Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC DZwHYxGGTXpMzfvgVXFVDvP S0066-782X2017001400425 10.5935/abc.20170155 Original Articles Pericardial Parietal Mesothelial Cells: Source of the Angiotensin-Converting-Enzyme of the Bovine Pericardial Fluid Sousa Ilsione Ribeiro de Filho Pereira Isabela Cabral Cavicchioli Morais Lourimar José de Teodoro Livia das Graças Vieito Lombardi Rodrigues Maria Laura Pinto Gomes Roseli Aparecida da Silva Universidade Federal do Triângulo Mineiro Uberaba MG Brazil Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), Uberaba MG - Brazil Universidade Federal do Triângulo Mineiro Mailing Address: Roseli Aparecida da Silva Gomes Praça Manoel Terra, 330. CEP 38025-015, Abadia, Uberaba, MG - Brazil. E-mail: bioq@dcb.uftm.edu.br

Author contributions

Conception and design of the research: Sousa Filho IR, Teodoro LGVL, Rodrigues MLP, Gomes RAS; Acquisition of data: Sousa Filho IR, Pereira ICC, Morais LJ, Rodrigues MLP; Analysis and interpretation of the data: Sousa Filho IR, Pereira ICC, Rodrigues MLP; Obtaining financing and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Teodoro LGVL, Rodrigues MLP, Gomes RAS; Writing of the manuscript: Sousa Filho IR, Pereira ICC, Morais LJ, Teodoro LGVL, Rodrigues MLP, Gomes RAS.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 11 2017 109 5 425 431 16 01 2017 26 06 2017 12 07 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Angiotensin II (Ang II), the primary effector hormone of the renin-angiotensin system (RAS), acts systemically or locally, being produced by the action of angiotensin-converting-enzyme (ACE) on angiotensin I. Although several tissue RASs, such as cardiac RAS, have been described, little is known about the presence of an RAS in the pericardial fluid and its possible sources. Locally produced Ang II has paracrine and autocrine effects, inducing left ventricular hypertrophy, fibrosis, heart failure and cardiac dysfunction. Because of the difficulties inherent in human pericardial fluid collection, appropriate experimental models are useful to obtain data regarding the characteristics of the pericardial fluid and surrounding tissues.

 Objectives:

To evidence the presence of constituents of the Ang II production paths in bovine pericardial fluid and parietal pericardium.

 Methods:

Albumin-free crude extracts of bovine pericardial fluid, immunoprecipitated with anti-ACE antibody, were submitted to electrophoresis (SDS-PAGE) and gels stained with coomassie blue. Duplicates of gels were probed with anti-ACE antibody. In the pericardial membranes, ACE was detected by use of immunofluorescence.

 Results:

Immunodetection on nitrocellulose membranes showed a 146-KDa ACE isoform in the bovine pericardial fluid. On the pericardial membrane sections, ACE was immunolocalized in the mesothelial layer.

 Conclusions:

The ACE isoform in the bovine pericardial fluid and parietal pericardium should account at least partially for the production of Ang II in the pericardial space, and should be considered when assessing the cardiac RAS.

 Keywords Renin-Angiotensin System Peptidyl-Dipeptidase A Pericardial Fluid Hypertrophy Left Ventricular Cattle CAPES FAPEMIG 01650/2008 This study was funded by CAPES and FAPEMIG n. APQ 01650/2008. Introduction

Cardiovascular diseases are the major cause of morbidity and mortality worldwide.1 It has been well established that dysregulation or overexpression of the renin-angiotensin system (RAS) leads to several harmful vascular effects, contributing to the pathophysiology of cardiovascular diseases.2 Angiotensin II (Ang II) is the primary effector hormone of that system, produced by the action of angiotensin-converting-enzyme (ACE) on its substrate, angiotensin I (Ang I).3-5 Angiotensin II can act systemically or as a tissue factor, locally produced. Tissue Ang II has paracrine and autocrine actions, promoting cell growth, apoptosis, inflammation, oxidative stress and tissue damage, leading to hypertrophy, fibrosis, heart failure and cardiac dysfunction.6,7 Local tissue6,8 and intracellular9 RASs, such as cardiac RAS, have been described, although little is known about the presence of an RAS in the pericardial fluid and its possible sources. Angiotensin II, some growth factors and enzymes have been identified in that fluid.10 Gomes et al.11 have shown ACE activity in the human pericardial fluid, and Bechtloff et al.12 have shown the presence of the protein fraction of ACE in the pericardial fluid of patients with coronary artery disease. However, the source of that enzyme in the pericardial fluid remains unknown.

Because of the difficulties inherent in pericardial fluid collection, the use of appropriate experimental models is essential. The heart is contained inside a fibroserous sac, the pericardial sac, which has an inner layer, the serous pericardium, which delimits the pericardial cavity. Serous pericardium has a visceral membrane, inseparable from the heart, and a parietal membrane, continuous with the visceral one. The pericardial fluid is found inside that cavity.13,14

Therefore, characterization in animal models of the pericardial fluid and surrounding tissues, including the source of the macromolecules of that fluid, is essential so that the results can be translated to human beings. This study aimed at collecting evidence in the bovine pericardial parietal membrane and pericardial fluid of the presence of constituents of the Ang II production paths.

 Methods Collection of bovine pericardial fluid and parietal pericardium

This study used fragments of pericardial parietal membranes, as well as pericardial fluid, of six Nelore cattle (Bos indicus, 1758) collected in Delta slaughterhouse (Delta-MG), subject to authorization by the veterinarians in charge. The fragments of pericardial membranes collected were washed and conditioned in saline solution at 4ºC. The pericardial fluids, aspirated from the pericardial cavities with 20-mL sterile syringes, were maintained at 4ºC and, with the membranes, transported to the laboratory.

Because this study was performed "ex vivo", it required no submission to the Ethics Committee in the Use of Animals (CEUA) UFTM, according to the Inner Regulation of the CEUA/UFTM, article 2, subsection I, §2º.

 Processing of pericardial parietal membranes

The fragments of the pericardial parietal membranes were washed in saline solution and dissected in horizontal laminar flow (Labconco, USA), in nutrient DMEM medium, to remove the adipose tissue of the epipericardial layer of the parietal pericardium. Then they were washed in TBS and sliced into fragments of approximately 1.0x0.3 cm, which were embedded in a cryoprotective medium (OCT) and submitted to frozen fixation with liquid nitrogen. After fixation, the fragments were sectioned in a cryostat (Leica Microsystems), and the 2-µm sections obtained were mounted in glass slides, fixed in acetone for 10 minutes, and stored at -20ºC.

 Pericardial fluid processing

The pericardial fluid was transferred to microcentrifuge tubes and centrifuged at 14000 rpm and 4ºC for 10 minutes (Centrifuge 5402, Eppendorf). The supernatants were collected, and the clear ones, with no visual blood contamination, were used, constituting a pericardial fluid pool.

The high concentrations of albumin in the pericardial fluid were reduced by using blue agarose resin (Bio-Rad). Samples of 250 µL of crude extract of pericardial fluid were incubated with 1 mL of blue agarose, balanced with sodium phosphate buffer 0.05 M, pH 6. They were incubated for 2 hours, at room temperature, under agitation. Then, the pericardial fluid extracts were centrifuged at 14000 rpm and 4ºC, and the supernatants were collected for further use.

