI Kim YJ Mechanisms and prospects of ischemic tolerance induced by cerebral preconditioning Int Neurourol J 2010 14 4 203 212 10.5213/inj.2010.14.4.203 4 Pac-Soo CK, Mathew H, Ma D. Ischemic conditioning strategies reduce ischaemia/reperfusion-induced organ injury. Br J Anaesth. 2015;114(2):204-16. doi: 10.1093/bja/aeu302. Pac-Soo CK Mathew H Ma D Ischemic conditioning strategies reduce ischaemia/reperfusion-induced organ injury Br J Anaesth 2015 114 2 204 216 10.1093/bja/aeu302 5 Altintas O, Kumas M, Altintas MO. Neuroprotective effect of ischemic preconditioning via modulating the expression of adropin and oxidative markers against transient cerebral ischemia in diabetic rats. Peptides. 2016;79:31-8. doi: 10.1016/j.peptides.2016.03.011. Altintas O Kumas M Altintas MO Neuroprotective effect of ischemic preconditioning via modulating the expression of adropin and oxidative markers against transient cerebral ischemia in diabetic rats Peptides 2016 79 31 38 10.1016/j.peptides.2016.03.011 6 Przyklenk K, Whittaker P. Remote ischemic preconditioning: current knowledge, unresolved questions, and future priorities. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2011;16(3-4):255-9. doi: 10.1177/1074248411409040. Przyklenk K Whittaker P Remote ischemic preconditioning current knowledge, unresolved questions, and future priorities J Cardiovasc Pharmacol Ther 2011 16 3-4 255 259 10.1177/1074248411409040 7 Johnstone MT, Veves A. (eds.). Diabetes and cardiovascular disease. 2nd ed. Totawa, New Jorsey: Humana Press; 2000. Johnstone MT Veves A Diabetes and cardiovascular disease 2000 2nd ed New Jorsey Humana Press 8 Devereux RB, Roman MJ, Paranicas M, O'Grady MJ, Lee ET, Welty TK, et al. Impact of diabetes on cardiac structure and function: the Strong Heart Study. Circulation. 2000;101(19):2271-6. PMID: 10811594. Devereux RB Roman MJ Paranicas M O'Grady MJ Lee ET Welty TK Impact of diabetes on cardiac structure and function: the Strong Heart Study Circulation 2000 101 19 2271 2276 10811594 9 Alves MG, Martins AD, Cavaco JE, Socorro S, Oliveira PF. Diabetes, insulin-mediated glucose metabolism and Sertoli/blood-testis barrier function. Tissue Barriers. 2013;1(2):e23992. doi: 10.4161/tisb.23992. Alves MG Martins AD Cavaco JE Socorro S Oliveira PF Diabetes, insulin-mediated glucose metabolism and Sertoli/blood-testis barrier function Tissue Barriers 2013 1 2 e23992 10.4161/tisb.23992 10 Prakash R, Johnson M, Fagan SC, Ergul A. Cerebral neovascularization and remodeling patterns in two different models of type 2 diabetes. PLoS One. 2013;8(2):e56264. doi: 10.1371/journal.pone.0056264. Prakash R Johnson M Fagan SC Ergul A Cerebral neovascularization and remodeling patterns in two different models of type 2 diabetes PLoS One 2013 8 2 e56264 10.1371/journal.pone.0056264 11 Muranyi M, Fujioka M, He Q, Han A, Yong G, Csiszar K, et al. Diabetes activates cell death pathway after transient focal cerebral ischemia. Diabetes. 2003;52(2):481-6. PMID: 12540624. Muranyi M Fujioka M He Q Han A Yong G Csiszar K Diabetes activates cell death pathway after transient focal cerebral ischemia Diabetes 2003 52 2 481 486 12540624 12 Ansley DM, Wang B. Oxidative stress and myocardial injury in the diabetic heart. J Pathol. 2013;229(2):232-41. doi: 10.1002/path.4113. Ansley DM Wang B Oxidative stress and myocardial injury in the diabetic heart J Pathol 2013 229 2 232 241 10.1002/path.4113 13 Cai L, Kang YJ. Oxidative stress and diabetic cardiomyopathy: a brief review. Cardiovasc Toxicol. 2001;1(3):181-93. PMID: 12213971. Cai L Kang YJ Oxidative stress and diabetic cardiomyopathy: a brief review Cardiovasc Toxicol 2001 1 3 181 193 12213971 14 Kolin A, Norris JW. Myocardial damage from acute cerebral lesions. Stroke. 1984;15(6):990-3. PMID: 6506127. Kolin A Norris JW Myocardial damage from acute cerebral lesions Stroke 1984 15 6 990 993 6506127 15 Song HS, Back JH, Jin DK, Chung PW, Moon HS, Suh BC, et al. Cardiac troponin T elevation after stroke: relationships between elevated serum troponin T, stroke location, and prognosis. J Clin Neurol. 2008;4(2):75-83. doi: 10.3988/jcn.2008.4.2.75. Song HS Back JH Jin DK Chung PW Moon HS Suh BC Cardiac troponin T elevation after stroke relationships between elevated serum troponin T, stroke location, and prognosis J Clin Neurol 2008 4 2 75 83 10.3988/jcn.2008.4.2.75 16 Szkudelski T. The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas. Physiol Res. 2001;50(6):537-46. PMID: 11829314. Szkudelski T The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas Physiol Res 2001 50 6 537 546 11829314 17 Akbarzadeh A, Norouzian D, Mehrabi MR, Jamshidi Sh, Farhangi A, Verdi AA, et al. Induction of diabetes by Streptozotocin in rats. Indian J Clin Biochem. 2007;22(2):60-4. doi: 10.1007/BF02913315. Akbarzadeh A Norouzian D Mehrabi MR Jamshidi Sh Farhangi A Verdi AA Induction of diabetes by Streptozotocin in rats Indian J Clin Biochem 2007 22 2 60 64 10.1007/BF02913315 18 Takeuchi K, Takehara K, Tajima K, Kato S, Hirata T. Impaired healing of gastric lesions in streptozotocin-induced diabetic rats: effect of basic fibroblast growth factor. J Pharmacol Exp Ther. 1997;281(1):200-7. PMID: 9103498. Takeuchi K Takehara K Tajima K Kato S Hirata T Impaired healing of gastric lesions in streptozotocin-induced diabetic rats: effect of basic fibroblast growth factor J Pharmacol Exp Ther 1997 281 1 200 207 9103498 19 Katayama S, Lee JB. Hypertension in experimental diabetes mellitus. Renin-prostaglandin interaction. Hypertension. 1985;7(4):554-61. PMID: 3891614. Katayama S Lee JB Hypertension in experimental diabetes mellitus Renin-prostaglandin interaction. Hypertension 1985 7 4 554 561 3891614 20 Koizumi J, Yoshida Y, Nakaqawa Y, Ooneda G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 1986;8:1-8. doi: http://doi.org/10.3995/jstroke.8.1 Koizumi J Yoshida Y Nakaqawa Y Ooneda G Experimental studies of ischemic brain edema, I a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area Jpn J Stroke 1986 8 1 8 http://doi.org/10.3995/jstroke.8.1 21 Altintas O, Antar V, Baran O, Karatas E, Altintas MO, Kesgin S, et al. Neuroprotective effects of hemicraniectomy in malign middle cerebral artery infarctions: experimental study. J Neurosurg Sci 2015 Oct 6. [Epub ahead of print]. Altintas O Antar V Baran O Karatas E Altintas MO Kesgin S Neuroprotective effects of hemicraniectomy in malign middle cerebral artery infarctions: experimental study J Neurosurg Sci 06 10 2015 [Epub ahead of print] 22 Erel O. A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status. Clin Biochem. 2005;38(12):1103-11. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2005.08.008. Erel O A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status Clin Biochem 2005 38 12 1103 1111 10.1016/j.clinbiochem.2005.08.008 23 Erel O. A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation. Clin Biochem. 2004;37(4):277-285. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2003.11.015. Erel O A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation Clin Biochem 2004 37 4 277 285 10.1016/j.clinbiochem.2003.11.015 24 Hilali N, Vural M, Camuzcuoglu H, Camuzcuoglu A, Aksoy N. Increased prolidase activity and oxidative stress in PCOS. Clin Endocrinol (Oxf). 2013;79(1):105-10. doi: 10.1111/cen.12110. Hilali N Vural M Camuzcuoglu H Camuzcuoglu A Aksoy N Increased prolidase activity and oxidative stress in PCOS Clin Endocrinol (Oxf) 2013 79 1 105 110 10.1111/cen.12110 25 Yin X, Zheng Y, Zhai X, Zhao X, Cai L. Diabetic inhibition of preconditioning- and postconditioning-mediated myocardial protection against ischemia/reperfusion injury. Exp Diabetes Res. 2012; 2012:198048. doi: 10.1155/2012/198048. Yin X Zheng Y Zhai X Zhao X Cai L Diabetic inhibition of preconditioning- and postconditioning-mediated myocardial protection against ischemia/reperfusion injury Exp Diabetes Res 2012 2012 198048 198048 10.1155/2012/198048 26 van der Bilt IA, Hasan D, Vandertop WP, Wilde AA, Algra A, Visser FC, et al. Impact of cardiac complications on outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a meta-analysis, Neurology. 2009;72(7):635-42. doi: 10.1212/01.wnl.0000342471.07290.07. van der Bilt IA Hasan D Vandertop WP Wilde AA Algra A Visser FC Impact of cardiac complications on outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a meta-analysis Neurology 2009 72 7 635 642 10.1212/01.wnl.0000342471.07290.07. 