Abstract

Arq Bras Cardiol

abc

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC

gkY5JZbpf8VRJcpzFjQY8Vc

S0066-782X2017000700063

10.5935/abc.20170081

S0066-782X2017005011102

Original Article

Gestational Protein Restriction Increases Cardiac Connexin 43 mRNA levels in male adult rat offspring

Rossini

Kamila Fernanda

Oliveira

Camila Andrea de

Rebelato

Hércules Jonas

Esquisatto

Marcelo Augusto Marreto

Catisti

Rosana

Centro Universitário Hermínio Ometto Programa de Pós Graduação em Ciências Biomédicas

Araras

Brazil Programa de Pós Graduação em Ciências Biomédicas do Centro Universitário Hermínio Ometto FHO - UNIARARAS, Araras, SP - Brazil Centro Universitário Hermínio Ometto

Mailing Address: Rosana Catisti Av. Maximiliano Baruto 500, Postal Code 13607-339, Jardim Universitário, Araras, São Paulo - Brazil. E-mail: rosanacatisti@uniararas.br, rocatisti@hotmail.com

Author contributions

Conception and design of the research, Statistical analysis, Obtaining funding and Writing of the manuscript: Catisti R; Acquisition of data: Rossini KF, Rebelato HJ; Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Oliveira CA, Esquisatto MAM, Catisti R.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

29 06 2017

07 2017

109 01 63 70 28 09 2016 23 01 2017 03 03 2017

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract Background:

The dietary limitation during pregnancy influences the growth and development of the fetus and offspring and their health into adult life. The mechanisms underlying the adverse effects of gestational protein restriction (GPR) in the development of the offspring hearts are not well understood.

Objectives:

The aim of this study was to evaluate the effects of GPR on cardiac structure in male rat offspring at day 60 after birth (d60).

Methods:

Pregnant Wistar rats were fed a normal-protein (NP, 17% casein) or low-protein (LP, 6% casein) diet. Blood pressure (BP) values from 60-day-old male offspring were measured by an indirect tail-cuff method using an electro sphygmomanometer. Hearts (d60) were collected for assessment of connexin 43 (Cx43) mRNA expression and morphological and morphometric analysis.

Results:

LP offspring showed no difference in body weight, although they were born lighter than NP offspring. BP levels were significantly higher in the LP group. We observed a significant increase in the area occupied by collagen fibers, a decrease in the number of cardiomyocytes by 10⁴ µm², and an increase in cardiomyocyte area associated with an increased Cx43 expression.

Conclusion:

GPR changes myocardial levels of Cx43 mRNA in male young adult rats, suggesting that this mechanism aims to compensate the fibrotic process by the accumulation of collagen fibers in the heart interstitium.

Keywords: Pregnancy Fetal Development Connexin 43 Metabolism

Introduction

Maternal dietary restriction is a recognized cause of mortality at birth1 and low-birth weight.2 The concept of "programming" is used to associate prenatal events to changes in fetal growth that may become pathological in adulthood.3^,4 Although molecular and physiological changes resulting from nutritional imbalance during pregnancy allow the offspring to survive, the long-term cardiovascular effects imposed by these changes promote structural modifications and changes in components of the renal, respiratory, endocrine, and central nervous systems.5^,6 Recent data have shown bioenergetic changes in liver mitochondria of 30-day-old pups born from mothers undergoing protein restriction during gestation.7 In addition, gestational protein restriction (GPR) has been shown to be an important risk factor for cardiovascular disorders later in life.8

During electrical activation of the heart, all myocytes are individually activated by currents flowing through intercellular junctions. In the cardiovascular system, these gap junctions include one or more of four connexins - namely, Cx37, Cx40, Cx43, and Cx45 - that work together during the initial cardiovascular development.9 Gap junctions also ensure the mechanical and electrical communication between different types of muscle cells.10 This role is crucial in the heart since proper ejection of blood to the circulation depends necessarily on a coordinated contraction of both atrial and ventricular cardiomyocytes.11^,12 Pathological conditions such as diabetes and hypertension are associated with deletions and changes in the regulation of connexin expression13 while connexin genes may have deleterious effects on cardiac function.14

The aim of this study was to evaluate the effects of GPR on cardiac structure in male rat offspring at day 60 (d60) after birth. We specifically investigated their blood pressure (BP) values during the 8th week of life, morphological and morphometric parameters of left ventricular cardiomyocytes, and Cx43 mRNA levels. Our choice to study the molecular profile of Cx43 was based on the fact that this is the most abundant and expressed connexin in the heart. This is the first study describing the cardiac expression of this gene in rats subjected to GPR.

Methods Animal care

All experiments were conducted in strict agreement with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and approved by the local Animal Care and Use Committee (Permit Nº. 056/2014). Ten-week-old virgin female Wistar rats weighing 180 to 250 g were mated with males. After confirming the pregnancy with observation of sperm in a vaginal smear (day 1 of pregnancy), we randomly allocated the pregnant rats (n = 12) on individual cages to receive an isocaloric and normal sodium semisynthetic diet (AIN 93G, Pragsoluções, Jau, SP, Brazil) with a normal protein content (17% casein, normal-protein [NP] group, n = 6, numbered from 1 to 6: 1NP to 6NP) or a low protein content (6% casein, low-protein [LP] group, n = 6, numbered from 1 to 6: 1LP to 6LP) (Table 1), as previously described.7^,15 The animals were maintained at a controlled temperature (21 ± 1ºC) on a 12-h light/dark cycle, with free access to water until they delivered pups at 22 days of gestation. The anogenital distance was measured in all pups16 and litters were culled to a maximum of 8 males pups to minimize variation in nutrition during the suckling period. All liveborn male offspring of each mother were used in the experiments. When the number of male pups was less than 8, the number was increased by female pups until this value was reached. After weaning, the pups were housed in cages for a maximum of 4 animals, numbered and identified according to their affiliation. The number of cages followed the identification number of the mothers (from 1 to 6, NP or LP). When the number of male pups of each mother exceeded four, the cages were identified by the number of the mother plus the letters A or B. The identification of the pups in the cages was done by the marking on the tail: 1st (without tail marking), 2nd (one tail trace), 3rd (two tail traces) and 4th (three tail traces). All the animals were identified by this method and the total number of male rats was 21 for the NP group and 37 for the LP group. They received ad libitum water and a standard laboratory diet (21.6% protein and 4.0% lipid, Nuvilab CR-1, Nuvital, Colombo, PR, Brazil). On the 8th week of life, their BP levels were measured and, after anesthesia with ketamine (75 mg·kg⁻¹ body weight, i.p.) and xylazine (10 mg·kg⁻¹ body weight, i.p.), their hearts were removed for analysis. The hearts were weighed, and fragments from the middle third of the left ventricles were processed for morphological and molecular analyses. Twelve animals (NP, n = 6; LP, n = 6; 1 male rat for each of the mothers, randomly) were perfused for measurement of the cross-sectional area of the cardiomyocytes.

Table 1 Composition of the diets fed to the pregnant rats: normal protein (NP, 17%) and low protein (LP, 6%)<xref ref-type="bibr" rid="B7">7</xref>,<xref ref-type="bibr" rid="B15">15</xref>

g/kg	NP (17%)	LP (6%)
Cornstarch	397	480
Casein (84%)	202	71.5
Dextrin (90-94%)	130.5	159
Sucrose	100	121
Soybean oil	70	70
Fiber	50	50
Salt mixture (AIN 93 GMX)	35	35
Vitamin mix (AIN 93 VX)	10	10
L-cystine	3	1
Choline bitartrate	2.5	2.5

Blood pressure measurement

Systemic arterial pressure was measured in conscious 7- and 8-week-old rats (LP, n = 12; NP, n = 12; 2 rats for each of the mothers, randomly) by an indirect tail-cuff method using an electrosphygmomanometer combined with a pneumatic pulse transducer/amplifier (IITC Life Science Inc., CA, USA). This indirect approach allowed repeated measurements with a close correlation (correlation coefficient = 0.975) to direct intra-arterial recording. The mean of three consecutive readings represented the BP level of the animal.

