Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC pQwHt8457xPWCrg9prtnxqD S0066-782X2017001400404 10.5935/abc.20170143 S0066-782X2017005018105 Original Articles Large Accumulation of Collagen and Increased Activation of Mast Cells in Hearts of Mice with Hyperlipidemia Cheng Yunpeng 1 Zhu Yanqiu 2 Zhang Jiashu 3 Duan Xingping 3 Zhang Ying 1 Dalian Medical University First Affiliated Hospital Department of Cardiology China Department of Cardiology - the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University Dalian University Affiliated Zhongshan Hospital Department of Ultrasonics China Department of Ultrasonics - Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University Dalian Medical University College of Pharmacy China College of Pharmacy - Dalian Medical University - China Mailing Address: Ying Zhang. 116044, Dalian, Liaoning - China. E-mail: zhangying_xn@163.com

Author contributions

Conception and design of the research and Writing of the manuscript: Cheng Y; Acquisition of data, Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis: Cheng Y, Zhu Y, Zhang J, Duan X; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Cheng Y, Zhu Y.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 28 09 2017 11 2017 109 5 404 409 14 02 2017 25 05 2017 03 07 2017 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Abstract Background:

Hyperlipidemia, which is characterized by an elevation of lipids in the bloodstream, is a major risk factor for cardiac disease.

 Objectives:

The present study investigated the role of fibrosis in the progression of hyperlipidemia in the mice heart, and whether mast cell activation was associated with the fibrosis process.

 Methods:

Hyperlipidemia was produced in C57BL / 6 mice by feeding them on a high-fat diet for 8 weeks.To assess tissue fibrosis, picrosirius red staining was performed. Hematoxylin & eosin (H&E) staining was performed to identify the histopathological changes in the hearts. Immunohistochemistry was also accomplished to determine the localization of transforming growth factor (TGF)-β and α-smooth muscle actin (α-SMA). Western blotting was performed to analyze the expression of chymase, tryptase, TGF-β, α-SMA and activity of Wnt/β-catenin pathway. At the end, serum total cholesterol (TC) and triglycerides (TG) levels were measured. All the values were expressed as means ± SD, the statistical significance level adopted was 5%.

 Results:

Hyperlipidemia mice showed significantly increased collagen deposition in the hearts compared with normal mice. In addition, H&E staining showed significant cellular degeneration. Cardiac muscle was arranged in disorder with fracture in mice of the model group. Immunohistochemistry and western blot analysis revealed that expression levels of tryptase, chymase, β-catenin, TGF-β and α-SMA were significantly increased in the hyperlipidemia mice compared with the control group.

 Conclusions:

The results indicated that mast cell activation might induce cardiac fibrosis by tryptase and chymase in hyperlipidemia, which had a close relationship with the increased activity of TGF-β/Wnt/β-catenin pathway.

Keywords: Rats Hyperlipidemias / physiopathology Heart Fibrosis Leukemia, Mast-Cell Introduction

Hyperlipidemia refers to hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia and mixed hyperlipidemia, and is a very common biochemical disorder1 with significantly risk of cardiovascular disease.2,3 It is reported that the hyperglycemia, another metabolic disorder, has a strong association with cardiac fibrosis that may reduce myocardial compliance and contribute to the pathogenesis of heart failure.4,5 However, the role of the hyperlipidemia in the development of cardiac fibrosis is poorly understood.

Cardiac fibrosis, which is a common pathologic feature of end-stage heart disease, always results in serious cardiac dysfunction.6,7 Therefore, potential causes of cardiac fibrosis have to be investigated. Although cardiac fibrosis is an important stage in the progression of heart disease, the mechanisms underlying fibrosis development and progression are still unclear. The process of fibrosis is mechanically characterized by myofibroblast accumulation, collagen deposition, extracellular matrix remodeling, and increased tissue stiffness, so that impairs the organ's function by reducing tissue elasticity and compliance. As reported, the Wnt/β-catenin/TGF-β signaling pathway is a key mediator of fibroblast activation8,9 and play important role in driving the aberrant synthesis of the extracellular matrix in heart fibrotic diseases.10,11

Mast cells have been recognized as important effector cells in tissue fibrosis.12,13 Potentially mast cell activation and degranulation could result in the release of inflammatory and profibrotic mediators promoting tissue fibrosis.14 Mast cells express serine proteases: tryptase and chymase, are associated with fibrosis in various diseases.15,16 As reported, hyperlipidemia could skew the transcriptional regulation of pro-inflammatory factors of myeloid cell, including mast cells, to promote myeloid cell extravasation and atherosclerosis.17,18 However, little is known about their involvement in cardiac fibrosis in hyperlipidemia mice.

In this study, we aimed to investigate whether hyperlipidemia is associated with cardiac fibrosis. Furthermore, we evaluated the activity of TGF-β/Wnt/β-catenin pathway, the expression levels of tryptase, chymase and α-SMA in hyperlipidemia mice.

 Methods Declaration of ethics in animals

Eight-week-old C57BL / 6 mice were purchased from the Experimental Animal Center of Dalian Medical University (Dalian, China). Mice were allowed access to water and food ad libitum, but fasted overnight with water available before surgery. All animal experiments were approved by the ethics committee of Dalian Medical University and performed in accordance with the institutional guidelines, and in accordance with the Helsinki Declaration.

 Induction of experimental hyperlipidemia

Via random number table, the animals were divided into two experimental groups (n = 8, for convenience) : control group received a normal diet , and the hyperlipidemia (H-lipid) group received high fat diet (HFD, D12451, Research diet, USA) for 8 weeks. Hyperlipidemia was documented by estimating the level of total cholesterol (TC) and triglycerides (TG) in serum using commercially available kits (Jiancheng Biotech, Nanjing, China).