 Immunoprecipitation of pericardial fluid

Samples of 500 µL of pericardial fluid, obtained after removing albumin, were incubated with 2.5 µL of anti-ACE antibody (200 µg/mL, Santa Cruz), during the night. Then, 25 µL of CL-4B Sepharose spheres (Amersham Biosciences) conjugated with G protein were added to the samples and incubated for 2 hours. The suspensions were centrifuged for 5 minutes at 14000 rpm. All procedures were performed under agitation at 4ºC. The supernatants were discarded and the precipitates collected were diluted with 20 µL of the sample solution.15 The immunocomplexes obtained were analyzed with SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).

 SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

The immunocomplexes obtained were diluted with the sample solution under reducing conditions, at 70ºC, centrifuged and applied to gels at 7.5% concentration. The polypeptide bands were separated by use of SDS-PAGE (Mighty Small II SE 260, Amersham Biosciences) at constant 25-mA current. The gels obtained were fixed, stained with coomassie blue and bleached. Duplicates of non-fixed gels were transferred to the nitrocellulose membrane (Invitrogen), in TE 22 (Amersham Biosciences) transfer unit, containing modified Towbin buffer,16 under agitation, during the night, at 4ºC, with a constant 200-mA current. The membranes obtained were stained with Ponceau S to assess the presence of polypeptide fractions, bleached with distilled water, dried in filter paper and submitted to ACE immunodetection.

 Immunodetection in nitrocellulose membranes

The nitrocellulose membranes were incubated with 10% skim milk and 2% serum bovine albumin in Tris-buffered saline (TBS), during the night, under agitation, at 4ºC, to block nonspecific bindings. Then, that solution was replaced with another containing the primary anti-ACE antibody (200 µg/mL, Santa Cruz), diluted at 1:100, and the membranes were incubated for 2 hours. After incubation with the primary antibody, the membranes were extensively washed with TBS and incubated with the secondary antibody [F(ab')2], rabbit anti-IgG, conjugated with peroxidase (Amersham), diluted at 1:1000, for 2 hours. The membranes were washed again, and the immunoreactive bands were revealed in a solution containing diaminobenzidine (DAB, Dako). The revelation was inactivated in distilled water. All antibodies were diluted in a solution of 1% bovine serum albumin and 0.05% Tween 20 in TBS, the incubation with antibodies being performed at room temperature under agitation. To determine the specificity of the reaction, the membranes were incubated without the primary antibody.

 Immunofluorescence in pericardial parietal membranes

The pericardial parietal sections obtained with the cryomicrotome were washed in TBS and incubated with anti-ACE antibody (200 µg/mL, Santa Cruz), for 1 hour, at room temperature, in a dark humid chamber. After incubation with primary antibody, the sections were washed in TBS plus 0.05% Tween 20 several times and incubated with rabbit anti-IgG secondary antibody conjugated with rhodamine (Alexa Fluor Molecular Probes 568). After being extensively washed, the sections mounted with Fluoromount G (Southern Biotech) were observed and documented under a fluorescence microscope Olympus, with a 568-nm wave length. To determine the immunostaining specificity, control sections were incubated without the primary antibody.

 Results ACE detection in the bovine pericardial fluid

When the crude extracts of the pericardial fluid underwent immunoprecipitation with anti-ACE antibody and were analyzed with SDS-PAGE under reducing conditions, a band with molecular mass of approximately 146 kDa, similar to the ACE mass (Figure 1; arrow), was detected. Of the polypeptide bands observed, the most prominent was the IgG heavy chain, because the antibody was not removed after being added to the pericardial fluid during immunoprecipitation (Figure 1; arrow head). In addition, other thinner bands were noted and could have been co-immunoprecipitated or even not properly removed by washing with buffer. The bovine pericardial fluid ACE immunoprecipitation was confirmed with immunodetection in the nitrocellulose membranes, which evidenced the ACE isoform in the position expected for an enzyme (Figure 2; arrow).

SDS-PAGE of samples of bovine pericardial fluid immunoprecipitated with anti-ACE antibody. Representative gel (7.5%), stained with coomassie blue, showing the presence of a band with apparent molecular mass of 146 kDa (arrow), suggestive of an ACE isoform. The arrow head indicates IgG heavy chain. These results are representative of three independent experiments. PF: pericardial fluid; P (Da): patterns of molecular weights.

Western Blot of samples of bovine pericardial fluid immunoprecipitated with anti-ACE antibody. The polypeptide fractions separated by SDS-PAGE were transferred to the nitrocellulose membranes and probed with anti-ACE antibody. The head indicates the immunomarked ACE isoform. These results are representative of three independent experiments. PF: pericardial fluid; P (Da): patterns of molecular weights.

Immunolocalization of ACE in the pericardial membrane

The histological sections of the parietal pericardium submitted to ACE detection by use of immunofluorescence showed unequivocal positivity for ACE in the mesothelial cells (Figure 3, right). That positivity neither was continuous in the entire mesothelium nor had the same intensity. Specific fluorescence for ACE was not observed in the fibrous layer of the pericardial membrane, except for the blood vessels, because ACE is expressed in endothelial cells. Negative controls showed no staining. Figure 3 shows the histological section of the parietal pericardium stained with toluidine blue.

Right: image representative of sections of bovine pericardial parietal membranes, cryofixed and submitted to ACE immunodetection. Note the positive mesothelial layer (arrow). Left: histological section of bovine parietal pericardium stained with toluidine blue. Original magnification: 40x.

Discussion

The present study evidences the presence of an ACE isoform in bovine pericardial fluid, and establishes the ACE location in mesothelial cells of the bovine pericardial parietal membrane, for the first time, indicating that membrane as a possible source of the pericardial fluid ACE.

The RAS, originally characterized as a circulating endocrine system, comprises several enzymatic paths and bioactive components that have several functions.

Currently, there is plenty of evidence of the presence of tissue RASs that influence local cell actions, with intracellular and subcellular components.17-20 Local RASs have been shown in many tissues/organs, such as heart, kidneys, adrenal glands, blood vessels, pancreas, liver, brain, and adipose tissue.6,19,21-24 Regarding the cardiac RAS, several of its constituents, such as angiotensinogen, renin, ACE, Ang I and Ang II, and AT1 and AT2 receptors, were detected in different regions of the heart, such as the atria, conduction system, heart valves, coronary arteries and ventricles, being synthesized by different cell types, such as fibroblasts and myocytes.6,24-26

The importance of the pericardium and pericardial fluid to control cardiac function has been established in past years. The quiescent nature of the visceral and parietal pericardium has been questioned, resulting in evidence for an important role in the production of substances that could have paracrine actions on the heart. When the human parietal pericardium is compared with that of other species, we observe that bovine parietal pericardium has the closest histological constitution to that of the human species.27,28 Thus, characterizing the bovine pericardium, mainly the macromolecules and mediators produced by the cells that delimit the pericardial cavity, is paramount to the better understanding of the biology and importance of that membrane and of the pericardial fluid under physiological conditions or in association with any disease.

The pericardial fluid is considered an ultrafiltrate of plasma, added by some components of the myocardial interstitial fluid. Its protein concentration is lower than that of the plasma, but with a relatively high albumin concentration.14 Substances detected in the human or animal pericardial fluid, such as endothelin-1, beta fibroblast growth factor (bFGF), Ang II, renin, atrial natriuretic factor, vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin-6, and cell adhesion molecules, could act upon the heart.10,29-31 Modulation of growth and survival of cardiac myocytes,10 endothelial cells and smooth muscle cells32,33 are some biological effects of mediators existing in the pericardial fluid of patients with ischemic and non-ischemic cardiac diseases. Limana et al.34 have shown that, in response to myocardial infarction, epicardial c-kit+ cells reactivate an embryonic program, in which soluble factors of the pericardial fluid play a fundamental role. Thus, the knowledge about that fluid composition has pathophysiological importance and diagnostic significance.30

Our results evidence the presence of an ACE isoform in the bovine pericardial fluid, showing the existence of a part of the RAS in the pericardial cavity, probably of local origin. Although the pericardial fluid is a plasma ultrafiltrate and plasma mediators, such as Ang II, can spread to the pericardial fluid with no restriction, the same does not happen with ACE. The structural organization of the mesotelial layer of the pericardium, both parietal and visceral ones, prevent that free circulation. The presence of tight junctions between the mesothelial cells27,28,35 prevents paracellular transport of macromolecules with molecular mass above 40 KDa.36 Because the ACE isoform present in the bovine pericardial fluid has molecular mass of approximately 146 KDa, similar to that predicted for human ACE,5 the paracellular route would not be an access way to the pericardial cavity.

