Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC YzSwsXhqFz7nwytHb3JJkVf S0066-782X2017001300275 10.5935/abc.20170139 Editorial G-Proteins Agonists and NO/cGMP Blockers: Unexplored Frontiers in the Pharmaceutical Industry Evora Paulo Roberto B. Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Departamento de Cirurgia e Anatomia São Paulo SP Brazil Departamento de Cirurgia e Anatomia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Universidade de São Paulo Mailing Address: Paulo Roberto B. Evora, Rua Rui Barbosa, 367 apt.15. CEP 14015-120, Ribeirão Preto, SP - Brazil. E-mail: prbevora@gmail.com 10 2017 109 4 275 276 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Keywords GTP-Binding Proteins Nitric Oxide Endothelial Cells Technology Pharmaceutical Reference Drugs

Two unexplored therapeutic frontiers the pharmaceutical industry still must address: 1) to answer the questions about the G-proteins’ signal transduction to keep the NO release normal, and 2) to block the amine-resistant inflammatory vasoplegia mediated by NO overproduction. It is important to remember that two Nobel prizes are involved.

G-proteins: potential therapeutic role

The release of nitric oxide (NO) can occur by different pathways involving G-proteins. The Gi-protein is responsible for the mediation of inhibitory effects of receptors in the adenylate cyclase and guanylate cyclase pathways. An early stage of the majority of the responses mediated by receptors is the activation of G-proteins in the cell membrane, which is the target of the modulation of a variety of intracellular events. The role of G-proteins in the pathophysiology of vasospasm after global ischemia and reperfusion is still a matter of investigations. Their participation was documented in a comparative study of vascular relaxation induced by sodium fluoride, which produces biphasic responses in human, bovine, and porcine coronary arteries, causing an endothelium-dependent relaxation and an endothelium-independent contraction. G-protein dysfunction in the endothelium has also been postulated as responsible for the endothelial dysfunction in conditions of endothelial cell regeneration after injury, atherosclerosis, and coronary vasospasm. Myocardial ischemia and reperfusion selectively impair receptor-mediated NO release. However, the ability of the endothelial cell to produce NO or generate endothelium-dependent relaxation to nonnitric oxide-dependent agonists remains intact.1,2

In summary: 1. Endothelial cells maintain their capacity to release NO based on their ability in receiving the transduction signal through the membrane; 2. G-proteins have a fundamental role in the signal transduction; 3. This paradigm is extended to all vasotonic cardiovascular diseases that coexist with platelet dysfunction. These data would be highly relevant in the research of G-protein-targeting drugs.

 The cGMP/cAMP “crosstalk” is underestimated

At present, clinical management of inflammatory vasoplegia associated with sepsis or anaphylaxis is symptomatic. Volume is expanded using administration of fluids, and low blood pressure is managed using administration of positive inotropes and vasoconstrictors. However, circulatory shock is frequently refractory to high amine concentrations.

Since 1994, blockade of guanylate cyclase by methylene blue (MB) in distributive shock has been the subject of study in our Laboratory of Endothelial Function and has been clinically used by the Cardiovascular Surgery Group, both at Ribeirao Preto Medical School of the University of Sao Paulo (FMRP-USP). There is strong evidence that MB, a guanylate cyclase inhibitor, is a therapeutic option for the treatment of the vasoplegic syndrome. Based on our clinical and laboratory experience, accumulated over a period of 20 years, classic concepts about the use of MB in this condition have been established: 1) Heparin and ACE inhibitors are risk factors; 2) At recommended doses, MB is considered a safe drug (the lethal dose is 40 mg/kg); 3) MB does not cause endothelial dysfunction; 4) The effects of MB appear only in the case of nitric oxide (NO) upregulation; 5) MB is not a vasoconstrictor per se; by blocking the cGMP system, it "releases" the cAMP system in a kind of “crosstalk”, facilitating the vasoconstrictor effect of noradrenaline; 6) The most commonly used dosage is 2 mg/kg intravenous bolus followed by continuous infusion, since plasma concentration decreases markedly in the first 40 minutes; 7) There is a possible "window of opportunity" for the effectiveness of the MB.3-5