 Morphological changes

After 8 weeks' high-fat diet, the mice were sacrificed. The hearts of mice were removed, and fixed in 10% (v/v) neutral formalin and processed by standard histological techniques. The hearts were stained with haematoxylin and eosin (H&E) and picrosirius red staining. Then they were examined for the morphological changes. The hearts of mice were also used to determinate expression of protein of chymase, tryptase, TGF-β, β-catenin and α-SMA by western blot analysis and immunohistochemical staining.

 Western blot analysis

According to the manufacturer's instructions, proteins were extracted from mice hearts with protein extraction kit (KeyGen Biotech, Nanjing, China). Protein was measured according to the procedure of bicinchoninic acid (BCA) (Solarbio, Beijing, China), with bovine serum albumin as the standard. Proteins (20 µg) were resuspended in electrophoresis sample buffer containing β-mercaptoethanol and separated by electrophoresis on a pre-cast 10% SDS-polyacrylamide gel (Bio-Rad, Hercules, CA), followed by electrotransfer to a PVDF membrane (Millipore, Bedford, MA). Membranes were blocked using 5% non-fat milk in Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20 (TBST) for 2 h at 37°C. β-actin served as loading control. Membranes were incubated overnight at 4°C with a 1:1000 dilution of polyclonal antibody for tryptase, chymase, TGF-β, β-catenin and α-SMA respectively (Beijing Boisynthesis Biotechnology, China), and with a 1:1500 dilution of monoclonal antibody for β-actin (Beyotime, China). After subsequent washing with TBST, the blots were then incubated with secondary antibodies. After extensive washing with TBST, membranes were exposed to the enhanced chemiluminescence-plus reagents (ECL) from Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China) according to the manufacturer's protocol. Emitted light was documented with a BioSpectrum-410 multispectral imaging system with a Chemi HR camera 410(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Protein bands were visualized and photographed under transmitted ultraviolet light. The image was used for semiquantitative measurements based on band densitometry.

 Immunohistochemical staining

Histological sections of mice hearts (4 µm thick) were mounted on poly-L-lysine-coated slides. Slides were deparaffinized in xylene and rehydrated in graded alcohols. Sections were pretreated with citrate buffer (0.01 mol/L citric acid, pH 6.0) for 20 min at 95 °C. Then, at room temperature, they were immersed in PBS containing 3% H2O2 for 10 min. After exposing them to 10% normal goat serum in PBS for 30 min at room temperature, the tissue sections were incubated at 4°C overnight with rabbit polyclonal anti-α-SMA and TGF-β (dilution 1:100). Then sections were rinsed with PBS, incubated with biotinylated goat anti-rabbit IgG for 20 min at room temperature and treated with 3,30-diaminobenzidine chromogen for 5 min at room temperature. Finally, sections were counterstained with hematoxylin for 6 min.

 Collagen quantification

Picrosirius red staining was performed with serially sectioned tissues. Paraffin-embedded tissues were deparaffinized in xylene, rehydrated in graded alcohols and then incubated in 0.1% Sirius Red solution for 1 h at room temperature. Finally, sections were counterstained with hematoxylin for 2 min. The sections were studied under a light microscope at different magnifications

 Data analysis

Statistical analysis was computed using SPSS 13.0 software. Group data were expressed as mean ± S.D. Shapiro-Wilk test was used to check the normality of the studied data, and, then, parametric or non-parametric tests were used for the analysis of normal or non-normal data distribution, respectively. Data with normal distribution underwent unpaired Student's sample t-test. In all statistical analyses, Two-sided p < 0.05 was considered to indicate a statistically significant result.

 Results Serum biochemistry changed after high-fat diet treatment

Following continuous feeding with high-fat diet for 8 weeks, serum levels of TC and TG in the H-lipid group were significantly higher than the control group (Table 1).

Serum levels of TC and TG after high-fat diet for 8 weeks. (mmol/l)
Group TG TC
Control 0.73 ± 0.12 1.87 ± 0.25
H-lipid 1.21 ± 0.13 3.34 ± 0.33
p value < 0.05 < 0.05

TC: total cholesterol; TG: triglycerides.

 Histological examinations

H&E staining of heart tissues showed that myocardial fibers in control group were in order and their structure was normal. There was no broken fiber, the nucleus of myocardial cell was regular. However, the muscle fiber was arranged in disorder, extensively collapsed and degenerated in hyperlipidemia group (Figure 1).

Change in heart photomicrographs of hyperlipidemic mice. Hearts were stained with H&E (A-B). Representative sections from hearts of a control mouse (A), hyperlipidemic mouse (B). H&E, magnification × 400.

Hyperlipidemia increased mast cell chymase and tryptase production

Since mast cell protease play essential role in fibrosis process, their production levels in the case of hyperlipidemia would be our concern. To investigate this, mice heart were immediately removed after sacrifice for western blot analysis. The results of western blot showed that the protein expressions of chymase and tryptase were increased significantly compared with the control group (Figure 2)

Effect of hyperlipidemia on the protein expression of tryptase, chymase, TGF-β, β-catenin and α-SMA in hyperlipidemic mice's hearts. The bar graph shows the relative expression ratio of each protein calculated after normalization by β-actin. Data are expressed as mean± S.D. (*p < 0.05 vs Control group; n = 8)

Hyperlipidemia promoted activity of TGF-β and WNT/β-catenin pathway.

