Conception and design of the research and Writing of the manuscript: Campos DR, Celotto AC, Évora PRB; Acquisition of data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Campos DR, Celotto AC, Albuquerque AAS, Ferreira LG, Monteiro ASN, Coelho EB, Évora PRB; Analysis and interpretation of the data: Campos DR, Celotto AC, Albuquerque AAS, Monteiro ASN, Évora PRB; Statistical analysis: Campos DR, Celotto AC, Albuquerque AAS, Évora PRB; Obtaining funding: Évora PRB
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
The diterpene Sclareol has antimicrobial action, cytotoxic and cytostatic effects and anti-tumor activities. However, researches on the cardiovascular system are scarce.
This study was designed to investigate the mechanisms involved in the Sclareol cardiovascular effect in normotensive and hypertensive rats.
The arterial hypertension was promoted using 2-kidneys 1-clip model in rats. The effect of sclareol on blood pressure was performed by using three dose (10, 20 and 40 mg/kg). Cumulative dose-response curves for Sclareol were determined for endothelium-intact and endothelium-denuded aortic rings in presence or absence of L-NAME and ODQ. The NOx levels were measure in the plasma sample.
The Sclareol administration in vivo caused a significant reduction in blood pressure in both groups. In vitro the sclareol promoted relaxation in aorta, with endothelium, pre-contracted to Phe. The inhibitors of the nitric oxide synthase and soluble guanylate cyclase were as efficient as the removal of endothelium, in inhibiting the Sclareol-induced relaxation. Otherwise, it was no change of NOx. Also, for unknown reasons, the Sclareol is not selective for hypertensive animals.
The diterpene Sclareol showed in vivo hypotensive and in-vitro vasodilator effects; The chemiluminescence plasmatic NO analysis showed no significant difference between groups and The Sclareol exhibit better effect on normotensive than hypertensive animals to reduce blood pressure. It is concluded that the diterpenes metabolites would be a promising source prototype for the development of new agents in the cardiovascular therapy.
The plant kingdom has contributed in a significant way to provide substances useful in the treatment of diseases that affect humans. In this context, diterpenes are a large class of secondary metabolites produced by plants and have many important biological activities.
The diterpene Sclareol (
The experimental procedures and policies for animal handling were reviewed and approved by the Institutional Committee for Animal Care and Use of the School of Medicine of Ribeirão Preto, the University of São Paulo, and were by the European Commission's Directive 2010/63/EU. Twenty male Wistar rats (180-220 g) were housed under standard laboratory conditions (12 h light/dark cycle at 21°C) with free access to food and water. The animals were randomly by lot and divided into two groups of 7 animals: normotensive and hypertensive for blood pressure protocols and 6 control animals for vascular reactivity protocol. The rats of the hypertensive group underwent the surgical procedure 2K1C for hypertension induction while the animals of the normotensive group were sham-operated.
Acetylcholine (ACh), 1H-[1,2,4] oxadiazole [4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ), phenylephrine (Phe) and Sclareol were purchased from Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) was obtained from Calbiochem (San Diego, CA, USA). Isoflurane from Abbott. All the salts used for Krebs solution preparation were furnished by Vetec Química Fina Ltda. Almost all the drugs were prepared with distilled water, except for indomethacin (which was dissolved in ethanol) and Sclareol (solubilized in dimethyl sulfoxide and diluted in ethanol + water).
