Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCjCC7CPcS6vdnkdKDFrZhpRqS0066-782X201700070005410.5935/abc.20170087S0066-782X2017005011105Original ArticleCardioprotective Effect of Crocin Combined with Voluntary Exercise in Rat: Role of Mir-126 and Mir-210 in Heart AngiogenesisGhorbanzadehVajiheMohammadiMustafaDariushnejadHassanAbhariAlirezaChodariLeilaMohaddesGisouTabriz University of Medical SciencesDrug Applied Research CenterTabrizIranDrug Applied Research Center - Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz - IranTabriz University of Medical SciencesMailing Address: Gisou Mohaddes Golgasht Ave. 5166614766. Meadle East. Tabriz - East Azarbaijan, Iran. E-mail: gmohades@yahoo.com
Author contributions
Conception and design of the research, Writing of the manuscript and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Ghorbanzadeh V, Mohammadi M, Mohaddes G; Acquisition of data: Ghorbanzadeh V, Dariushnejad H, Abhari A, Chodari L; Analysis and interpretation of the data: Ghorbanzadeh V, Dariushnejad H, Abhari A; Statistical analysis:Ghorbanzadeh V, Dariushnejad H, Mohaddes G.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
29062017072017109015462140720162001201709032017This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
Crocin is reported to have a wide range of biological activities such as cardiovascular protection. Recent epidemiologic studies have shown that exercise reduces cardiovascular morbidity and mortality in the general population.
Objective:
The aim of this study was to evaluate the effect of crocin and voluntary exercise on miR-126 and miR-210 expression levels and angiogenesis in the heart tissue.
Methods:
Animals were divided into 4 groups: control, exercise, crocin, and exercise-crocin. Animals received oral administration of crocin (50 mg/kg) or performed voluntary exercise alone or together for 8 weeks. Akt, ERK1/2 protein levels, miR-126 and miR-210 expression were measured in the heart tissue. Immunohistochemical method was used to detect CD31 in the heart tissue.
Results:
Akt and ERK1/2 levels of the heart tissue were higher in crocin treated group and voluntary exercise trained group after 8 weeks. Combination of crocin and exercise also significantly enhanced Akt and ERK1/2 levels in the heart tissue. MiR-126, miR-210 expression and CD31 in the heart increased in both crocin and voluntary exercise groups compared with control group. In addition, combination of exercise and crocin amplified their effect on miR-126 and miR-210 expression, and angiogenesis.
Conclusion:
Crocin and voluntary exercise improve heart angiogenesis possibly through enhancement of miR-126 and miR-210 expression. Voluntary exercise and diet supplementation with crocin could have beneficial effects in prevention of cardiovascular disease.
Crocin is a bioactive constituent found in the fruits of gardenia and in the stigmas of saffron.1 Crocin has long been used in traditional medicine and has been reported to have various pharmacological activities, such as antioxidant, anti-cancer, anti-inflammation, anti-atherosclerotic effects, and protection against cardiovascular diseases.2 The cardioprotective effects of crocin has been reported in some studies that are related to modulation of endogenous antioxidant enzymatic activities and cardiac biomarkers.3,4 Recent evidence has indicated the protective effect of crocin on hypoxic damage of myocardial cells by elevation of vascular endothelial growth factor (VEGF), as a proangiogenic factor.5
Physical activity plays a critical role in metabolism, cardiovascular function, and immune function. In the last years it became evident that exercise training is a very powerful therapeutic strategy for prevention of development and progression of cardiovascular disease.6 Nevertheless, exhaustive exercise may be problematic, as they are stressful through production of reactive oxygen species and can cause damage to muscle tissue and other organs.7,8 It has been suggested that voluntary exercise may be a better model with more beneficial effects.9 In the animal model of voluntary exercise, the animal has free access to a running wheel and uses the wheel according to its physiological threshold for physical activity. It has been discovered that physical activity triggers extension of the capillary network or angiogenesis. This process is known to be VEGF dependent.10 However, the underlying mechanisms of exercise have yet to be fully elucidated.