TGF-β is a pro-fibrotic cytokine that induces proliferation of macrophages and fibroblast through the induction of other growth factors. The Wnt/β-catenin signaling pathway is essential for the fibrosis induced by TGF-β. Western blot analysis of TGF-β and β-catenin showed that increased expression of both proteins were evident in H-lipid group compared to the control group. (Figure 2)

The immunohistochemistry results were similar to the mentioned above. The protein expressions of TGF-β in the mice's hearts of H-lipid group were significantly increased compared with the control group (Figure 3).

Effect of hyperlipidemia on the protein expression of TGF-β in hyperlipidemic mice's hearts. The hearts were immunohistochemical stained (A-B). Representative sections from hearts of a control mouse (A), a hyperlipidemic mouse (B). Immunohistochemical staining, magnification × 400.

Hyperlipidemia induced great collagen accumulation in the heart

Picrosirius red staining suggested significant greater collagen content in the H-lipid group compared with the control groups (Figure 4) moreover, the immunohistochemistry (Figure 5) and western blot (Figure 2) results showed that the expression levels of α-SMA in the heart tissues of the H-lipid group were increased significantly compared with the control group.

Effect of hyperlipidemia on the collagen accumulation in hyperlipidemic mice's hearts. The hearts were picro-sirius red stained (A-B). Representative sections from hearts of a control mouse (A), hyperlipidemic mouse (B). Picro-sirius red staining, magnification ×400.

Effect of hyperlipidemia on the protein expression of α-SMA in hyperlipidemic mice's hearts. The hearts were immunohistochemical stained (A-C). Representative sections from hearts of a control mouse (A), hyperlipidemic mouse (B). Immunohistochemical staining, magnification × 400.

Discussion

Hyperlipidemia is a clinical and metabolic disorder characterized by abnormal elevation of the major circulatory lipid and lipoprotein levels that accounts for approximately 56% cases of cardiovascular diseases worldwide and causes about 4.4 million deaths annually.19 As reported, the death risk from ischemic heart disease is significantly high in patients with essential hyperlipidemia.20

In addition, it was reported that high-calorie diet feeding could induce hyperlipidemia and promoted heart injury and failure in rats.21 However, there is little knowledge about the mechanisms underlying these biological changes. Cardiac fibrosis is a common pathologic feature of end-stage heart disease. Therefore, as potential causes of cardiac fibrosis have to be investigated, we researched whether hyperlipidemia is associated with the cardiac fibrosis progression, contributing to the pathogenesis of heart failure. In the present study, the level of TC and TG in serum was significantly higher in H-lipid group, which indicates that the model of hyperlipidemia mice has been established successfully. Then we investigated the changes in mice heart morphology by H&E staining. The results showed muscular layer of heart arranged in disorder with fracture in mice of the model group. Picrosirius red staining suggested significantly greater collagen content in the H-lipid group compared with the control groups, and western blot showed that the expression level of α-SMA, known as marker of myofibroblast, in H-lipid group was significantly higher than in control group.

Mast cells have been recognized as important effector cells in tissue fibrosis. As reported, mast cells express serine proteases; tryptase and chymase that are associated with fibrosis in various diseases. However, little is known about their involvement in heart disease induced by hyperlipidemia. In our study, the results of western blot showed that the protein expressions of tryptase and chymase in the mice's heart of H-lipid group were increased compared with the control group. To further explore the molecular mechanism of cardiac fibrosis in hyperlipidemia mice, using western blot analysis and immunohistochemical staining, we examined the protein expressions of TGF-β which are intricately linked with the profibrotic effects of mast cells, and the Wnt/β-catenin pathway that is essential for the fibrosis induced by TGF-β. The results of western blot analysis and immunohistochemical staining demonstrated that the protein expressions of TGF-β in the mice's heart of H-lipid group were significantly increased compared with the control group. Moreover, the results of western blot analysis showed that the changed protein expression level of β-catenin was similar to TGF-β.