The animals were anesthetized with ketamine (50 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) intraperitoneally. After complete anesthesia, the rats were submitted to a laparotomy: half of the animals had partial constriction of the main left renal artery with a silver clip with a 0.10 mm gap (2K1C) (Goldblatt et al.,
After anesthesia (urethane, 2 g/kg, intraperitoneal), vascular cannulation and stabilization period (20 minutes) with continuous real time SBP recording, three doses of Sclareol (10, 20 and 40 mg/kg) or vehicle (DMSO and water+ethanol) were administered to the normotensive and hypertensive rats. The vehicle administration was performed before sclareol curve in the both groups and because we didn’t have difference between normotensive and hypertensive, we mixed then. Each dose was given in a 200
Five male Wistar rats (280-300 g) were anesthetized with inhalational isoflurane, followed by laparotomy for exsanguination via abdominal aorta and thoracotomy for thoracic aorta harvesting. The thoracic aorta was carefully dissected, confirmed to be free of connective tissue, and immediately immersed in Krebs solution. The Krebs solution was composed of NaCl (118.0 mM), KCl (4.7 mM), CaCl2 (2.5 mM), KH2PO4 (1.2 mM), MgSO4 (1.66 mM), glucose (11.1 mM), and NaHCO3 (25.0 mM); the solution had a pH 7.4. The thoracic aorta immersed in Krebs solution was cut into rings that were 4-5 mm in length. The endothelium was removed from some of the rings by gently rubbing the intimal surface of the blood vessel with a pair of watchmaker's forceps. This procedure effectively removes the endothelium, but it does not affect the ability of the vascular smooth muscle to contract or relax. The aortic rings were placed in isolated organ baths (10 mL) filled with Krebs solution, maintained at 37°C, and bubbled with 95% O2/5% CO2 (pH 7.4). Each arterial ring was suspended by two stainless steel clips that were inserted through the lumen. One clip was anchored to the bottom of the organ bath while the other was connected to a strain gauge to measure the isometric force with the aid of the Grass FT03 equipment (Grass Instrument Company, Quincy, MA, USA). Each ring was stretched to the optimal length-tension of 2.0 g, which had been determined in a pilot study, and was allowed to equilibrate for 60 min. During this period, tissues were washed every 15 min. The endothelium was considered to be present (E+) when the Ach-induced relaxation was at least 80% after pre-contraction with Phe (10−6 M). Endothelium was deemed to be absent (E−) when the relaxation response did not occur. Next, each ring was washed and re-equilibrated for 30 min. The aortic rings were pre-contracted with Phe (10−6 M) after a stable plateau was reached, and dose-response curves of Sclareol were obtained. The concentration-response assays in the organ baths were carried out in the presence or absence: L-NAME (10−4 M), a nonspecific nitric oxide synthase inhibitor and ODQ (10−4 M), a guanylyl cyclase inhibitor. The preparations were incubated with the inhibitors for 30 min.
Blood samples were collected through the femoral vein after sclareol administration and placed into tubes containing heparin. After blood centrifugation (3000 × g, 10 minutes, 4°C), plasma aliquots were immediately immersed in liquid nitrogen and stored at -70°C until nitrite and nitrate (NOx) measurements. Samples were analyzed in duplicates for NOx using an ozone-based chemiluminescence assay. Briefly, the plasma samples were treated with cold ethanol (1 volume of plasma: 2 volumes of ethanol for 30 minutes at −20°C) and centrifuged (4000 × g, 10 minutes). The NOx levels were measured by injecting 25
The data are expressed as means ± the standard error of the mean (SEM). We performed statistical analyzes with two-way repeated-measures analysis of variance (ANOVA) and the Bonferroni post-test, or test t Student was carried out to detect possible differences between the values in the study. P < 0.05 was considered significant. (Prism 5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). A sample size of (N = 5) animals per group provided 95% power with a 0.05 significance level to detect a relative 10% reduction in the maximal contraction in pre-contracted vessels and a sample size of (N = 7) animals per group provided 95% power with a 0.05 significance level in protocols of in vivo blood pressure measurement. The number of animals was chosen based on literature.