27 Zygun D. Non-neurological organ dysfunction in neurocritical care: impact on outcome and etiological considerations. Curr Opin Crit Care. 2005;11(2):139-43. PMID: 15758594. Zygun D Non-neurological organ dysfunction in neurocritical care: impact on outcome and etiological considerations Curr Opin Crit Care 2005 11 2 139 143 15758594 28 Lim HB, Smith M. Systemic complications after head injury: a clinical review, Anaesthesia. 2007;62(5):474-82. doi: 10.1111/j.1365-2044.2007.04998.x. Lim HB Smith M Systemic complications after head injury: a clinical review Anaesthesia 2007 62 5 474 482 10.1111/j.1365-2044.2007.04998.x. 29 Banki NM, Zaroff JG. Neurogenic cardiac injury. Curr Treat Options Cardiovasc Med. 2003;5(6):451-8. PMID: 14575622. Banki NM Zaroff JG Neurogenic cardiac injury Curr Treat Options Cardiovasc Med 2003 5 6 451 458 14575622 30 Gregory T, Smith M. Cardiovascular complications of brain injury. Continuing Education Anaesthesia Critical Care & Pain. 2012;12(2):67-71. Gregory T Smith M Cardiovascular complications of brain injury Continuing Education Anaesthesia Critical Care & Pain 2012 12 2 67 71 31 Ilidromitis EK, Lazou A, Kremastinos DT. Ischemic preconditioning: Protection against myocardial necrosis and apoptosis. Vasc Health Risk Manag. 2007;3(5):629-37. PMID: 18078014. Ilidromitis EK Lazou A Kremastinos DT Ischemic preconditioning: Protection against myocardial necrosis and apoptosis Vasc Health Risk Manag 2007 3 5 629 637 18078014 32 Schweichel JU, Merker HJ. The morphology of various types of cell death in prenatal tissues. Teratology. 1973;7(3):253-66. doi: 10.1002/tera.1420070306. Schweichel JU Merker HJ The morphology of various types of cell death in prenatal tissues Teratology 1973 7 3 253 266 10.1002/tera.1420070306 33 Ishihara M, Inoue I, Kawagoe T, Shimatani Y, Kurisu S, Nishioka K, et al. Diabetes mellitus prevents ischemic preconditioning in patients with a first acute anterior wall myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2001;38(4):1007-1011. PMID: 11583873. Ishihara M Inoue I Kawagoe T Shimatani Y Kurisu S Nishioka K Diabetes mellitus prevents ischemic preconditioning in patients with a first acute anterior wall myocardial infarction J Am Coll Cardiol 2001 38 4 1007 1011 11583873 34 Bronner G, Mitchell K, Welsh FA. Cerebrovascular adaptation after unilateral carotid artery ligation in the rat: preservation of blood flow and ATP during forebrain ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 1998;18(1):118-21. doi: 10.1097/00004647-199801000-00012. Bronner G Mitchell K Welsh FA Cerebrovascular adaptation after unilateral carotid artery ligation in the rat preservation of blood flow and ATP during forebrain ischemia J Cereb Blood Flow Metab 1998 18 1 118 121 10.1097/00004647-199801000-00012 35 Kuo WW, Chung LC, Liu CT, Wu SP, Kuo CH, Tsai FJ, et al. Effects of insulin replacement on cardiac apoptotic and survival pathways in streptozotocin-induced diabetic rats. Cell Biochem Funct. 2009;27(7):479-87. doi: 10.1002/cbf.1601. Kuo WW Chung LC Liu CT Wu SP Kuo CH Tsai FJ Effects of insulin replacement on cardiac apoptotic and survival pathways in streptozotocin-induced diabetic rats Cell Biochem Funct 2009 27 7 479 487 10.1002/cbf.1601 36 Lee Y, Gustafsson AB. Role of apoptosis in cardiovascular disease. Apoptosis. 2009;14(4):536-48. doi: 10.1007/s10495-008-0302-x. Lee Y Gustafsson AB Role of apoptosis in cardiovascular disease Apoptosis 2009 14 4 536 548 10.1007/s10495-008-0302-x 37 Frustaci A, Kajstura J, Chimenti C, Jakoniuk I, Leri A, Maseri A, et al. Myocardial cell death in human diabetes. Circ Res. 2000;87(12):1123-32. PMID: 11110769. Frustaci A Kajstura J Chimenti C Jakoniuk I Leri A Maseri A Myocardial cell death in human diabetes Circ Res 2000 87 12 1123 1132 11110769 38 Cai L, Li W, Wang G, Guo L, Jiang Y, Kang YJ. Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium: Mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway. Diabetes. 2002;51(6):1938-48. PMID: 12031984. Cai L Li W Wang G Guo L Jiang Y Kang YJ Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium: Mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway Diabetes 2002 51 6 1938 1948 12031984 39 Misao J, Hayakawa Y, Ohno M, Kato S, Fujiwara T, Fujiwara H. Expression of bcl-2 protein, an inhibitor of apoptosis, and Bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction. Circulation. 1996;94(7):1506-12. PMID: 8840837. Misao J Hayakawa Y Ohno M Kato S Fujiwara T Fujiwara H Expression of bcl-2 protein, an inhibitor of apoptosis, and Bax, an accelerator of apoptosis, in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction Circulation 1996 94 7 1506 1512 8840837 40 Huang Q, Bu S, Yu Y, Guo Z, Ghatnekar G, Bu M, et al. Diazoxide prevents diabetes through inhibiting pancreatic cells from apoptosis via Bcl-2/Bax rate and p38-mitogen-activated protein kinase. Endocrinology. 2007;148(1):81-91. doi: 10.1210/en.2006-0738. Huang Q Bu S Yu Y Guo Z Ghatnekar G Bu M Diazoxide prevents diabetes through inhibiting pancreatic cells from apoptosis via Bcl-2/Bax rate and p38-mitogen-activated protein kinase Endocrinology 2007 148 1 81 91 10.1210/en.2006-0738 41 Chao DT, Korsmeyer SJ. BCL-2 family: regulators of cell death. Annu Rev Immunol. 1998;16:395-419. doi: 10.1146/annurev.immunol.16.1.395. Chao DT Korsmeyer SJ BCL-2 family regulators of cell death Annu Rev Immunol 1998 16 395 419 10.1146/annurev.immunol.16.1.395 42 Gustafsson AB, Tsai JG, Logue SE, Crow MT, Gottlieb RA. Apoptosis repressor with caspase recruitment domain protects against cell death by interfering with Bax activation. J Biol Chem. 2004;279:21233-8. doi: 10.1074/jbc.M400695200. Gustafsson AB Tsai JG Logue SE Crow MT Gottlieb RA Apoptosis repressor with caspase recruitment domain protects against cell death by interfering with Bax activation J Biol Chem 2004 279 21233 21238 10.1074/jbc.M400695200 43 Villapol S, Bonnin P, Fau S, Baud O, Renolleau S, Charriaut-Marlangue C. Unilateral blood flow decrease induces bilateral and symmetric responses in the immature brain. Am J Pathol. 2009;175(5):2111-20. doi: 10.2353/ajpath.2009.090257. Villapol S Bonnin P Fau S Baud O Renolleau S Charriaut-Marlangue C Unilateral blood flow decrease induces bilateral and symmetric responses in the immature brain Am J Pathol 2009 175 5 2111 2120 10.2353/ajpath.2009.090257 44 Marshall D, Sack MN. Apoptosis: a pivotal event or an epiphenomenon in the pathophysiology of heart failure? Heart. 2000;84(4):355-6. PMID: 10995395. Marshall D Sack MN Apoptosis: a pivotal event or an epiphenomenon in the pathophysiology of heart failure? Heart 2000 84 4 355 356 10995395 45 Piot CA, Martini JF, Bui SK, Wolfe CL. Ischemic preconditioning attenuates ischemia/reperfusion-induced activation of caspases and subsequent cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase in rat hearts in vivo. Cardiovasc Res. 1999;44(3):536-42. PMID: 10690285. Piot CA Martini JF Bui SK Wolfe CL Ischemic preconditioning attenuates ischemia/reperfusion-induced activation of caspases and subsequent cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase in rat hearts in vivo Cardiovasc Res 1999 44 3 536 542 10690285 Artigos Originais Coronariopatia Aguda Efeito Protetor do Pré-Condicionamento Isquêmico no Miocárdio Contra Lesão Remota de Tecidos após Isquemia Cerebral Focal Transitória em Ratos Diabéticos Kumas Meltem 1 Altintas Ozge 2 Karatas Ersin 3 Kocyigit Abdurrahim 4 BezmiAlem Vakif University - Vocational School of Health Services - Medical Laboratory Techniques; - Turquia Kirklareli State Hospital, Neurology Clinic; - Turquia Gebze Technical University, Department of Molecular Biology and Genetics; - Turquia Bezmialem Vakif University - Medical Faculty - Medical Biochemistry Department - Turquia Correspondência: Ozge Altintas Kirklareli State Hospital, Kirklareli - Turquia. E-mail: dr.ozgealtintas@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Obtenção de financiamento e Redação do manuscrito: Kumas M, Altintas O; Obtenção de dados: Altintas O; Análise e interpretação dos dados: Kumas M, Altintas O, Karatas E, Kocyigit A; Análise estatística: Kumas M, Karatas E; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante:Kumas M, Altintas O, Karatas E.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