 Conclusions

In summary, as the pathogenesis indicates, the progression of cardiac fibrosis may be induced by hyperlipidemia. Interestingly, heart tissues from hyperlipidemia mice revealed increased mast sell activation e upregulated activity of TGF-β/Wnt/β-catenin pathway. The results of this study demonstrated that the mast cells and TGF-β/Wnt/β-catenin pathway were not only very important for the cardiac tissue fibrosis in hyperlipidemia but also a possible target for therapy.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 References 1 Thinn Hlaing T, Park A. Hyperlipidemia. Medicine. 2013;41(10):607-9. Thinn Hlaing T Park A Hyperlipidemia Medicine 2013 41 10 607 609 2 Ansell, Benjamin J. Current world literature: hyperlipidaemia and cardiovascular disease. Curr Opin Lipidol. 2013;24(4):357-62. doi: 10.1097/MOL.0b013e328363a73b. Ansell Benjamin J Current world literature hyperlipidaemia and cardiovascular disease Curr Opin Lipidol 2013 24 4 357 362 10.1097/MOL.0b013e328363a73b 3 Peter R, Bajwa H, Anthony S. Hyperlipidemia and cardiovascular disease - newer antihyperglycaemic agents and cardiovascular disease. Curr Opin Lipidol. 2013;24(2):189-90. doi: 10.1097/MOL.0b013e32835ec5f5. Peter R Bajwa H Anthony S Hyperlipidemia and cardiovascular disease - newer antihyperglycaemic agents and cardiovascular disease Curr Opin Lipidol 2013 24 2 189 190 10.1097/MOL.0b013e32835ec5f5 4 Adebiyi OA, Adebiyi OO, Owira PM. Naringin reduces hyperglycemia-induced cardiac fibrosis by relieving oxidative stress. PLoS One. 2016;11(3):e0149890. doi: 10.1371/journal.pone.0149890. Adebiyi OA Adebiyi OO Owira PM Naringin reduces hyperglycemia-induced cardiac fibrosis by relieving oxidative stress PLoS One 2016 11 3 e0149890 10.1371/journal.pone.0149890 5 Russo I, Frangogiannis NG. Diabetes-associated cardiac fibrosis: cellular effectors, molecular mechanisms and therapeutic opportunities. J Mol Cell Cardiol. 2016;90:84-93. doi: 10.1016/j.yjmcc.2015.12.011. Russo I Frangogiannis NG Diabetes-associated cardiac fibrosis cellular effectors, molecular mechanisms and therapeutic opportunities J Mol Cell Cardiol 2016 90 84 93 10.1016/j.yjmcc.2015.12.011 6 Fan D, Takawale A, Lee J, Kassiri Z. Cardiac fibroblasts, fibrosis and extracellular matrix remodeling in heart disease. Fibrogenesis Tissue Repair. 2012;5(1):15. doi: 10.1186/1755-1536-5-15. Fan D Takawale A Lee J Kassiri Z Cardiac fibroblasts, fibrosis and extracellular matrix remodeling in heart disease Fibrogenesis Tissue Repair 2012 5 1 15 15 10.1186/1755-1536-5-15 7 Kania G, Blyszczuk P, Eriksson U. Mechanisms of cardiac fibrosis in inflammatory heart disease. Trends Cardiovasc Med. 2009;19(8):247-52. doi: 10.1016/j.tcm.2010.02.005. Kania G Blyszczuk P Eriksson U Mechanisms of cardiac fibrosis in inflammatory heart disease Trends Cardiovasc Med 2009 19 8 247 252 10.1016/j.tcm.2010.02.005 8 Chen D, Jarrell A, Guo C, Lang R, Atit R. Dermal β-catenin activity in response to epidermal Wnt ligands is required for fibroblast proliferation and hair follicle initiation. Development. 2012;139(8):1522-33. doi: 10.1242/dev.076463. Chen D Jarrell A Guo C Lang R Atit R Dermal β-catenin activity in response to epidermal Wnt ligands is required for fibroblast proliferation and hair follicle initiation Development 2012 139 8 1522 1533 10.1242/dev.076463 9 Zerr P, Palumbo-Zerr K, Huang J, Tomcik M, Sumova B, Distler O, et al. Sirt1 regulates canonical TGF-[beta] signalling to control fibroblast activation and tissue fibrosis. Ann Rheum Dis. 2016;75(1):226-33. doi: 10.1136/annrheumdis-2014-205740. Zerr P Palumbo-Zerr K Huang J Tomcik M Sumova B Distler O Sirt1 regulates canonical TGF-[beta] signalling to control fibroblast activation and tissue fibrosis Ann Rheum Dis 2016 75 1 226 233 10.1136/annrheumdis-2014-205740 10 Wang S, Meng XM, Ng YY, Ma FY, Zhou S, Zhang Y, et al. TGF-β/Smad3 signalling regulates the transition of bone marrow-derived macrophages into myofibroblasts during tissue fibrosis. Oncotarget. 2016;7(8):8809-22. doi: 10.18632/oncotarget.6604. Wang S Meng XM Ng YY Ma FY Zhou S Zhang Y TGF-β/Smad3 signalling regulates the transition of bone marrow-derived macrophages into myofibroblasts during tissue fibrosis Oncotarget 2016 7 8 8809 8822 10.18632/oncotarget.6604 11 Blyszczuk P, Müller-Edenborn B, Valenta T, Osto E, Stellato M, Behnke S, et al. Transforming growth factor-β-dependent Wnt secretion controls myofibroblast formation and myocardial fibrosis progression in experimental autoimmune myocarditis. Eur Heart J. 2017;38(18):1413-25. doi: 10.1093/eurheartj/ehw116. Blyszczuk P Müller-Edenborn B Valenta T Osto E Stellato M Behnke S Transforming growth factor-β-dependent Wnt secretion controls myofibroblast formation and myocardial fibrosis progression in experimental autoimmune myocarditis Eur Heart J 2017 38 18 1413 1425 10.1093/eurheartj/ehw116 12 Madjene LC, Pons M, Danelli L, Claver J, Ali L, Madera-Salcedo IK, et al. Mast cells in renal inflammation and fibrosis: lessons learnt from animal studies. Mol Immunol. 