Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 7tyNntP3Pc9F8wSgY5q9pvv S0066-782X2017000800124 10.5935/abc.20170090 S0066-782X2017005001203 Original Articles Ruthenium Complex Improves the Endothelial Function in Aortic Rings From Hypertensive Rats Vatanabe Izabela Pereira 1 Rodrigues Carla Nascimento dos Santos 1 Buzinari Tereza Cristina 1 Moraes Thiago Francisco de 1 Silva Roberto Santana da 2 Rodrigues Gerson Jhonatan 1 Universidade Federal de São Carlos São Paulo SP Brazil Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Paulo, SP - Brazil Universidade Federal de São Carlos Universidade de São Paulo Ribeirão Preto SP Brazil Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP - Brazil Universidade de São Paulo Mailing Address: Izabela Pereira Vatanabe, Avenida Miguel Damha, 1515. Postal Code 15063-000, Residencial Gaivotas I, São José do Rio Preto, SP - Brazil. E-mail: izabelavatanabe1@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research, Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Vatanabe IP, Rodrigues GJ, Silva RS; Acquisition of data: Vatanabe IP, Rodrigues CNS, Buzinnari TC, Moraes TF; Statistical analysis and Writing of the manuscript: Vatanabe IP; Obtaining funding: Vatanabe IP, Rodrigues GJ.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 29 06 2017 Jul-Aug 2017 109 2 124 131 19 08 2016 16 12 2016 15 03 2017 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

The endothelium is a monolayer of cells that extends on the vascular inner surface, responsible for the modulation of vascular tone. By means of the release of nitric oxide (NO), the endothelium has an important protective function against cardiovascular diseases.

 Objective:

Verify if cis- [Ru(bpy)2(NO2)(NO)](PF6)2 (BPY) improves endothelial function and the sensibility of conductance (aorta) and resistance (coronary) to vascular relaxation induced by BPY.

 Methods:

Normotensive (2K) and hypertensive (2K-1C) Wistar rats were used. For vascular reactivity study, thoracic aortas were isolated, rings with intact endothelium were incubated with: BPY(0.01 to10 µM) and concentration effect curves to acetylcholine were performed. In addition, cumulative concentration curves were performed to BPY (1.0 nM to 0.1 µM) in aortic and coronary rings, with intact and denuded endothelium.

 Results:

In aorta from 2K-1C animals, the treatment with BPY 0.1µM increased the potency of acetylcholine-induced relaxation and it was able to revert the endothelial dysfunction. The presence of the endothelium did not modify the effect of BPY in inducing the relaxation in aortas from 2K and 2K-1C rats. In coronary, the endothelium potentiated the vasodilator effect of BPY in vessels from 2K and 2K-1C rats.

 Conclusion:

Our results suggest that 0.1 µM of BPY is able to normalize the relaxation endothelium dependent in hypertensive rats, and the compound BPY induces relaxation in aortic from normotensive and hypertensive rats with the same potency. The endothelium potentiate the relaxation effect induced by BPY in coronary from normotensive and hypertensive rats, with lower effect on coronary from hypertensive rats.

 Keywords: Rats Hypertension, Renal Ruthenium Endothelium / physiopathology Nitric Oxide São Paulo Research Fundatio 2012/24477-8 2014/02231-2 National Counsel of Technological and Scientific Development 478849/2013-3 This work was supported by grants from São Paulo Research Fundation (FAPESP grant 2012/24477-8 and 2014/02231-2) and National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq grant 478849/2013-3). Introdution

Endothelial dysfunction is characterized mainly by decreasing the ability of endothelial cells to release nitric oxide (NO),1 and it has been associated with hypertension as well as other cardiovascular diseases, furthermore, it includes release and superoxide anion (O2 -) increased bioavailability generating to peroxinitrite (ONOO-) join reaction with NO. This reaction is present in dysfunctional endothelial cells 2K-1C animals, due to the current Angiotensina II increase.2

NO is involved in diverse pathophysiological process that encourages the emergence of researches about drugs that can be able to modulate NO concentration for therapeutic purpose,3 including NO donors.

On preliminary results, we have observed that the ruthenium complex cis-[Ru(H-dcbpy)2(Cl)(NO)] (dcbpy) improved the relaxation endothelium dependent induced by acetylcholine in aortic rings from hypertensive rats4. This compound also is able to induce relaxation by NO release in higher concentration, and the improvement in endothelial function was attributed to inactivation of O2 -.4

The NO donors are pharmacologically active substances that release NO. The NO donors most widely used in medical practice are organic and inorganic nitrates, nitroglycerine and sodium nitroprusside, respectively. However prolonged treatment with these drugs have induced adverse effects, such as intolerance, endothelial dysfunction, release of toxic compounds, reflex tachycardia and other adverse effects that are limiting factors to the use of these NO donors.5-8

Thus, the macrocyclic nitrosyl ruthenium complexes are being studied as NO donors, 9-14 which are attractive because they have active forms that are stable and have low toxicity under physiological conditions.10,12,13 Another important feature displayed by these compounds is the sustained release of NO, as we noted in prolonged hypotensive effect generated in hypertensive animals 15,16 and that was also observed in studies of release kinetics NO in vitro.17,18

Exogenous NO donors agents based on ruthenium-derived metal nitrosyl complexes have been developed as strategy to reduce side effects and cytotoxicity. They have not displayed any toxic effects and they are able to induce vascular relaxation and decrease blood pressure in normotensive and hypertensive rats15,19 being the cis- [Ru(bpy)2 (NO2)(NO)] (PF6)2 (BPY) able to induce aortic relaxation and decrease blood pressure in normotensive rats.20

Thus, drugs in which the center of the metal is ruthenium, as BPY, have good clinical application, especially considering that the low toxicity of the metal ion is similar to the physical and chemical properties present in the iron metal ion.21 The body can protect from the effects caused by excess of iron ions with the formation of transferrin and albumin, therefore it is believed that the mechanism of protection against the toxicity of ruthenium would be the same.21,22 Thus, based on literature existing surrounding this issue, it appears that the BPY is more attractive to present active form under physiological conditions predicting a good future clinical application.11-13

Objective

This study was made to evaluate if BPY improves endothelial function, and the sensibility of conductance (aorta) and resistance (coronary) to vascular relaxation induced by BPY.