O pré-condicionamento isquêmico remoto (IPreC) poderia fornecer efeito protetor de tecido em um local remoto por vias de sinalização anti-inflamatórias, neuronais e humorais.

 Objetivos:

O objetivo do estudo foi investigar os possíveis efeitos protetores do IPreC remoto no miocárdio após a oclusão transitória da artéria cerebral média (MCAo) em ratos com diabetes induzida por estreptozotocina (STZ) e ratos não diabéticos.

 Métodos:

48 ratos Spraque Dawley machos foram divididos em oito grupos: grupos Sham, STZ, IPreC, MCAo, IPreC + MCAo, STZ + IPreC, STZ + MCAo e STZ + IPreC + MCAo. Induzimos MCAo sete dias após a diabetes induzida por STZ e realizamos IPreC 72 horas antes do MCAo. A lesão miocárdica remota foi investigada histopatologicamente. Os níveis de proteína Bax, Bcl2 e caspase-3 foram medidos pela análise Western Blot. O estado de antioxidante total (TAS), e o estado de oxidação total (TOS) do tecido miocárdico foram medidos por meio de um estudo colorimétrico. O índice de estresse oxidativo (OSI) foi calculado como a relação TOS-TAS. Para todas as análises estatísticas, os valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

 Resultados:

Observamos danos graves, incluindo necrose, congestão e infiltração de células mononucleares no tecido miocárdico dos grupos diabético e isquêmico. Nesses grupos os níveis de TOS e OSI foram significativamente maiores; os níveis de TAS foram inferiores aos dos grupos relacionados com IPreC (p < 0,05). O IPreC melhorou marcadamente as alterações histopatológicas e aumentou os níveis de TAS em IPreC + MCAo e STZ + IPreC + MCAo em comparação com os grupos MCAo e STZ + MCAo (p < 0,05). Em ratos não diabéticos, MCAo activou a morte celular apoptótica através do aumento da relação Bax / Bcl2 e dos níveis de caspase-3. IPreC reduziu a morte celular apoptótica pela supressão de proteínas pró-apoptóticas. O diabetes aumentou acentuadamente os níveis de proteína apoptótica e o efeito não foi revertido pelo IPreC.

 Conclusões:

Podemos sugerir que o IPreC atenua a lesão miocárdica através da melhora dos achados histológicos, ativando mecanismos antioxidantes e induzindo atividade antiapoptótica em ratos diabéticos.