Tissue collection: histology and morphometric analysis

Hearts were removed and longitudinally sectioned in the middle region in two halves. For histological analysis, the upper and lower halves of the six hearts from each experimental group animal were fixed using Millonig's solution and treated for paraffin embedding. Six-micrometer-thick sections were obtained from each blocked tissue from the middle region and stained with toluidine blue (TB) and picrosirius-hematoxylin (PH). Three of the sections stained with TB were used for cardiomyocyte counting (number per 10⁴ µm²) and three other sections stained with PH were used for quantification of collagen fibers using polarization microscopy (% of birefringence area in 10⁴ µm²). Five representative fields obtained from each longitudinal section of the left ventricle of each rat (150,000 µm² of total area by animal heart) were analyzed by light microscopy (Leica DM 2000 Photomicroscope) and captured with a digital Leica DFC 425 digital camera (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Each digital image was photographed with the × 40 objective and formatted at fixed pixel density (8 × 10 inches at 150 dpi) using Sigma Scan Pro (v.6.0). At each digital image, the cardiomyocytes were counted following recommendation by Olivetti et al.17 and the area of birefringent collagen fibers was calculated as described by Mendes et al.18 For the analyses, the investigators were blinded to the group allocation.

Measurement of cardiomyocyte cross-sectional area

The animals were anesthetized and perfused by the left carotid artery with saline containing heparin (5%) for 15 min and subsequently with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) containing 4% (w/v) paraformaldehyde for 25 min. After perfusion, myocardial tissue samples were obtained from the septum and free wall of the middle part of the left ventricle and fixed in 4% phosphate-buffered formalin during 24 h for paraffin embedding. Five-micrometer-thick sections were cut from the blocked tissue and stained with hematoxylin-eosin (HE). The cross-sectional area of the cardiomyocytes was determined in at least 100 myocytes per slide stained with HE. The measurements were performed under a Leica DM 2000 microscope (x40 magnification lens) attached to a digital camera (Leica DFC 425, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) and connected to a personal computer equipped with the image analyser software Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). The cardiomyocyte area was measured with a digitizing pad, and the selected cells were transversely cut with the nucleus clearly identified in the center of the myocyte.19

RNA isolation and semiquantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

Total RNA was isolated from ~100-mg samples of left ventricular tissue with the TRIzol® reagent (Invitrogen, CA, USA) and digested with DNAse I, Amplification Grade (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. RNA concentration was determined by measuring UV absorbance at 260 nm using a spectrophotometer, and integrity was confirmed by formaldehyde gel electrophoresis. Samples of total RNA were stored at -80ºC until further use for analysis. cDNA was synthesized from 2 µg of RNA in the presence of dithiothreitol, dNTP, random primers, RNAseOUT, and SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen) in a final volume of 20 µL. Semiquantitative analysis of Cx43 mRNA expression was performed by RT-PCR in a final volume of 25 µL containing 1 µL of cDNA, 1.6 mM of MgCl₂, 200 µM of each dNTP, 0.2 ρmol of each primer, and 0.04 U of Taq DNA polymerase (Invitrogen, Itapevi, SP, Brazil). Cx43 was amplified using gene-specific forward (5´-GATTGAAGAGCACGGCAAGG-3') and reverse (5´-GTGTAGACCGCGCTCAAG-3´) primers with an expected amplicon of 144 bp (Tm 58ºC). ACTB (β-actin) was used as a housekeeping gene (Tm 57ºC; forward primer 5´-AGAGGGAAATCGTGCGTGACA-3' and reverse primer 5´-CGATAGTGATGACCTGACCGTCA-3´) yielding an amplification product of 178 bp that was used to normalize the Cx43 mRNA levels.

The amplified products were separated on 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide, visualized, and photographed with the gel documentation system Syngene G: Box®. The signal intensity of the bands was measured densitometrically using the Scion Image software. Each value was determined as the mean of three densitometric readings. The results are expressed as average ratios of the relative optical densities of Cx43 PCR products in relation to the β-actin gene.

Data analysis

The results were analyzed using the GraphPad Prism software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) and are reported as the mean ± standard deviation (SD) of the measurements from six different animals. In cases in which two groups were compared, we used unpaired Student's t-test with a significance level of 5% (p < 0.05). When appropriate, we used analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's post-hoc test.

Results Characteristics of the animals

A previous analysis of the weight of pups on day 1 after birth (published by our research group and shown in Figure 1A 7^,20 for validation of the GPR model) showed that male offspring of mothers fed a low-protein diet (LP, n = 37, □ symbols, weight 6.40 ± 0.21 g) were significantly lighter than offspring of mothers fed a normal-protein diet (NP, n = 21, ■ symbols, weight 7.805 ± 0.51 g, * p = 0.0048, Figure 1A).7^,20 Figure 1B shows the body weight gain of the animals over a period of 60 days after birth. At d60, there was no significant difference in weight between the NP and LP male offspring (LP, n = 37, □ symbols, final weight 271.8 ± 66.66 g; NP, n = 21, ■ symbols, final weight 298.3 ± 68.68 g).

Figure 1 Effect of gestational protein restriction on the offspring weights. (A) weights on day 1 of male offspring of rats fed a normal-protein diet (NP, 17% protein, ■ symbol) or low-protein diet (LP, 6% protein, symbol □) during pregnancy (X ± SD, * p = 0.0048 versus NP); (B) growth curve of the offspring from the 1st to the 60th day after birth.

Effect of GPR on systemic arterial pressure and cardiac mass at d60

The mean systemic BP values of the offspring at the 8th week of life are shown in Figure 2A. Values in the LP group (131.8 ± 2.7 mmHg) were significantly higher than those in the NP group (120.3 ± 3.33 mmHg, p = 0.021). Hearts isolated at d60 were quickly weighed after sacrifice, and their weights showed no significant difference (NP, 1.71 ± 0.34 g; LP, 1.48 ± 0.22 g), as shown in Figure 2B. Similarly, the ratio of heart tissue weight (mg) and body weight (g) (Figure 2C) showed no significant difference between groups (NP, 3.89 ± 0.48 mg/g; LP, 3.86 ± 0.28 mg/g).

Figure 2 Effect of gestational protein restriction on the blood pressure levels and their cardiac mass of the offspring at d60. (A) blood pressure (mmHg); (B) cardiac mass (g); (C) ratio (mg/g) of the cardiac mass and body mass in young male offspring of rats fed a normal-protein diet (NP, full bar) or low-protein diet (LP, empty bars) (n = 12; X ± SD, * p = 0.021 versus NP).

Effect of GPR on cardiac morphology

Figure 3A shows the quantification of the area of collagen fibers in the heart of rats at d60. We observed a significant increase in the collagen fiber area in the heart of LP animals compared with NP ones. Morphometric analysis by TB staining allowed quantification of the number of myocytes present in the heart of NP and LP male offspring. The results showed a significant decrease in the number of myocytes in the hearts of LP offspring when compared with NP ones (Figure 3B). After perfusion of some animals (n = 6), the left ventricles were collected, weighed and processed for quantitation of the cardiomyocyte area. The ratio of left ventricle weight (mg) and body weight (g) (Figure 3C) showed no significant difference in the NP (2.28 ± 0.25 mg/g) and LP (2.49 ± 0.27 mg/g) groups. As seen in Figure 3D, the area of myocytes was significantly larger in the LP group (188.2 ± 4.14 µm²) compared with the NP group (160.8 ± 2.57 µm²).