In this milieu, one main question comes up: ‘What can we do when circulatory shock becomes refractory to the classical therapeutic measures including fluid administration, inotropes, and vasoconstrictors? Responses to this question are currently limited to the accumulated evidence regarding three cAMP-independent vasoconstriction mechanisms: 1) cGMP/NO-dependent vasoconstriction (the most important mechanism); 2) vasopressin administration and; 3) hyperpolarization-dependent vasoconstriction. Why these therapeutic alternatives do not always work?’ We believe that there are at least, five aspects pertaining to this inquiry: 1) The lack of consideration of existing ‘guidelines’ or ‘evidence based medicine’ regarding the accepted treatment options available; 2) lack of knowledge of different vasodilatation mechanisms; 3) the possibility of a crosstalk between different vasodilatation mechanisms; 4) the soluble guanylyl cyclase (sGC) enzymatic activity and; 5) the common use of MB as a ‘rescue’ or ‘ultimate’ therapeutic attempt.6

Although there are no definitive multicentric studies, the use of MB is currently the unique, safest, cheapest treatment option for vasoplegic syndrome in cardiac surgery. Nevertheless, the MB "affair” masks the real problem of vasoplegic endothelial dysfunction, whose blockade could be the target of current drugs other than MB.

However, in the scope of an editorial, it must be considered that there is no simple answer to the questions addressed above, since there are multiple factors that influence the decision making in multimillion dollar investments. Even considering the actual and potentialy clinical benefits, one must consider the patent situation of the product and its development, as well as the potential of present and future market. In addition, according to executives of the pharmaceutical industry, there is also a possible competition for funding that often entails internal competition between many lines of research.

These considerations would be speculative, but in our opinion the pharmaceutical industry owes us explanations on: 1) questions about the G-proteins signal transduction to keep NO release normal, and 2) blockage of the amine-resistant inflammatory vasoplegia mediated by NO overproduction. It is important to remember that two Nobel prizes are involved (Figure 1).

Endothelial nitric oxide synthase converts L-arginine to nitric oxide, which activates guanylate cyclase, responsible for the conversion of GTP to cGMP that causes endothelium-dependent vasodilatation commonly associated with circulatory shock mediated by membrane receptors (Adapted from Evora & Simon; Ann Allergy Asthma Immunol. 2007;99:306-313.)<xref ref-type="bibr" rid="B7">7</xref>

References 1 Evora PR, Pearson PJ, Schaff HV. Impaired endothelium-dependent relaxation after coronary reperfusion injury: evidence for G-protein dysfunction. Ann Thorac Surg. 1994;57(6):1550-6 PMID: 8010801 Evora PR Pearson PJ Schaff HV Impaired endothelium-dependent relaxation after coronary reperfusion injury: evidence for G-protein dysfunction Ann Thorac Surg 1994 1550 1556 57 6 1550 1556 8010801 2 Evora PR, Nobre F. The role of G-proteins in the pathophysiology of the cardiovascular diseases. Arq Bras Cardiol. 1999;72(2):209-29. PMID: 10488580 Evora PR Nobre F The role of G-proteins in the pathophysiology of the cardiovascular diseases Arq Bras Cardiol 1999 209 229 72 2 209 229 10488580 3 Evora PR, Ribeiro PJ, Vicente WV, Reis CL, Rodrigues AJ, Menardi AC, Alves Junior L, Evora PM, Bassetto S. Methylene blue for vasoplegic syndrome treatment in heart surgery: fifteen years of questions, answers, doubts and certainties.Rev Bras Cir Cardiovasc. 2009;24(3):279-88. PMID:20011872. Evora PR Ribeiro PJ Vicente WV Reis CL Rodrigues AJ Menardi AC Alves L Junior Evora PM Bassetto S Methylene blue for vasoplegic syndrome treatment in heart surgery: fifteen years of questions, answers, doubts and certainties Rev Bras Cir Cardiovasc 2009 24 3 279 288 20011872 4 Evora PR, Alves Jr L, Ferreira CA, Menardi AC, Bassetto S, Rodrigues AJ, et al. Twenty years of vasoplegic syndrome treatment in heart surgery. Methylene blue revised. Rev Bras Cir Cardiovasc. 2015;30(1):84-92. Doi: 10.5935/1678-9741.20140115. Evora PR Alves L Jr Ferreira CA Menardi AC Bassetto S Rodrigues AJ Twenty years of vasoplegic syndrome treatment in heart surgery. Methylene blue revised Rev Bras Cir Cardiovasc 2015 30 1 84 92 10.5935/1678-9741.20140115 5 Evora PR, Rodrigues AJ, Vicente WV, Vicente YA, Basseto S, Basile Filho A, et al. Is the cyclic GMP system underestimated by intensive care and emergency teams? Med Hypotheses. 2007;69(3):564-7. PMID: 17363182. Evora PR Rodrigues AJ Vicente WV Vicente YA Basseto S Basile A Filho Is the cyclic GMP system underestimated by intensive care and emergency teams? Med Hypotheses 2007 69 3 564 567 17363182 6 Calil I, Tineli RA, Vicente WV, Rodrigues AJ, Evora PR. The concept of crosstalk and its implications for cardiovascular function and disease. Arq Bras Cardiol. 2007;88(1):e26-31 PMID: 17364108 Calil I Tineli RA Vicente WV Rodrigues AJ Evora PR. The concept of crosstalk and its implications for cardiovascular function and disease Arq Bras Cardiol 2007 88 1 26 31 17364108 7 Evora PR, Simon MR. Role of nitric oxide production in anaphylaxis and its relevance for the treatment of anaphylactic hypotension with methylene blue. Ann Allergy Asthma Immunol. 2007;99(4):306-13. Doi: 10.1016-1206(10)60545-5. Evora PR Simon MR Role of nitric oxide production in anaphylaxis and its relevance for the treatment of anaphylactic hypotension with methylene blue Ann Allergy Asthma Immunol 2007 99 4 306 313 10.1016-1206(10)60545-5 Editorial Agonistas de Proteínas G e Bloqueadores da via NO/cGMP: Duas Fronteiras não Exploradas pelas Indústrias Farmacêuticas Evora Paulo Roberto B. Departamento de Cirurgia e Anatomia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil Correspondência: Paulo Roberto B. Evora, Rua Rui Barbosa, 367 apt.15. CEP 14015-120, Ribeirão Preto, SP - Brasil. E-mail: prbevora@gmail.com Palavras-chave Proteinas de Ligação ao GTP Celulas Endoteliais Tecnologia Farmacêutica Medicamentos de Referência