 Palavras-chave: Precondicionamento Isquêmico Miocárdico Artéria Cerebral Média Ratos Diabetes Mellitus Experimental BezmiAlem Vakif University 3.2015/31 O presente estudo foi financiado pelo BezmiAlem Vakif University, processo nº 3.2015/31. Introdução

O pré-condicionamento isquêmico (IPreC) foi descrito como redutor da lesão de isquemia-reperfusão ao desencadear episódios transientes e breves de isquemia para órgãos alvo. O IPreC pode ser induzido localmente quando o estímulo de pré-condicionamento é aplicado ao mesmo tecido ou pode ser uma proteção em tecidos distantes, um fenômeno conhecido como IPREC remoto (rIPreC).1 O rIPreC pode aplicar-se principalmente a um órgão alvo, mas se uma isquemia breve é ​​induzida em tecido não alvo, confere proteção em um local remoto, como o cérebro, tecido miocárdico adjacente não infartado, pulmão, rim, intestino ou músculo esquelético. O rIPreC produz um grau similar de proteção de tecido como faz o IPreC.1-5 Estudos recentes indicaram que uma isquemia-reperfusão breve induzida em tecido adicional poderia fornecer efeito protetor de tecido em um local remoto por vias de sinalização anti-inflamatórias, neuronais e humorais.1,6

Vários estudos mostraram que a hiperglicemia causa disfunção endotelial nas barreiras sanguíneas e cardiomiopatia diabética.7-9 Estudos clínicos demonstraram que a hiperglicemia aumentou o tamanho da área de infarto isquêmico e causou pobre desfecho clínico após o AVC.10

O estresse oxidativo é um parâmetro principal para avaliação de lesões de isquemia/reperfusão em pacientes com diabetes mellitus.11,12 As células do miocárdio também sofrem morte em resposta a hiperglicemia e lesão de isquemia/reperfusão.13 No presente estudo, postulamos que existe um possível efeito remoto do pré-condicionamento isquêmico cerebral no miocárdio.

O banco de dados atual mostra a conexão entre doença cardíaca e AVC agudo. A arritmia cardíaca, a disfunção miocárdica e a elevação da enzima cardíaca sérica são conhecidas por se desenvolver após o acidente vascular cerebral agudo.14 Os eventos cerebrovasculares isquêmicos agudos podem induzir várias alterações miocárdicas. As lesões cardíacas não são observadas antes de seis horas após o evento cerebral agudo, e não mais de duas semanas, ocorrendo lesão cardíaca como resultado da ativação intensa do sistema nervoso simpático.15

Diabetes é um importante fator de risco modificável para acidentes vasculares cerebrais, especialmente acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Neste estudo, nós hipotetizamos que o pré-condicionamento isquêmico poderia desempenhar um papel crucial na cardio-neuroproteção, que foi desencadeada pela hiperglicemia. Portanto, buscamos avaliar o efeito do pré-condicionamento isquêmico remoto no tecido miocárdico após a lesão transitória intraluminal de reperfusão isquêmica cerebral intra-angina em ratos diabéticos e não-diabéticos.

 Métodos Animais

Todos os animais foram obtidos do Laboratório Experimental de Pesquisa Animal da Bezmialem Vakif University, Istambul, Turquia. Os animais tiveram acesso livre aos alimentos e à água a temperatura ambiente controlada (22-25°C) sob um ciclo 12/12 horas diurno / noturno durante a duração do estudo. Durante os procedimentos cirúrgicos, a temperatura corporal foi monitorada usando um termômetro infravermelho Nimomed®.

 Indução de diabetes mellitus experimental por Estreptozotocina em ratos

A estreptozotocina (STZ) induz diabetes em 3 dias, destruindo as células beta pancreáticas.16,17 A solução de estreptozotocina (STZ, Sigma Chemical Corp., Alemanha) foi preparada em tampão de citrato a 0,1 mol/L, pH 4,5, imediatamente antes da utilização. O diabetes foi induzido em ratos por uma única injeção de STZ na dose de 50 mg/kg do peso corporal intraperitonealmente e foram alimentados normalmente a partir de então. A insulina não foi administrada. Os outros grupos de animais receberam um volume igual de solução salina. As concentrações de glicose no sangue foram monitoradas antes da injeção de STZ, na 6ª hora após a injeção de STZ e no 3º dia após a injeção de STZ usando um ACCU-CHEK® (Active Glucometer, Roche Diagnostics GmbH, Alemanha). As amostras de sangue foram coletadas das veias dorsais do pé do rato. Os ratos com uma concentração de glicose superior a 300 mg/dL foram considerados diabéticos.18,19 Todos os ratos tornaram-se diabéticos após a injeção de STZ. De acordo com a pesquisa experimental publicada, cerca de seis horas depois, ocorre hipoglicemia com altos níveis de insulina no sangue.11 Para contra-arrestar a hipoglicemia inicial após a injeção de STZ, incluímos a opção de que os ratos tomassem 10% de dextrose na água fornecida aproximadamente 6 horas após a injeção STZ, além da sua água normal, durante as primeiras 24 horas.

 Pré-condicionamento isquêmico (IPreC)

O pré-condicionamento isquêmico (IPreC) envolveu três ciclos de 10 minutos de reperfusão e 10 minutos de oclusão da Artéria carótida interna proximal unilateral esquerda.5 O IPreC foi realizada 72 horas antes de MCAo e 4 dias após em ratos diabéticos induzidos por STZ. Os animais foram anestesiados com cetamina (4 mg / 100 g) e xilazina (1,5 mg / 100 g) por injeção intramuscular e colocados em uma placa de operação na posição supina. Suas cabeças e membros foram fixados. Após o barbeado e a esterilização, realizou-se uma incisão medial cervical (3-4 cm de comprimento). A fáscia precervical e os músculos foram isolados com fórceps, e fáscia e músculo no interior do esternocleidomastoideo foram dissociados. Os pulsos arteriais eram visíveis. Os tecidos que rodeavam a artéria foram cuidadosamente dissociados, sem lesão no nervo vago. A artéria carótida comum esquerda e a artéria carótida externa esquerda foram expostas através de uma incisão na linha média do pescoço. Primeiro, a artéria carótida interna esquerda (ACI) foi ocluída por micro clamp. Depois, o micro clamp foi removido para restaurar o fluxo sanguíneo após 10 minutos de reperfusão, seguido de 10 minutos de oclusão. Após a remoção do micro clamp, observamos que a ACI esquerda foi reinjetada de forma anterogradia. Os controles da cirurgia Sham foram operados com os mesmos procedimentos sem oclusão da artéria.

 Oclusão da artéria cerebral média (MCAo)

O modelo de AVC mais comum, devido à sua relevância para o acidente vascular cerebral humano, é o MCAo focal.20,21 No presente estudo, induzimos um MCAo proximal transitório de 3 horas seguido de reperfusão de 3 horas para causar lesão remota de isquemia-reperfusão afim de medir o nível de marcadores de estresse oxidativo e verificar se eles estavam associados com danos no tecido miocárdico e também o possível efeito protetor do pré-condicionamento isquêmico. A isquemia cerebral focal foi induzida utilizando uma técnica endovascular de oclusão arterial cerebral média, conforme descrito anteriormente.20,21 A operação sham consistiu na mesma manipulação, mas sem introdução do monofilamento.