Figure 3 Effect of gestational protein restriction on cardiac morphometry at d60. (A) percentage of collagen fibers area/104 µm2 in left ventricular sections stained with picrosirius-hematoxylin (n = 6; *** p < 0.0001 versus NP); (B) number of myocytes/104 µm2 in left ventricular sections stained with toluidine blue (n = 6; * p < 0.0001 versus NP); (C) relationship between left ventricular weight and body mass (mg/g) at the age of 60 days in offspring of rats fed a normal-protein diet (NP, full bars) or low-protein diet (LP, empty bars); (D) cardiomyocyte cross-sectional area (µm2; X ± SD; n > 100 myocytes; *** p < 0.0001 versus NP).

Modulation of Cx43 in the heart

We collected left ventricular fragments for analysis of Cx43 expression. The values after densitometric analysis are shown in Figure 4. Compared with the NP group, the LP group showed significant increases in Cx43 mRNA levels (NP, 0.695 ± 0.058, n = 4, rats born to 4 different mothers; LP, 0.799 ± 0.032, n = 4; rats born to 4 different mothers).

Figure 4 RT-PCR of Cx43 mRNA expression in the left ventricle (A) and densitometric analysis (B). Young male offspring of rats fed a normal-protein diet (NP, full bar) or low-protein diet (LP, empty bar) at d60 (n = 4; X ± SD of the optical density of Cx43 mRNA expression relative to β-actin; * p = 0.02 versus NP).

Discussion

As expected and described in the literature,7^,20^,21 offspring of rats that received a low-protein diet (LP group) were born lighter than offspring of rats fed a normal-protein diet (NP group). Fetal exposure to glucocorticoids (GC) has been proposed as one of the main risk factors for chronic diseases in adulthood.22 Exogenous or endogenous (maternal stress) fetal exposure to excess GC reduces fetal growth.23^-25 During pregnancy, high levels of cortisol (in women)26 and corticosterone (in rats)27 are present in the maternal circulation.24 Several studies in rats have shown that maternal malnutrition in response to maternal stress increases corticosterone levels in the plasma, decreases placental expression of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11β-HSD2), and increases placental expression of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11β-HSD1).24^,28 A study in sheep fetuses has shown that mineralocorticoid (MR) and GC (GR) receptors, as well as 11β-HSD1 are abundantly expressed in myocytes and cardiac blood vessels.29 The authors suggested that GC have access to both MR and GR in the fetal heart, and when GC plasma levels are elevated during a low-protein diet, the GC action in the cardiac MR and GR receptors also increases. GC could stimulate cardiac growth, either by hypertrophy or hyperplasia, or possibly even both. Cardiac hypertrophy could also result from high BP levels.30 At d60 in our study, the LP offspring had increased systolic BP levels in parallel to an increased area of cardiac collagen fibers. However, these changes were not sufficient to increase the heart weight, which would then characterize the changes as cardiac hypertrophy. Although the area of the cardiomyocytes increased, the number of cardiomyocytes reduced. This finding, observed in young male offspring hearts in our study, support the evidence of interstitial collagen deposition, a symptom of cardiac hypertrophy in response to hypertension in adult human hearts.30

The renin-angiotensin system (RAS) plays an important role in primary and secondary forms of hypertension. Components of the RAS, such as angiotensin-converting enzyme (ACE) and angiotensin II, are locally produced in cardiac tissues31 and are primary candidates for factors promoting remodeling, mainly cardiac myocyte hypertrophy and increased extracellular fibrosis, which lead to deterioration in cardiac function.32 Various experimental animal models have been developed to investigate the associations between fetal undernutrition and cardiovascular disease later in life,33^,34 and a possible involvement of systemic RAS in the development of hypertension has been reported.35^,36

The composition of the extracellular matrix in physiological and pathophysiological conditions can affect the degree of electrical coupling in cardiac myocytes.37 The conduction of electrical impulses in the heart is determined mainly by three key parameters: electrical coupling between cardiomyocytes, excitability of individual cardiomyocytes, and connective tissue architecture.37 These parameters of conduction are primarily mediated by Cx43, NaV1.5 sodium channels, and by the amount of collagen fibers, respectively. In cardiac arrhythmias,38 abnormalities in any of these driving parameters have frequently been observed. Cx43 is generally down-regulated, less phosphorylated, and/or redistributed at the intercalated discs along the lateral aspects of the cardiomyocyte.14^,39^,40 Our study provides the first evidence of increased Cx43 expression in rat hearts induced by GPR. Although our results are limited, we hypothesize that the increased deposition of collagen fibers in the heart associated with increased systolic BP lead to changes in the cardiac conduction of electrical impulses. In response to this injury and associated with the observed increased cardiomyocyte area, the preservation of cell-to-cell communication via upregulation of myocardial Cx43 may be attributed to a protective effect.

Conclusion

Using a rat model of fetal protein restriction, we showed that GPR affects the organization and number of myocytes in the offspring heart and increases the amount of collagen fibers in the cardiac tissue, showing clearly a degenerative process compatible with fibrosis. This finding reinforces the association between maternal malnutrition with low birth weight and the risk of cardiovascular morbidity in adulthood. GPR increases the area of cardiomyocytes and expression of Cx43 in the myocardium of young adult male rats, suggesting that this mechanism aims to compensate the fibrotic process by the accumulation of collagen fibers in the heart interstitium.

Sources of Funding

This study was funded by Fundação Hermínio Ometto.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Kamila Fernanda Rossini, from Centro Universitário Hermínio Ometto.

Acknowledgments

The authors thank Daniela Neodini and Renata Barbieri for their excellent technical assistance. This work was partially supported by grants from the Brazilian funding agencies FHO-Uniararas. KFR was the recipient of a graduate fellowships grant from the Biomedical Sciences Graduate Program, FHO-Uniararas.

References 1

1 Kingdom JC, Burrell SJ, Kaufmann P. Pathology and clinical implications of abnormal umbilical artery doppler waveforms ultrasound. Obstet Gynecol. 1997;9(4):271-86.

Kingdom

Burrell

Kaufmann

Pathology and clinical implications of abnormal umbilical artery doppler waveforms ultrasound

Obstet Gynecol 1997 9 4 271 286

2 De Onis M, Blossner M, Borghi E, Frongillo EA, Morris R. Estimates of global prevalence of childhood underweight in 1990 and 2015. JAMA. 2004;291(21):2600-6.

De Onis

Blossner

Borghi

Frongillo

Morris

Estimates of global prevalence of childhood underweight in 1990 and 2015

JAMA 2004 291 21 2600 2606

3 Seckl JR. Physiologic programming of the fetus. Clin Perinatol. 1988;15(4):939-62.

Seckl

Physiologic programming of the fetus

Clin Perinatol 1988 15 4 939 962

4 Seckl JR. Prenatal glucocorticoids and long-term programming. Eur J Endocrinol. 2004;151(Suppl 3):U49-U62.

Seckl

Prenatal glucocorticoids and long-term programming

Eur J Endocrinol 2004 151 Suppl 3 U49 U62

5 Barker DJ, Osmond C. Infant mortality, childhood nutrition, and ischaemic heart disease in England and Wales. Lancet. 1986;1(8489):1077-81.

Barker

Osmond

Infant mortality, childhood nutrition, and ischaemic heart disease in England and Wales

Lancet 1986 1 8489 1077 1081

6 Fowden AL, Giussani DA, Forhead AJ. Intrauterine programming of physiological systems: causes and consequences. Physiology (Bethesda). 2006; 21:29-37.