Micro-RNAs (miRs) are small non-coding 18-25 nucleotide RNAs that play a key role in regulating gene expression by inhibiting protein translation or enhancing messenger RNA degradation.11,12 Their participation in cardiovascular disease has been recognized during recent years.11-13 MiR-126 is one of the few miRNAs that is an endothelial cell-specific miRNA and plays an essential role in neoangiogenesis. MiRNA-126 is strongly expressed in the heart endothelium and targets Sprouty-related protein-1 (Spred-1), PIK3R2, a regulatory subunit of PI3K.14,15 Downregulation of these targets activates survival kinases ERK and Akt and enhances the actions of vascular endothelial growth factor (VEGF).16,17 VEGF exerts many of its effects on angiogenesis via the Akt and ERK1/2 pathways. During developmental vasculogenesis, the Akt pathway regulates venous specification, whereas the ERK pathway regulates arterial specification.18,19 MiR-210 overexpression in normoxic endothelial cells stimulated the formation of capillary like structures as well as VEGF-driven cell migration.20 MiR-210 induction is a virtually constant feature of the hypoxic response that is important in the pathogenesis of several human diseases, such as heart disease.21
According to the advantage effects of crocin and voluntary exercise on diabetes that mentioned above, we hypothesized that, compared with crocin or voluntary exercise alone, 8 weeks of crocin combined with voluntary exercise in diabetic rats would produce a larger improvement in cardiovascular complications of type 2 diabetes. The present study was undertaken to clarify the effect of crocin and voluntary exercise on miR-126 and miR-210 expression in cardiac myocytes of diabetic rats.
MethodsAnimals
Male Wistar rats (200-250g) were obtained from Tabriz medical faculty (Iran-Tabriz). Animals were housed in a room with a constant temperature of 24ºC, a relative humidity of 50%, and a 12h dark/light cycle with access to food and water ad libitum. Animals in the exercise group were placed in individual wheel-cage units while the sedentary groups were housed in normal plastic cages. This study was approved by the Animal Ethics Committee (document number 92197) in accordance with the instruction for the care and use of laboratory animals prepared by Tabriz University of Medical Sciences.
Experimental design
Forty animals were randomly divided into four groups. Ten animals were allocated to each experimental group at the beginning of the study. Group 1: Rats received NaCl 0.9 % Solution as a control group (Con). Group 2: Rats received a single dose of crocin (50 mg/kg) for eight weeks (Cro). Group 3: Rats performed voluntary exercise for eight weeks (Exe). Group 4: Animals received crocin and simultaneously performed voluntary exercise for eight weeks (Cro-Exe).
Crocin powder (Sigma, Germany) was diluted by normal saline (0.9%). Crocin was gavaged (50 mg/kg) 6 days a week for 8 weeks.22 In addition, NaCl 0.9 % solution was gavaged in groups 1 and 3 during experiment.
For the assessment of voluntary exercise, rats were housed individually in a cage containing a wheel (1.00 m circumference, TajhizGostar). Each exercising rat had a separate running wheel in its cage that allowed it to run voluntarily during 8 weeks of the study. This stainless-steel running wheel was equipped with a digital magnetic counter that was activated by wheel rotation and wheel revolutions were recorded daily. Then the running distance per day was calculated as the number of wheel revolutions each day. Rats with running distance lower than ~2000 m per day were eliminated before statistical analysis.23 Considering the excluding criteria (exercise below standard protocols) statistical analysis was performed for 7 animals in each group.
Quantification of Akt and ERK1/2 in heart by ELISA
On the final day of experiment, rats were sacrificed under deep anesthesia with ketamine/xylazine (88/10 mg/kg, i.p.). Heart tissue immediately removed and washed with saline 0.9%. Tissue samples were weighted, homogenized in PBS (pH 7.2-7.4) and centrifuged for 20 min at the speed of 3000 rpm and 4ºC. Then supernatants were collected in new tube and Akt and ERK1/2 levels were measured using sandwich rat ELISA kits. The ELISA assay was performed according to the manufacturer's instructions. Akt protein activation by phosphorylation at serine residue 473 (P-Akt) and ERK1/2 phosphorylation (PT202/Y204) was assayed with ELISA (Akt: Cat. No. CK-E91385; Hangzhou Eastbiopharm Co., Ltd., Hangzhou, China. ERK1/2:Abcam Cambridge, UK) and normalized to the total protein concentration for each sample as determined by the Bradford assay.24
Total RNA extraction, cDNA synthesis and real time PCR
Expression of miR-126 and miR-210 was assessed by qRT-PCR. Triplicate assays were performed for each RNA sample. MicroRNA was extracted from the heart tissue using the miRCURYTM RNA Isolation Kit (Exiqon, Denmark) according to the manufacturer's protocol. The procedure was performed based on spin column using a proprietary resin as a separation matrix for RNA from other cell components. RNA content and purity were measured at a wavelength of 260-280 nm using Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo scientific, Wilmington DE 19810 USA).
cDNA synthesis was done according to LNA universal RT miRNA PCR kit (Exiqon, Denmark). Briefly, total RNA containing microRNA was polyadenylated and cDNA was synthesized using a poly (T) primer with a 3' degenerate anchor and a 5' universal tag.
Syber Green qPCR Mix purchased from Exiqon (denmark) and used for real time PCR. Real time PCR was done using Rotor-Gene 6000 Corbett. The 2-(ΔΔCt) method was used to determine relative quantitative levels of miR-126 and miR-210. The results were expressed as the fold-difference to the control group. Mir-1 was used as the endogenous control miRNA.