Before surgical procedures, there were no differences in the SBP between normotensive and hypertensive groups (sham: 120.7 ± 3.5 mmHg versus 2K1C: 133.8 ± 3.6 mmHg, p > 0.05). However, from the 1st to 3th week after the hypertension induction, the SBP significantly increased in the hypertensive rats (sham at 3th week after surgical procedures: 130.6 ± 3.8 mmHg versus 2K1C group at 3th week after surgical procedures: 192.9 ± 10.2 mmHg, p < 0.001) (
All the three doses of Sclareol (10, 20 and 40 mg/kg) significantly decreased the SBP in the normotensive rats (vehicle: -10.7 ± 6.7 mmHg versus normotensive sclareol: -43.1 ± 7.1 mmHg at 10 mg/kg, p < 0.01; vehicle: -4.8 ± 2.8 mmHg versus normotensive sclareol: -45.5 ± 6.0 mmHg at 20 mg/kg, p < 0.01; vehicle: -2.8 ± 2.3 mmHg versus normotensive Sclareol: -33.3 ± 7.0 mmHg at 40 mg/kg, p < 0.01). Nevertheless, only 20 mg/Kg dose of sclareol change the SBP in the hypertensive animals (vehicle: -4.8 ± 2.8 mmHg versus hypertensive sclareol: -39.1 ± 15.8 mmHg at, p > 0.05) (
In the case of Phe pre-contracted arteries, Sclareol promoted a dose-dependent relaxation only in intact rings (E+ 52.9 ± 5.0 % versus E- 6,9 ± 4.0%). Incubation with either L-NAME or ODQ totally blocked the relaxation induced by Sclareol in both endothelium-intact rings (
The plasma NOx concentration did not change between all groups group (vehicle: 55.4 ± 7.4
The in vivo results obtained after administration of three escalating doses of Sclareol demonstrate that it promoted a reduction in BP, both in the normotensive and hypertensive animals. The mechanisms involved in this relaxing effect remain unknown. Nevertheless, this effect may be connected with the fact that these compounds are possibly responsible for activation of NO pathways. Looking more deeply into the data collected in 2K1C model, the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) is the primary factor in the development of hypertension.
The second mechanism possible involved in the hypotensive effect of sclareol, is the vasodilator property. We tested the Sclareol vasorelaxant effect, in vitro, using isolated rat aortic rings pre-contracted with phenylephrine. The relaxant effect observed from sclareol dose-response curve, in rat aorta denuded-rings, was completely blocked by incubation with L-NAME (non-selective NOS inhibitor) and ODQ (inhibitor of guanylate cyclase), which indicates that Sclareol promotes vasorelaxation via NO/cGMP pathway.
In the present study, indirect plasma measurements of NO were carried out by determination of serum levels of nitrite and nitrate using the SieversNOAnalizer 280i. There were no significant differences between the group treated with Sclareol and the vehicle group. However, the analysis of NO in plasma can be influenced in different stages of the process, because it is a very fine analysis. From this result, the ideal would be measured in real time of NO in isolated endothelial cells stimulated with the compounds. This protocol has been tested in different ways, but we were unsuccessful. After several attempts, we believe that the compounds, in any way interfere with the reading of sly (DAF) used.
The diterpene Sclareol showed in vivo hypotensive and in-vitro vasodilator effects;
2).The chemiluminescence analysis of the plasmatic NO showed no significant difference between groups and 3) For unknown reasons, the Sclareol is not selective in hypertensive animals. So it is important that further research involving the diterpene Sclareol in the cardiovascular function can be explore more detail about mechanisms of action. From the data obtained in this study, it is concluded that the diterpenes metabolites class would be a promising source prototype for the development of new agents in the cardiovascular therapy.
This study was funded by CNPq.
This article is part of the thesis of master submitted by Debora Ribeiro Campos, from Universidade Federal de São Paulo.
Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito: Campos DR, Celotto AC, Évora PRB; Obtenção de dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Campos DR, Celotto AC, Albuquerque AAS, Ferreira LG, Monteiro ASN, Coelho EB, Évora PRB; Análise e interpretação dos dados: Campos DR, Celotto AC, Albuquerque AAS, Monteiro ASN, Évora PRB; Análise estatística: Campos DR, Celotto AC, Albuquerque AAS, Évora PRB; Obtenção de financiamento: Évora PRB.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
O diterpeno Esclareol tem ação antimicrobiana, efeitos citotóxicos e citostáticos e atividades antitumorais. No entanto, pesquisas sobre o sistema cardiovascular são escassas.
Este estudo foi desenvolvido para investigar os mecanismos envolvidos no efeito cardiovascular de Esclareol em ratos normotensos e hipertensos.