2015;63(1):86-93. doi: 10.1016/j.molimm.2014.03.002. Madjene LC Pons M Danelli L Claver J Ali L Madera-Salcedo IK Mast cells in renal inflammation and fibrosis lessons learnt from animal studies Mol Immunol 2015 63 1 86 93 10.1016/j.molimm.2014.03.002 13 Silver RB. Role of mast cells in renal fibrosis. Kidney Int. 2013;84(1):214. doi: 10.1038/ki.2013.72. Silver RB Role of mast cells in renal fibrosis Kidney Int 2013 84 1 214 214 10.1038/ki.2013.72 14 Summers SA, Gan PY, Dewage L, Ma FT, Ooi JD, O'Sullivan KM, et al. Mast cell activation and degranulation promotes renal fibrosis in experimental unilateral ureteric obstruction. Kidney Int. 2012;82(6):676-85. doi: 10.1038/ki.2012.211. Summers SA Gan PY Dewage L Ma FT Ooi JD O'Sullivan KM Mast cell activation and degranulation promotes renal fibrosis in experimental unilateral ureteric obstruction Kidney Int 2012 82 6 676 685 10.1038/ki.2012.211 15 Gaca MD, Arthur MJ, Benyon RC. Mast cell protease and stem cell factor expression in rat liver fibrosis. J Hepatol. 1998;28(Suppl):81. doi: 10.1016/50168-8278(98)80523-0. Gaca MD Arthur MJ Benyon RC Mast cell protease and stem cell factor expression in rat liver fibrosis J Hepatol 1998 28 Suppl 81 81 10.1016/50168-8278(98)80523-0 16 Yadav A, Desai RS, Bhuta BA, Singh JS, Mehta R, Nehete AP. Altered immunohistochemical expression of mast cell tryptase and chymase in the pathogenesis of oral submucous fibrosis and malignant transformation of the overlying epithelium. Plos One. 2014;9(5):e98719. doi: 10.1371/journal.pone.0098719. Yadav A Desai RS Bhuta BA Singh JS Mehta R Nehete AP Altered immunohistochemical expression of mast cell tryptase and chymase in the pathogenesis of oral submucous fibrosis and malignant transformation of the overlying epithelium Plos One 2014 9 5 e98719 10.1371/journal.pone.0098719 17 Soehnlein O, Drechsler M, Hristov M, Weber C. Functional alterations of myeloid cell subsets in hyperlipidemia: relevance for atherosclerosis. J Mol Cell Cardiol. 2009;13(11-12):4293-303. doi: 10.1111/j.1582-4934.2009.00965.x. Soehnlein O Drechsler M Hristov M Weber C Functional alterations of myeloid cell subsets in hyperlipidemia relevance for atherosclerosis J Mol Cell Cardiol 2009 13 11-12 4293 4303 10.1111/j.1582-4934.2009.00965.x 18 Spinas E; Kritas SK; Saggini A; Mobili A; Caraffa A; Antinolfi P; Pantalone A, et al. Role of mast cells in atherosclerosis: a classical inflammatory disease. Int J Immunopathol Pharmacol. 2014;27(4):517-21. doi: 10.1177/039463201402700407. Spinas E Kritas SK Saggini A Mobili A Caraffa A Antinolfi P Pantalone A Role of mast cells in atherosclerosis a classical inflammatory disease Int J Immunopathol Pharmacol 2014 27 4 517 521 10.1177/039463201402700407 19 Adeneye AA, Adeyemi OO, Agbaje EO. Anti-obesity and antihyperlipidaemic effect of Hunteria umbellata seed extract in experimental hyperlipidemia. J Ethnopharmacol. 2010;130(2):307-14. doi: 10.1016/j.jep.2010.05.009.. Adeneye AA Adeyemi OO Agbaje EO Anti-obesity and antihyperlipidaemic effect of Hunteria umbellata seed extract in experimental hyperlipidemia J Ethnopharmacol 2010 130 2 307 314 10.1016/j.jep.2010.05.009. 20 Slack J, Nevin NC. Hyperlipidaemic xanthomatosis. I. Increased risk of death from ischaemic heart disease in first degree relatives of 53 patients with essential hyperlipidemia and xanthomatosis. J Med Genet. 1968;5(1):4-8. PMID: 5653869. Slack J Nevin NC Hyperlipidaemic xanthomatosis. I. Increased risk of death from ischaemic heart disease in first degree relatives of 53 patients with essential hyperlipidemia and xanthomatosis J Med Genet 1968 5 1 4 8 5653869 21 Liao PH, Kuo WW, Kuo CH, Yeh YL, Shen CY, Cheng YH, et al. Lactobacillus reuteri GMNL-263 reduces hyperlipidemia and the heart failure process in high-calorie diet-fed induced heart dysfunction in rats. J Funct Foods. 2016;20:226-35. Liao PH Kuo WW Kuo CH Yeh YL Shen CY Cheng YH Lactobacillus reuteri GMNL-263 reduces hyperlipidemia and the heart failure process in high-calorie diet-fed induced heart dysfunction in rats J Funct Foods 2016 20 226 235 Artigos Originais Grande Acúmulo de Colágeno e Aumento da Ativação de Mastócitos nos Corações de Ratos com Hiperlipidemia Cheng Yunpeng 1 Zhu Yanqiu 2 Zhang Jiashu 3 Duan Xingping 3 Zhang Ying 1 Department of Cardiology - the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University Department of Ultrasonics - Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University College of Pharmacy - Dalian Medical University - China Correspondência: Ying Zhang. 116044, Dalian, Liaoning - China. E-mail: zhangying_xn@163.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito: Cheng Y; Obtenção de dados, Análise e interpretação dos dados e Análise estatística: Cheng Y, Zhu Y, Zhang J, Duan X; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Cheng Y, Zhu Y.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