Immunohistochemical assessments
For the investigation of angiogenesis in the heart tissue, samples from left ventricle were immersed into 10% formalin after excision, embedded in paraffin, and cut into 4 µm-thick slices. Sections were deparaffinized in xylene and dehydrated in a graded series of ethanol. Slides were incubated sequentially in proteinase K and treated by 0.3% hydrogen peroxide to block endogenous peroxidase activity. Sections were overlaid by primary antibody CD31 (Santa Cruz, USA) a marker of angiogenesis and incubated at +4ºC overnight. Sections were then washed and incubated with standard avidin-biotin complex (ABC; Santa Cruz) according to the manufacturer's instructions. Then, the slides were incubated in DAB (di-amino-benzidine, Santa Cruz), as the chromagen, and counterstained with Mayer's hematoxylin. Finally, sections were cleared in xylene, mounted with Entellan and assessed by light microscope (Olympus BX 40, Japan). Capillaries were visualized in the myocardium as a brown precipitate. Vascular structures positive for CD31 were counted for 5 to 6 slides per animal and 10 fields per slide.
Statistical analysis
Results are presented as mean ± SD. Statistical analysis was performed using SPSS version 21.0 statistical software for Windows. All parameters were tested for normality using the one-sample Kolmogorov-Smirnov test. Average daily running distances for rats in each exercise group were averaged for each week and were compared using repeated measures ANOVA. Physical activity between Exe and Cro-Exe groups was analyzed using independent t-test. For Akt, ERK, CD31, miR-126, and miR-210 parameters, data were analyzed using two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. A p-value less than 0.05 was considered statistically significant.
ResultsVoluntary exercise
The Figure 1 illustrates the average running distance per week over the 8-week period of experiment. Animals ran voluntarily an average of 2.949 ± 178 m/week in the exercise group and an average of 3.090 ± 140 m/week in the crocin-exercise group. There was no significant difference in physical activity between Exe and Cro-Exe groups based on an independent t-test analysis.
Running distance was averaged over each week of running wheel access (mean ± SD) for the 8-week duration of experiment, for both Exe and Cro-Exe groups (n = 7/group). There was no significant difference between groups. Animals in both Exe and Cro-Exe groups increased their average weekly running distance over the subsequent weeks. *p < 0.05 indicates a significant difference between consecutive weeks in Exe group. #p < 0.05 and ##p < 0.01 indicate significant differences between consecutive weeks in Cro-Exe group.
Average running distance increased gradually in both Exe and Cro-Exe groups from first to eighth week. This increase in Exe group was significantly different from the prior week in fourth (p < 0.05) and sixth (p < 0.05) weeks. In Cro-Exe group, animals ran significantly more distance in second (p < 0.01), third (p < 0.01), fifth (p < 0.05), and sixth (p < 0.05) weeks than the prior week.
Effects of crocin combined with voluntary exercise on Akt levels in the heart tissue
After 8 weeks of administration of crocin or performing voluntary exercise, the level of p-Akt increased significantly in Exe (p < 0.01), Cro (p < 0.01) and Cro-Exe (p < 0.001) groups in comparison with Con group (Figure 2). A comparison between the Cro-Exe group with Exe and Cro groups exhibited significant difference among these groups (p < 0.01 and p < 0.001, respectively).
Effect of crocin and voluntary exercise on p-Akt levels. Data are shown as mean ± SD for n = 7 animals. <sup>***</sup>p < 0.001 and <sup>**</sup>p < 0.01 indicate significant differences with control group,<sup>$$$</sup>p < 0.001 indicates a significant difference with Cro group, and <sup>##</sup>p < 0.01 indicates a significant difference with Exe group.
Effects of crocin combined with voluntary exercise on ERK1/2 levels in the heart tissue
Two-way ANOVA showed that the p-ERK1/2 levels were significantly higher in rats treated with crocin or voluntary exercise than in control rats (Exe: p < 0.01, Cro: p < 0.05, and Cro-Exe: p < 0.001). Administration of crocin combined with exercise significantly increased p-ERK1/2 levels of the heart tissue compared to Exe (p < 0.01) and Cro (p < 0.001) groups (Figure 3). Figure 2 also indicates that crocin combined with voluntary exercise has a synergistic effect in p-ERK1/2 protein levels in heart tissue.
Effect of crocin and voluntary exercise on p-ERK1/2 levels. Data are shown as mean ± SD for n = 7 animals.<sup>*</sup>p < 0.05, <sup>**</sup>p < 0.01, and <sup>***</sup>p < 0.001 indicate significant differences with control group. <sup>$$$</sup>p < 0.001 indicates a significant difference with Cro group and <sup>##</sup>p < 0.01 indicates a significant difference with Exe group.