 Methods

Materials used (Drugs and chemicals), Acetylcholine (Ach) and phenylephrine (Phe) were purchased from Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA); Compound cis- [Ru(bpy)2 (NO2)(NO)] (PF6)2 (BPY) was synthesized by a partner in University of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto.

Experimental animals

Male Wistar rats were used weighing between 180-200 grams. The animals were maintained on a standard diet with a 12 h cycle light/dark and free access to food (standard diet) and water. The animals were anaesthetized with Tribromoethanol (2.5 mg/kg, ip) after a midline laparotomy a silver clip with an internal diameter of 0.20 mm was placed around the left renal artery as previously described for 2K-1C by Goldblatt et al.23, where only one renal artery is restricted to reduce chronic renal perfusion. Normotensive two-kidney rats (2K, n = 6) were only submitted to laparotomy. Systolic blood pressure (SBP) was measured by a method of indirect tail plethysmography (MLT125R pulse pressure transducer/Cuss coupled to PowerLab 4/S-digital converter; AD Instruments Pty Ltd, Castle Hill, Australia) in animals not anaesthetized. The animal were considered hypertensive when systolic blood pressure was greater than 160 mmHg six weeks after surgery.

 Ethical aspects

Experimental protocols followed standards and policies of Animal Care and Use Committee of the Federal University of São Carlos (CEUA: 012/2013).

 Vascular reactivity study

Six weeks after surgery, rats were killed by decapitation and the thoracic aorta or coronary were dissected, cut into rings and placed in bath chambers containing Krebs solution at 37°C, pH 7.4, continuously bubbled with 95% O2 and 5% CO2, in an isometric myograph (Mulvany-Halpern-model 610 DMT-USA, Marietta, GA) and recorded by a PowerLab8/SP data acquisition system (ADInstruments Pty Ltd., Colorado Springs, CO).

Endothelial integrity was assessed by the degree of relaxation induced by 1 µmol/L acetylcholine after contraction of the aortic ring by phenylephrine (0.1 µmol/l). The ring was discarded if relaxation with acetylcholine was lower than 80% in 2K and 60% in 2K-1C rat aortas. After the endothelial integrity test, aortic rings were pre-contracted with phenylephrine (0.1 µM) and then were constructed concentration-effect curves to acetylcholine (0,01 µM to 10 µM) and BPY (1,0 nM to 0.1 µM), similarly in coronary artery rings, with and without intact endothelium, pre-contracted contractile agent (serotonin 10 µM) cumulative concentration curves were performed for the purpose BPY compound.

Aortic rings from 2K and 2K-1C were treated for 30 min with BPY (at concentrations: 0.1 µM) or PBS (control). The concentration of BPY chosen (0.1 µM) is close to EC50. After incubation, aortic rings were washed three times to remove drugs, pre-contracted and concentration-effect curves to acetylcholine were constructed. The potency values (pD2) and maximum relaxant effect (ME) were analyzed. The curves concentration effect for BPY were realized without previous incubation.29

Statistical analysis

Normality of distribution was checked with the Kolmogorov-Sminorv test, differences in means were compared by ANOVA. When significance was indicated, a Newman-Keuls post hoc analysis was used with statistical significance set at p < 0.05 (Software Prisma 3.0, Graphpad Software Inc, La Jolla, CA, USA). Data are expressed as mean ± S.D.

To calculate the sample size was followed the statistical formula for the calculation of the sample in an infinite population. In preclinical studies, we found that the standard deviation in the power of relaxation induced by acetylcholine in normotensive rat arteries was 0.31. We consider a tolerable sampling error of 0.25, thus define the size of the sample used in accordance with the formula: n = (1.96X0.31/0.25) 2 = 5.9 animals.

 Results Vascular reactivity studies

As can be seen at Figure 1, acetylcholine induces relaxation in pre-contracted aortic rings. However, the potency and the maximum relaxant effect was lower in aortic rings from hypertensive rats 2K-1C (Tables 1 and 2) when compared to aortic rings of normotensive 2K rats (Tables 1 and 2), indicating endothelial dysfunction in aortic rings of hypertensive rats 2K-1C.

Concentration-response curves (n = 8) for acetylcholine in intact endothelium- aortic rings contracted with phenylephrine. Values are mean ± S.D of experiments performed on preparations obtained from different animals. *** indicates signifcant difference (p < 0.001) in pD2 value for 2K vs. 2K-1C.

Potency (pD2) and Maximum relaxant effect (ME) to acetylcholine in endothelium intact aortic rings from 2K and 2K-1C rats incubated with PBS and BPY (0.1<italic>µ</italic>M), and ME to acetylcholine in coronary rings from rats with intact (E+) and denuded (E-) endothelium from 2K and 2K-1C incubated with BPY (0.1<italic>µ</italic>M). Values are mean of <italic>n</italic> experiments performed on preparations obtained from different animals, and number of animals used
2K-1C 2K
PBS pD2 Mean; Number of animals (n) 6.34; n = 6 7.07; n = 7
Emax Mean; Number of animals (n) 71.01, n = 6 93.90; n = 7
BPY 0.1 µM pD2 Mean; Number of animals (n) 7.74; n= 7 7.32; n = 7
Emax Mean; Number of animals (n) 90.85; n = 6 98.64; n = 7
Intact endothelium (E+) Emax Mean; Number of animals (n) 66.90; n = 5 86.97; n = 5
Denuded endothelium (E-) Emax Mean; Number of animals (n) 34.72; n = 7 34.88; n = 5
Potency (pD2) and Maximum relaxant effect (ME) to acetylcholine in endothelium intact aortic rings from 2K and 2K-1C rats incubated with PBS and BPY (0.1 <italic>µ</italic>M), and ME to acetylcholine in coronary rings from rats with intact (E+) and denuded (E-) endothelium from 2K and 2K-1C incubated with BPY (0.1 <italic>µ</italic>M). Values are ± S.D of <italic>n</italic> experiments performed on preparations obtained from different animals.
2K-1C 2K
PBS Standard Deviation of pD2 ± 0.07 ± 0.22
Standard Deviation of Emax ± 2.58 ± 2.79
BPY 0.1 µM Standard Deviation of pD2 ± 0.08 ± 0.11
Standard Deviation of Emax ± 1.34 ± 2.33
Intact endothelium (E+) Standard Deviation of Emax ± 2.11 ± 5.65
Denuded endothelium (E-) Standard Deviation of Emax ± 6.89 ± 5.45

Treatment of aortic rings with BPY at 0.1 µM was able to increase the potency of acetylcholine (Ach) in aortic rings of 2K-1C animals (Tables 1 and 2, p < 0.001) when compared with control 2K-1C -PBS (Tables 1 and 2) (Figures 2 and 3).