A hiperlipidemia, que se caracteriza por uma elevação dos lipídeos na corrente sanguínea, é um importante fator de risco para a doença cardíaca.

 Objetivos:

O presente estudo investigou o papel da fibrose na progressão da hiperlipidemia no coração do rato e se a ativação dos mastócitos estava associada ao processo de fibrose.

 Método:

A hiperlipidemia foi produzida em ratos C57BL/6 alimentando-os com uma dieta rica em gordura durante 8 semanas. Para avaliar a fibrose tecidual, foi realizada coloração vermelha picro-Sirius. A coloração com hematoxilina e eosina (H & E) foi feita para identificar as alterações histopatológicas nos corações. A imuno-histoquímica também foi levada a cabo para determinar a localização do fator de crescimento transformante (TGF) -β e α-actina do músculo liso (α-SMA). O Western Blot foi realizado para analisar as expressões de quimase, triptase, TGF-β, α-SMA e a atividade da via Wnt / β-catenina. Finalmente, se mediram os níveis séricos de colesterol total (TC) e triglicerídeos (TG). Todos os valores foram expressos como média ± DP, o nível de significância estatística adotado foi de 5%.

 Resultados:

Os ratos hiperlipidêmicos mostraram aumento significativo da deposição de colágeno nos corações em comparação com ratos normais. Além disso, a coloração de H & E mostrou degeneração celular significativa. O músculo cardíaco estava em desordem com ruptura de fibras em ratos do grupo modelo. A análise imuno-histoquímica e o Western Blot revelaram que os níveis de expressão de triptase, quimase, β-catenina, TGF-β e α-SMA estavam significativamente aumentados nos ratos hiperlipidêmicos em comparação com o grupo controle.

 Conclusões:

Os resultados indicaram que a ativação de mastócitos pode induzir fibrose cardíaca por triptase e quimase em hiperlipidemia, a qual teve uma relação estreita com a atividade aumentada da via TGF-β / Wnt / β-catenina.

 Palavras-chave: Ratos Hioperlipidemias / fisiopatologia Coração Fibrose Leucemia de Mastócitos Introdução

A hiperlipidemia se refere à hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hiperlipidemia mista e é um distúrbio bioquímico muito comum1 com risco significativo de doença cardiovascular.2,3 É relatado que a hiperglicemia, outra desordem metabólica, tem uma forte associação com a fibrose cardíaca que pode reduzir a distensibilidade miocárdica e contribuir para a patogênese da insuficiência cardíaca.4,5 No entanto, o papel da hiperlipidemia no desenvolvimento de fibrose cardíaca é pouco compreendido.

A fibrose cardíaca, que é uma característica patológica comum da doença cardíaca em estágio final, sempre resulta em disfunção cardíaca grave.6,7 Portanto, as causas potenciais da fibrose cardíaca devem ser investigadas. Embora a fibrose cardíaca seja um estágio importante na progressão da doença cardíaca, os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e progressão dela ainda não são claros. O processo de fibrose é mecanicamente caracterizado por acumulação de miofibroblasto, deposição de colágeno, remodelação da matriz extracelular e aumento da rigidez do tecido, de modo que prejudica a função do órgão, reduzindo a elasticidade e distensibilidade do tecido. Conforme relatado, a via de sinalização Wnt / β-catenina / TGF-β é um mediador chave da ativação de fibroblastos8,9 e desempenha um papel importante na condução da síntese aberrante da matriz extracelular em doenças fibróticas cardíacas.10,11

Os mastócitos foram reconhecidos como importantes células efetoras na fibrose tecidual.12,13 Potencialmente a ativação e desgranação de mastócitos podem resultar na liberação de mediadores inflamatórios e profibróticos que promovam a fibrose tecidual.14 Os mastócitos expressam proteases de serina, triptase e quimase que estão associadas à fibrose em várias doenças.15,16 Conforme relatado, a hiperlipidemia pode distorcer a regulação transcricional dos fatores pró-inflamatórios da célula mieloide, incluindo os mastócitos, para promover o extravasamento e a aterosclerose das células mieloides.17,18 No entanto, pouco se sabe sobre o envolvimento deles na fibrose cardíaca em ratos com hiperlipidemia.

Neste estudo, buscamos pesquisar se a hiperlipidemia está associada à fibrose cardíaca. Além disso, avaliamos a atividade da via TGF-β / Wnt / β-catenina, os níveis de expressão de triptasa, quimase e α-SMA em ratos hiperlipidêmicos.

 Métodos Declaração de ética em animais

Os ratos C57BL/6 de oito semanas de idade foram comprados no Centro Experimental Animal da Universidade Médica de Dalian (Dalian, China). Os ratos podiam acessar a água e os alimentos ad libitum, mas jejuavam durante a noite com água disponível antes da cirurgia. Todas as experiências em animais foram aprovadas pelo comitê de ética da Dalian Medical University e realizadas de acordo com as diretrizes institucionais e de acordo com a Declaração de Helsinque.

 Indução de hiperlipidemia experimental

Por meio da tabela de números aleatórios, os animais foram divididos em dois grupos experimentais (n = 8, por conveniência): o grupo controle recebeu uma dieta normal e o grupo de hiperlipidemia (lípidos H) recebeu dieta rica em gordura (HFD, D12451, Dieta de pesquisa, EUA) durante 8 semanas. A hiperlipidemia foi documentada estimando o nível de colesterol total (TC) e triglicerídeos (TG) no soro usando kits comercialmente disponíveis (Jiancheng Biotech, Nanjing, China).

 Alterações morfológicas

Após 8 semanas de dieta rica em gordura, os ratos foram sacrificados. Os corações dos ratos foram removidos e fixados em formalina neutra 10% (v/v) e processados por técnicas histológicas padrão. Os corações foram corados com hematoxilina e eosina (H & E) e picro-Sirius. Em seguida, foram examinadas as alterações morfológicas. Os corações de ratos também foram usados para determinar a expressão proteica de quimase, triptase, TGF-β, β-catenina e α-SMA por análise Western Blot e coloração imuno-histoquímica.