Há duas fronteiras terapêuticas ainda inexploradas sobre as quais a indústria farmacêutica deve esclarecer: 1) responder questões sobre a transdução do sinal das proteínas G para manter a liberação normal de NO e 2) bloquear a vasoplegia inflamatória resistente à ação de aminas, mediada pela superprodução de NO. É importante lembrar que dois prêmios Nobel estão envolvidos.

Proteínas G: potencial papel terapêutico

A liberação de óxido nítrico (NO) pode ocorrer por diferentes vias envolvendo proteínas G. A proteína Gi é responsável pela mediação dos efeitos inibitórios dos receptores nas vias adenilato ciclase e guanilato ciclase. Um estágio inicial da maioria das respostas mediadas por receptores é a ativação das proteínas G na membrana celular, alvo da modulação de uma variedade de eventos intracelulares. O papel das proteínas G na fisiopatologia do vasoespasmo após isquemia global e reperfusão ainda é questão de investigações. Sua participação foi documentada em um estudo comparativo do relaxamento vascular causado por estímulo com fluoreto de sódio, que produz respostas bifásicas nas artérias coronárias, humanas, bovinas e suínas, relaxamento dependente do endotélio e contração independente do endotélio. A disfunção das proteínas G no endotélio também foi indicada como responsável pela disfunção endotelial em condições de regeneração de células endoteliais após lesão, aterosclerose e vasoespasmo coronariano. A isquemia miocárdica e a reperfusão prejudicam seletivamente a liberação de NO mediada por receptor. No entanto, a capacidade de as células endoteliais produzirem NO ou gerarem relaxamento em resposta a agonistas dependentes de óxido não nítrico permanece intacta.1,2

Em resumo: 1. As células endoteliais mantêm a capacidade de liberar NO com base na sua capacidade de receber o sinal de transdução através da sua membrana; 2. As proteínas G têm um papel fundamental na transdução do sinal; 3. Este paradigma é estendido a todas as doenças cardiovasculares vasotônicas que coexistem com a disfunção plaquetária. Esses dados seriam altamente relevantes ao sugerir a pesquisa de drogas moduladoras de proteínas - G.

 O "crosstalk" entre cGMP e cAMP é subestimado

Atualmente, o tratamento clínico da vasoplegia inflamatória associada à sepse ou anafilaxia é sintomática. Expande-se a volemia pela administração de fluidos e a baixa pressão arterial é gerenciada pela administração de inotrópicos positivos e vasoconstritores. No entanto, o choque circulatório é frequentemente refratário a altas concentrações de aminas.