Concentration-response curves for acetylcholine (BPY) in aortic rings with intact endothelium and incubated with different concentrations of cis-[Ru(bpy)<sub>2</sub>(NO<sub>2</sub>-) (NO)](PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> and contracted with phenylephrine. Values are mean ± S.D of experiments performed on preparations obtained from different animals.* indicates signifcant difference 2K-1C PBS vs 2K-1C BPY 0.1 <italic>µ</italic>M (p < 0.001) e 2K-1C PBS vs 2K PBS (p < 0.001) in pD2.

Presents differences in the potency (pD2) of acetylcholine in inducing relaxation in aortas with and without cis-[Ru(bpy)<sub>2</sub>(NO<sub>2</sub>-)(NO)](PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> treatment. The concentration 0.1 nM normalized relaxation in 2K-1C aortic rings compared to 2K aortic rings. *** - Indicates statistical difference between 2K-1C PBS vs. 2K-1C BPY 0.1 <italic>µ</italic>M (p < 0.001) and 2K-1C PBS vs. 2K PBS (p < 0.001).

In addition, the treatment with 0.1 µM of BPY increased the maximum relaxant effect in aortic rings of 2K-1C rats (table 1 and 2, p < 0.001) when compared to the control - 2K-1C PBS (Tables 1 and 2) (Figure 4).

Presents differences in the effciency (E<sub>max</sub>) of acetylcholine in inducing relaxation in aortas with and without cis-[Ru(bpy)<sub>2</sub>(NO<sub>2</sub>-)(NO)](PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> treatment. The concentration 0.1 nM normalized relaxation in 2K-1C aortic rings compared to 2K aortic rings. *** - Indicates statistical difference between 2K-1C PBS vs. 2K-1C BPY 0.1 <italic>µ</italic>M (p < 0.001) and 2K-1C PBS vs. 2K PBS (p < 0.001).

However, the treatment with 0.1µM BPY 2K-1C in aortic rings was able to normalize the potency and the maximum relaxation effect to acetylcholine. In other words, the potency and ME to 2K-1C aortic rings treated with 0.1 µM BPY were similar to that obtained in aortic rings of 2K animals (Tables 1 and 2), suggesting a reversion of endothelial function in 2K-1C aortic ring by treatment with 0.1 µM of BPY (Figures 2, 3 and 4).

As can be seen at Figure 5, the NO donor BPY promoted concentration-dependent relaxation in isolated aortic rings from normotensive (2K) and hypertensive (2K-1C) rats with (E+) and without (E-) endothelium. Moreover, the presence of the endothelium did not change the vasodilating effect induced by BPY compound.

Concentration-response curves for acetylcholine in aortic rings with (E+) and without (E-) intact endothelium, from rats 2K and 2K-1C and incubated with different concentrations of cis-[Ru(bpy)<sub>2</sub>(NO<sub>2</sub> -)(NO)](PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> and contracted with phenylephrine. Values are mean ± S.D of experiments performed on preparations obtained from different animals. There was no statistical difference.

The NO donor cis-[Ru(bpy)2(NO2 -)(NO)](PF6)2 (BPY) induced concentration-dependent relaxation in isolated rat coronary with intact (E+) and denuded (E-) endothelium from 2K and 2K-1C animals. As can be seen at figure 6, in coronary arteries of hypertensive (2K-1C) rats, the presence of endothelium potentiated relaxation induced by BPY (Tables 1 and 2) compared to the absence of the endothelium (Tables 1 and 2, p < 0.001).

In coronary from normotensive (2K) rats, the endothelium also increased the relaxation induced BPY (Tables 1 and 2, p < 0.001) (Figure 7).

Relaxation coronary artery of rats (2K-1C) with (E +) and without (E-) form endothelium induced by compound cis-[Ru(bpy)<sub>2</sub>(NO<sub>2</sub> <sup>-</sup>)(NO)](PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> in rings pre-contracted with serotonin (SE). Curves cumulative concentration-effect were performed for BPY compound. Each point represents the mean ± S.D of data obtained from 5-7 independent determinations. * Indicates difference in the value of Emax.

Coronary artery relaxation of normotensive rats (2K) with (E +) and without (E-) form endothelium induced by compound cis-[Ru(bpy)<sub>2</sub>(NO<sub>2</sub>-)(NO)](PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub>, in coronary rings contracted with serotonin. Curves cumulative concentration-effect were performed for BPY compound. Each point represents the mean ± S.D of data obtained in fve independent determinations. *Indicates difference in the value of E<sub>max</sub>.

In the absence of the endothelium, BPY compound is able to induce relaxation in coronary from normotensive (2K) rats (Tables 1 and 2) and hypertensive rats (Tables 1 and 2), with no significant difference between the two groups (Figure 7). In intact endothelium coronary arteries, the relaxation induced by BPY was more effective in normotensive animals (Tables 1 and 2) when compared to hypertensive (Tables 1 and 2, p < 0.05) (Figures 6 and 7).