In addition to the above cited factors, which partially support the local synthesis of ACE, ACE localization should be considered. Immunofluorescence evidenced positivity in parietal pericardial mesothelial cells and in the blood vessels of the pericardial membrane. Immunolocalization of ACE in blood vessels was expected, because ACE has ubiquitous distribution in the endothelium.5,37 However, in mesothelial cells, its immunolocalization is a strong evidence that those cells are the source of pericardial fluid ACE, because: i) they have a close anatomical relationship with the pericardial cavity, because they delimit it; ii) ACE is an integral protein of the membrane, being, thus, produced by mesothelial cells, with its extracellular domain directed to the pericardial cavity;5iii) the ability of mesothelial cells to synthesize ACE has been demonstrated by the presence of that enzyme's mRNA in cultured human peritoneal mesothelial cells, by use of RT-PCR;38iv) they have abundant endoplasmic reticulum and developed Golgi complex,27,28,35 consistent with the profile of cells capable of active protein synthesis.

Corroborating with those arguments, several studies have shown the metabolic profile of mesothelial cells. Mesothelial cells synthesize and secrete lubricants, such as glycosaminoglycans and surfactant, to prevent friction and the formation of adhesions between the parietal and visceral surfaces.39 They play a critical role in homeostasis control of the serous membranes in response to injury, inflammation and immunoregulation.39 In addition, mesothelial cells play a central role in the repair of serous membranes, secretion of inflammatory mediators, chemokines, growth factors and extracellular matrix components. They have different phenotypes, which, depending on their location and activation status, reflect functional differences.39

The importance of local RASs has not been totally clarified. Higher concentrations of active cardiovascular mediators in the pericardial fluid than in the plasma raises a question about their origin and possible actions upon the surrounding tissues. The pericardial fluid of patients with coronary artery disease trigger substantial arterial contractions in isolated carotid arteries of rats, which are mediated primarily by ET-1.40 Our results showed both the presence of an ACE isoform in the pericardial fluid, and, for the first time, the immunolocalization of that protein in parietal pericardial mesothelial cells, suggesting that the parietal pericardial mesothelial layer is one possible source of the pericardial fluid ACE. Thus, the Ang II produced locally could act on its own pericardial mesothelial cells, both parietal and visceral, or even directly on the myocardium, promoting inflammation, oxidative stress and cell death, contributing to cardiac hypertrophy and fibrosis. In addition, it could act directly on the myocardial microcirculation promoting important vasomotor effects. In that context, the pericardial fluid would be an important reservoir of mediators that could modulate the functions of cardiac cells.

The use of experimental models with tissues similar to the human ones, both regarding structural organization and cell constitution, would be more suitable for studying certain human conditions. In addition to structural organization, biochemical and molecular features are fundamental to achieving optimal balance between quantity and quality of the data produced and their relevance for the condition investigated.

The structural features of the bovine pericardial mesotelial layer, similar to the human ones,27,28 suggest our results can be extended to human pericardial mesothelial cells, which could be the partial source of the human pericardial fluid ACE.11,12 A better knowledge of both the pericardial fluid constituents and the mesothelial cells in proper animal models could help understanding the paracrine or autocrine effects of mediators produced by the pericardium on the heart.

One limitation of our study was the volume of the pericardial fluid obtained from the animals in the sample. Because of the difficulties inherent in collecting bovine pericardial fluid, the volume was relatively low. Thus, further research is required to clarify how mesothelial cells interact with their local environment and what is their contribution to the production of mediators in the pericardial fluid that can modulate cell actions essential to maintain cardiac homeostasis.

 Conclusions

The Ang II present in the bovine pericardial fluid is partially produced by the action of the ACE existing in that fluid, pericardial parietal mesothelial cells being a source of that ACE.

Sources of Funding

This study was funded by CAPES and FAPEMIG n. APQ 01650/2008.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Ilsione Ribeiro de Sousa Filho, from Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