 Design do estudo

A análise de potência foi utilizada para estimar o tamanho da amostra. O tamanho da amostra foi calculado para ser quarenta e oito com uma margem de erro de 3% em um nível de significância de 0,05 para o valor de potência de 80% (erro Tipo I = 0,05; potência estatística = 0,80). Quarenta e oito ratos machos Sprague-Dawley (450-500 g; 10-12 meses) foram divididos em oito grupos; Grupo operado Sham (n = 6), grupo de ratos diabéticos induzidos por STZ (STZ) (n = 6), grupo MCAo (n = 6), grupo pré-condicionamento isquêmico (IPreC) (n = 6), pré-condicionamento isquêmico (IPreC) + Grupo MCAo (n = 6), Grupo de diabéticos (STZ) pré-condicionamento isquêmico (IPreC) (n = 6), Grupo de Diabéticos (STZ) Grupo MCAo (n = 6) e Diabético (STZ) Pré-condicionamento isquêmico (IPreC) + Grupo MCAo (n = 6).

Um MCAo proximal transitório de 3 horas foi induzido nos grupos experimentais (MCAo, IPreC + MCAo, STZ + MCAo, STZ + IPreC + MCAo). Induzimos MCAo sete dias após a diabetes induzida por STZ e também realizamos IPreC 72 horas antes do MCAo para avaliar se o IPreC poderia ter um efeito protetor no tecido remoto. Todos os animais foram sacrificados na 6ª hora após 3 horas de oclusão seguida de 3 horas de reperfusão. Os volumes totais de infarto hemisférico de cada cérebro de ratos foram avaliados analisando.2,3,5 alterações de coloração do cloreto de trifeniltetrozólio (TTC) nos gânglios basais e córtex, que são as localizações do núcleo isquêmico neste modelo. Além disso, todos os animais foram pesados todos os dias durante o período de estudo usando uma escala digital. As concentrações de glicose no sangue foram monitoradas antes da injeção de STZ, na 6ª hora após a injeção de STZ, no 3º dia após a injeção de STZ e após o sacrifício dos ratos.

 Avaliação do volume de infarto

Os volumes de infarto foram calculados usando seções cerebrais tingidas com TTC, conforme descrito anteriormente.5 Após o sacrifício, os cérebros foram removidos imediatamente e cortados em seções coronais de 2 mm. As amostras foram então incubadas durante 30 min numa solução a 2% de TTC a 37°C e fixadas por imersão em 10% de solução de formalina tamponada. Cinco seções cerebrais por animal foram coradas com TTC e depois fotografadas. Os volumes de infarto cerebral foram avaliados utilizando o programa de análise de imagem do Adobe Photoshop CS5 estendido (versão 12.1).

 Homogeneização de tecidos

O ventrículo esquerdo foi cortado em pedaços adequadamente pequenos para análise (300 mg) e colocado em tubos de microcentrifugado, lavado 3x com 1 ml de PBS e aspirado. Foram utilizadas pérolas de aço inoxidável (mistura de 1,6 mm) para homogeneização com tampão de lise NP-40 (Tris-Cl 2 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol a 10% e NP-40 a 0,2% mais um coquetel inibidor de protease). Após a homogeneização, os homogeneizados foram centrifugados a 19,700 x g durante 30 minutos a + 4ºC. O sobrenadante foi usado como amostra de proteína.

 Medição do estado do oxidante total

O nível de TOS do miocárdio foi medido usando um novo método automatizado desenvolvido por Erel.22 Os oxidantes presentes numa amostra oxidam o íon ferroso de um complexo de o-dianisidina para íon férrico. A oxidação é aumentada pelo glicerol, que é abundante no meio de reação, e o íon férrico forma um complexo colorido com laranja xilenol em condições ácidas. A intensidade da cor, que pode ser medida por espectrofotometria, está associada ao nível total de oxidantes presentes. O peróxido de hidrogênio é usado para calibrar o ensaio e os resultados são expressos em termos de micromoles de peróxido de hidrogênio equivalente por litro (mmol H2O2 equiv./l).

 Medição do estado antioxidante total

O nível de TAS do miocárdio foi medido usando outro método inovador automatizado desenvolvido por Erel.23 Envolve a produção do radical hidroxilo, que é um potente reagente biológico. Uma solução de íons ferrosos (Reagente 1) é misturada com peróxido de hidrogênio (Reagente 2). Os radicais produzidos pelo radical hidroxilo, incluindo o catião do radical dianisidinilo marrom, também são potentes em termos biológicos. Assim, é possível medir a capacidade antioxidante de uma amostra em termos de inibição de reações de radicais livres iniciadas pela produção do radical hidroxilo. A variação nos dados de ensaio é muito baixa (menos de 3%) e os resultados são expressos como mmol Trolox equiv./l. Os resultados foram dados para 1 mg de proteína total em tecido.

 Medição do índice de estresse oxidativo (OSI)

O nível de OSI foi a relação do TOS-miocárdico e o TAS miocárdico, mas os valores de TAS foram alterados para mmol/l. Cada OSI foi calculado da seguinte forma: OSI (unidades arbitrárias) = TOS (mmol H2O2/l) / TAS (mmol Trolox/l).24

Análise histopatológica

O ventrículo esquerdo também foi avaliado para análise histopatológica. As seções foram coradas com os métodos de hematoxilina-eosina e tricromo de Masson. Usamos hematoxilina-eosina para detecção rotineira de alterações patológicas, incluindo necrose, congestionamento e infiltração. O método tricrômico de Masson foi escolhido para determinar a fibrose no miocárdio, se houver. As seções foram examinadas e marcadas por um observador que era cego à identificação dos grupos usando um microscópio Nikon Eclipse i5 com câmera Nikon DS-Fi1c e sistemas de análise de imagem Nikon NIS Elements versão 4.0 (Nikon Instruments Inc., Tóquio, Japão). O dano do miocárdio foi avaliado em termos de necrose, congestionamento e infiltração de células mononucleares. Cada dado foi classificado como: 0: ausente, 1: mínimo, 2: moderado, 3: dano severo.

 Western Blot

A proteína de membrana total foi extraída das amostras de tecido homogeneizado do modo seguinte. Os tecidos cardíacos de todos os grupos foram homogeneizados em tampão de lise (Tris-Cl 2 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol a 10% e coquetel inibidor de protease NP-40 + 0,2%) durante 30 min em gelo. Em seguida, os homogeneizados foram centrifugados (Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha) a 19,700 x g durante 10 min a 4° C, e o sobrenadante final foi utilizado como proteína de membrana total. As amostras de gel foram feitas adicionando 100 µl de tampão de amostra de Laemmli contendo 2% de SDS (Santa Cruz, Paso Robles, CA) a uma proteína total de 10 mg. A concentração de proteína foi medida usando o método de Bradford, foram carregados 40 microgramas de proteína total de cada amostra em um gel de electroforese de poliacrilamida de poliéster de sódio a 8% a 12% (PAGE) para separação. A proteína separada foi transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA). Após a incubação em 5% de leite desnatado durante 2 h à temperatura ambiente para bloquear a ligação não específica, a membrana de PVDF foi feita reagir durante 16 h a 4° C. Os anticorpos monoclonais de coelho anti-rato caspase 3, Bax e Bcl-2 foram adquiridos da Sigma -Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Todos os anticorpos foram diluídos 1: 1000 em solução salina tamponada com Tris mais Tween 20 (TBST: Tris HCl 20 mM, NaCl 137 mM e Tween-20 a 0,1%, pH 7,6) contendo% 5 de leite em pó desnatado. A membrana foi então lavada com solução salina tamponada com tris mais Tween (TBST: Tris HCl 20 mM, NaCl 137 mM e Tween-20 a 0,1%, pH 7,6) três vezes durante 10 minutos cada vez e incubadas com peroxidase de rábano (HRP) - Anticorpos de IgG anti-coelho marcados diluídos 1: 5000 em TBS contendo 5% de leite desnatado (Santa Cruz). Finalmente, a membrana de PVDF foi lavada três vezes com TBST por 10 min cada vez, feita reagir com o substrato de transferência Western Pierce ECL (Thermo Scientific) e visualizada utilizando o Fussion Fx7 Imaging System (Vilber Lourmat SA, França). O anticorpo da b-actina (Santa Cruz) foi utilizado como um controle de carga. Para análise semiquantitativa, as escalas de cinza das bandas Caspase-3, Bax, Bcl-2 e b-actina foram medidas usando o software Image J. A proporção de Caspase 3, Bax, Bcl-2 para b-actina foi calculada.