A hipertensão arterial foi promovida utilizando modelo de 2 clones de 1-clipe em ratos. O efeito do esclareol sobre a pressão arterial foi realizado utilizando três doses (10, 20 e 40 mg/kg). As curvas dose-resposta cumulativas para Esclareol foram determinadas para anéis aórticos endotélio-intactos e desprovidos de endotélio na presença ou ausência de L-NAME e ODQ. Os níveis de NOx foram medidos na amostra de plasma.
A administração de Esclareol in vivo causou uma redução significativa na pressão sanguínea em ambos os grupos. In vitro o esclareol promoveu relaxamento na aorta, com endotélio, pré-contraído a Phe. Os inibidores da óxido nítrico sintase e da guanilato ciclase solúvel foram tão eficientes quanto a remoção do endotélio, na inibição do relaxamento induzido por Esclareol. Por outra parte, não houve mudança de NOx. Além disso, por razões desconhecidas, o Sclareol não é seletivo para animais hipertensos.
O diterpeno Esclareol apresentou efeitos hipotensores in vivo e vasodilatadores in vitro; A análise de NO plasmático por quimioluminescência não mostrou diferença significativa entre os grupos e O Esclareol exibe melhor efeito sobre os animais normotensos do que hipertensos para reduzir a pressão arterial. Conclui-se que os metabólitos de diterpenos seriam um protótipo de fonte promissora para o desenvolvimento de novos agentes na terapia cardiovascular.
O reino vegetal tem contribuído de forma significativa para fornecer substâncias úteis no tratamento de doenças que afetam aos seres humanos. Neste contexto, os diterpenos são uma grande classe de metabólitos secundários produzidos pelas plantas e têm muitas atividades biológicas importantes.
O diterpeno Esclareol (
Os procedimentos e políticas experimentais de manejo de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e pela Diretiva da Comissão Europeia 2010/63/UE. Vinte ratos Wistar machos (180-220 g) foram alojados em condições laboratoriais normais (ciclo de luz/escuridão de 12 h a 21°C) com acesso livre a alimentos e água. Os animais foram sorteados e divididos em dois grupos de 7 animais: normotensos e hipertensos para protocolos de pressão arterial e 6 animais de controle para protocolo de reatividade vascular. Os ratos do grupo hipertenso foram submetidos ao procedimento cirúrgico 2K1C para indução de hipertensão, enquanto os animais do grupo normotenso foram submetidos a cirurgia sham.
Acetilcolina (ACh), 1H- [1,2,4] oxadiazole [4,3-a] quinoxalin-1-ona (ODQ), fenilefrina (Phe) e Esclareol foram adquiridos a Sigma Chemical Company (St. Louis, EUA). Foi obtido o éster metílico de Nω-nitro-L-arginina (L-NAME) de Calbiochem (San Diego, CA, EUA). Isoflurano de Abbott. Todos os sais utilizados para a preparação da solução de Krebs foram fornecidos pela Vetec Química Fina Ltda. Quase todos os fármacos foram preparados com água destilada, exceto para a indometacina (que foi dissolvida em etanol) e Esclareol (solubilizado em dimetilsulfóxido e diluído em etanol + água).