 Análise Western Blot

De acordo com as instruções do fabricante, as proteínas foram extraídas dos corações de ratos com kit de extração de proteína (KeyGen Biotech, Nanjing, China). A proteína foi medida de acordo com o procedimento de ácido bicinconínico (BCA) (Solarbio, Pequim, China), com albumina de soro bovino como padrão. As proteínas (20 µg) foram ressuspensas em tampão de amostra de eletroforese contendo β-mercaptoetanol e separadas por eletroforese num gel SDS-poliacrilamida 10% pré-moldado (Bio-Rad, Hercules, CA), seguido de transferência eletrônica a uma membrana PVDF (Millipore, Bedford, MA). As membranas foram bloqueadas usando 5% de leite sem gordura em solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20 (TBST) durante 2h a 37°C. A β-Actina serviu como controle de carga. As membranas foram incubadas durante a noite a 4°C com uma diluição 1: 1000 de anticorpo policlonal para triptase, quimase, TGF-β, β-catenina e α-SMA, respectivamente (Pequim Boisynthesis biotechnology, China) e com uma diluição de 1: 1500 de anticorpo monoclonal para a β-actina (Beyotime, China). Após a lavagem subsequente com TBST, foram então incubadas com anticorpos secundários. Após uma extensa lavagem com TBST, as membranas foram expostas aos reagentes mais avançados de quimioluminiscência (ECL) do Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, China) de acordo com o protocolo do fabricante. A luz emitida foi documentada com um sistema de imagem multiespectral BioSpectrum-410 com uma câmera Chemi HR 410 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As bandas de proteínas foram visualizadas e fotografadas sob luz ultravioleta transmitida. A imagem foi utilizada para medições semiquantitativas com base na densitometria de banda.

 Coloração imuno-histoquímica

Seções histológicas de corações de ratos (4 µm de espessura) foram montadas em lâminas revestidas de poli-L-lisina. As lâminas foram desparafinadas em xileno e reidratadas em álcoois graduados. As seções foram pré-tratadas com solução reguladora de citrato (0,01 mol/L de ácido cítrico, pH 6,0) durante 20 min a 95°C. Em seguida, à temperatura ambiente foram imersos em PBS contendo 3% de H2O2 durante 10 min. Depois de expô-las a 10% de soro de cabra normal em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, as seções de tecido foram incubadas a 4°C durante a noite com anti-α-SMA e TGF-β policlonais de coelho (diluição 1: 100). Em seguida, seções foram enxaguadas com PBS, incubadas com anticorpo de coelho-anti IgG de cabrabiotinilada durante 20 minutos à temperatura ambiente e tratadas com cromogênio de 3,30-diaminobenzidina durante 5 min à temperatura ambiente. Finalmente, as seções foram contrastadas com hematoxilina durante 6 min.

 Quantificação de colágeno

Foi realizada coloração vermelha de picro-Sirius em tecidos seccionados em série. Os tecidos embebidos em parafina foram desparafinados em xileno, reidratados em álcoois graduados e depois incubados em vermelho Sirius 0,1% durante 1 h à temperatura ambiente. Finalmente, as seções foram contrastadas com hematoxilina durante 2 min. As seções foram estudadas sob um microscópio de luz em diferentes ampliações.

 Análise de dados

A análise estatística foi calculada usando o software SPSS 13.0. Os dados do grupo foram expressos como média ± S.D. O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para verificar a normalidade dos dados estudados e, então, foram utilizados testes paramétricos ou não paramétricos para análise de distribuição de dados normal ou não normal, respectivamente. Os dados com distribuição normal foram submetidos à teste t de Student da amostra. Em todas as análises estatísticas, p < 0,05 de dois lados foi considerado para indicar um resultado estatisticamente significante.

 Resultados A bioquímica sérica mudou após o tratamento com dieta rica em gordura

Após a alimentação contínua com dieta rica em gordura durante 8 semanas, os níveis séricos de TC e TG no grupo H-lipídico foram significativamente maiores que os do grupo controle (Tabela 1).

Níveis séricos de TC e TG após dieta rica em gordura durante 8 semanas. (mmol/l)
Grupo TG TC
Controle 0,73 ± 0,12 1,87 ± 0,25
H-lípido 1,21 ± 0,13 3,34 ± 0,33
Valor de p < 0,05 < 0,05

TC: colesterol total; TG: triglicerídeos.

 Exames histológicos

A coloração H & E de tecidos do coração mostraram que as fibras do miocárdio no grupo de controle estavam em ordem e a sua estrutura era normal. Não houve fibra rompida, o núcleo da célula do miocárdio estava normal. No entanto, a fibra muscular estava disposta em desordem, amplamente colapsada e degenerada no grupo hiperlipidemia (Figura 1).

Mudança em microfotografias cardíacas de ratos hiperlipidêmicos. Os corações foram corados com H & E (A-B). Seções representativas dos corações de um rato de controle (A), rato hiperlipidêmico (B). H & E, ampliação × 400.

Hiperlipidemia aumenta a produção da quimase e triptase de mastócitos

Desde que a protease dos mastócitos desempenha um papel essencial no processo de fibrose, seus níveis de produção no caso de hiperlipidemia seria a nossa preocupação. Para investiga-la, corações de ratos foram removidos imediatamente após o sacrifício para análise de Western blot. Os resultados do Western blot mostraram que a expressão de proteínas de quimase e triptase estava significativamente aumentada em comparação com o grupo de controle (Figura 2)

Efeito da hiperlipidemia na expressão proteica da triptase, da quimase, do TGF-β, da β-catenina e da α-SMA nos corações dos ratos hiperlipidêmicos. O gráfico de barras mostra a relação de expressão relativa de cada proteína calculada após a normalização por β-actina. Os dados são expressos como média ± SD. (*p < 0,05 versus grupo controle; n = 8).