Effects of crocin combined with voluntary exercise on miR-126 expression in the heart tissue
Two-way ANOVA showed that the miR-126 expression were significantly higher in rats treated with crocin (p < 0.001), voluntary exercise (p < 0.01) and crocin combination with exercise (p < 0.001) than in control rats. In the rats that underwent voluntary exercise and simultaneously received crocin for 8 weeks, expression of heart miR-126 significantly increased compared with Exe (p < 0.01), and Cro (p < 0.001) groups (Figure 4).
Effect of crocin and voluntary exercise on miR-126 expression levels. Data are shown as mean ± SD for n = 7 animals. <sup>**</sup>p < 0.01 and <sup>***</sup>p < 0.001 indicate significant differences with control group. <sup>$$$</sup>p < 0.001 indicates a significant difference with Cro group and <sup>##</sup>p < 0.01 indicates a significant difference with Exe group.
Effects of crocin combined with voluntary exercise on miR-210 expression in the heart tissue
As shown in Figure 5, following crocin administration and exercise performing, the heart expression level of miR-210 was significantly upregulated in Cro and Exe groups when compared to control group (p < 0.01 and p < 0.001, respectively). On the other hand, the expression of miR-210 increased significantly in Cro-Exe group compared with control group (p < 0.001). In addition, there is a significant difference between Cro-Exe and Cro groups (p < 0.01).
Effect of crocin and voluntary exercise on miR-210 expression levels. Data are shown as mean ± SD for n = 7 animals. <sup>**</sup>p < 0.01 and <sup>***</sup>p < 0.001 indicate significant differences with control group and <sup>$$$</sup>p < 0.001 indicates a significant difference with Cro group.
Effects of crocin combined with voluntary exercise on CD31<sup>+</sup> cells in myocardial capillary network
As demonstrated in figure 6, number of CD31+ cells were higher in animals that received crocin (p < 0.05) or performed exercise (p < 0.05) compared with control group (Figures 6A, B, C). In addition, CD31+ cells were significantly higher in sections from the heart of Cro-Exe group than Exe (p < 0.01) and Cro (p < 0.01) groups (Figure 6D). Thus, crocin combination with voluntary exercise appears to enhance vasculogenic response.
A) Representative images of CD31 staining (brown) in cardiac vessels of control, exercise, crocin and exercise-crocin groups (Magnification ×400). A: Con, B: Exe, C: Cro, D: Cro-Exe. B) Microvessel density was analyzed by immunohistochemistry for CD31. Microvessel density was quantified using 6 slides per animal and 10 fields per slide. Data are shown as mean ± SD for n = 7 animals. ***p < 0.001 indicates a significant difference with control group. ###p < 0.001 and $$$p < 0.001 indicate significant differences with exercise group and crocin group, respectively.
Discussion
In the present study, we demonstrated that miR-126 and miR-210 expression of rat cardiac tissue increased in crocin, voluntary exercise, and exercise-crocin groups. In addition, crocin and voluntary exercise stimulated Akt and ERK1/2 proteins and angiogenesis in the heart tissue. For the first time, our study demonstrated that heart miR-126 and its related pathways including Akt and ERK1/2 upregulated in response to crocin combined with voluntary exercise in rats. Furthermore, our findings showed that crocin administration and voluntary exercise performing increased the expression of heart miR-210.
MiR-210, a hypoxia-specific miRNA, depends on HIF activation and upregulated after hypoxia.25 When miR-210 is overexpressed in endothelial cells, the ability of these cells to form blood vessels becomes pronounced, more than that of cells with normal levels of expression. Confirming miR-210 proangiogenic role, up-regulation of miR-210 in CD34+ cells increased tissue perfusion and capillary density in a mouse model of hind limb ischemia.26 Previous research has indicated that miR-210 may improve angiogenesis through the negative regulation of its target gene, ephrin A3, which is an important member of the ephrin angiogenesis regulatory gene family.27 Heart tissue expresses a variety of miRNAs, but little is known about the cardiac angiogenic response to crocin and exercise.28 Preclinical work demonstrated that intracardiac injections with a minicircle vector carrying miR-210 in a mouse model of myocardial infarction promoted significant improvement of left ventricular fractional shortening, decreased cellular apoptosis, and increased neovascularization.9 In the current study, we observed that crocin and voluntary exercise increased miR-210 expression levels in heart tissue using quantitative real-time PCR analysis. The miR-210 upregulation seems to be dependent on the exercise performing because the group that performed voluntary exercise showed a stronger miR-210 expression than crocin group. A probable mechanism is that during exercise, local hypoxic conditions in the cardiac muscle can occur and hypoxic situation trigger a number of physiological responses such as angiogenesis through HIF-1α-induced miR-210 expression.30,31 These data are in line with the observations made by Anja Bye et al.32 regarding significant increase in miR-210 expression in subjects with low Vo2max following the exercise activity.