Desde 1994, o bloqueio de guanilato ciclase pelo azul de metileno (AM) em choque distributivo tem sido objeto de estudo em nosso Laboratório de Função Endotelial e clinicamente utilizado pelo Grupo de Cirurgia Cardiovascular, ambos pertencentes à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). Existem fortes evidências de que o AM, um inibidor da guanilato ciclase, seja uma opção terapêutica para o tratamento da síndrome vasoplégica. Com base em nossa experiência clínica e laboratorial, acumulada ao longo de 20 anos, alguns conceitos clássicos sobre o uso de AM nessa condição foram estabelecidos: 1) Os inibidores de heparina e da ECA são fatores de risco; 2) Nas doses recomendadas, o AM é considerado um medicamento seguro (a dose letal é de 40 mg/kg); 3) O AM não causa disfunção endotelial; 4) Os efeitos do AM aparecem apenas no caso de suprarregulação do óxido nítrico (NO); 5) O AM não é um vasoconstritor em si; ao bloquear o sistema GMPc, o AM "libera" o sistema AMPc por uma espécie de “conversação cruzada” (crosstalk), facilitando o efeito vasoconstritor da noradrenalina; 6) A dosagem mais utilizada é de 2 mg/kg de bolus intravenoso, seguida de infusão contínua, uma vez que a concentração plasmática diminui acentuadamente nos primeiros 40 minutos; 7) Existe uma possível "janela de oportunidade" para a eficácia do MB.3-5

Nesse contexto, surge uma questão principal: "O que podemos fazer quando o choque circulatório se torna refratário às medidas terapêuticas clássicas, incluindo administração de fluidos, inotrópicos e vasoconstritores? As respostas a esta questão estão atualmente limitadas à evidência acumulada em relação a três mecanismos vasoconstritores independentes do AMPc: 1) vasoconstrição dependente de cGMP/NO (a mais importante); 2) administração de vasopressina e; 3) vasoconstrição dependente da hiperpolarização. Por que essas alternativas terapêuticas nem sempre funcionam? "Acreditamos que existem, pelo menos, cinco aspectos relacionados a essa questão: 1) A não consideração de "diretrizes" ou de "medicina baseada em evidências" em relação às opções disponíveis de tratamentos aceitos; 2) A falta de conhecimento dos diferentes mecanismos de vasodilatação; 3) a possibilidade de “crosstalk” entre os diferentes mecanismos de vasodilatação; 4) a atividade enzimática da guanilil ciclase solúvel (GCs) e; 5) o uso comum do AM como uma tentativa terapêutica “de resgate” ou “final".6

Embora não existam estudos multicêntricos definitivos, o uso de AM atualmente, a opção única, mais segura e mais barata para o tratamento da síndrome vasoplégica na cirurgia cardíaca. Contudo, a polêmica sobre o AM atenua o problema real da disfunção endotelial vasoplégica, cujo bloqueio poderia ser alvo de outras drogas atuais além do AM.

No entanto, no âmbito de um editorial, deve-se considerar que não existe uma resposta simples às questões apresentadas acima, uma vez que existem múltiplos fatores que influenciam no processo de decisão nos investimentos multimilionários. Mesmo considerando os benefícios clínicos reais e potenciais, é preciso considerar a situação da patente do produto e seu desenvolvimento, bem como o potencial de mercado presente e futuro. Ainda, segundo executivos da indústria farmacêutica, existe uma possível competição por financiamento que muitas vezes gera uma competição interna entre várias linhas de pesquisa.

Essas considerações seriam especulativas, mas, em nossa opinião, a indústria farmacêutica ainda nos deve explicações sobre: 1) perguntas sobre a transdução do sinal das proteínas G para manter a liberação de NO normal e; 2) bloqueio da vasoplegia inflamatória resistente a aminas medida pela superprodução de NO. É importante lembrar que dois prêmios Nobel estão envolvidos (Figura 1).

A óxido nítrico sintase endotelial converte L-arginina em óxido nítrico que ativa a enzima guanilato ciclase responsável pela transformação de GTP em cGMP, que causa vasodilatação dependente do endotélio comumente associada ao choque circulatório mediado por receptores de membrana (Adaptado de Evora & Simon; Ann Allergy Asthma Immunol. 2007; 99: 306-313.)<xref ref-type="bibr" rid="B7">7</xref>