 Discussion

Our results have shown that the endothelium-dependent relaxation induced by acetylcholine is impaired in aortic rings from hypertensive rats (2K-1C). Hypertension model (2K-1C) is mediated by activation of the Renin Angiotensin Aldosterone System, occurring high concentration of circulating Angiotensina II. In accordance with Santeliz et al.,24 vascular cells stimulated by angiotensin II show high concentration of superoxide anion (O2-) due to activation of NADPH complex, which is responsible for the reduction in the vascular relaxation, since this species produced react with the released NO to form peroxynitrite, thus generating smaller amount of NO available. Furthermore, in hypertensive animals occurs a malfunction in endothelial cell layer due to shear stress and activation of the renin-angiotensin-aldosterone system. This dysfunction is characterized mainly by the decreasing ability of endothelial cells to release NO1. The NO produced in the endothelial cell diffuses to a lesser extent into the vascular lumen and for vascular cells smooth muscle25-28 causing a failure to control the modulation of vascular tone by NO.

The main finding of the present manuscript was that the treatment with BPY (at concentration 0.1 µM) in hypertensive aortic rings improved the endothelium-dependent relaxation, and was able to normalize the relaxation in 2K-1C aortic rings. These results suggest that a punctual concentration of BPY is able to induce improvement on endothelial function, which could be because of some enzymatic activation or an inhibition generating an increasing effect of endothelium dependent relaxation. It seems that the tonus modulation by endothelial can be improved by BPY.

These results are in accordance with previous study, that have shown an improvement on endothelial function by aortic rings treatment with 0.1µM of another ruthenium compound (cis-[Ru(H-dcbpy-)2(Cl)(NO)]).4 Thus, some results have suggested that ruthenium compounds can release NO and improve the endothelial function, which is a desirable effect on vascular system when endothelial dysfunction is present.

The endothelium and hypertension did not change the vasodilator effect induced by BPY compound in aortic rings. Rodrigues et al.,9 demonstrated that NO donors, TERPY (ruthenium complex) and SNP as well as BPY promoted concentration-dependent relaxation on isolated aorta from hypertensive (2K-1C) rats and normotensive (2K) rats, without altering the percentage of the maximum relaxation. However the potency of both NO donors (TERPY and SNP) was lower in the aorta from hypertensive rats (2K-1C), different from that observed to BPY, which generated the same potency of relaxation in 2K and 2K-1C aortas. The lower potency to TERPY and SNP was attributed to elevated concentration of O2 - in aortic rings.2 Thus, our results indicate that the vascular effect of BPY is not modified by endothelium or by O2 - present in aorta 2K-1C.29

The endothelium potentiated the relaxation in coronary from normotensive (2K) and hypertensive (2K-1C) rats. This effect was observed just in coronary and not in aorta. In previous study, it was found that the endothelium also potentiated the relaxation induced by SNP in aortic rings,18 and we have not found coronary study evaluating the effect of endothelium on relaxation induced by SNP. However, the relaxation induced by BPY is impaired in 2K-1C coronary rings with endothelium, with no difference in the absence. The impaired relaxation is in accordance to our previous study in aortic rings with another ruthenium compound.2 but we have not verified any description in coronary. In our opinion, the potentiation of the effect generated on the relaxation was greater in coronary suggesting that in resistance vessels, the endothelium participates in inducing relaxation, and it does not happen in conductance vessels such as the aorta.30

Conclusion

Taken together, our results suggest that 0.1 uM of BPY is able to normalize the endothelium dependent relaxation in hypertensive rats, and the compound BPY induces relaxation in aortic rings from normotensive and hypertensive rats with the same potency. In addition, the endothelium potentiate the relaxation effect induced by BPY in coronary rings from normotensive and hypertensive rats, with lower effect on coronary from hypertensive rats.

Limitations

The short period of time, corresponding to the duration of a master degree.

Sources of Funding

This work was supported by grants from São Paulo Research Fundation (FAPESP grant 2012/24477-8 and 2014/02231-2) and National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq grant 478849/2013-3).

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Izabela Pereira Vatanabe, from Universidade Federal de São Carlos.

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Bonaventura D de S Oliveira F Togniolo V Tedesco AC da Silva RS Bendhack LM A macrocyclic nitrosyl ruthenium complex is a NO-donor that induces rat aorta relaxation Nitric Oxide 2004 10 2 83 91 19 Bonaventura D, Oliveira FS, da Silva RS, Bendhack LM. Decreased vasodilation induced by a new nitric oxide donor in 2K-1C hypertensive rats is due to impaired K+ channel activation. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2005;32(5-6):478-81. Bonaventura D Oliveira FS da Silva RS Bendhack LM Decreased vasodilation induced by a new nitric oxide donor in 2K-1C hypertensive rats is due to impaired K+ channel activation Clin Exp Pharmacol Physiol 2005 32 5-6 478 481 20 Rodrigues GJ, Pereira AC, de Moraes TF, Wang CC, da Silva RS, Bendhack LM. Pharmacological characterization of the vasodilating effect induced by the ruthenium complex cis-[Ru(NO)(NO2)(bpy)2].(PF6)2. J Cardiovasc Pharmacol. 2015;65(2):168-77. Rodrigues GJ Pereira AC de Moraes TF Wang CC da Silva RS Bendhack LM Pharmacological characterization of the vasodilating effect induced by the ruthenium complex cis-[Ru(NO)(NO2)(bpy)2].(PF6)2 J Cardiovasc Pharmacol 2015 65 2 168 177 21 Silva ON. Estudo cinético da reação dos complexos cis -[Ru(bpy)2ImN(NO)](PF)3 e cis-[Ru(bpy)2SO3NO](PF6) com redutores biológicos. [Tese]. Fortaleza: Universidade Federal do Ceará; 2008. Silva ON Estudo cinético da reação dos complexos cis -[Ru(bpy)2ImN(NO)](PF)3 e cis-[Ru(bpy)2SO3NO](PF6) com redutores biológicos Tese 2008 Fortaleza Universidade Federal do Ceará 22 Allardyce CS, Dyson PJ. Rhuthenium in medicine: current clinical uses and future prospects. Platinum Metals Reviews. 2001;45(2):62-9. Allardyce CS Dyson PJ Rhuthenium in medicine: current clinical uses and future prospects Platinum Metals Reviews 2001 45 2 62 69 23 Goldblat H, Lynch J, Hanzal RF, Summerville WW. 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Munhoz FC Potje SR Pereira AC Daruge MG da Silva RS Bendhack LM Hypotensive and vasorelaxing effects of the new NO-donor [Ru(terpy)(bdq)NO+]3+ in espontaneously hypertensive rats Nitric Oxide 2012 26 2 111 117 Artigos Originais Complexo de Rutênio Melhora a Função Endotelial em Anéis de Aorta de Ratos Hipertensos Renais Vatanabe Izabela Pereira 1 Rodrigues Carla Nascimento dos Santos 1 Buzinari Tereza Cristina 1 Moraes Thiago Francisco de 1 Silva Roberto Santana da 2 Rodrigues Gerson Jhonatan 1 Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Paulo, SP - Brasil Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP - Brasil Correspondência: Izabela Pereira Vatanabe, Avenida Miguel Damha, 1515. CEP 15063-000, Residencial Gaivotas I, São José do Rio Preto, SP - Brasil. E-mail: izabelavatanabe1@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Vatanabe IP, Rodrigues GJ, Silva RS; Obtenção de dados: Vatanabe IP, Rodrigues CNS, Buzinnari TC, Moraes TF; Análise estatística e Redação do manuscrito: Vatanabe IP; Obtenção de financiamento: Vatanabe IP, Rodrigues GJ.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