 Análise estatística

A normalidade de todos os dados foi testada com o teste Kolmogorov-Smirnov D. Uma vez que eles foram normalmente distribuídos (teste Kolmogorov-Smirnov D, p ≥ 0,05), o teste ANOVA paramétrico (post-hoc: HSD de Tukey) foi utilizado para comparações múltiplas. As medidas contínuas são expressas como média e desvio padrão (média ± 2SD) para cada grupo. Os valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises estatísticas e gráficos de barras foram realizadas com SPSS 20.0 (IBM, Nova York, EUA), MS Office Excel e Graph Pad Prism 6.

 Resultados Avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo

O valor de TAS miocárdico médio mais baixo foi detectado em 0,96 ± 0,15 (média ± 2SD) do grupo STZ + MCAo, enquanto os valores mais altos foram medidos como 1,58 ± 0,56 e 1,57 ± 0,88 nos grupos sham e IPreC + MCAo, respectivamente. A indução de lesão por reperfusão de isquemia diminuiu significativamente o TAS miocárdico em todos os grupos relacionados quando comparado aos grupos sham e IPreC (p = 0,003 e p = 0,042, respectivamente). Além disso, o pré-condicionamento isquêmico aumentou significativamente o valor médio de TAS do miocárdio após lesão de isquemia-reperfusão em ratos não-diabéticos (IPreC + MCAo versus MCAo (1,07 ± 0,30), p = 0,008), enquanto o efeito protetor não apareceu em ratos diabéticos (STZ + MCAo + IPreC (1,13 ± 0,50) versus STZ + MCAo (0,96 ± 0,30), p > 0,05).

Os níveis médios de TOS do miocárdio dos grupos STZ e MCAo foram 12,79 ± 1,12 e 12,74 ± 1,54, respectivamente. Assim, esses níveis de grupos IPreC (11,17 ± 1,26) e sham (11,05 ± 1,56) foram semelhantes. O resultado pode indicar que o pré-condicionamento isquêmico não excede o limiar de danos nos tecidos. Além disso, um estudo clínico relatou que o diabetes pode prevenir o pré-condicionamento isquêmico.25 Em contraste, descobrimos que o pré-condicionamento isquêmico reduziu a capacidade oxidante em ratos diabéticos (STZ vs. IPreC + STZ (11,62 ± 1,74), p = 0,036). Da mesma forma, o IPreC reduziu significativamente o nível médio de TOS miocárdico em ratos diabéticos e não diabéticos submetidos à oclusão da artéria cerebral média (MCAo vs. IPreC + MCAo (10,96 ± 1,72), p < 0,001; STZ + MCAo (12,81 ± 1,46) vs. STZ + MCAo + IPreC (12,33 ± 0,58), p = 0,04).

Em todos os grupos de estudo, o maior valor do OSI, que é determinado com base na relação miocárdica TOS/TAS, foi detectado como 12,15 ± 4,26 e 13,61 ± 5,28 nos grupos MCAo e STZ + MCAo, respectivamente. Tanto os ratos diabéticos como os não diabéticos que foram induzidos por lesão de isquemia-reperfusão, demonstraram significativamente valores inferiores de OSI após IPreC, em comparação com os não relacionados a IPreC (MCAo vs. IPreC + MCAo, p = .005 e STZ + MCAo vs. STZ + IPreC + MCAo, p = 0,037).

Os níveis médios de estado antioxidante total do miocárdio (TAS, Figura 1 A), estado de oxidação total (TOS, Figura 1 B) e índice de estresse oxidativo calculado (OSI: TOS/TAS, Figura 2) para todos os grupos são mostrados em gráficos de barras.

Nível médio de TAS do miocárdio (estado antioxidante total) e TOS (estado do oxidante total) em todos os grupos. (* p <0,05 versus grupo MCAo, np < 0,05 vs. STZ + grupo MCAo, δp < 0,05 vs. grupo STZ. ANOVA unidirecional, teste HSD de Tukey pós-hoc. (STZ, diabéticos induzidos por Estreptozotocina, IPreC, Pré-condicionamento isquêmico, MCAo, oclusão da artéria cerebral média).

Valores médios de OSI (índice de estresse oxidativo) em todos os grupos. (* p < 0,05 versus grupo MCAo, np < 0,05 vs. STZ + grupo MCAo, δp < 0,05 vs. grupo STZ. ANOVA unidirecional, teste HSD de Tukey pós-hoc. (STZ, diabéticos induzidos por Estreptozotocina, IPreC, Pré-condicionamento isquêmico, MCAo, oclusão da artéria cerebral média).

Histopatologia do miocárdio

A arquitetura histológica dos tecidos cardíacos do grupo IPreC foi semelhante à do grupo sham (Figura 3 (1)). Os tecidos cardíacos de grupos isquêmicos e diabéticos apresentaram alterações histopatológicas graves, incluindo congestão, necrose e infiltração de células mononucleares. O escore médio de congestão (MCS) do tecido miocárdico foi semelhante entre STZ e MCAo (p > 0,05, 2,00 ± 1,42, 2,00 ± 1,26, respectivamente). O valor médio de congestionamento miocárdico mais alto foi avaliado no grupo STZ + MCAo (2,50 ± 1,10). O IPreC remoto diminuiu o escore de congestão miocárdica nos grupos IPreC + MCAo (1,85 ± 0,76) (Figure 3 (2a)) e STZ + IPreC + MCAo (1,87 ± 1,78) (Figure 3 (2b)) quando comparados aos grupos MCAo e STZ + MCAo, respectivamente. Essas diferenças não foram encontradas estatisticamente significativas entre os grupos (p > 0,05).

(1) Normal histological view of cardiac myofibrils in IPreC group. (Longitudinal section, Masson Trichrome stain, Magnification: 40X). (2) Congestion in IPreC+ MCAo (A) and STZ+ IPreC+ MCAo (B) groups. Overview of myofibril is nearly normal appearance. (Longitudinal section, A. H-E stain, B. Masson Trichrome stain, Magnification: 20X). (3) Eosinophilic stained areas show necrotic myofibrils that are lack of nuclei (arrow-heads) in STZ group. Arrows indicate that spaces between cardiac myofibrils. These spaces indicate necrotic area, and probably interstitial edema. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Transverse section, H-E stain, Magnification: 20X).