 References 1 World Health Organization. (WHO). Global atlas on cardiovascular diseases prevention and control. Geneva; 2011. World Health Organization. (WHO) Global atlas on cardiovascular diseases prevention and control Geneva 2011 2 Dzau VJ. Theodore Cooper Lecture - Tissue angiotensin and pathobiology of vascular disease: a unifying hypothesis. Hypertension. 2001;37(4):1047-52. PMID: 11304501. Dzau VJ Theodore Cooper Lecture - Tissue angiotensin and pathobiology of vascular disease: a unifying hypothesis Hypertension 2001 37 4 1047 1052 11304501 3 Acharya KR, Sturrock ED, Riordan JF, Ehlers MR. Ace revisited: a new target for structure-based drug design. Nat Rev Drug Discov. 2003;2(11):891-902. doi: 10.1038/nrd1227. Acharya KR Sturrock ED Riordan JF Ehlers MR Ace revisited: a new target for structure-based drug design Nat Rev Drug Discov 2003 2 11 891 902 10.1038/nrd1227 4 Riordan JF. Angiotensin-I-converting enzyme and its relatives. Genome Biol. 2003;4(8):225. doi: 10.1186/gb-2003-4-8-225. Riordan JF Angiotensin-I-converting enzyme and its relatives Genome Biol 2003 4 8 225 225 10.1186/gb-2003-4-8-225 5 Bernstein KE, Ong FS, Blackwell WL, Shah KH, Giani JF, Gonzalez-Villalobos RA, et al. A modern understanding of the traditional and nontraditional biological functions of angiotensin-converting enzyme. Pharmacol Rev. 2012;65(1):1-46. doi: 10.1124/pr.112.006809. Bernstein KE Ong FS Blackwell WL Shah KH Giani JF Gonzalez-Villalobos RA A modern understanding of the traditional and nontraditional biological functions of angiotensin-converting enzyme Pharmacol Rev 2012 65 1 1 46 10.1124/pr.112.006809 6 Paul M, Poyan Mehr A, Kreutz R. Physiology of local renin-angiotensin systems. Physiol Rev. 2006;86(3):747-803. doi: 10.1152/physrev.00036.2005. Paul M Poyan Mehr A Kreutz R Physiology of local renin-angiotensin systems Physiol Rev 2006 86 3 747 803 10.1152/physrev.00036.2005 7 Sun Y. Myocardial repair/remodelling following infarction: roles of local factors. Cardiovasc Res. 2009;81(3):482-90. doi: 10.1093/cvr/cvn333. Sun Y Myocardial repair/remodelling following infarction: roles of local factors Cardiovasc Res 2009 81 3 482 490 10.1093/cvr/cvn333 8 Re RN. Mechanisms of disease: local renin-angiotensin-aldosterone systems and the pathogenesis and treatment of cardiovascular disease. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2004;1(1):42-7. doi: 10.1038/ncpcardio0012. Re RN Mechanisms of disease: local renin-angiotensin-aldosterone systems and the pathogenesis and treatment of cardiovascular disease Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2004 1 1 42 47 10.1038/ncpcardio0012 9 Kumar R, Singh VP, Baker KM. The intracellular renin-angiotensin system: a new paradigm. Trends Endocrinol Metab. 2007;18(5):208-14. doi: 10.1016/j.tem.2007.05.001. Kumar R Singh VP Baker KM The intracellular renin-angiotensin system: a new paradigm Trends Endocrinol Metab 2007 18 5 208 214 10.1016/j.tem.2007.05.001 10 Corda S, Mebazaa A, Gandolfini MP, Fitting C, Marotte F, Peynet J, et al. Trophic effect of human pericardial fluid on adult cardiac myocytes. Differential role of fibroblast growth factor-2 and factors related to ventricular hypertrophy. Circ Res. 1997;81(5):679-87. PMID: 9351441. Corda S Mebazaa A Gandolfini MP Fitting C Marotte F Peynet J Trophic effect of human pericardial fluid on adult cardiac myocytes. Differential role of fibroblast growth factor-2 and factors related to ventricular hypertrophy Circ Res 1997 81 5 679 687 9351441 11 Gomes RA, Teodoro Ld, Lopes IC, Bersanetti PA, Carmona AK, Hial V. Angiotensin-converting enzyme in pericardial fluid: comparative study with serum activity. Arq Bras Cardiol. 2008;91(3):156-61, 172-8. PMID: 18853057. Erratum in: Arq Bras Cardiol. 2008;91(6):442. Gomes RA Ld Teodoro Lopes IC Bersanetti PA Carmona AK Hial V Angiotensin-converting enzyme in pericardial fluid: comparative study with serum activity Arq Bras Cardiol 2008 91 3 156 161 172-8 18853057 Erratum in: Arq Bras Cardiol. 2008;91(6):442 12 Bechtloff R, Goette A, Bukowska A, Kähne T, Peters B, Huth C, et al. Gender and age-dependent differences in the bradykinin-degradation within the pericardial fluid of patients with coronary artery disease. Int J Cardiol. 2011;146(2):164-70. doi: 10.1016/j.ijcard.2009.06.028. Bechtloff R Goette A Bukowska A Kähne T Peters B Huth C Gender and age-dependent differences in the bradykinin-degradation within the pericardial fluid of patients with coronary artery disease Int J Cardiol 2011 146 2 164 170 10.1016/j.ijcard.2009.06.028 13 Michailova KN, Usunoff KG. Serosal membranes (Pleura, Pericardium, Peritoneum): normal structure, development and experimental pathology. Adv Anat Embryol Cell Biol. 2006;83:i-vii, 1-144. PMID: 16570866. Michailova KN Usunoff KG Serosal membranes (Pleura, Pericardium, Peritoneum): normal structure, development and experimental pathology Adv Anat Embryol Cell Biol 2006 83 i vii 1-144 16570866 14 Holt JP. The normal pericardium. Am J Cardiol. 1970;26(5):455-65. PMID: 4991283. Holt JP The normal pericardium Am J Cardiol 1970 26 5 455 465 4991283 15 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227(5259):680-5. PMID: 5432063. Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 1970 227 5259 680 685 5432063 16 Towbin H, Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding--current status and outlook. J Immunol Methods. 1984;72(2):313-40. PMID: 6206159. Towbin H Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding--current status and outlook J Immunol Methods 1984 72 2 313 340 6206159 17 Abadir PM, Walston JD, Carey RM. Subcellular characteristics of functional intracellular renin-angiotensin systems. Peptides. 2012;38(2):437-45. doi: 10.1016/j.peptides.2012.09.016. Abadir PM Walston JD Carey RM Subcellular characteristics of functional intracellular renin-angiotensin systems Peptides 2012 38 2 437 445 10.1016/j.peptides.2012.09.016 18 Carey RM. Functional intracellular renin-angiotensin systems: potential for pathophysiology of disease. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2012;302(5):R479-81. doi: 10.1152/ajpregu.00656.2011. Carey RM Functional intracellular renin-angiotensin systems: potential for pathophysiology of disease Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2012 302 5 R479 R481 10.1152/ajpregu.00656.2011 19 Kobori H, Nangaku M, Navar LG, Nishiyama A. The intrarenal renin-angiotensin system: from physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease. Pharmacol Rev. 2007;59(3):251-87. doi: 10.1124/pr.59.3.3. Kobori H Nangaku M Navar LG Nishiyama A The intrarenal renin-angiotensin system: from physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease Pharmacol Rev 2007 59 3 251 287 10.1124/pr.59.3.3 20 Kumar R, Thomas CM, Yong QC, Chen W, Baker KM. The intracrine renin-angiotensin system. Clin Sci (Lond). 2012;23(5):273-84. doi: 10.1042/CS20120089. Kumar R Thomas CM Yong QC Chen W Baker KM The intracrine renin-angiotensin system Clin Sci Lond 2012 23 5 273 284 10.1042/CS20120089 21 Baltatu OC, Campos LA, Bader M. Local renin-angiotensin system and the brain--a continuous quest for knowledge. Peptides. 2011;32(5):1083-6. doi: 10.1016/j.peptides.2011.02.008. Baltatu OC Campos LA Bader M Local renin-angiotensin system and the brain--a continuous quest for knowledge Peptides 2011 32 5 1083 1086 10.1016/j.peptides.2011.02.008 22 Carey RM, Siragy HM. Newly recognized components of the renin-angiotensin system: potential roles in cardiovascular and renal regulation. Endocr Rev. 2003;24(3):261-71. doi: 10.1210/er.2003-0001. Carey RM Siragy HM Newly recognized components of the renin-angiotensin system: potential roles in cardiovascular and renal regulation Endocr Rev 2003 24 3 261 271 10.1210/er.2003-0001 23 Cheng Q, Leung PS. An update on the islet renin-angiotensin system. Peptides. 