Fowden

Giussani

Forhead

Intrauterine programming of physiological systems: causes and consequences

Physiology (Bethesda) 2006 21 29 37

7 Moraes C, Rebelato HJ, Amaral MEC, Resende TM, Silva EV, Esquisatto MAM, Catisti. Effect of maternal protein restriction on liver metabolism in rat offspring. J Physiol Sci. 2014; 64(5):347-55.

Moraes

Rebelato

Amaral

MEC

Resende

Silva

Esquisatto

MAM

Catisti

Effect of maternal protein restriction on liver metabolism in rat offspring

J Physiol Sci 2014 64 5 347 355

8 Sathishkumar K, Elkins R, Yallampalli U, Yallampalli C. Protein restriction during pregnancy induces hypertension in adult female rat offspring - influence of oestradiol. Br J Nutr. 2012; 107(5):665-73.

Sathishkumar

Elkins

Yallampalli

Protein restriction during pregnancy induces hypertension in adult female rat offspring - influence of oestradiol

Br J Nutr 2012 107 5 665 673

9 Figueroa XF, Duling BR. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxid Redox Signal. 2009;11(2):251-66.

Figueroa

Duling

Gap junctions in the control of vascular function

Antioxid Redox Signal 2009 11 2 251 266

10 Spray DC, Burt JM. Structure activity relations of cardiac gap-junction channel. Am J Phys. 1990;258(2Pt1):C195-205.

Spray

Burt

Structure activity relations of cardiac gap-junction channel

Am J Phys 1990 258 2

Pt1

C195 C205

11 Peters NS. Gap junctions and clinical cardiology: from molecular biology to molecular medicine. Eur Heart J. 1997;18(11):1697-702.

Peters

Gap junctions and clinical cardiology: from molecular biology to molecular medicine

Eur Heart J 1997 18 11 1697 1702

12 Severs NJ. Pathophysiology of gap junctions in heart disease. J Card Electrophys. 1994;5(5):462-75.

Severs

Pathophysiology of gap junctions in heart disease

J Card Electrophys 1994 5 5 462 475

13 Haefliger JA, Meda P. Chronic hypertension alters the expression of Cx43 in cardiovascular muscle cells. Braz J Med Biol Res. 2000; 33(4): 431-8.

Haefliger

Meda

Chronic hypertension alters the expression of Cx43 in cardiovascular muscle cells

Braz J Med Biol Res 2000 33 4 431 438

14 Fontes MS, van Veen TA, de Bakker JM, van Rijen HV. Functional consequences of abnormal Cx43 expression in the heart. Biochim Biophys Acta 2012;1818(8):2020-9.

Fontes

van Veen

de Bakker

van Rijen

Functional consequences of abnormal Cx43 expression in the heart

Biochim Biophys Acta 2012 1818 8 2020 2029

15 Reeves PG, Rossow KL, Lindlauf J. Development and testing of the AIN-93 purified diets for rodents: results on growth, kidney calcification and bone mineralization in rats and mice. J Nutr. 1993;123(11):1923-31.

Reeves

Rossow

Lindlauf

Development and testing of the AIN-93 purified diets for rodents: results on growth, kidney calcification and bone mineralization in rats and mice

J Nutr 1993 123 11 1923 1931

16 Zambrano E, Bautista CJ, Deás M, Martínez-Samayoa PM, González-Zamorano M, Ledesma H, et al. A low maternal protein diet during pregnancy and lactation has sex- and window of exposure-specific effects on offspring growth and food intake, glucose metabolism and serum leptin in the rat. J Physiol. 2006; 571(Pt1):221-30.

Zambrano

Bautista

Deás

Martínez-Samayoa

González-Zamorano

Ledesma

A low maternal protein diet during pregnancy and lactation has sex- and window of exposure-specific effects on offspring growth and food intake, glucose metabolism and serum leptin in the rat

J Physiol 2006 571

Pt1

221 230

17 Olivetti G, Giordano G, Corradi D, Melissari M, Lagrasta C, Gambert SR, Anversa P. Gender differences and aging: effects on the human heart. J Am Coll Cardiol. 1995;26(4):1068-79.

Olivetti

Giordano

Corradi

Melissari

Lagrasta

Gambert

Anversa

Gender differences and aging: effects on the human heart

J Am Coll Cardiol 1995 26 4 1068 1079

18 Mendes AB, Ferro M, Rodrigues B, Souza MR, Araujo RC, Souza RR. Quantification of left ventricular myocardial collagen system in children, young adults, and the elderly. Medicina (B Aires). 2012;72(3):216-20.

Mendes

Ferro

Rodrigues

Souza

Araujo

Souza

Quantification of left ventricular myocardial collagen system in children, young adults, and the elderly

Medicina (B Aires) 2012 72 3 216 220

19 Silva RB, Mesquita FF, Andreo M, Assalin HB, Gontijo JAR, Boer PA. Effect of gestational protein restriction on left ventricle hypertrophy and heart angiotensin II signaling pathway in adult offspring rats. Health. 2013;5(4A):78-84.

Silva

Mesquita

Andreo

Assalin

Gontijo

JAR

Boer

Effect of gestational protein restriction on left ventricle hypertrophy and heart angiotensin II signaling pathway in adult offspring rats

Health 2013 5 4A 78 84

20 Rebelato HJ, Esquisatto MAM, Moraes C, Amaral MEC, Catisti R. Gestational protein restriction induces alterations in placental morphology and mitochondrial function in rats during late pregnancy. J Mol Histol. 2013;44(6):629-37.

Rebelato

Esquisatto

MAM

Moraes

Amaral

MEC

Catisti

Gestational protein restriction induces alterations in placental morphology and mitochondrial function in rats during late pregnancy

J Mol Histol 2013 44 6 629 637

21 Langley-Evans SC, Phillips GJ, Benediktsson R, Gardner DS, Edwards CR, Jackson AA, Seckl JR. Maternal dietary protein restriction, placental glucocorticoid metabolism and the program of hypertension. Placenta. 1996;17(2-3):169-72.

Langley-Evans

Phillips

Benediktsson

Gardner

Edwards

Jackson

Seckl

Maternal dietary protein restriction, placental glucocorticoid metabolism and the program of hypertension

Placenta 1996 17 2-3 169 172

22 Seckl JR, Holmes MC. Mechanisms of disease: glucocorticoids, their placental metabolism and fetal 'programming' of adult pathophysiology. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2007;3(6):479-88.

Seckl

Holmes

Mechanisms of disease: glucocorticoids, their placental metabolism and fetal 'programming' of adult pathophysiology

Nat Clin Pract Endocrinol Metab 2007 3 6 479 488

23 Belkacemi L, Chen CH, Ross MG, Desai M. Increased placental apoptosis in maternal food restricted gestations: role of the Fas pathway. Placenta. 2009; 30(9):739-51.

Belkacemi

Chen

Ross

Desai

Increased placental apoptosis in maternal food restricted gestations: role of the Fas pathway

Placenta 2009 30 9 739 751

24 Belkacemi L, Jelks A, Chen CH, Ross MG, Desai, M. Altered placental development in undernourished rats: the role of maternal glucocorticoids. Reprod Biol Endocrinol. 2011;9:105.

Belkacemi

Jelks

Chen

Ross

Desai

Altered placental development in undernourished rats: the role of maternal glucocorticoids

Reprod Biol Endocrinol 2011 9 105 105

25 Seckl JR, Meaney MJ. Glucocorticoid programming. Ann N Y Acad Sci. 2004; 1032:63-84.

Seckl

Meaney

Glucocorticoid programming

Ann N Y Acad Sci 2004 1032 63 84

26 Nolten WE, Rueckert PA. Elevated free cortisol index in pregnancy: possible regulatory mechanisms Am J Obstet Gynecol. 1981;139(4):492-8.