O endotélio é uma monocamada de células que se estende sobre a superfície interna vascular, responsável pela modulação do tônus vascular. Por meio da liberação de óxido nítrico (NO), o endotélio tem uma função protetora importante contra doenças cardiovasculares.

 Objetivo:

Verificar se o cis- [Ru (BPY)2 (NO2) (NO)] (PF6) 2 (BPY) melhora a função endotelial e a sensibilidade da condutância (aorta) e da resistência (coronária) ao relaxamento vascular induzido por BPY.

 Métodos:

Foram utilizados ratos Wistar normotensos (2K) e hipertensos (2K-1C). Para o estudo de reatividade vascular, as aortas torácicas foram isoladas, os anéis com endotélio intacto foram incubados com: BPY (0,01 a 10 µM) e se realizaram curvas de efeito de concentração para acetilcolina. Adicionalmente, foram feitas curvas de concentração cumulativas para BPY (1,0 nM a 0,1 µM) nos anéis aórticos e coronários, com endotélio intacto e nu.

 Resultados:

Na aorta de animais 2K-1C, o tratamento com BPY 0,1 µM aumentou a potência do relaxamento induzido pela acetilcolina e foi capaz de reverter a disfunção endotelial. A presença do endotélio não modificou o efeito da BPY na indução do relaxamento em aortas de ratos 2K e 2K-1C. Na coronária, o endotélio potencializou o efeito vasodilatador do BPY em vasos de ratos 2K e 2K-1C.

 Conclusão:

Nossos resultados sugerem que 0,1 µM de BPY é capaz de normalizar o relaxamento dependente do endotélio em ratos hipertensos, e o composto BPY induz relaxamento na aorta de ratos normotensos e hipertensos com a mesma potência. O endotélio potencializa o efeito de relaxamento induzido pela BPY em coronárias de ratos normotensos e hipertensos, com menor efeito em coronárias de ratos hipertensos.

 Palavras-chave: Ratos Hipertensão Renal Rutênio Endotélio / fisiopatologia Óxido Nítrico Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2012/24477-8 2014/ 02231-2 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 478.849/2013-3 Este trabalho contou com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2012/24477-8 e 2014/ 02231-2) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq concedido pelo processo 478.849/2013-3). Introdução

A disfunção endotelial é caracterizada principalmente pela diminuição da capacidade das células endoteliais para liberar óxido nítrico (NO),1 a mesma tem sido associada à hipertensão, bem como outras doenças cardiovasculares, além disso, inclui liberação e aumento da biodisponibilidade de aníon superóxido (O2-) gerando a reação de junção do peroxinitrito (ONOO-) com NO. Esta reação está presente em células endoteliais animais 2K-1C disfuncionais, devido ao aumento da Angiotensina II.2

O NO está envolvido em diversos processos fisiopatológicos que estimulam o surgimento de pesquisas sobre drogas capazes de modular a concentração de NO com finalidade terapêutica,3 incluindo doadores de NO.

Em resultados preliminares, observamos que o complexo de rutênio cis- [Ru (H-dcbpy)2 (Cl) (NO)] (dcbpy) melhorou o relaxamento dependente do endotélio induzido pela acetilcolina em anéis aórticos de ratos hipertensos.4 Este composto também é capaz de induzir o relaxamento pela liberação de NO em maior concentração e a melhora da função endotelial foi atribuída à inativação do O2-.4

Os doadores de NO são substâncias farmacologicamente ativas que liberam NO. Os dadores de NO mais amplamente utilizados na prática médica são nitratos orgânicos e inorgânicos, nitroglicerina e nitroprussiato de sódio, respectivamente. No entanto, o tratamento prolongado com estes fármacos tem efeitos adversos induzidos, tais como intolerância, disfunção endotelial, liberação de compostos tóxicos, taquicardia reflexa e outros efeitos adversos que são fatores limitantes para o uso destes doadores de NO.5-8

Assim, os complexos macrocíclicos de nitrosilo rutênio estão sendo estudados como doadores de NO,9-14 os quais são atrativos porque possuem formas ativas que são estáveis e de baixa toxicidade em condições fisiológicas.10,12,13 Outra característica importante apresentada por estes compostos é a liberação sustentada de NO, tal como observamos no efeito hipotensor prolongado gerado em animais hipertensos15,16 e que também foi observado em estudos de cinética de libertação NO in vitro.17,18

Os agentes dadores de NO exógenos baseados em complexos de nitrosilo metálicos derivados do ruténio foram desenvolvidos como estratégia para reduzir efeitos secundários e citotoxicidade. Não apresentam efeitos tóxicos e são capazes de induzir o relaxamento vascular e diminuir a pressão arterial em ratos normotensos e hipertensos15,19 sendo o cis- [Ru(bpy)2 (NO2)(NO)] (PF6)2 (BPY) capaz de induzir o relaxamento aórtico e diminuir a pressão arterial em ratos normotensos.20

Assim, fármacos nos quais o centro do metal é o ruténio, como o BPY, têm boa aplicação clínica, especialmente considerando que a baixa toxicidade do íon metálico é semelhante às propriedades físicas e químicas presentes no íon metálico ferro.21 O corpo pode se proteger contra os efeitos causados pelo excesso de íons de ferro com a formação de transferrina e albumina, portanto, acredita-se que o mecanismo de proteção contra a toxicidade do rutênio seria o mesmo.21,22 Assim, com base na literatura existente em torno a esta questão, parece que o BPY é mais volcado a apresentar forma ativa em condições fisiológicas predizendo uma boa aplicação clínica futura.11-13

Objetivo

Avaliar se o BPY melhora a função endotelial e a sensibilidade da condutância (aorta) e da resistência (coronária) ao relaxamento vascular induzido pelo BPY.