2011;32(5):1087-95. doi: 10.1016/j.peptides.2011.03.003. Cheng Q Leung PS An update on the islet renin-angiotensin system Peptides 2011 32 5 1087 1095 10.1016/j.peptides.2011.03.003 24 Dostal DE, Baker KM. The cardiac renin-angiotensin system conceptual or a regulator of cardiac function. Circ Res. 1999;85(7):643-50. PMID: 10506489. Dostal DE Baker KM The cardiac renin-angiotensin system conceptual or a regulator of cardiac function Circ Res 1999 85 7 643 650 10506489 25 Dzau VJ, Ellison KE, Brody T, Ingelfinger J, Pratt R. A comparative study of the distribution of renin and angiotensinogen messenger ribonucleic acids in rat and mouse tissues. Endocrinology. 1987;120(6):2334-8. doi: 10.1210/endo-120-6-2334. Dzau VJ Ellison KE Brody T Ingelfinger J Pratt R A comparative study of the distribution of renin and angiotensinogen messenger ribonucleic acids in rat and mouse tissues Endocrinology 1987 120 6 2334 2338 10.1210/endo-120-6-2334 26 Hellmann W, Suzuki F, Ohkubo H, Nakanishi S, Ludwig G, Ganten D. Angiotensinogen gene expression in extrahepatic rat tissues: application of a solution hybridization assay. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1988;338(3):327-31. PMID: 3194040. Hellmann W Suzuki F Ohkubo H Nakanishi S Ludwig G Ganten D Angiotensinogen gene expression in extrahepatic rat tissues: application of a solution hybridization assay Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1988 338 3 327 331 3194040 27 Ishihara T, Ferrans VJ, Jones M, Boyce SW, Kawanami O, Roberts WC. Histologic and ultrastructural features of normal human parietal pericardium. Am J Cardiol. 1980;46(5):744-53. PMID: 7435384. Ishihara T Ferrans VJ Jones M Boyce SW Kawanami O Roberts WC Histologic and ultrastructural features of normal human parietal pericardium Am J Cardiol 1980 46 5 744 753 7435384 28 Ishihara T, Ferrans VJ, Jones M, Boyce SW, Roberts WC. Structure of bovine parietal pericardium and of unimplanted Ionescu-Shiley pericardial valvular bioprostheses. J Thorac Cardiovasc Surg. 1981;81(5):747-57. PMID: 7218840. Ishihara T Ferrans VJ Jones M Boyce SW Roberts WC Structure of bovine parietal pericardium and of unimplanted Ionescu-Shiley pericardial valvular bioprostheses J Thorac Cardiovasc Surg 1981 81 5 747 757 7218840 29 Namiki A, Kubota T, Fukazawa M, Ishikawa M, Moroi M, Aikawa J, et al. Endothelin-1 concentrations in pericardial fluid are more elevated in patients with ischemic heart disease than in patients with nonischemic heart disease. Jpn Heart J. 2003;44(5):633-44. PMID: 14587645. Namiki A Kubota T Fukazawa M Ishikawa M Moroi M Aikawa J Endothelin-1 concentrations in pericardial fluid are more elevated in patients with ischemic heart disease than in patients with nonischemic heart disease Jpn Heart J 2003 44 5 633 644 14587645 30 Fujita M, Komeda M, Hasegawa K, Kihara Y, Nohara R, Sasayama S. Pericardial fluid as a new material for clinical heart research. Int J Cardiol. 2001;77(2-3):113-8. PMID: 11182172. Fujita M Komeda M Hasegawa K Kihara Y Nohara R Sasayama S Pericardial fluid as a new material for clinical heart research Int J Cardiol 2001 77 2-3 113 118 11182172 31 Mebazaa A, Wetzel RC, Dodd-o JM, Redmond EM, Shah AM, Maeda K, et al. Potential paracrine role of the pericardium in the regulation of cardiac function. Cardiovasc Res. 1998;40(2):332-42. PMID: 9893727. Mebazaa A Wetzel RC Dodd-o JM Redmond EM Shah AM Maeda K Potential paracrine role of the pericardium in the regulation of cardiac function Cardiovasc Res 1998 40 2 332 342 9893727 32 Iwakura A, Fujita M, Hasegawa K, Sawamura T, Nohara R, Sasayama S, et al. Pericardial fluid from patients with unstable angina induces vascular endothelial cell apoptosis. J Am Coll Cardiol. 2000;35(7):1785-90. PMID: 10841225. Iwakura A Fujita M Hasegawa K Sawamura T Nohara R Sasayama S Pericardial fluid from patients with unstable angina induces vascular endothelial cell apoptosis J Am Coll Cardiol 2000 35 7 1785 1790 10841225 33 Yoneda T, Fujita M, Kihara Y, Hasegawa K, Sawamura T, Tanaka T, et al. Pericardial fluid from patients with ischemic heart disease accelerates the growth of human vascular smooth muscle cells. Jpn Circ J. 2000;64(7):495-8. PMID: 10929776. Yoneda T Fujita M Kihara Y Hasegawa K Sawamura T Tanaka T Pericardial fluid from patients with ischemic heart disease accelerates the growth of human vascular smooth muscle cells Jpn Circ J 2000 64 7 495 498 10929776 34 Limana F, Bertolami C, Mangoni A, Di Carlo A, Avitabile D, Mocini D, et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 2010;48(4):609-18. doi: 10.1016/j.yjmcc.2009.11.008. Limana F Bertolami C Mangoni A Di Carlo A Avitabile D Mocini D Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid J Mol Cell Cardiol 2010 48 4 609 618 10.1016/j.yjmcc.2009.11.008 35 Mutsaers SE. Mesothelial cells: their structure, function and role in serosal repair. Respirology. 2002;7(3):171-91. PMID: 12153683. Mutsaers SE Mesothelial cells: their structure, function and role in serosal repair Respirology 2002 7 3 171 191 12153683 36 Page E, Upshaw-Earley J, Goings G. Permeability of rat atrial endocardium, epicardium, and myocardium to large molecules. Stretch-dependent effects. Circ Res. 1992;71(1):159-73. PMID: 1376644. Page E Upshaw-Earley J Goings G Permeability of rat atrial endocardium, epicardium, and myocardium to large molecules. Stretch-dependent effects Circ Res 1992 71 1 159 173 1376644 37 Hial V, Gimbrone MA Jr, Peyton MP, Wilcox GM, Pisano JJ. Angiotensin metabolism by cultured human vascular endothelial and smooth muscle cells. Microvasc Res. 1979;17(3 Pt 1):314-29. PMID: 223017. Hial V Gimbrone MA Jr Peyton MP Wilcox GM Pisano JJ Angiotensin metabolism by cultured human vascular endothelial and smooth muscle cells Microvasc Res 1979 17 3 1 314 329 223017 38 Kyuden Y, Ito T, Masaki T, Yorioka N, Kohno N. Tgf-beta1 induced by high glucose is controlled by angiotensin-converting enzyme inhibitor and angiotensin II receptor blocker on cultured human peritoneal mesothelial cells. Perit Dial Int. 2005;25(5):483-91. PMID: 16178483. Kyuden Y Ito T Masaki T Yorioka N Kohno N Tgf-beta1 induced by high glucose is controlled by angiotensin-converting enzyme inhibitor and angiotensin II receptor blocker on cultured human peritoneal mesothelial cells Perit Dial Int 2005 25 5 483 491 16178483 39 Mutsaers SE, Birnie K, Lansley S, Herrick SE, Lim CB, Prêle CM. Mesothelial cells in tissue repair and fibrosis. Front Pharmacol. 2015;6:113. doi: 10.3389/fphar.2015.00113. Mutsaers SE Birnie K Lansley S Herrick SE Lim CB Prêle CM Mesothelial cells in tissue repair and fibrosis Front Pharmacol 2015 6 113 113 10.3389/fphar.2015.00113 40 Nemeth Z, Cziraki A, Szabados S, Horvath I, Koller A. Pericardial fluid of cardiac patients elicits arterial constriction: role of endothelin-1. Can J Physiol Pharmacol. 2015;93(9):779-85. doi: 10.1139/cjpp-2015-0030. Nemeth Z Cziraki A Szabados S Horvath I Koller A Pericardial fluid of cardiac patients elicits arterial constriction: role of endothelin-1 Can J Physiol Pharmacol 2015 93 9 779 785 10.1139/cjpp-2015-0030 Artigos Originais Células Mesoteliais Pericárdicas Parietais: Fonte da Enzima Conversora de Angiotensina Existente no Líquido Pericárdico Bovino Sousa Ilsione Ribeiro de Filho Pereira Isabela Cabral Cavicchioli Morais Lourimar José de Teodoro Livia das Graças Vieito Lombardi Rodrigues Maria Laura Pinto Gomes Roseli Aparecida da Silva Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), Uberaba MG - Brasil Correspondência: Roseli Aparecida da Silva Gomes Praça Manoel Terra, 330. CEP 38025-015, Abadia, Uberaba, MG - Brasil. E-mail: bioq@dcb.uftm.edu.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Sousa Filho IR, Teodoro LGVL, Rodrigues MLP, Gomes RAS; Obtenção de dados: Sousa Filho IR, Pereira ICC, Morais LJ, Rodrigues MLP; Análise e interpretação dos dados: Sousa Filho IR, Pereira ICC, Rodrigues MLP; Obtenção de financiamento e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Teodoro LGVL, Rodrigues MLP, Gomes RAS; Redação do manuscrito: Sousa Filho IR, Pereira ICC, Morais LJ, Teodoro LGVL, Rodrigues MLP, Gomes RAS.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