Os animais foram anestesiados com cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por via intraperitoneal. Após a anestesia completa, os ratos foram submetidos à laparotomia: metade dos animais apresentou constrição parcial da artéria renal esquerda principal com clipe de prata com uma folga de 0,10 mm (Goldblatt et al.,
Após a anestesia (uretano, 2 g/kg, intraperitoneal), canulação vascular e período de estabilização (20 minutos) com registro contínuo de PAS em tempo real, três doses de Esclareol (10, 20 e 40 mg/kg) ou veículo (DMSO e água + etanol) foram administradas aos ratos normotensos e hipertensos. A administração do veículo foi realizada antes da curva esclareol nos dois grupos e porque não tínhamos diferença entre normotensos e hipertensos, misturámos então. Cada dose foi administrada num bolus intravenoso de 200
Cinco ratos Wistar machos (280-300g) foram anestesiados com isoflurano inalatório, seguido de laparotomia para exsanguinação via aorta abdominal e toracotomia para colheita da aorta torácica. A aorta torácica foi cuidadosamente dissecada, confirmada como isenta de tecido conjuntivo, e imediatamente imersa em solução de Krebs. A solução de Krebs foi composta de NaCl (118,0 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM), MgSO4 (1,66 mM), glucose (11,1 mM) e NaHCO3 (25,0 mM); A solução tinha um pH de 7,4. A aorta torácica imersa em solução de Krebs foi cortada em anéis que tinham 4-5 mm de comprimento. O endotélio foi removido de alguns dos anéis esfregando suavemente a superfície íntima do vaso sanguíneo com um par de pinças de relojoeiro. Este procedimento remove eficazmente o endotélio, mas não afeta a capacidade do músculo liso vascular de contrair ou relaxar. Os anéis aórticos foram colocados em banhos de órgãos isolados (10 mL) cheios com solução de Krebs, mantidos a 37°C e borbulhados com 95% O2/5% CO2 (pH 7,4). Cada anel arterial foi suspenso por dois clipes de aço inoxidável que foram inseridos através do lúmen. Um grampo foi ancorado ao fundo do banho de órgãos enquanto o outro foi ligado a um medidor de tensão para medir a força isométrica com o auxílio do equipamento Grass FT03 (Grass Instrument Company, Quincy, MA, EUA). Cada anel foi esticado para a tensão de comprimento óptima de 2,0 g, que tinha sido determinada num estudo piloto, e foi deixado a equilibrar durante 60 min. Durante este período, os tecidos foram lavados a cada 15 min. Considerou-se que o endotélio estava presente (E +) quando o relaxamento induzido pelo Ach era pelo menos 80% após a pré-contração com Phe (10-6 M). O endotélio foi considerado ausente (E-) quando a resposta de relaxamento não ocorreu. Em seguida, cada anel foi lavado e reequilibrado durante 30 min. Os anéis aórticos foram pré-contraídos com Phe (10-6 M) após atingir um patamar estável e foram obtidas curvas dose-resposta de Esclareol. Os ensaios de concentração-resposta nos banhos de órgãos foram realizados na presença ou ausência: L-NAME (10-4 M), um inibidor inespecífico da óxido nítrico sintase e ODQ (10-4 M), um inibidor da guanilil ciclase. As preparações foram incubadas com os inibidores durante 30 min.
As amostras de sangue foram colhidas através da veia femoral após administração de esclareol e colocadas em tubos contendo heparina. Após centrifugação com sangue (3000 × g, 10 minutos, 4°C), alíquotas de plasma foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70°C até as medições de nitrito e nitrato (NOx). As amostras foram analisadas em duplicado para NOx utilizando um ensaio de quimioluminescência a base de ozônio. Resumidamente, as amostras de plasma foram tratadas com etanol frio (1 volume de plasma: 2 volumes de etanol durante 30 minutos a -20°C) e centrifugadas (4000 × g, 10 minutos). Os níveis de NOx foram medidos por injeção de 25
Os dados são expressos como médias ± o desvio padrão da média (SEM). Realizou-se análise estatística com análise de variância bidirecional de medidas repetidas (ANOVA) e pós-teste de Bonferroni, ou teste t de Student para detectar possíveis diferenças entre os valores no estudo. P < 0,05 foi considerado significativo. (Prism 5.0, Software GraphPad, San Diego, CA, EUA). Um tamanho de amostra de (N = 5) animais por grupo proporcionou potência de 95% com um nível de significância de 0,05 para detectar uma redução relativa de 10% na contração máxima em vasos pré-contraídos e um tamanho de amostra de (N = 7) animais por grupo proporcionou potência de 95% com um nível de significância de 0,05 nos protocolos de medição da pressão sanguínea in vivo. O número de animais foi escolhido com base na literatura.