Nolten

Rueckert

Elevated free cortisol index in pregnancy: possible regulatory mechanisms

Am J Obstet Gynecol 1981 139 4 492 498

27 Neaves WB, Billingham RE. Transplantation of the testis. Transplantation. 1979;28(3):163-5.

Neaves

Billingham

Transplantation of the testis

Transplantation 1979 28 3 163 165

28 Lesage J, Blondeau B, Grino M, Breant B, Dupouy JP. Maternal undernutrition during late gestation induces fetal overexposure to glucocorticoids and intrauterine growth retardation, and disturbs the hypothalamo-pituitary adrenal axis in the newborn rat. Endocrinology. 2001;142(5):1692-702.

Lesage

Blondeau

Grino

Breant

Dupouy

Maternal undernutrition during late gestation induces fetal overexposure to glucocorticoids and intrauterine growth retardation, and disturbs the hypothalamo-pituitary adrenal axis in the newborn rat

Endocrinology 2001 142 5 1692 1702

29 Reini SA, Wood CE, Jensen E, Keller-Wood M. Increased maternal cortisol in late gestation ewes decreases fetal cardiac expression of 11?-HSD2 mRNA and the ratio of AT1 to AT2 receptor mRNA. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2006; 291(6):R1708-16.

Reini

Wood

Jensen

Keller-Wood

Increased maternal cortisol in late gestation ewes decreases fetal cardiac expression of 11?-HSD2 mRNA and the ratio of AT1 to AT2 receptor mRNA

Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2006 291 6 R1708 R1716

30 Diez J. Mechanisms of cardiac fibrosis in hypertension. J Clin Hypertens. 2007; 9(7):546-50.

Diez

Mechanisms of cardiac fibrosis in hypertension

J Clin Hypertens 2007 9 7 546 550

31 Varagic J, Frohlich ED. Local cardiac renin-angiotensin system: hypertension and cardiac failure. J Mol Cell Cardiol. 2002; 34(11):1435-42.

Varagic

Frohlich

Local cardiac renin-angiotensin system: hypertension and cardiac failure

J Mol Cell Cardiol 2002 34 11 1435 1442

32 Berecek KH, Reaves P, Raizada M. Effects of early perturbation of the reninangiotensin system on cardiovascular remodeling in spontaneously hypertensive rats. Vasc Pharmacol. 2005;42(3):93-8.

Berecek

Reaves

Raizada

Effects of early perturbation of the reninangiotensin system on cardiovascular remodeling in spontaneously hypertensive rats

Vasc Pharmacol 2005 42 3 93 98

33 Holemans K, Aerts L, Van Assche FA. Fetal growth restriction and consequences for the offspring in animal models. J Soc Gynecol Investig. 2003; 10(7):392-9.

Holemans

Aerts

Van Assche

Fetal growth restriction and consequences for the offspring in animal models

J Soc Gynecol Investig 2003 10 7 392 399

34 Ozaki T, Nishina H, Hanson MA, Poston L. Dietary restriction in pregnant rats causes gender-related hypertension and vascular dysfunction in offspring. J Physiol. 2001;530(Pt1):141-52.

Ozaki

Nishina

Hanson

Poston

Dietary restriction in pregnant rats causes gender-related hypertension and vascular dysfunction in offspring

J Physiol 2001 530

Pt1

141 152

35 Rasch R, Skriver E, Woods LL. The role of the RAS in programming of adult hypertension. Acta Physiol Scand. 2004;181(4):537-42.

Rasch

Skriver

Woods

The role of the RAS in programming of adult hypertension

Acta Physiol Scand 2004 181 4 537 542

36 Kawamura M, Itoh H, Yura S, Mogami H, Suga S, Makino H, Miyamoto Y, Yoshimasa Y, Sagawa N, Fujii S. Undernutrition in utero augments systolic blood pressure and cardiac remodeling in adult mouse offspring: possible involvement of local cardiac angiotensin system in developmental origins of cardiovascular disease. Endocrinology. 2007;148(3):1218-25.

Kawamura

Itoh

Yura

Mogami

Suga

Makino

Miyamoto

Yoshimasa

Sagawa

Fujii

Undernutrition in utero augments systolic blood pressure and cardiac remodeling in adult mouse offspring: possible involvement of local cardiac angiotensin system in developmental origins of cardiovascular disease

Endocrinology 2007 148 3 1218 1225

37 Shanker AJ, Yamada K, Green KG, Yamada KA, Saffitz JE. Matrix-protein-specific regulation of Cx43 expression in cardiac myocytes subjected to mechanical load. Circ Res. 2005;96(5):558-66.

Shanker

Yamada

Green

Yamada

Saffitz

Matrix-protein-specific regulation of Cx43 expression in cardiac myocytes subjected to mechanical load

Circ Res 2005 96 5 558 566

38 Kleber AG, Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias Physiol Rev. 2004;84(2):431-88.

Kleber

Rudy

Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias Physiol

Rev 2004 84 2 431 488

39 Severs NJ, Bruce AF, Dupont E, Rothery S. Remodelling of gap junctions and connexin expression in diseased myocardium. Cardiovasc Res. 2008;80(1):9-19.

Severs

Bruce

Dupont

Rothery

Remodelling of gap junctions and connexin expression in diseased myocardium

Cardiovasc Res 2008 80 1 9 19

40 Fontes MS, Raaijmakers AJ, van Doorn T, Kok B, Nieuwenhuis S, van der Nagel R, et al. Changes in Cx43 and NaV1.5 expression precede the occurrence of substantial fibrosis in calcineurin-induced murine cardiac hypertrophy. PLoS One. 2014;9(1):e87226.

Fontes

Raaijmakers

van Doorn

Kok

Nieuwenhuis

van der Nagel

Changes in Cx43 and NaV1.5 expression precede the occurrence of substantial fibrosis in calcineurin-induced murine cardiac hypertrophy

PLoS One 2014 9 1

e87226

Artigos

Restrição Proteica Gestacional Aumenta Níveis de RNAm de Conexina 43 no Coração de Filhotes Machos Adultos

Rossini

Kamila Fernanda

Oliveira

Camila Andrea de

Rebelato

Hércules Jonas

Esquisatto

Marcelo Augusto Marreto

Catisti

Rosana

Programa de Pós Graduação em Ciências Biomédicas do Centro Universitário Hermínio Ometto FHO - UNIARARAS, Araras, SP - Brasil

Correspondência: Rosana Catisti Av. Maximiliano Baruto 500, CEP 13607-339, Jardim Universitário, Araras, São Paulo - Brasil. E-mail: rosanacatisti@uniararas.br, rocatisti@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Análise estatística, Obtenção de financiamento e Redação do manuscrito: Catisti R; Obtenção de dados: Rossini KF, Rebelato HJ; Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Oliveira CA, Esquisatto MAM, Catisti R.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Resumo Fundamento:

A limitação dietética durante a gravidez influencia o crescimento e desenvolvimento do feto e da prole e sua saúde na vida adulta. Os mecanismos subjacentes dos efeitos adversos da restrição proteica gestacional (RPG) no desenvolvimento dos corações da prole não são bem compreendidos.

Objetivos:

Avaliar os efeitos da RPG sobre a estrutura cardíaca em filhotes machos de ratas aos 60 dias após o nascimento (d60).

Métodos:

Ratos fêmeas Wistar grávidas foram alimentadas com uma dieta de proteína normal (PN, 17% caseína) ou de baixa proteína (BP, caseína 6%). Os valores de pressão arterial (PA) de descendentes do sexo masculino de 60 dias de idade foram medidos por meio de um método indireto de manguito de cauda usando um eletro esfigmomanômetro. Os corações (d60) foram coletados para avaliação da expressão de RNAm da conexina 43 (Cx43) e análise morfológica e morfométrica.