Hiperlipidemia promoveu atividade de TGF-β e via Wnt/ β-catenina

TGF-β é uma citocina pró-fibrótica que induz a proliferação de fibroblastos e macrófagos, por meio da indução de outros fatores de crescimento. A via de sinalização / β-catenina Wnt é essencial para a fibrose induzida por TGF-β. A análise de Western blot de TGF-β e β-catenina mostrou um aumento da expressão de ambas as proteínas que era evidente no grupo H-lípido comparado com o grupo de controle. (Figura 2).

Os resultados de imuno-histoquímica foram semelhantes aos mencionados acima. As expressões proteicas de TGF-β em corações do grupo H-lipídico dos ratos estavam significativamente aumentadas em comparação com o grupo de controle (Figura 3).

Efeito da hiperlipidemia na expressão proteica de TGF-β nos corações dos ratos hiperlipidêmicos. Os corações foram imunohistoquímicamente corados (A-B). Seções representativas dos corações de um rato de controle (A), um rato hiperlipidêmico (B). Coloração imuno-histoquímica, ampliação × 400.

A hiperlipidemia induziu grande deposição de colágeno no coração

A coloração picro-Sirius vermelha sugeriu significativo maior teor de colágeno no grupo H-lípido, quando comparado com os grupos de controle (figura 4). Além disso, os resultados da imuno-histoquímica (Figura 5) e do Western blot (Figura 2) mostraram que os níveis de expressão de α-SMA no tecido do coração do grupo H-lípido estavam significativamente aumentados em comparação com o grupo de controle.

Efeito da hiperlipidemia na acumulação de colágeno nos corações dos ratos hiperlipidêmicos. Os corações foram corados com picro-Sirius vermelho (A-B). Seções representativas dos corações de um rato de controle (A), rato hiperlipidêmico (B). Picro-Sirius coloração vermelha, ampliação × 400.

Efeito da hiperlipidemia na expressão proteica de α-SMA em corações de ratos hiperlipidêmicos. Os corações foram imunohistoquimicamente corados (A-C). Seções representativas dos corações de um rato de controle (A), rato hiperlipidêmico (B). Coloração imuno-histoquímica, ampliação × 400.

Discussão

A hiperlipidemia é um distúrbio clínico e metabólico caracterizado pela elevação anormal dos principais lipídeos circulatórios e dos níveis de lipoproteínas que representa aproximadamente 56% dos casos de doenças cardiovasculares no mundo e causa ao redor de 4,4 milhões de mortes anuais.19 Como foi informado, o risco de morte por cardiopatia isquêmica é significativamente alto em pacientes com hiperlipidemia essencial.20

Além disso, relatou-se que a dieta de alto conteúdo calórico poderia induzir hiperlipidemia e promover a lesão cardíaca e a insuficiência em ratos.21 Há porém, pouco conhecimento sobre os mecanismos subjacentes nestas mudanças biológicas. A fibrose cardíaca é uma característica patológica comum da doença cardíaca em estágio final. Portanto, como as causas potenciais da fibrose cardíaca devem ser investigadas, pesquisamos se a hiperlipidemia está associada à progressão da fibrose cardíaca, contribuindo para a patogênese da insuficiência cardíaca. No presente estudo, o nível de TC e TG no soro foi significativamente maior no grupo H-lipídico, o que indica que o modelo de ratos com hiperlipidemia foi estabelecido com sucesso. Em seguida, pesquisamos as alterações na morfologia cardíaca dos ratos por coloração H & E. Os resultados mostraram uma camada muscular do coração disposta em desordem com ruptura em ratos do grupo modelo. A coloração vermelha de picro-Sirius sugeriu um teor de colágeno significativamente maior no grupo H-lipídico em comparação com os grupos controle, e o Western Blot mostrou que o nível de expressão de α-SMA, conhecido como marcador de miofibroblasto, no grupo lipídeos foi significativamente maior do que no grupo de controle. Os mastócitos foram reconhecidos como importantes células efetoras na fibrose tecidual. Conforme relatado, os mastócitos expressam proteases de serina; triptase e quimase as quais estão associadas à fibrose em várias doenças. No entanto, pouco se sabe sobre seu envolvimento em doenças cardíacas induzidas por hiperlipidemia. No nosso estudo, os resultados de Western blot mostraram que as expressões proteicas de triptase e de quimase no coração de ratos do grupo H-lipídico estavam aumentadas em comparação com o grupo controle. Para explorar ainda mais o mecanismo molecular da fibrose cardíaca em ratos de hiperlipidemia, utilizando análise Western Blot e coloração imuno-histoquímica, examinamos as expressões proteicas de TGF-β que estão intrincadamente ligadas aos efeitos profibróticos dos mastócitos e a via Wnt / β-catenina que é essencial para a fibrose induzida por TGF-β. Os resultados da análise Western Blot e da coloração imuno-histoquímica demonstraram que as expressões proteicas de TGF-β no coração do grupo de ratos H-lípidos aumentaram significativamente em comparação com o grupo controle. Além disso, os resultados da análise Western Blot mostraram que o nível de expressão de proteína alterada de β-catenina era semelhante ao TGF-β.

 Conclusões

Em resumo, como a patogênese indica, a progressão da fibrose cardíaca pode ser induzida por hiperlipidemia. De modo interessante, os tecidos cardíacos de ratos hiperlipidêmicos revelaram aumento da ativação de mastócitos e atividade aumentada da via TGF-β / Wnt / β-catenina. Os resultados deste estudo demonstraram que os mastócitos e a via TGF-β / Wnt / β-catenina não eram apenas muito importantes para a fibrose do tecido cardíaco na hiperlipidemia, mas também um possível alvo para a terapia.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.