 Métodos

Como material (Drogas e produtos químicos), utilizou-se Acetilcolina (Ach) e fenilefrina (Phe) da Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, EUA); Composto cis- [Ru(bpy)2 (NO2)(NO)] (PF6)2 (BPY) foi sintetizado por parceiro na Universidade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto.

Animais do experimento

Foram utilizados ratos Wistar machos com peso entre 180 e 200 gramas. Os animais foram mantidos em uma dieta padrão com um ciclo de 12 horas de luz/escuridão e acesso livre a alimentos (dieta padrão) e água. Os animais foram anestesiados com Tribromoetanol (2,5 mg/kg, ip) após uma laparotomia de linha média, colocou-se um clip com um diâmetro interno de 0,20 mm em torno da artéria renal esquerda como no 2K-1C previamente descrito por Goldblatt et al.,23 onde apenas uma artéria renal é restrita para reduzir a perfusão renal crônica. Os ratos normotensos de dois rins (2K, n = 6) foram submetidos apenas à laparotomia. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por um método de pletismografia indireta da cauda (transdutor de pressão de pulso MLT125R/Cuss acoplado ao conversor PowerLab 4 / S-digital, AD Instruments Pty Ltd, Castle Hill, Austrália) em animais não anestesiados. Os animais foram considerados hipertensos quando a pressão arterial sistólica era maior que 160 mmHg, seis semanas após a cirurgia.

 Aspectos éticos

Os protocolos experimentais seguiram as normas e políticas do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Federal de São Carlos (CEUA: 012/2013).

 Estudo de reatividade vascular

Seis semanas após a cirurgia, os ratos foram mortos por decapitação e a aorta torácica ou coronária foram dissecadas, cortadas em anéis e colocadas em câmaras de banho contendo solução de Krebs a 37°C, pH 7,4, borbulhado continuamente com 95% de O2 e 5% de CO2, em um miógrafo isométrico (Mulvany-Halpern-modelo 610 DMT-USA, Marietta, GA) e registrado por um sistema de colheita de dados PowerLab8/SP (ADInstruments Pty Ltd., Colorado Springs, CO).

A integridade endotelial foi avaliada pelo grau de relaxamento induzido por 1 µmol/L de acetilcolina após a contração do anel aórtico pela fenilefrina (0,1 µmol/l). O anel foi descartado se o relaxamento com acetilcolina fosse inferior a 80% na aorta de rato 2K e 60% em aorta de rato 2K-1C. Após o teste de integridade endotelial, os anéis aórticos foram pré-contraídos com fenilefrina (0,1 µM) e depois foram construídas curvas de concentração-efeito para acetilcolina (0,01 µM a 10 µM) e BPY (1,0 nM a 0,1 µM), do mesmo modo em anéis de artérias coronárias, com e sem endotélio intacto, realizaram-se curvas de concentração cumulativa pré-contraídas (serotonina 10 µM) para o composto BPY.

Os anéis aórticos de 2K e 2K-1C foram tratados durante 30 min com BPY (em concentrações: 0,1 µM) ou PBS (controle). A concentração de BPY escolhida (0,1 µM) está próxima de CE50. Após incubação, os anéis aórticos foram lavados três vezes para remover fármacos, pré-contraídos e curvas de efeito de concentração para acetilcolina foram construídas. Os valores de potência (pD2) e efeito relaxante máximo (ME) foram analisados. As curvas de efeito de concentração para BPY foram realizadas sem prévia incubação.29

Análise estatística

A normalidade da distribuição foi verificada com o teste Kolmogorov-Sminorv, as diferenças nas médias foram comparadas pelo ANOVA. Quando foi indicada significância, utilizou-se uma análise post hoc de Newman-Keuls com significância estatística estabelecida para p < 0,05 (Software Prisma 3,0, Graphpad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Os dados são expressos como média ± DP. Para calcular o tamanho da amostra foi seguida a fórmula estatística para o cálculo da amostra em uma população infinita. Em estudos pré-clínicos, encontramos que o desvio padrão no poder de relaxação induzida pela acetilcolina em artérias de ratos normotensos foi de 0,31. Consideramos um erro de amostragem tolerável de 0,25, definindo assim o tamanho da amostra utilizada de acordo com a fórmula: n = (1,96 X 0,31/ 0,25) 2 = 5,9 animais.

 Resultados Estudos de reatividade vascular

Como pode ser observado na Figura 1, a acetilcolina induz relaxamento em anéis aórticos pré-contraídos. No entanto, a potência e o efeito relaxante máximo foram menores nos anéis aórticos de ratos hipertensos 2K-1C (Tabelas 1 e 2) quando comparados aos anéis aórticos de ratos 2K normotensos (Tabelas 1 e 2), indicando disfunção endotelial em anéis aórticos de ratos hipertensos 2K-1C.

Curvas de concentração-resposta (n = 8) para acetilcolina em anéis endotélio-aórticos intactos contraídos com fenilefrina. Os valores são média ± DP dos experimentos realizados em preparações obtidas de diferentes animais. *** indica diferença signifcativa (p < 0,001) no valor de pD2 para 2K vs. 2K-1C.