MiR-126 is a pro-angiogenic miR, which is strongly expressed in the heart endothelium and directly targets SPRED1 and PIK3R2 for repression and functions to promote VEGF signaling.14,15 In fact, miR-126 activates survival kinases including ERK and Akt by downregulation of its targets and enhances the actions of VEGF.16,17 In endothelial cells, VEGF promotes angiogenesis through the phosphorylation of ERK1 and Akt. ERK and Akt are well known kinases that activate and promote cell proliferation by stimulating growth factors.18
In the present study, we showed that miR-126 regulates heart angiogenesis via Akt and ERK1/2 pathways in response to crocin and voluntary exercise. However, a few studies available say that exercise can increase miR expression in cardiac tissue. In line with our results, Uhlemann et al.33 reported that miR-126 expression increased after acute endurance exercise. Major findings also emerge from Fernandes et al.34 study indicating that exercise training restored the levels of peripheral miR-126 associated with revascularization in hypertension. Despite the observation that exercise affects endothelial function, the exact mechanism remains speculative. It is well established that exercise can increase VEGF levels, which is one of the major regulators of angiogenesis and cell survival.35 VEGF binds to VEGFR2 and promotes endothelial survival and angiogenesis signals which are intermediated by PI3K and its downstream target of the Akt and ERK1/2. In addition, we showed that ERK1/2 and Akt levels increased under high expression of miR-126. Therefore, it seems that voluntary exercise relieves the repressive influence of Spred-1/PI3K on the Akt and ERK1/2 by miR-126 overexpression, which finally improves cardiac angiogenesis. This finding is in agreement with a previous study that showed that PI3KR2 mRNA expression in the heart decreased in the exercise groups and it was associated with increase in protein expression of PI3K and phosphorylated Akt.36
In this study, we also showed that crocin regulates heart angiogenesis through miR-126 and its related Akt and ERK1/2 pathways. Crocin, a carotenoid pigment of saffron, has different pharmacological functions on the nervous,37 cardiac,38 and renal39 systems. Cardioprotective effects of crocin have been reported in some studies that are related to improvement of antioxidant activities and cardiac biomarkers.3,40 Although many researchers have explored the roles of crocin on different tissues, only a few studies have investigated the effects of crocin on angiogenesis in the heart tissue. Bie et al41 demonstrated that saffron increased expression of VEGF-R2 and promoted angiogenesis following brain injury in rats. Furthermore, it has been reported that the PI3K/Akt pathways are activated by crocin in the ganglion cell layer after retinal IR injury.42 Kang et al43 also showed that saffron increased the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), as one member of ERK family, in the muscle cells. Also our previous study confirms that crocin increases VEGF-A levels in the heart tissue of diabetic and non-diabetic rats.40
Based on the present results it could be concluded that crocin pretreatment improved cardiac angiogenesis, the effect which can be attributed to its ability of increasing Akt and ERK1/2 levels via enhancement of miR-126. Preservation of histoarchitecture of heart tissue by crocin pretreatment confirms these effects. Regarding the limitations of this study, we did not measure other factors involved in angiogenesis and we referred to previous studies. Further studies are needed to explore other possible mechanisms and pathways that might be directly or indirectly involved in its cardioprotective effects. Therefore, we suggest that crocin by increasing of miR-126 and enhancement of VEGF signaling pathways through Akt and ERK1/2 can induce cardiac capillary formation. In addition, we showed that crocin combination with voluntary exercise has synergistic effects on miR-126 expression and Akt, ERK1/2 levels in heart tissue, which was the first study in rat cardiac angiogenesis.
Conclusion
This study shows that crocin in combination with voluntary exercise promotes cardiac angiogenesis and this may be related to expression of miRNA-126 and miR-210. Further studies about the mechanism of crocin and voluntary exercise on cardiac angiogenesis may provide a basis for the development of new therapeutic or preventive approaches to some overcome cardiovascular diseases.
Sources of Funding
This study was funded by Drug Applied Research Center of Tabriz University of Medical Sciences.
Study Association
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Vajiheh Ghorbanzadeh from Tabriz University of Medical Sciences.