Angiotensina II (Ang II), o hormônio efetor primário do sistema renina-angiotensina (SRA), atuando em níveis sistêmicos ou locais, é produzida pela ação da enzima conversora de angiotensina (ECA) sobre a angiotensina I. Embora diversos SRAs teciduais, como o SRA cardíaco, tenham sido descritos em muitos estudos, dados de um SRA no líquido pericárdico e sua origem não são ainda disponíveis. A Ang II localmente produzida tem efeitos parácrinos e autócrinos, induzindo a hipertrofia ventricular esquerda, fibrose, insuficiência e disfunção cardíacas. Devido às dificuldades inerentes à obtenção de líquido pericárdico humano, modelos experimentais apropriados são muito úteis para obter dados relativos às suas características bem como dos tecidos contíguos.

 Objetivos:

Obter evidências da presença de constituintes das vias de produção de Ang II no líquido pericárdico e no pericárdio parietal bovinos.

 Métodos:

Extratos brutos de líquido pericárdico bovino sem albumina (sobrenadantes), imunoprecipitados com anticorpo anti-ECA, foram submetidos a eletroforese (SDS-PAGE) e os géis corados com Coomassie Blue. Duplicatas dos géis foram sondadas com anticorpo anti-ECA. A detecção de ECA nas membranas pericárdicas foi realizada por imunofluorescência.

 Resultados:

A imunodetecção sobre as membranas de nitrocelulose mostrou uma isoforma de ECA com 146 KDa no líquido pericárdico bovino. Nas secções de membrana pericárdica, a ECA foi imunolocalizada na camada mesotelial.

 Conclusões:

A isoforma de ECA do líquido pericárdico bovino e do pericárdio parietal deve ser, pelo menos em parte, responsável pela produção de Ang II no espaço pericárdico, devendo ser considerada quando o SRA cardíaco for avaliado.

 Palavras-chave Sistema Renina-Angiotensina Peptidil Dipeptidase A Líquido Pericárdico Hipertrofia Ventricular Esquerda Bovinos CAPES e FAPEMIG 01650/2008 O presente estudo foi financiado pela CAPES e FAPEMIG n. APQ 01650/2008. Introdução

Doenças cardiovasculares são consideradas a principal causa de morbimortalidade em todo o mundo.1 Já está bem estabelecido que a desregulação ou a superexpressão do sistema renina-angiotensina (SRA) leva a uma variedade de efeitos vasculares danosos, contribuindo para a fisiopatologia das doenças cardiovasculares.2 Angiotensina II (Ang II) é o hormônio efetor primário desse sistema, sendo produzida através da ação da enzima conversora de angiotensina (ECA) sobre o seu substrato, a angiotensina I (Ang I).3-5 A Ang II pode atuar sistemicamente ou como um fator tecidual, produzido localmente. A Ang II tecidual exerce ações parácrinas e autócrinas, promovendo crescimento celular, apoptose, inflamação, estresse oxidativo e danos aos tecidos, levando a hipertrofia, fibrose, insuficiência e disfunção cardíacas.6,7 Os SRAs teciduais6,8 e intracelulares9 locais, como o SRA cardíaco, já estão descritos na literatura, embora pouco se saiba a respeito da presença de um SRA no líquido pericárdico e quais suas possíveis fontes. A Ang II, alguns fatores de crescimento e enzimas já foram identificados nesse líquido.10 Gomes et al.11 mostraram atividade de ECA no líquido pericárdico humano e Bechtloff et al.12 mostraram a presença da fração proteica da ECA no líquido pericárdico de pacientes com doença arterial coronariana. Entretanto, a fonte dessa enzima no líquido ainda permanece desconhecida.

Devido às dificuldades inerentes à obtenção de líquido pericárdico, o uso de modelos experimentais apropriados é fundamental. O coração está contido no interior de um saco fibrosseroso, o saco pericárdico, o qual apresenta um folheto mais interno, o pericárdico seroso, que delimita a cavidade pericárdica. O pericárdio seroso é constituído por um folheto visceral, inseparável do coração, e por um folheto parietal, contínuo ao visceral. O líquido pericárdico encontra-se no interior dessa cavidade.13,14

Assim, a caracterização do líquido pericárdico bem como dos tecidos circundantes de modelos animais é essencial para que os resultados possam apresentar aplicabilidade de translação para os seres humanos, incluindo a fonte das macromoléculas desse líquido. O objetivo deste trabalho foi obter na membrana pericárdica parietal e no líquido pericárdico bovinos evidências da presença de constituintes das vias de produção de Ang II.

 Métodos Obtenção do líquido pericárdico e do pericárdio parietal bovinos

Foram utilizados fragmentos de membranas pericárdicas parietais de seis bovinos da raça Nelore (Bos indicus Linnaeus, 1758), bem como líquido pericárdico, coletados no frigorífico de Delta (Delta-MG), mediante autorização dos veterinários responsáveis. Os fragmentos de membranas pericárdicas obtidos foram lavados e acondicionados em solução salina a 4ºC. Os líquidos pericárdicos, aspirados das cavidades pericárdicas com seringas estéreis de 20 mL, foram mantidos a 4ºC e, juntamente com as membranas, transportados para o laboratório.

Este estudo, por se tratar de condições "ex vivo", não necessitou de parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) UFTM para sua execução (conforme Regulamento Interno da CEUA/UFTM, artigo 2, inciso I, §2º).

 Processamento das membranas pericárdicas parietais

Fragmentos de membranas pericárdicas parietais foram lavados em salina e dissecados em fluxo laminar horizontal (Labconco, EUA), na presença de meio nutriente (DMEM), para retirada do tecido adiposo existente na camada epipericárdica do pericárdio parietal. A seguir, foram lavados em TBS e recortados, sendo obtidos fragmentos de aproximadamente 1,0x0,3 cm, os quais foram colocados em meio crioprotetor (OCT) e submetidos ao processo de fixação por congelamento em nitrogênio líquido. Após fixação, os fragmentos foram seccionados em criostato (Leica Microsystems). Secções de 2 µm obtidas foram colocadas em lâminas, fixadas em acetona por 10 minutos, e acondicionadas a -20ºC.

 Processamento do líquido pericárdico

O líquido pericárdico foi transferido para tubos de microcentrífuga e centrifugados a 14.000 rpm, a 4ºC, por 10 minutos (Centrifuge 5402, Eppendorf). Os sobrenadantes foram coletados e aqueles que apresentavam aspecto límpido, sem contaminação visual com sangue, foram utilizados, sendo então constituído um "pool" de líquido pericárdico.

A albumina presente no líquido pericárdico em concentrações elevadas foi reduzida pela utilização da resina Blue Agarose (Bio-Rad). Amostras de 250 µL do extrato bruto de líquido pericárdico foram incubadas com 1 mL de Blue Agarose, equilibrado com tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 6. A incubação foi realizada por 2 horas, à temperatura ambiente, e sob agitação. Em seguida, os extratos de líquido pericárdico foram centrifugados a 14.000 rpm, a 4ºC, e os sobrenadantes coletados para posterior utilização.