Potência (pD2) e efeito relaxante máximo (ME) para acetilcolina em anéis aórticos com endotélio intacto de ratos 2K e 2K-1C incubados com PBS e BPY (0,1 µM) e ME para acetilcolina em anéis coronários de ratos com endotélio intacto (E+) e desnudado (E-) de 2K e 2K-1C incubados com BPY (0,1 uM). Os valores são média de <italic>n</italic> experimentos realizados em preparações obtidas de diferentes animais, e o número de animais utilizados
2R-1C 2R
PBS pD2 Média; Número de animais (n) 6,34; n = 6 7,07; n = 7
Emax Média; Número de animais (n) 71,01, n = 6 93,90; n = 7
BPY 0,1 µM pD2 Média; Número de animais (n) 7,74; n = 7 7,32; n = 7
Emax Média; Número de animais (n) 90,85; n = 6 98,64; n = 7
Endotélio intacto (E+) Emax Média; Número de animais (n) 66,90; n = 5 86,97; n = 5
Endotélio desnudado (E-) Emax Média; Número de animais (n) 34,72; n = 7 34,88; n = 5
Potência (pD2) e efeito relaxante máximo (ME) para acetilcolina em anéis aórticos de endotélio intacto de ratos 2K e 2K-1C incubados com PBS e BPY (0,1 µM) e ME com acetilcolina em anéis coronários de ratos com endotélio intacto (E+) e desnudado (E-) de 2K e 2K-1C incubados com BPY (0,1 uM). Os valores são ± DP de <italic>n</italic> experimentos realizados em preparações obtidas de diferentes animais
2R-1C 2R
PBS Desvio Padrão de pD2 ± 0,07 ± 0,22
Desvio Padrão de Emax ± 2,58 ± 2,79
BPY 0,1 µM Desvio Padrão de pD2 ± 0,08 ± 0,11
Desvio Padrão de Emax ± 1,34 ± 2,33
Endotélio intacto (E+) Desvio Padrão de Emax ± 2,11 ± 5,65
Endotélio desnudado (E-) Desvio Padrão de Emax ± 6,89 ± 5,45

O tratamento de anéis aórticos com BPY a 0,1 µM foi capaz de aumentar a potência da acetilcolina (Ach) em anéis aórticos de animais 2K-1C (Tabelas 1 e 2, p < 0,001) quando comparado com o controle 2K-1C-PBS (Tabelas 1 e 2) (Figuras 2 e 3).

Curvas de concentração-resposta para acetilcolina (BPY) em anéis aórticos com endotélio intacto e incubados com diferentes concentrações de cis- [Ru (bpy) 2 (NO2-) (PF6) 2 e contraídas com fenilefrina. Os valores são média ± DP das experiências realizadas em preparações obtidas de diferentes animais. * Indica diferença significativa PBS 2K-1C vs BPP 2K-1C 0,1 pM (p < 0,001) e PBS 2K-1C vs PBS 2K (p < 0,001) em pD2.

Apresenta diferença na potência (pD2) da acetilcolina na indução de relaxamento em aortas com e sem tratamento cis- [Ru (bpy)<sub>2</sub> (NO<sub>2</sub>-) (PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub>. A concentração de 0,1 nM normalizou o relaxamento em anéis aórticos 2K-1C em comparação com anéis aórticos 2K. *** - Indica a diferença estatística entre 2K-1C PBS versus 2K-1C PBS 0,1 <italic>µ</italic>M (p < 0,001) e 2K-1C PBS vs. PBS 2K (p < 0,001).

Além disso, o tratamento com 0,1 µM de BPY aumentou o efeito relaxante máximo nos anéis aórticos de ratos 2K-1C (Tabelas 1 e 2, p < 0,001) quando comparado com o controle - 2K-1C PBS (Tabelas 1 e 2; Figura 4).

Apresenta diferença na efciência (Emax) da acetilcolina na indução de relaxamento em aortas com e sem tratamento cis- [Ru (bpy)<sub>2</sub> (NO<sub>2</sub>-) (PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub>. A concentração 0,1 nM normalizou o relaxamento em anéis aórticos 2K-1C em comparação com anéis aórticos 2K. *** - Indica a diferença estatística entre 2K-1C PBS versus 2K-1C PBS 0,1 <italic>µ</italic>M (p < 0,001) e 2K-1C PBS vs. 2K PBS (p < 0,001).

No entanto, o tratamento com 0,1 µM de BPY em anéis aórticos 2K-1C foi capaz de normalizar a potência e o efeito de relaxamento máximo para a acetilcolina. Em outras palavras, a potência e ME para os anéis aórticos 2K-1C tratados com 0,1 µM de BPY foram semelhantes aos obtidos em anéis aórticos de animais 2K (Tabelas 1 e 2), sugerindo uma reversão da função endotelial no anel aórtico 2K-1C com tratamento com 0,1 µM de BPY (Figuras 2, 3 e 4).

Como pode ser observado na Figura 5, o BPY doador de NO promoveu relaxamento dependente da concentração em anéis aórticos isolados de ratos normotensos (2K) e hipertensos (2K-1C) com (E+) e sem (E-) endotélio. Além disso, a presença do endotélio não alterou o efeito vasodilatador induzido pelo composto BPY.

Curvas de concentração-resposta para acetilcolina em anéis aórticos com (E +) e sem (E-) endotélio intacto, a partir de ratos 2K e 2K-1C e incubados com diferentes concentrações de cis- [Ru (bpy)<sub>2</sub> (NO<sub>2</sub>-) (NO)] (PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> e contraído com fenilefrina. Os valores são média ± DP dos experimentos realizados em preparações obtidas de diferentes animais. Não houve diferença estatística.

O doador de NO cis- [Ru (bpy)2 (NO2-) (NO)] (PF6)2 (BPY) induziu o relaxamento dependente da concentração em coronária de rato isolada com endotélio intacto (E+) desnudado (E-) de animais 2K e 2K-1C. Como pode ser observado na Figura 6, em artérias coronárias de ratos hipertensos (2K-1C), a presença de relaxamento potenciado pelo endotélio e induzido por BPY (Tabelas 1 e 2) em comparação com a ausência do endotélio (Tabelas 1 e 2, p < 0,001).

Relaxamento da artéria coronária de ratos (2K-1C) com (E +) e sem (E-) endotélio, induzido pelo composto cis- [Ru (bpy)<sub>2</sub> (NO<sub>2-</sub>) (NO)] (PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> em anéis pré-contraídos com serotonina (SE). O efeito de concentração cumulativa das curvas foi realizado para o composto BPY. Cada ponto representa a média ± DP dos dados obtidos de 5-7 determinações independentes. * Indica diferença no valor de Emax.