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Tabriz - East Azarbaijan - Irã. E-mail: gmohades@yahoo.com
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa, Redação do manuscrito e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Ghorbanzadeh V, Mohammadi M, Mohaddes G; Obtenção de dados: Ghorbanzadeh V, Dariushnejad H, Abhari A, Chodari L; Análise e interpretação dos dados: Ghorbanzadeh V, Dariushnejad H, Abhari A; Análise estatística: Ghorbanzadeh V, Dariushnejad H, Mohaddes G.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamentos:
A crocina tem uma vasta gama de atividades biológicas, tais como a proteção cardiovascular. Estudos epidemiológicos recentes demonstraram que o exercício reduz a morbidade e a mortalidade cardiovasculares na população em geral.
Objetivo:
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da crocina e do exercício voluntário nos níveis de expressão miR-126 e miR-210 e na angiogênese no tecido cardíaco.
Métodos:
Os animais foram divididos em 4 grupos: controle, exercício, crocina e exercício-crocina. Os animais receberam a administração oral de crocina (50 mg/kg) ou realizaram exercício voluntário sozinhos ou em conjunto durante 8 semanas. Os níveis de proteína Akt, ERK1/2, e a expressão de miR-126 e miR-210 foram medidos no tecido cardíaco. O método imunohistoquímico foi utilizado para detectar CD31 no tecido cardíaco.
Resultados:
Os níveis de Akt e ERK1/2 do tecido cardíaco foram maiores no grupo tratado com crocina e no grupo de exercício voluntário após 8 semanas. A combinação de crocina e exercício também aumentou significativamente os níveis de Akt e ERK1/2 no tecido cardíaco. A expressão de MiR-126, miR-210 e CD31 no coração aumentou tanto em no grupo de crocina como no grupo de exercício voluntário em comparação com o grupo de controle. Além disso, a combinação de exercício e crocina amplificou seu efeito na expressão de miR-126 e miR-210 e angiogênese.
Conclusão:
A Crocina e o exercício voluntário melhoram a angiogênese cardíaca possivelmente através do aumento da expressão de miR-126 e miR-210. O exercício voluntário e a suplementação dietética com crocina podem ter efeitos benéficos na prevenção de doenças cardiovasculares.
Palavras-chave:RatosModuladores da AngiogêneseExercícioCrocus SativusAntioxidantesmiR-126, miR-210Introdução
A crocina é um componente bioativo encontrado nos frutos da gardênia e nos estigmas do açafrão.1 A crocina tem sido usada há muito tempo na medicina tradicional e tem sido relatada como tendo várias atividades farmacológicas, como antioxidante, anticancerígena, anti-inflamatória, efeitos ateroscleróticos e proteção contra doenças cardiovasculares.2 Os efeitos cardioprotetores da crocina têm sido relatados em alguns estudos que estão relacionados à modulação de atividades enzimáticas antioxidantes endógenas e biomarcadores cardíacos.3,4 Evidências recentes indicaram o efeito protetor da crocina na lesão por hipóxia das células miocárdicas devido à elevação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), como fator proangiogênico.5
A atividade física desempenha um papel crítico no metabolismo, função cardiovascular e função imunológica. Nos últimos anos, tornou-se evidente que o treinamento físico é uma estratégia terapêutica muito poderosa para a prevenção do desenvolvimento e progressão da doença cardiovascular.6 No entanto, exercícios exaustivos podem ser problemáticos, pois são estressantes pela produção de espécies reativas de oxigênio e podem causar danos no tecido muscular e outros órgãos.7,8 Sugeriu-se que o exercício voluntário pode ser um modelo melhor com mias efeitos benéficos.9 No modelo animal de exercício voluntário, o animal tem livre acesso a uma roda de corrida e eua a roda de acordo com seu limiar fisiológico para a atividade física. Descobriu-se que a atividade física desencadeia a extensão da rede capilar ou angiogénese. Sabe-se que esse processo é dependente do VEGF.10 No entanto, os mecanismos subjacentes ao exercício ainda não foram totalmente elucidados.
Os micro-RNAs (miRs) são pequenos RNAs de 18 a 25 nucleótidos não codificantes que desempenham um papel chave na regulação da expressão de genes, inibindo a tradução de proteínas ou aumentando a degradação do RNA mensageiro.11,12 A sua participação nas doenças cardiovasculares tem sido reconhecida nos últimos anos.11-13 O MiR-126 é um dos poucos miRNAs que é um miRNA específico de células endoteliais e desempenha um papel essencial na neoangiogénese. O MiRNA-126 é fortemente expresso no endotélio cardíaco e alvos Sprouty relacionados à proteína-1 (Spred-1), PIK3R2, uma subunidade reguladora de PI3K.14,15 A desregulação desses alvos ativa as quinases ERK e Akt e melhora a ação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).16,17 O VEGF exerce muitos dos seus efeitos na angiogénese através das vias Akt e ERK1/2. Durante a vasculogênese do desenvolvimento, a via Akt regula a especificação venosa, enquanto a via ERK regula a especificação arterial.18,19 O MiR-210 em células endoteliais normóxicas estimulou a formação de estruturas semelhantes a capilares, bem como a migração celular impulsionada pelo VEGF.20 A indução de MiR-210 é uma característica praticamente constante da resposta hipóxica que é importante na patogênese de várias doenças humanas como as cardíacas.21
De acordo com os efeitos de vantagem da crocina e do exercício voluntário sobre o diabetes mencionado acima, a hipótese é que, em comparação com crocina ou exercício voluntário sozinho, 8 semanas de crocina combinadas com exercício voluntário em ratos diabéticos iria produzir uma maior melhoria nas complicações cardiovasculares do diabetes tipo 2. O presente estudo foi realizado para esclarecer o efeito da crocina e do exercício voluntário na expressão de miR-126 e miR-210 em miócitos cardíacos de ratos diabéticos.