 Imunoprecipitação do líquido pericárdico

Amostras de 500 µL de líquido pericárdico, obtidas após a retirada de albumina, foram incubadas com 2,5 µL de anticorpo anti-ECA (200 µg/mL, Santa Cruz), durante a noite. Em seguida, 25 µL de esferas de Sepharose CL-4B (Amersham Biosciences) conjugadas com proteína G foram adicionadas às amostras e incubadas por 2 horas. As suspensões foram centrifugadas por 5 minutos, a 14.000 rpm. Todos os procedimentos foram realizados sob agitação, a 4ºC. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados coletados solubilizados com 20 µL de solução de amostra.15 Os imunocomplexos obtidos foram analisados em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE).

 Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)

Os imunocomplexos obtidos foram solubilizados com solução de amostra em condições redutoras, aquecidos a 70ºC, centrifugados e aplicados em géis com concentração de 7,5%. As bandas polipeptídicas foram separadas por SDS-PAGE (Mighty Small II SE 260, Amersham Biosciences), a uma corrente constante de 25 mA. Os géis obtidos foram fixados, corados com azul de Coomassie e descorados. Duplicatas dos géis não fixadas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Invitrogen), em cuba de transferência (TE 22 Amersham), contendo tampão Towbin modificado,16 sob agitação, durante a noite, a 4ºC, com corrente constante de 200 mA. As membranas obtidas foram coradas com Ponceau S para verificar a presença das frações polipeptídicas, descoradas com água destilada, secas em papel de filtro e submetidas à imunodetecção de ECA.

 Imunodetecção em membranas de nitrocelulose

As membranas de nitrocelulose foram incubadas com leite desnatado 10% e albumina bovina sérica 2% em salina tamponada com Tris (TBS), durante a noite, sob agitação, a 4ºC, para bloquear ligações não específicas. Em seguida, essa solução foi substituída por solução contendo o anticorpo primário anti-ECA (200 µg/mL, Santa Cruz), diluído a 1:100, e as membranas foram incubadas por 2 horas. Após incubação com anticorpo primário, as membranas foram exaustivamente lavadas com TBS e incubadas com anticorpo secundário [F(ab')2], anti-IgG de coelho, conjugado com peroxidase (Amersham), diluído a 1:1000, por 2 horas. As membranas foram novamente lavadas e as bandas imunorreativas foram reveladas em uma solução contendo diaminobenzidina (DAB, Dako). A revelação foi inativada em água destilada. Todos os anticorpos foram diluídos em uma solução constituída por albumina bovina sérica 1% e Tween 20 0,05% em TBS, sendo as incubações com os anticorpos realizadas à temperatura ambiente e sob agitação. Para se determinar a especificidade da reação, membranas foram incubadas sem a presença do anticorpo primário.

 Imunofluorescência nas membranas pericárdicas parietais

As secções de pericárdio parietal obtidas após criomicrotomia foram lavadas em TBS e incubadas com anticorpo anti-ECA (200 µg/mL, Santa Cruz), por 1 hora, à temperatura ambiente, em câmara úmida e escura. Após incubação com anticorpo primário, as secções foram lavadas em TBS mais Tween 20 0,05% diversas vezes e incubadas com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com rodamina (Alexa Fluor Molecular Probes 568). Após serem exaustivamente lavadas, as secções montadas com Fluoromount G (Southern Biotech) foram observadas e documentadas em microscópio de fluorescência Olympus, em comprimento de onda de 568 nm. Para determinar a especificidade da imunocoloração, secções controle foram incubadas com omissão do anticorpo primário.

 Resultados Detecção da ECA no líquido pericárdico bovino

Quando os extratos brutos de fluido pericárdico foram submetidos à imunoprecipitação com anticorpo anti-ECA e analisados por SDS-PAGE em condições redutoras, foi detectada uma banda com massa molecular aproximada de 146 kDa, semelhante à massa da ECA (Figura 1; seta). Dentre as bandas polipeptídicas observadas, a mais proeminente é a cadeia pesada de IgG, pois o anticorpo não foi removido após ser adicionado ao fluido pericárdico durante a imunoprecipitação (Figura 1; cabeça de seta). Outras bandas menos espessas são também notadas e podem ter sido co-imunoprecipitadas ou mesmo não terem sido adequadamente removidas pelas lavagens com tampão. A imunoprecipitação de ECA do líquido pericárdico bovino foi confirmada através da imunodetecção nas membranas de nitrocelulose, que evidenciou a isoforma da ECA. A isoforma da ECA detectada encontra-se na posição esperada para a enzima (Figura 2; seta).

SDS-PAGE de amostras do líquido pericárdico bovino imunoprecipitadas com anticorpo anti-ECA. Gel representativo (7,5%), corado por azul de Coomassie, onde observamos a presença de uma banda com massa molecular aparente de 146 kDa (seta), sugerindo ser uma isoforma de ECA. A cabeça de seta indica a cadeia pesada da IgG. Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes. FP: fluido pericárdico; P (Da): padrões de pesos moleculares.

Western Blot de amostras do líquido pericárdico bovino imunoprecipitadas com anticorpo anti-ECA. As frações polipeptídicas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para membranas de nitrocelulose e sondadas com anticorpo anti-ECA. A seta indica a isoforma de ECA imunomarcada. Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes. FP: fluido pericárdico; P (Da): padrões de pesos moleculares.

Imunolocalização da ECA na membrana pericárdica

As secções histológicas de pericárdio parietal submetidas à detecção da ECA, através da técnica da imunofluorescência, mostraram, de maneira inequívoca, a marcação positiva para ECA nas células mesoteliais (Figura 3, à direita). Essa marcação não foi contínua em todo o mesotélio nem com a mesma intensidade. Fluorescência específica para ECA não foi observada na camada fibrosa da membrana pericárdica, exceto nos vasos sanguíneos, pois a ECA é expressa nas células endoteliais. Os controles negativos não apresentaram nenhuma coloração. À esquerda, secção histológica de pericárdio parietal corada por azul de toluidina.

À direita, imagens representativas de secções de membranas pericárdicas parietais bovinas, fixadas por congelamento e submetidas à imunodetecção de ECA. Notar a positividade da marcação na camada mesotelial (seta). À esquerda, secção histológica de pericárdio parietal bovino corada por azul de toluidina. Aumentos originais: 40x.

Discussão

O presente estudo evidencia a presença de uma isoforma da ECA no líquido pericárdico bovino e estabelece a localização celular da ECA nas células mesoteliais da membrana pericárdica parietal bovina, pela primeira vez, indicando essa membrana como uma possível fonte da ECA existente no líquido pericárdico.

O SRA, originalmente caracterizado como um sistema endócrino circulante, compreende um número de vias enzimáticas e componentes bioativos que exercem ações funcionais diversas.

Evidências abundantes, atualmente, revelam também a presença de SRAs teciduais que influenciam em ações celulares locais e exibem componentes intracelulares e subcelulares.17-20 SRAs locais foram demonstrados em muitos tecidos/órgãos, entre eles o coração, os rins, as glândulas adrenais, os vasos sanguíneos, o pâncreas, o fígado, o cérebro e o tecido adiposo.6,19,21-24 Particularmente em relação ao SRA cardíaco, diversos constituintes desse sistema, como o angiotensinogênio, a renina, a ECA, a Ang I e a Ang II e os receptores AT1 e AT2, foram detectados em diferentes regiões do coração, entre elas os átrios, o sistema de condução, as valvas, os vasos coronários e os ventrículos, e são sintetizados por diferentes tipos celulares, como os fibroblastos e os miócitos.6,24-26

A importância do pericárdio e do fluido pericárdico no controle da função cardíaca tem sido estabelecida nos últimos anos. A natureza quiescente do pericárdio visceral e do parietal tem sido questionada, com evidências para um importante papel na produção de substâncias que poderiam exercer ações parácrinas sobre o coração. Quando comparamos o pericárdio parietal humano com o de outras espécies, verificamos que o pericárdio parietal bovino é o que apresenta constituição histológica mais próxima à da espécie humana.27,28 Assim, a caracterização do pericárdio bovino, principalmente das macromoléculas e mediadores produzidos pelas células que delimitam a cavidade pericárdica, é fundamental para se entender melhor a biologia e a importância dessa membrana bem como do líquido pericárdico, em condições fisiológicas ou associadas a alguma doença.