Resultados:

A prole BP não mostrou diferença no peso corporal, embora tenha nascido mais leve do que a prole PN. Os níveis de PA foram significativamente mais altos no grupo BP. Observou-se um aumento significativo na área ocupada pelas fibras colágenas, diminuição do número de cardiomiócitos em 10⁴ µm² e aumento da área de cardiomiócitos associada ao aumento da expressão de Cx43.

Conclusão:

A RPG altera os níveis miocárdicos de RNAm de Cx43 em ratos adultos jovens, sugerindo que este mecanismo visa compensar o processo fibrótico pelo acúmulo de fibras de colágeno no interstício cardíaco.

Palavras-chave: Gestação Desevolvimento Fetal Conexina 4 Metabolismo

Introdução

A restrição dietética materna é uma causa reconhecida de mortalidade ao nascimento1 e baixo peso ao nascer.2 O conceito de "programação" é utilizado para associar eventos pré-natais a mudanças no crescimento fetal que podem se tornar patológicas na idade adulta.3^,4 Embora as alterações moleculares e fisiológicas resultantes do desequilíbrio nutricional durante a gravidez permitam que a prole sobreviva, os efeitos cardiovasculares a longo prazo impostos por essas mudanças promovem modificações estruturais e alterações nos componentes dos sistemas renal, respiratório, endócrino e nervoso central.5^,6 Dados recentes têm mostrado alterações na bioenergética mitocondrial hepática de filhotes de 30 dias nascidos de mães submetidas a restrição proteica durante a gestação.7 Além disso, a restrição proteica gestacional (RPG) tem se mostrado um importante fator de risco para doenças cardiovasculares na vida adulta.8

Durante a atividade elétrica do coração, todos os miócitos são ativados individualmente pelo fluxo elétrico através das junções intercelulares. No sistema cardiovascular, estas junções gap incluem uma ou mais de quatro conexinas - nomeadamente, Cx37, Cx40, Cx43 e Cx45 - que trabalham em conjunto durante o início do desenvolvimento cardiovascular.9 As junções gap também garantem a comunicação mecânica e elétrica entre diferentes tipos de células musculares.10 Esse papel é crucial no coração, uma vez que a correta ejeção do sangue para a circulação depende necessariamente de uma contração coordenada tanto dos cardiomiócitos auriculares como ventriculares.11^,12 Condições patológicas como diabetes e hipertensão estão associadas a deleções e alterações na regulação da expressão da conexina,13 enquanto que os genes da conexina podem ter efeitos deletérios na função cardíaca.14

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da RPG sobre a estrutura cardíaca em filhotes machos de ratas no dia 60 (d60) após o nascimento. Nós investigamos especificamente seus valores de pressão arterial (PA) durante a 8ª semana de vida, os parâmetros morfológicos e morfométricos dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo e os níveis de RNAm de Cx43. Nossa escolha para estudar o perfil molecular de Cx43 foi baseada no fato de que esta é a conexina mais abundante e expressa no coração. Este é o primeiro estudo que descreve a expressão cardíaca deste gene em ratos submetidos a RPG.

Métodos Cuidados com animais

Todos os experimentos foram conduzidos em estrita concordância com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (Permissão Nº. 056/2014). Ratos Wistar fêmeas virgens de dez semanas de idade, pesando 180 a 250 g, foram acasaladas com machos. Após a confirmação da prenhez pela observação observação de espermatozoides em um esfregaço vaginal (dia 1 da gestação), alocamos aleatoriamente as ratas prenhes (n = 12) em gaiolas individuais para receber uma dieta semisintética isocalórica e normal de sódio (AIN 93G, Pragsoluções, Jau, SP, Brasil) com um conteúdo proteico normal (17% de caseína, grupo de proteína normal [PN], n = 6, numerado de 1 a 6: 1PN a 6PN) ou baixo teor proteico (caseína 6% BP], n = 6, numerado de 1 a 6: 1BP a 6BP) (Tabela 1), conforme descrito anteriormente.7^,15 Os animais foram mantidos a uma temperatura controlada (21 ± 1ºC) em um ciclo de luz/escuridão de 12 h, com acesso livre à água até o nascimento dos filhotes aos 22 dias de gestação. A distância anogenital foi medida em todos os filhotes16 e as ninhadas foram sacrificadas até um máximo de 8 filhotes machos para minimizar a variação na nutrição durante o período de amamentação. Todas as crias machos vivos de cada mãe foram utilizadas nos experimentos. Quando o número de filhotes foi menor do que 8, o número foi aumentado por filhotes fêmeas até que este valor foi atingido. Após o desmame, os filhotes foram alojados em gaiolas para um máximo de 4 animais, numerados e identificados de acordo com sua afiliação. O número de gaiolas seguiu o número de identificação das mães (de 1 a 6, PN ou BP). Quando o número de filhotes machos de cada mãe excedeu quatro, as gaiolas foram identificadas pelo número da mãe mais as letras A ou B. A identificação dos filhotes nas gaiolas foi feita pela marcação na cauda: 1º (sem marcação na cauda), 2º (um traço na cauda), 3º (dois traços na cauda) e 4º (três traços na cauda). Todos os animais foram identificados por este método e o número total de ratos machos foi de 21 para o grupo PN e 37 para o grupo BP. Receberam água ad libitum e uma dieta padrão de laboratório (21,6% de proteína e 4,0% de lipídeo, Nuvilab CR-1, Nuvital, Colombo, PR, Brasil). Na 8ª semana de vida, os níveis de PA foram medidos e, após anestesia com cetamina (75 mg · kg^-1 de peso corporal, ip) e xilazina (10 mg · kg^-1 de peso corporal, ip), os corações foram removidos para análise. Os corações foram pesados e fragmentos do terço médio dos ventrículos esquerdos foram processados para análises morfológicas e moleculares. Doze animais (PN, n = 6, BP, n = 6; um macho por cada uma das mães, aleatoriamente) foram perfundidos para a medição da área da seção transversal dos cardiomiócitos.

Tabela 1 Composição das dietas das ratas prenhes: proteína normal (PN, 17%) e baixa proteína (BP, 6%)<xref ref-type="bibr" rid="B7">7</xref>,<xref ref-type="bibr" rid="B15">15</xref>

g/kg	PN (17%)	BP (6%)
Amido de milho	397	480
Caseína (84%)	202	71.5
Dextrina (90-94%)	130.5	159
Sacarose	100	121
Óleo de soja	70	70
Fibra	50	50
Mistura de sal (AIN 93 GMX)	35	35
Mistura de vitaminas (AIN 93 VX)	10	10
L-cistina	3	1
Bitartrato de colina	2.5	2.5

Medição da pressão arterial

A pressão arterial sistêmica foi medida em ratos conscientes de 7 e 8 semanas de idade (BP, n = 12; PN, n = 12; 2 ratos por cada uma das mães, aleatoriamente) por meio de um método indireto de manguito de cauda usando um eletro esfigmomanômetro combinado com um transdutor/amplificador de pulso pneumático (IITC Life Science Inc., CA, EUA). Esta abordagem indireta permitiu medidas repetidas com uma estreita correlação (coeficiente de correlação = 0,975) para direcionar o registro intra-arterial. A média de três leituras consecutivas representou o nível de PA do animal.