MétodosAnimais
Ratos Wistar machos (200-250g) foram obtidos da Faculdade de Medicina de Tabriz (Irã-Tabriz). Os animais foram alojados numa sala com uma temperatura constante de 24ºC, uma humidade relativa de 50% e um ciclo de 12h escuridão / luz com acesso a alimentos e água à vontade. Os animais do grupo de exercícios foram colocados em unidades individuais de gaiolas de rodas, enquanto os grupos sedentários foram alojados em gaiolas de plástico normais. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal (documento número 92197) de acordo com a instrução para o cuidado e uso de animais de laboratório preparado pela Universidade de Ciências Médicas de Tabriz.
Design experimental
Quarenta animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos. Dez animais foram alocados para cada grupo experimental no início do estudo. Grupo 1: Ratos receberam solução de NaCl a 0,9% como grupo de controle (Con). Grupo 2: Os ratos receberam uma dose única de crocina (50 mg/kg) durante oito semanas (Cro). Grupo 3: Os ratos realizaram exercício voluntário durante oito semanas (Exe). Grupo 4: Os animais receberam crocina e realizaram, simultaneamente, exercício voluntário durante oito semanas (Cro-Exe). O pó de crocina (Sigma, Alemanha) foi diluído por solução salina normal (0,9%). A crocina foi administrada por gavagem (50 mg/kg) 6 dias por semana durante 8 semanas.22 Também, a solução de NaCl a 0,9% foi administrada por gavagem nos grupos 1 e 3 durante a experiência.
Para a avaliação do exercício voluntário, os ratos foram alojados individualmente numa gaiola contendo uma roda (circunferência de 1,00 m, TajhizGostar). Cada rato de exercício tinha uma roda de funcionamento separada na sua gaiola que lhe permitiu correr voluntariamente durante as 8 semanas do estudo. Esta roda de aço inoxidável foi equipada com um contador magnético digital que foi ativado pela rotação da roda e as revoluções da roda foram registradas diariamente. Então a distância de corrida por dia foi calculada como o número de rotações de roda por dia. Os ratos com uma distância de corrida inferior a ~ 2000 m por dia foram eliminados antes da análise estatística.3 Considerando os critérios de exclusão (exercício abaixo dos protocolos padrão) foi realizada análise estatística para 7 animais em cada grupo.
Quantificação de Akt e ERK1/2 no coração por ELISA
No último dia da experiência, os ratos foram sacrificados sob anestesia profunda com cetamina/xilazina (88/10 mg/kg, i.p.). O tecido cardíaco foi imediatamente removido e lavado com soro fisiológico 0,9%. As amostras de tecido foram pesadas, homogeneizadas em PBS (pH 7,2-7,4) e centrifugadas durante 20 min à velocidade de 3000 rpm e 4ºC. Em seguida, os sobrenadantes foram recolhidos em novo tubo e os níveis de Akt e ERK1/2 foram medidos utilizando kits sanduíche ELISA de rato. O ensaio ELISA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. A ativação da proteína Akt por fosforilação no resíduo de serina 473 (P-Akt) e a fosforilação da ERK1/2 (PT202/Y204) foi analisada com ELISA (Akt: Cat. Nº. CK-E91385; Hangzhou Eastbiopharm Co., Ltd., Hangzhou, China. ERK1/2: Abcam Cambridge, UK) e normalizada para a concentração de proteína total para cada amostra como determinado pelo ensaio de Bradford.24
Extração total de RNA, síntese de cDNA e PCR em tempo real
A expressão de miR-126 e miR-210 foi avaliada por qRT-PCR. Foram realizados ensaios em triplicado para cada amostra de RNA. O MicroRNA foi extraído do tecido cardíaco utilizando o kit de isolamento de RNA miRCURYTM (Exiqon, Dinamarca) de acordo com o protocolo do fabricante. O procedimento foi realizado com base na coluna de spin utilizando uma resina patenteada como matriz de separação de RNA de outros componentes celulares. O teor de RNA e a pureza foram medidos a um comprimento de onda de 260-280 nm utilizando o espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington DE 19810 EUA).