O líquido pericárdico é considerado um ultrafiltrado do plasma, adicionado de componentes do fluido intersticial miocárdico. Sua concentração proteica é menor do que a do plasma, mas com uma concentração de albumina relativamente elevada.14 Substâncias já detectadas no líquido pericárdico humano ou no de animais, como a endotelina-1, o fator de crescimento de fibroblastos b (bFGF), a Ang II, a renina, o fator natriurético atrial, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), a interleucina-6, moléculas de adesão celular entre outras, poderiam exercer seus efeitos sobre o coração.10,29-31 A modulação do crescimento e a sobrevivência de miócitos cardíacos,10 de células endoteliais e de células musculares lisas32,33 são alguns dos efeitos biológicos dos mediadores existentes no líquido pericárdico de pacientes com doenças cardíacas isquêmicas e não isquêmicas. Limana et al.34 mostraram que, em resposta ao infarto do miocárdio, células epicárdicas c-kit+ reativam um programa embrionário e fatores solúveis existentes no líquido pericárdico desempenham um papel fundamental nesse evento. Assim, conhecer a composição desse líquido tem importância fisiopatológica e significância diagnóstica.30

Nossos resultados evidenciaram a presença de uma isoforma de ECA no líquido pericárdico bovino, mostrando a existência de parte do SRA na cavidade pericárdica, provavelmente com origem local. Embora o líquido pericárdico seja um ultrafiltrado do plasma e os mediadores existentes no plasma, como a Ang II, possam se difundir para o líquido pericárdico sem nenhuma restrição, o mesmo não acontece com a ECA. A organização estrutural da camada mesotelial do pericárdio, tanto parietal como visceral, impediria essa livre circulação. A presença de junções de oclusão entre as células mesoteliais27,28,35 não permite o trânsito paracelular de macromoléculas com massa molecular acima de 40 KDa.36 Como a isoforma da ECA presente no líquido pericárdico bovino apresenta massa molecular aproximada de 146 KDa, semelhante à massa molecular prevista da ECA humana,5 a rota paracelular não seria uma via de acesso à cavidade pericárdica.

Além dos fatores acima citados que, em parte, respaldam uma síntese local de ECA, a localização da ECA também deve ser considerada. A imunofluorescência evidenciou uma marcação positiva nas células mesoteliais pericárdicas parietais e nos vasos sanguíneos existentes na membrana pericárdica. A imunolocalização da ECA nos vasos sanguíneos já era esperada, pois a ECA apresenta distribuição ubíqua no endotélio.5,37 Já nas células mesoteliais, a imunolocalização é um forte indício de que essas células sejam a fonte da ECA existente no líquido pericárdico, pois: i) apresentam uma íntima relação anatômica com a cavidade pericárdica, pois delimitam-na; ii) a ECA é uma proteína integral de membrana, sendo portanto produzida pelas células mesoteliais, com seu domínio extracelular estando voltado para a cavidade pericárdica;5iii) a capacidade das células mesoteliais sintetizarem a ECA foi demonstrada pela presença do RNAm dessa enzima em células mesoteliais peritoneais humanas em cultura, através de RT-PCR;38iv) apresentam retículo endoplasmático abundante e complexo de Golgi desenvolvido,27,28,35 consistentes com o perfil de células que realizam uma ativa síntese proteica.

Corroborando esses argumentos, diversos trabalhos têm demonstrado o perfil metabólico das células mesoteliais. As células mesoteliais sintetizam e secretam lubrificantes, incluindo glicosaminoglicanos e surfactante para prevenir a fricção e a formação de adesões entre as superfícies parietal e visceral.39 Elas desempenham um papel crítico na manutenção da homeostase das membranas serosas em resposta a lesão, inflamação e imunorregulação.39 As células mesoteliais também têm papel central na reparação das serosas, na secreção de mediadores inflamatórios, quimiocinas, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular. Apresentam diferentes fenótipos, os quais, dependendo de sua localização e estado de ativação, refletem diferenças funcionais.39

A importância de SRA locais ainda não está bem esclarecida. A presença de mediadores cardiovasculares ativos em maiores concentrações no líquido pericárdico do que no plasma suscita questão sobre suas origens e suas possíveis ações nos tecidos circundantes. Líquido pericárdico de pacientes com doença arterial coronariana desencadeiam contrações arteriais substanciais em artérias carótidas de rato isoladas, as quais são mediadas primariamente pela ET-1.40 Nossos resultados mostraram a presença de uma isoforma de ECA no líquido pericárdico e a imunolocalização, pela primeira vez, dessa proteína nas células mesoteliais parietais pericárdicas, sugerindo a camada mesotelial pericárdica parietal como uma das possíveis fontes da ECA existente no líquido pericárdico. Assim, a Ang II produzida localmente poderia atuar nas próprias células mesoteliais pericárdicas, tanto parietais como viscerais, ou ainda diretamente no miocárdio, promovendo a inflamação, o estresse oxidativo e a morte celular, contribuindo para a hipertrofia e fibrose cardíacas. Além disso, poderia atuar diretamente sobre a microcirculação miocárdica promovendo efeitos vasomotores importantes. Nessa visão, o líquido pericárdico representaria um importante reservatório de mediadores que poderiam modular as funções das células cardíacas.

A utilização de modelos experimentais com tecidos semelhantes aos tecidos humanos, em organização estrutural e em constituição celular, seria mais adequada para o estudo de determinadas condições humanas. Além da organização estrutural, as caracterizações bioquímica e molecular são condições fundamentais para a obtenção de um balanço ótimo entre a quantidade e a qualidade dos dados produzidos e sua relevância para a condição investigada.

As características estruturais da camada mesotelial pericárdica bovina, semelhantes à humana,27,28 sugerem que nossos resultados possam ser estendidos às células mesoteliais pericárdicas humanas, sendo essas a possível fonte de parte da ECA existente no líquido pericárdico humano.11,12 Uma melhor compreensão dos constituintes do líquido pericárdico bem como das células mesoteliais em modelos animais adequados poderia ajudar no entendimento dos efeitos parácrinos ou autócrinos dos mediadores produzidos pelo pericárdio sobre o coração.

Entre as limitações de nosso estudo deve ser considerado o volume de líquido pericárdico obtido dos animais que constituíram nossa amostra. Devido às dificuldades inerentes a obtenção de líquido pericárdico, inclusive bovino, esse volume foi relativamente pequeno. Assim, mais pesquisas são necessárias para investigar como as células mesoteliais interagem com seu meio ambiente local e qual a sua real contribuição na produção de mediadores existentes no líquido pericárdico que possam modular ações celulares fundamentais para a manutenção da homeostase cardíaca.

 Conclusões

A Ang II presente no líquido pericárdico bovino é produzida, em parte, pela ação da ECA existente nesse líquido, sendo as células mesoteliais pericárdicas parietais uma das fontes dessa ECA.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela CAPES e FAPEMIG n. APQ 01650/2008.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Ilsione Ribeiro de Sousa Filho pela Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).