As fibrilas necróticas raramente apareceram no tecido miocárdico de grupos IPreC e sham. O escore de necrose média (MNS) do miocárdio no grupo IPreC foi registrado como 2,00 ± 1,26. Esse escore não foi encontrada significativamente diferente da do grupo sham (p > 0,05). Diabetes e isquemia causaram necrose coagulativa extensa ao longo do parênquima cardíaco, em comparação com o grupo sham (p = 0,001, p < 0,001, respectivamente). Após a lesão de isquemia-reperfusão em ratos diabéticos, as fibrilas miocárdicas e os núcleos de miócitos tornaram-se pouco visíveis e quase desapareceram (Figura 3 (3)) e os espaços entre fibrilas miocárdicas se tornaram maiores, provavelmente indicando edema intersticial (Figura 4 (b)). O MNS mais alto foi detectado como 2,66 ± 1,04 no grupo STZ + MCAo. Mais uma vez, existem diferenças consistentes entre os grupos IPreC + MCAo e STZ + IPreC + MCAo e os grupos MCAo e STZ + MCAo quanto ao escore de necrose média (p < 0,001, para ambos).

(a) Congestion (arrows) destroyed myofibrils in STZ+ MCAo group. Cardiac myofibrils are separated from each other along with congestive area. These areas probably seem to be necrotic areas accompanied by interstitial edema. (Transverse section, H-E stain, Magnification: 20X). (b) Mononuclear cell infiltration, congestion and interstitial edema in necrotic areas (arrows) destroyed cardiac myofibrils in STZ+ MCAo group (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Longitudinal section, H-E stain, Magnification: 20X).

A infiltração de células mononucleares foi observada principalmente em torno das áreas necróticas acompanhadas de edema intersticial em grupos isquêmicos, incluindo MCAo e STZ + MCAo (Figura 4 (b)). Os valores médios de infiltração mais altos (MIS) foram registrados no grupo MCAo e STZ + MCAo. A infiltração destruiu severamente as miofibrilas e degenerou o miocárdio nos grupos MCAo (Figura 5A) e STZ + MCAo (Figura 5B). O pré-condicionamento isquêmico remoto reduziu a infiltração de células mononucleares no parênquima miocárdico após MCAo em ratos diabéticos e não-diabéticos em comparação com controles não pré-condicionados (MCAo (2,16 ± 1,5) vs. IPreC + MCAo (0,57 ± 0,46), p = 0,013 e STZ + MCAo (2,83 ± 0,82) vs. STZ + IPreC + MCAo (1,57 ± 1,06), p < 0,001). Entre os grupos STZ, IPreC e STZ + IPreC, não houve diferença significativa em relação ao MIS (p > 0,05). Como resultado, induzir estímulos de pré-condicionamento isquêmico remoto abaixo do limiar de dano, poderia reprimir a resposta inflamatória e oxidativa celular a lesões isquêmicas e diabetes, o que poderia prevenir lesões cardíacas remotas.

A) Degenerated myocardium caused by mononuclear cell infiltration (arrows) in MCAo group. B) Severely myodegeneration with interstitial edema, necrosis (arrows) and congestion (arrow-heads), in STZ+ MCAo group. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion, Longitudinal section, H-E stain, Magnification: 10X).

Os escores de lesões do miocárdio como escore médio de congestão, escore de necrose média e escore médio de infiltração de células mononucleares para todos os grupos de estudo são mostrados na Figura 6 (a), 6 (b) e 6 (c), respectivamente.

A) Mean congestion scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. B) Mean necrosis scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group. C) Mean mononuclear cell infiltration scores in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group (One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion).

Análise Western Blot

No grupo MCAo, a relação Bax/Bcl2 foi de 1,18 ± 0,26, e essa proporção foi encontrada como 0,72 ± 0,3 no grupo IPreC (p = 0,026) e 0,09 ± 0,06 no grupo sham (p < 0,001). Relação Bax/Bcl2 marcadamente reduzida no grupo IPreC + MCAo em comparação com o grupo MCAo (p < 0,001).

O nível de Caspase 3 foi maior no grupo MCAo (1,29 ± 0,12) em comparação com os grupos sham (0,35 ± 0,06) e IPreC (0,82 ± 0,30) (p < 0,001). Portanto, esse nível foi menor no grupo IPreC + MCAo (0,52 ± 0,02, p < 0,001). IPreC suprimiu o progresso da apoptose em ratos isquêmicos não-diabéticos.

A apoptose do miocárdio foi severamente induzida pela diabetes em todos os grupos de estudo com diabetes, incluindo os grupos STZ, STZ + IPreC, STZ + MCAo e STZ + IPreC + MCAo. A maior relação de Bax/Bcl2 e os níveis de proteína da caspase 3 foram detectados nesses grupos. A diabetes isolada principalmente induziu a morte das células apoptóticas através de proteínas ativadas Bax e Caspase-3 e suprimiu a atividade de Bcl-2. O pré-condicionamento não mostrou nenhum efeito protetor contra a apoptose em grupos diabéticos. A análise de Western blots e a razão média de Bax/Bcl-2 e os níveis de caspase 3 de todos os grupos são mostrados na Figura 7 e 8, respectivamente.

A) Western blot analysis of Bax and Bcl 2 proteins in cardiac tissues of all groups. B) Mean ratio of Bax/Bcl 2 levels in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. One way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion).

<bold>A.</bold> Western blot analysis of Caspase 3 protein in cardiac tissues of all groups. <bold>B.</bold> Mean Caspase 3 levels in all groups. (*p < 0.05 vs. MCAo group, #p < 0.05 vs. STZ+ MCAo group, δp < 0.05 vs. STZ group. One-way ANOVA, post-hoc Tukey’s HSD test. (STZ, Streptozotocin-induced diabetic; IPreC, ischemic preconditioning; MCAo, middle cerebral artery occlusion)

Pré-condicionamento isquêmico reduz o volume total de infarto

Não observamos nenhuma área de infarto nas seções cerebrais tingidas com TTC dos grupos STZ, Sham, IPreC e STZ + IPreC. O pré-condicionamento isquêmico antes da isquemia cerebral reduziu significativamente o tamanho do infarto em comparação com os demais grupos [IPreC + MCAo (27,26 ± 20,04 mm3) vs. MCAo (109,07 ± 30,56 mm3) p < 0,001; STZ + IPreC + MCAo (38,70 ± 19,18 mm3) vs. STZ + MCAo (165,87 ± 82 mm3) p < 0,001, respectivamente]. Além disso, detectamos que o pré-condicionamento isquêmico poderia melhorar a lesão isquêmica em diabetes [STZ + IPreC + MCAo vs. MCAo p < 0,001].