Antes dos procedimentos cirúrgicos, não havia diferenças na PAS entre os grupos normotensos e hipertensos (sham: 120,7 ± 3,5 mmHg versus 2K1C: 133,8 ± 3,6 mmHg, p > 0,05). No entanto, da 1ª à 3ª semana após a indução da hipertensão, a PAS aumentou significativamente nos ratos hipertensos (sham na 3ª semana após os procedimentos cirúrgicos: 130,6 ± 3,8 mmHg versus grupo 2K1C na 3ª semana após os procedimentos cirúrgicos: 192,9 ± 10,2 mmHg, p < 0,001) (
Todas as três doses de Esclareol (10, 20 e 40 mg/kg) diminuíram significativamente a PAS em ratos normotensos (veículo: -10,7 ± 6,7 mmHg versus esclareol normotensos: -43,1 ± 7,1 mmHg a 10 mg/kg, p < 0,01, Veículo: -4,8 ± 2,8 mmHg versus esclareol normotenso: -45,5 ± 6,0 mmHg a 20 mg/kg, p < 0,01, veículo: -2,8 ± 2,3 mmHg versus Esclareol normotenso: -33,3 ± 7,0 mmHg a 40 mg/kg, p < 0,01). No entanto, apenas a dose de 20 mg/Kg de esclareol altera a PAS nos animais hipertensos (veículo: -4,8 ± 2,8 mmHg versus esclareol hipertensivo: -39,1 ± 15,8 mmHg a, p> 0,05) (
No caso das artérias pré-contraídas, o Esclareol promoveu um relaxamento dose-dependente apenas nos anéis intactos (E + 52,9 ± 5,0% versus E - 6,9 ± 4,0%). A incubação com L-NAME ou ODQ bloqueou totalmente o relaxamento induzido por Esclareol em ambos os anéis intactos do endotélio (
A concentração plasmática de NOx não se alterou entre todos os grupos (veículo: 55,4 ± 7,4
Os resultados in vivo obtidos após a administração de três doses crescentes de Esclareol demonstram que promoveu uma redução na PA, tanto nos animais normotensos como nos hipertensos. Os mecanismos envolvidos neste efeito relaxante permanecem desconhecidos. No entanto, este efeito pode estar relacionado com o fato de estes compostos serem possivelmente responsáveis pela ativação das vias de NO. Analisando mais profundamente os dados coletados no modelo 2K1C, o sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) é o fator primário no desenvolvimento da hipertensão.
O segundo mecanismo possível envolvido no efeito hipotensivo do esclareol, é a propriedade vasodilatadora. Testou-se o efeito vasorrelaxante do Esclareol, in vitro, utilizando anéis aórticos isolados de rato pré-contraídos com fenilefrina. O efeito relaxante observado a partir da curva dose-resposta de esclareol, nos anéis desnudados de aorta de rato, foi completamente bloqueado por incubação com L-NAME (inibidor não seletivo de NOS) e ODQ (inibidor da guanilato ciclase), o que indica que o Esclareol promove a vasorrelaxação via caminho NO/cGMP.
No presente estudo, as medições indiretas do NO foram realizadas por determinação dos níveis séricos de nitrito e nitrato utilizando o SieversNOAnalizer 280i. Não houve diferenças significativas entre o grupo tratado com Esclareol e o grupo veículo. No entanto, a análise do NO no plasma pode ser influenciada em diferentes estágios do processo, pois é uma análise muito fina. A partir deste resultado, o ideal seria medir em tempo real de NO em células endoteliais isoladas estimuladas com os compostos. Este protocolo foi testado de diferentes maneiras, mas não tivemos sucesso. Após várias tentativas, acreditamos que os compostos, de alguma forma interferem com a leitura do sly (DAF) usado.
O diterpeno Esclareol mostrou efeitos in vivo e hipotensores in-vitro;
2). A análise de quimioluminescência do NO plasmático não mostrou diferença significativa entre os grupos e 3) Por razões desconhecidas, o Esclareol não é seletivo em animais hipertensos. Por isso, é importante que mais pesquisas envolvendo o diterpeno Esclareol na função cardiovascular possam explorar mais detalhes sobre os mecanismos de ação. A partir dos dados obtidos neste estudo, conclui-se que a classe de metabólitos de diterpenos seria um protótipo de fonte promissora para o desenvolvimento de novos agentes na terapia cardiovascular.
O presente estudo foi parcialmente financiado pelo CNPq.
Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Debora Ribeiro Campos pela Universidade de São Paulo.