Coleta de tecidos: histologia e análise morfométrica

Os corações foram removidos e seccionados longitudinalmente na região média em duas metades. Para análise histológica, as metades superior e inferior dos seis corações de cada animal do grupo experimental foram fixadas utilizando a solução de Millonig e tratadas para inclusão de parafina. Foram obtidas seções de 6 micrómetros de espessura de cada bloco de tecido da região média e coradas com azul de toluidina (AT) e picrosirius-hematoxilina (PH). Três das seções coradas com TB foram utilizadas para a contagem de cardiomiócitos (número por 10⁴ µm²) e três outras seções coradas com PH para a quantificação de fibras de colágeno utilizando microscopia de polarização (% de área de birrefringência em 10⁴ µm²). Cinco campos representativos obtidos de cada seção longitudinal do ventrículo esquerdo de cada rato (150.000 µm² de área total por coração animal) foram analisados por microscopia óptica (Leica DM 2000 Photomicroscope) e capturados com uma câmara digital Leica DFC 425 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). Cada imagem digital foi fotografada com o objetivo x40 e formatada com densidade de pixels fixa (8 × 10 polegadas a 150 dpi) usando Sigma Scan Pro (v.6.0). Em cada imagem digital, os cardiomiócitos foram contados seguindo a recomendação de Olivetti et al.17 e a área de fibras de colágeno birrefringentes foi calculada como descrito por Mendes et al.18 Para as análises, a alocação dos grupos foi feita às cegas pelos pesquisadores.

Medição da área da seção transversal dos cardiomiócitos

Os animais foram anestesiados e perfundidos pela artéria carótida esquerda com solução salina contendo heparina (5%) durante 15 min e subsequentemente com tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) contendo paraformaldeído a 4% (p/v) durante 25 min. Após a perfusão, amostras de tecido miocárdico foram obtidas a partir do septo e parede livre da parte média do ventrículo esquerdo e fixadas em 4% de formalina tamponada com fosfato durante 24 h para inclusão de parafina. Foram cortadas seções de 5 micrómetros de espessura do tecido e coradas com hematoxilina-eosina (HE). A área da seção transversal dos cardiomiócitos foi determinada em pelo menos 100 miócitos por lamela corada com HE. As medições foram realizadas com um microscópio Leica DM 2000 (lente de ampliação x40) ligado a uma câmara digital (Leica DFC 425, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e ligados a um computador pessoal equipado com o software de análise de imagem Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA). Mediu-se a área de cardiomiócitos com uma almofada de digitalização e as células selecionadas foram cortadas transversalmente com o núcleo claramente identificado no centro do miócito.19

Isolamento de RNA e reação em cadeia da polimerase via <italic>transcriptase</italic> reversa semiquantitativa (RT-PCR)

O RNA total foi isolado a partir de amostras de 100 mg de tecido ventricular esquerdo com o reagente TRIzol® (Invitrogen, CA, EUA) e digerido com DNAse I, Grau de Amplificação (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorvência de UV a 260 nm utilizando um espectrofotómetro, e a integridade foi confirmada por eletroforese em gel de formaldeído. As amostras de RNA total foram armazenadas a -80ºC até análise posterior. O cDNA foi sintetizado a partir de 2 µg de RNA na presença de ditiotreitol, dNTP, primers aleatórios, RNAseOUT e Transcriptase Reversa SuperScript™ II (Invitrogen) num volume final de 20 µL. A análise semiquantitativa da expressão de RNAm de Cx43 foi realizada por RT-PCR num volume final de 25 µL contendo 1 µL de DNAc, 1,6 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µmol de cada primer e 0,04 U de DNA polimerase Taq Invitrogen, Itapevi, SP, Brasil). Cx43 foi amplificado utilizando iniciadores específicos para o gene (5'-GATTGAAGAGCACGGCAAGG-3') e reverso (5'-GTGTAGACCGCGCTCAAG-3') com um amplicon esperado de 144 bp (Tm 58ºC). Utilizou-se ACTB (beta-actina) como um gene constitutivo (Tm 57ºC, primer direto 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGACA-3 'e primer reverso 5'-CGATAGTGATGACCTGACCGTCA-3') produzindo um produto de amplificação de 178 bp que foi utilizado para normalizar os níveis de RNAm de Cx43. Os produtos amplificados foram separados em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio, visualizado e fotografado com o sistema de documentação de gel Syngene G: Box®. A intensidade do sinal das bandas foi medida densitometricamente usando o software Scion Image. Cada valor foi determinado como a média de três leituras densitométricas. Os resultados são expressos como a razão da densidade ótica relativa do produto de PCR da Cx43 em relação ao gene da beta actina.

Análise de dados

Os resultados foram analisados utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA) e são relatados como a média ± desvio padrão (DP) das medições de seis animais diferentes. Nos casos em que foram comparados dois grupos, utilizou-se o teste t de Student não pareado com nível de significância de 5% (p < 0,05). Quando apropriado, utilizamos a análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste post-hoc de Tukey.

Resultados Características dos animais

Uma análise prévia do peso dos filhotes no dia 1 após o nascimento (publicado pelo nosso grupo de pesquisa e mostrado na Figura 1A 7^,20 para validação do modelo RPG) (PN, n = 37, □ símbolos, peso 6,40 ± 0,21 g) foram significativamente mais leves do que os descendentes de mães alimentadas com uma dieta normal em proteínas (PN, n = 21, ■ símbolos, peso 7,805 ± 0,51 g, p = 0,0048, Figura 1A).7^,20 A Figura 1B mostra o ganho de peso corporal dos animais durante um período de 60 dias após o nascimento. No d60, não houve diferença significativa no peso entre os os animais dos grupos PN e BP (BP, n = 37, □ símbolos, peso final 271,8 ± 66,66 g, PN, n = 21, ■ símbolos, peso final 298,3 ± 68,68 g).

Figura 1 Efeito da restrição protéica gestacional nos pesos da prole. (A) no dia 1 de descendência masculina de ratos alimentados com uma dieta de proteína normal (PN, 17% de proteína, ■ símbolo) ou dieta de baixa proteína (BP, 6% de proteína, símbolo □) durante a gravidez (X ± DP, *p = 0,0048 versus PN); (B) curva de crescimento da prole desde o 1º ao 60º dia após o nascimento.

Efeito da RPG na pressão arterial sistêmica e massa cardíaca em d60

Os valores médios de PA sistémica da prole na 8ª semana de vida são mostrados na Figura 2A. Os valores no grupo BP (131,8 ± 2,7 mmHg) foram significativamente maiores que os do grupo PN (120,3 ± 3,33 mmHg, p = 0,021). Os corações isolados em d60 foram rapidamente pesados após o sacrifício, e seus pesos não mostraram diferença significativa (PN, 1,71 ± 0,34 g, BP, 1,48 ± 0,22 g), como mostrado na Figura 2B. De forma semelhante, a razão entre o peso do tecido cardíaco (mg) e o peso corporal (g) (Figura 2C) não mostrou diferença significativa entre os grupos (PN, 3,89 ± 0,48 mg/g, BP, 3,86 ± 0,28 mg/g).

Figura 2 Efeito da restrição protéica gestacional nos níveis de pressão arterial e massa cardíaca da prole em d60. (A) pressão sanguínea (mmHg); (B) massa cardíaca (g); (Mg/g) da massa cardíaca e da massa corporal em descendentes de machos jovens de ratos alimentados com uma dieta de proteína normal (PN, barra cheia) ou dieta de baixa proteína (BP, barras vazias) (n = 12; X ± DP, * p = 0,021 versus PN).