 Discussão

Distúrbios cardiovasculares, incluindo hipertensão, arritmias cardíacas, liberação de biomarcadores de lesão cardíaca e disfunção ventricular esquerda são observados principalmente após vários tipos de lesão cerebral, como trauma, acidente vascular cerebral isquêmico e hemorragia subaracnóidea.14,26,27 A lesão cardíaca neurogênica aumenta o risco de mortalidade e morbidade.>28,29 A lesão neurológica afeta o tecido cardíaco através da inflamação e da liberação da catecolamina. Ambas causam morte de células cardíacas.30 Diabetes é um importante fator de risco modificável para acidentes vasculares cerebrais, especialmente acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Foi afirmado em estudos anteriores que a hiperglicemia também causou cardiomiopatia e resultou em similares complicações cardiovasculares com isquemia.7,8,12

A resposta precoce das células do miocárdio contra a hiperglicemia é a morte de células cardíacas.13 Dois tipos de morte celular, incluindo necrose e apoptose, são detectados em cardiomiócitos de animais diabéticos.31 A necrose é uma morte celular descontrolada em resposta ao estresse oxidativo. Isso provoca depleção de ATP e muda rapidamente a integridade da membrana plasmática, que acompanha a inflamação e danifica seriamente não apenas as células relacionadas, mas também células vizinhas.32,33 No presente estudo, tentamos avaliar lesões cardíacas remotas após oclusão cerebral média em ratos diabéticos. Observamos extensas áreas necróticas no miocárdio de grupos STZ e MCAo, especialmente em grupos STZ + MCAo. Além disso, inflamação e edema foram vistos em torno das áreas necróticas desses grupos. O maior escore necrótico médio foi detectado no grupo STZ + MCAo em comparação com outros grupos (p < 0,05). O IPREC é eficaz na redução do dano cardíaco induzido por MCAo por supressão da morte celular necrótica. Os escores mais baixos foram registrados em grupos pré-condicionados isquêmicos remotos. No entanto, os escores médios de necrose dos grupos STZ e STZ + IPreC foram quase similares entre si. Podemos relatar que o pré-condicionamento isquêmico remoto diminui a taxa de necrose induzida pela isquemia, mesmo que induzir a diabetes suprima o efeito protetor.

A possível explicação para o resultado pode ser a ativação do sistema de defesa antioxidante. O estresse oxidativo é um determinante primário de lesões cerebrais e miocárdicas durante a reperfusão/isquemia cerebral e miocárdica em pacientes com diabetes mellitus.11,12 Os diabéticos e os modelos animais experimentais induzidos por STZ apresentam alto estresse oxidativo devido à disfunção de células b resultante em toxicidade de glicose; por isso a atividade do sistema de defesa antioxidante é danificada pelo diabetes.11,34 TAS, TOS e OSI são amplamente utilizados em estudos para determinar a atividade de estresse oxidativo. TOS indica a concentração de todos os radicais oxidantes livres causados por diabetes e isquemia contra dano oxidativo. Por outro lado, o TAS é um marcador importante para determinar as atividades do sistema de defesa antioxidante contra danos celulares.5 No presente estudo, os níveis de TOS foram bem maiores em grupos induzidos por MCAo e STZ comparados com grupos sham e IPreC, enquanto que os níveis TAS mais baixos foram detectados nesses grupos (p < 0,001). Observamos que a OSI foi mais alta em grupos diabéticos e isquêmicos em comparação com os grupos IPreC (p < 0,001). O IPreC inibiu o estresse oxidativo em ratos diabéticos e não diabéticos. O TAS miocárdico foi notadamente ativado pelo pré-condicionamento em grupos diabéticos e isquêmicos.

Os escores histopatológicos de outros parâmetros, incluindo congestão e infiltração celular também diminuíram nos grupos IPreC + MCAo e STZ + IPreC + MCAo. IPreC melhorou as alterações histopatológicas em grupos diabéticos e isquêmicos.

Em contraste com a necrose, a apoptose é uma morte celular programada fisiologicamente, remove apenas células danificadas sem provocar inflamação e danificar outras células vizinhas.33,35 Estudos experimentais e baseados em humanos mostraram que a apoptose do miocárdio aumenta o diabetes e o diabetes induzido por STZ.36-38 Assim, os miócitos cardíacos do miocárdio diabético são mais vulneráveis à apoptose do que os não diabéticos.37-39 A apoptose dos miócitos cardíacos é comumente vista em várias doenças cardiovasculares, incluindo cardiomiopatia diabética, infarto do miocárdio, lesão por isquemia/reperfusão.36 O pré-condicionamento é um mecanismo protetor contra a lesão orgânica induzida por isquemia/reperfusão. O pré-condicionamento isquêmico reduz acentuadamente a fragmentação do DNA e a morte celular apoptótica em miócitos.31 O equilíbrio nas proteínas pró-apoptóticas Bax e anti-apoptóticas Bcl-2 regulam a via de morte celular mitocondrial.39-41 Bcl-2 é importante na sobrevivência celular através da supressão da morte celular apoptótica e protege os miócitos cardíacos contra vários fatores de estresse. Por outro lado, o Bax é ativado pelo estresse oxidativo e a superexpressão da proteína Bax provoca a morte celular apoptótica.42 Caspase-3 desempenha um papel fundamental na execução da apoptose, a ativação da caspase-3 sozinha foi suficiente para causar morte celular no músculo cardíaco.43 A ativação da Caspase-3 está principalmente envolvida na morte celular apoptótica induzida pela hiperglicemia no miocárdio.11 O IPreC inibe a apoptose alterando o equilíbrio entre as proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas e inibindo a atividade da caspase.44,45 Em nosso estudo, descobrimos que o pré-condicionamento isquêmico remoto diminuiu a relação Bax/Bcl2 e a atividade da caspase 3 após lesão por isquemia-reperfusão (Grupo IPreC + MCAo vs. MCAo, p < 0,001). Por isso, o índice de lesão miocárdica em ratos diabéticos induzidos por STZ foi detectado tão alto como nos ratos MCAo. Ao contrário dos ratos não-diabéticos, a IPreC remota não desempenhou um papel na inibição da morte celular apoptótica em ratos diabéticos.

 Conclusão

Como conclusão, o pré-condicionamento isquêmico cerebral atenua a lesão miocárdica através da melhora dos achados histológicos e ativando o mecanismo antioxidante e induzindo atividade anti-apoptótica em ratos diabéticos. O pré-condicionamento também tem efeito anti-apoptótico em ratos não-diabéticos, enquanto que não tem o mesmo efeito em ratos diabéticos. Podemos sugerir que a razão é que o processo de pré-condicionamento foi aplicado após a injeção de Estreptozotocina, portanto a apoptose já foi induzida pelo diabetes antes do processo de pré-condicionamento. Como resultado, poderíamos assumir que o IPreC remoto pode não ter mostrado efeito protetor contra a apoptose em ratos diabéticos. Mais estudos experimentais poderiam ser feitos para determinar possíveis mecanismos que possam explicar a perda de pré-condicionamento isquêmico em corações diabéticos; as alterações vasculares e bioquímicas no miocárdio associadas à hiperglicemia induzida por STZ poderiam ser avaliadas em diferentes intervalos de tempo após pré-condicionamento isquêmico remoto.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo BezmiAlem Vakif University, processo nº 3.2015/31.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

 Agradecimentos

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Universidade de Bezmialem Vakif e realizados de acordo com as diretrizes institucionais (Decisão nº 2015-60). Este trabalho foi apoiado pela Fundação do Projeto de Pesquisa Científica fundada pela Universidade Bezmialem Vakif (3.2015/31).