Em coronárias de ratos normotensos (2K), o endotélio também aumentou o relaxamento induzido por BPY (Tabelas 1 e 2, p <0,001). (Figura 7).

Relaxamento da artéria coronária de ratos normotensos (2K) com (E +) e sem (E-) endotélio, induzido pelo composto cis- [Ru (bpy)<sub>2</sub> (NO<sub>2-</sub>) (NO)] (PF<sub>6</sub>)<sub>2</sub> em anéis coronários contraídos com serotonina. O efeito de concentração cumulativa das curvas foi realizado para o composto BPY. Cada ponto representa a média ± DP dos dados obtidos em 5 determinações independentes. * Indica diferença no valor de Emax.

Na ausência do endotélio, o composto BPY é capaz de induzir relaxamento em coronárias de ratos normotensos (2K) (Tabelas 1 e 2) e hipertensos (Tabelas 1 e 2), sem diferença significativa entre os dois grupos (Figura 7). Nas artérias coronárias com endotélio intacto, o relaxamento induzido pela BPY foi mais efetivo nos animais normotensos (Tabelas 1 e 2) quando comparado aos hipertensos (Tabelas 1 e 2, p < 0,05) (Figuras 6 e 7).

 Discussão

Nossos resultados mostraram que o relaxamento dependente do endotélio induzido pela acetilcolina é prejudicado em anéis aórticos de ratos hipertensos (2K-1C). O modelo de hipertensão (2K-1C) é mediado pela ativação do Sistema Renina Angiotensina Aldosterona, ocorrendo alta concentração de Angiotensina II circulante. De acordo com Santeliz et al.,24 células vasculares estimuladas pela angiotensina II apresentam alta concentração de aníon superóxido (O2-) devido à ativação do complexo NADPH, responsável pela redução do relaxamento vascular, uma vez que esta espécie produz reação com o NO liberado para formar peroxinitrito, gerando assim menor quantidade de NO disponível. Além disso, em animais hipertensos ocorre um mau funcionamento na camada de células endoteliais devido ao stress de cisalhamento e ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona. Esta disfunção é caracterizada principalmente pela diminuição da capacidade das células endoteliais para liberar NO1. O NO produzido na célula endotelial se difunde em menor extensão no lúmen vascular e para o músculo liso das células vasculares,25-28 causando uma falha no controle da modulação do tom vascular pelo NO.

O principal achado do presente trabalho foi que o tratamento com BPY (na concentração 0,1 µM) em anéis aórticos hipertensos melhorou o relaxamento endotélio dependente e foi capaz de normalizar o relaxamento em anéis aórticos 2K-1C. Estes resultados sugerem que uma concentração pontual de BPY é capaz de induzir melhora na função endotelial, o que poderia ser por alguma ativação enzimática ou uma inibição gerando um efeito aumentado de relaxamento endotélio dependente. Parece que a modulação do tônus pelo endotélio pode ser melhorada pelo BPY.

Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores, que demonstraram uma melhora na função endotelial pelo tratamento dos anéis aórticos com 0,1 µM de outro composto de rutênio (cis- [Ru (H-dcbpy-)2 (Cl) (NO)]4. Assim, alguns resultados sugeriram que os compostos de ruténio podem liberar NO e melhorar a função endotelial, o que é um efeito desejável no sistema vascular quando está presente disfunção endotelial.

O endotélio e a hipertensão não alteraram o efeito vasodilatador induzido pelo composto de BPY em anéis aórticos. Rodrigues et al.,9 demonstraram que os doadores de NO, TERPY (complexo de rutênio) e SNP bem como BPY promovem relaxamento dependente da concentração em aorta isolada de ratos hipertensos (2K-1C) e normotensos (2K), sem alterar a porcentagem do relaxamento máximo. No entanto, a potência de ambos dadores de NO (TERPY e SNP) foi menor na aorta de ratos hipertensos (2K-1C), diferente da observada no BPY, o qual gerou a mesma potência de relaxamento em aortas 2K e 2K -1C. A potência menor para TERPY e SNP foi atribuída à concentração elevada de O2- nos anéis aórticos.2 Assim, nossos resultados indicam que o efeito vascular do BPY não é modificado pelo endotélio ou pelo O2- presente na aorta 2K-1C.29

O endotélio potencializou o relaxamento em coronárias de ratos normotensos (2K) e hipertensos (2K-1C). Este efeito foi observado apenas nas coronárias e não na aorta. Em estudo anterior, se encontrou que o endotélio também potencializou o relaxamento induzido pelo SNP em anéis aórticos,18 e não encontramos estudo de coronárias avaliando o efeito do endotélio sobre o relaxamento induzido pelo SNP. No entanto, o relaxamento induzido por BPY é prejudicado em anéis coronários 2K-1C com endotélio, sem diferença na sua ausência. O relaxamento prejudicado está de acordo com nosso estudo prévio em anéis aórticos para outro composto de rutênio,2 mas não verificamos nenhuma descrição em coronárias. Em nossa opinião, a potencialização do efeito gerado no relaxamento foi maior na coronária, sugerindo que em vasos de resistência, o endotélio participa na indução do relaxamento, o que não ocorre em vasos de condutância como a aorta.30

Conclusão

Em conjunto, os resultados sugerem que 0,1 uM de BPY é capaz de normalizar o relaxamento dependente do endotélio em ratos hipertensos, e o composto BPY induz relaxamento em anéis aórticos de ratos normotensos e hipertensos com a mesma potência. Além disso, o endotélio potencializa o efeito de relaxamento induzido por BPY em anéis coronarianos de ratos normotensos e hipertensos, com menor efeito em coronárias de ratos hipertensos.

Limitações do estudo

O período curto, correspondente à duração de um mestrado.

Fontes de financiamento

Este trabalho contou com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2012/24477-8 e 2014/ 02231-2) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq concedido pelo processo 478.849/2013-3).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Izabela Pereira Vatanabe pela Universidade Federal de São Carlos.