Efeito do RPG na morfologia cardíaca

A Figura 3A mostra a quantificação da área de fibras de colágeno no coração de ratos a d60. Observamos um aumento significativo na área de fibras de colágeno no coração de animais BP em comparação com os PN. A análise morfométrica pela coloração da AT permitiu a quantificação do número de miócitos presentes no coração da linhagem PN e BP. Os resultados mostraram uma diminuição significativa no número de miócitos nos corações da descendência BP quando comparados com os PN (Figura 3B). Após a perfusão de alguns animais (n = 6), os ventrículos esquerdos foram coletados, pesados e processados para quantificação da área de cardiomiócitos. A relação entre o peso do ventrículo esquerdo (mg) e o peso corporal (g) (Figura 3C) não mostrou diferença significativa nos grupos PN (2,28 ± 0,25 mg/g) e BP (2,49 ± 0,27 mg/g). Como visto na Figura 3D, a área de miócitos foi significativamente maior no grupo BP (188,2 ± 4,14 µm²) em comparação com o grupo PN (160,8 ± 2,57 µm²).

Figura 3 Efeito da restrição protéica gestacional na morfometria cardíaca em d60. (A) porcentagem de área de fibras de colágeno / 104 µm2 em seções do ventrículo esquerdo coradas com picrosirius-hematoxilina (n = 6; *** p <0,0001 versus PN); (B) número de miócitos / 104 µm2 nas seções do ventrículo esquerdo coradas com azul de toluidina (n = 6; * p < 0,0001 versus PN); (C) relação entre peso ventricular esquerdo e massa corporal (mg/g) aos 60 dias de descendência de ratos alimentados com uma dieta de proteína normal (PN, barras cheias) ou dieta de baixa proteína (BP, barras vazias); (D) área de seção transversal dos cardiomiócitos (µm2, X ± DP, n > 100 miócitos, *** p < 0,0001 versus PN).

Modulação de Cx43 no coração

Recolhemos fragmentos do ventrículo esquerdo para análise da expressão de Cx43. Os valores após análise densitométrica são mostrados na Figura 4. Em comparação com o grupo PN, o grupo BP apresentou aumentos significativos nos níveis de RNAm de Cx43 (PN, 0,695 ± 0,058, n = 4, ratos nascidos de 4 mães diferentes, BP, 0,799 ± 0,032, N = 4, ratos nascidos de 4 mães diferentes).

Figura 4 RT-PCR da expressão de RNAm de Cx43 no ventrículo esquerdo (A) e análise densitométrica (B). Os descendentes masculinos jovens de ratos alimentados com uma dieta de proteína normal (PN, barra cheia) ou dieta de baixa proteína (BP, barra vazia) a d60 (n = 4; X ± DP da densidade óptica da expressão de RNA de Cx43 em relação a β-Actina; * p = 0,02 versus PN).

Discussão

Como esperado e descrito na literatura,7^,20^,21 os descendentes de ratas que receberam uma dieta de baixa proteína (grupo BP) nasceram mais leves que os descendentes de ratos alimentados com uma dieta de proteína normal (grupo PN). A exposição fetal aos glicocorticoides (GC) tem sido proposta como um dos principais fatores de risco para doenças crônicas na idade adulta.22

A exposição fetal exógena ou endógena (estresse materno) ao excesso de GC diminui o crescimento fetal.23^-25 Durante a gravidez, altos níveis de cortisol (em mulheres)26 e corticosterona (em ratos)27 estão presentes na circulação materna.24 Vários estudos em ratos mostraram que a desnutrição materna em resposta ao estresse materno aumenta os níveis de corticosterona no plasma, diminui a expressão placentária da 11β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 (11β-HSD2) e aumenta a expressão placentária da 11β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 1 -HSD1).24^,28 Um estudo em fetos de ovelhas mostrou que os receptores mineralocorticoides (MR) e GC (GR), assim como o 11β-HSD1, são expressos abundantemente nos miócitos e nos vasos sanguíneos cardíacos.29 Os autores sugeriram que o GC tem acesso a MR e a GR no coração fetal e quando os níveis plasmáticos de GC são elevados durante uma dieta de baixa proteína, a ação do GC nos receptores MR e GR cardíacos também aumenta. O GC poderia estimular o crescimento cardíaco, quer por hipertrofia ou hiperplasia, ou possivelmente por ambos. A hipertrofia cardíaca também pode resultar de níveis elevados de PA30. No d60 em nosso estudo, a prole BP tinha aumentado os níveis de PA sistólica em paralelo a uma área aumentada de fibras de colágeno cardíaco. No entanto, estas alterações não foram suficientes para aumentar o peso cardíaco, o que poderia caracterizar as alterações como hipertrofia cardíaca. Embora a área dos cardiomiócitos tenha aumentado, o número de cardiomiócitos diminuiu. Esse achado, observado em corações de machos jovens de prole em nosso estudo, apoia a evidência de acúmulo de colágeno intersticial, um sintoma de hipertrofia cardíaca em resposta à hipertensão em corações humanos adultos.30

O sistema renina-angiotensina (RAS) desempenha um papel importante nas formas primária e secundária de hipertensão. Os componentes do RAS, como a enzima conversora da angiotensina (IECA) e a angiotensina II, são produzidos localmente nos tecidos cardíacos31 e são candidatos primários a fatores promotores de remodelação, principalmente hipertrofia cardíaca de miócitos e aumento da fibrose extracelular, que levam à deterioração da função cardíaca.32 Vários modelos animais experimentais foram desenvolvidos para investigar as associações entre desnutrição fetal e doença cardiovascular na vida adulta,33^,34 e um possível envolvimento do RAS sistêmico no desenvolvimento de hipertensão arterial foi relatado.35^,36

A composição da matriz extracelular em condições fisiológicas e fisiopatológicas pode afetar o grau de acoplamento elétrico em miócitos cardíacos.37 A condução de impulsos elétricos no coração é determinada principalmente por três parâmetros-chave: acoplamento elétrico entre cardiomiócitos, excitabilidade de cardiomiócitos individuais e arquitetura do tecido conjuntivo.37 Estes parâmetros de condução são mediados principalmente por Cx43, canais de sódio NaV1.5, e pela quantidade de fibras de colágeno, respectivamente. Nas arritmias cardíacas,38 foram frequentemente observadas anomalias em qualquer um destes parâmetros de condução. Cx43 é geralmente regulado negativamente, menos fosforilado e/ou redistribuído nos discos intercalares ao longo do cardiomiócito.14^,39^,40 Nosso estudo fornece a primeira evidência de aumento da expressão de Cx43 em corações de ratos submetidos à RPG. Embora nossos resultados sejam limitados, nossa hipótese é que o aumento do acúmulo de fibras de colágeno no coração associado com aumento da pressão arterial sistólica leva a alterações na condução de impulsos elétricos cardíacos. Em resposta a esta lesão e associada à ao aumento da área de cardiomiócitos observada, a preservação da comunicação célula a célula através da regulação positiva da Cx43 miocárdica pode ser atribuída a um efeito protetor.

Conclusão

Usando um modelo de rato de restrição proteica fetal, mostramos que a RPG afeta a organização e o número de miócitos no coração da prole e aumenta a quantidade de fibras de colágeno no tecido cardíaco, mostrando claramente um processo degenerativo compatível com fibrose. Esse achado reforça a associação entre desnutrição materna com baixo peso ao nascer e o risco de morbidade cardiovascular na idade adulta. A RPG aumenta a área de cardiomiócitos e a expressão de Cx43 no miocárdio de ratos machos adultos jovens, sugerindo que este mecanismo visa compensar o processo fibrótico pelo acúmulo de fibras de colágeno no interstício cardíaco.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela Fundação Hermínio Ometto.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Kamila Fernanda Rossini pelo Centro Universitário Hermínio Ometto.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Daniela Neodini e Renata Barbieri pela sua excelente assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente apoiado por doações das agências de fomento brasileiras FHO-Uniararas. KFR foi o beneficiário de uma bolsa de pós-graduação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biomédicas, FHO-Uniararas.