A síntese de cDNA foi realizada de acordo com o kit de PCR de miRNA RT LNA universal (Exiqon, Dinamarca). Resumidamente, o RNA total contendo microRNA foi poliadenilado e o cDNA foi sintetizado utilizando um primer poli (T) com uma âncora degenerada 3' e uma etiqueta universal 5'.
Syber Green qPCR Mix adquirido da Exiqon (Dinamarca) e utilizado para PCR em tempo real. O PCR em tempo real foi feito usando Rotor-Gene 6000 Corbett. O método 2- (ΔΔCt) foi utilizado para determinar níveis quantitativos relativos de miR-126 e miR-210. Os resultados foram expressos como o dobro do grupo de controle. Utilizou-se Mir-1 como o miARN de controle endógeno.
Avaliações imunohistoquímicas
Para a investigação da angiogênese no tecido cardíaco, as amostras do ventrículo esquerdo foram imersas em formol a 10% após excisão, embebidas em parafina e cortadas em fatias de 4 µm de espessura. As secções foram desparafinadas em xileno e desidratadas numa série graduada de etanol. As lâminas foram incubadas sequencialmente em proteinase K e tratadas com peróxido de hidrogénio a 0,3% para bloquear a atividade de peroxidase endógena. As fatias foram sobrepostas pelo anticorpo primário CD31 (Santa Cruz, EUA) um marcador de angiogênese e incubadas a + 4ºC toda a noite. As seções foram então lavadas e incubadas com complexo avidina-biotina padrão (ABC, Santa Cruz) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, as lâminas foram incubadas em DAB (di-amino-benzidina, Santa Cruz), como cromogênio e coradas por contraste com hematoxilina de Mayer. Finalmente, as seções foram clareadas em xileno, montadas com Entellan e avaliadas por microscópio óptico (Olympus BX 40, Japão). Os capilares foram visualizados no miocárdio como um precipitado castanho. As estruturas vasculares positivas para CD31 foram contadas para 5 a 6 lâminas por animal e 10 campos por lâmina.
Análise estatística
Os resultados são apresentados como média ± DP. A análise estatística foi realizada usando o software estatístico SPSS versão 21.0 para Windows. Todos os parâmetros foram testados quanto à normalidade utilizando o teste Kolmogorov-Smirnov de uma amostra. As médias das distâncias diárias percorridas pelos ratos em cada grupo de exercício foram médias para cada semana e foram comparadas utilizando ANOVA de medidas repetidas. A atividade física entre os grupos Exe e Cro-Exe foi analisada utilizando o teste t independente. Para os parâmetros de Akt, ERK, CD31, miR-126 e miR-210, os dados foram analisados utilizando ANOVA bidirecional seguida pelo teste post hoc de Tukey. Um valor p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
ResultadosExercício voluntário
A Figura 1 ilustra a média de distância percorrida por semana durante o período de 8 semanas do experimento. Os animais realizaram voluntariamente uma média de 2,949 ± 178 m/semana no grupo de exercícios e uma média de 3,090 ± 140 m/semana no grupo de crocina e exercícios. Não houve diferença significativa na atividade física entre os grupos Exe e Cro-Exe com base em uma análise de teste t independente.
A média de distância percorrida foi calculada cada semana de acesso à roda (média ± DP) durante a duração de 8 semanas do experimento, para os grupos Exe e Cro-Exe (n = 7/grupo). Não houve diferença significativa entre os grupos. Animais em ambos os grupos Exe e Cro-Exe aumentaram a sua distância média semanal de corrida nas semanas subsequentes. * p < 0,05 indica uma diferença significativa entre as semanas consecutivas no grupo Exe. <italic>#</italic> p < 0,05 e <italic>##</italic> p < 0,01 indicam diferenças significativas entre semanas consecutivas no grupo Cro-Exe.
A distância média percorrida aumentou gradualmente nos grupos Exe e Cro-Exe da primeira para a oitava semana. Este aumento no grupo Exe foi significativamente diferente da semana anterior na quarta (p < 0,05) e sexta (p < 0,05) semanas. No grupo Cro-Exe, os animais correram uma distância significativamente maior na segunda (p <0,01), terceira (p < 0,01), quinta (p < 0,05) e sexta (p < 0,05) do que na semana anterior.
Efeitos da crocina combinada com o exercício voluntário nos níveis de Akt no tecido cardíaco
Após 8 semanas de administração de crocina ou realização de exercício voluntário, o nível de p-Akt aumentou significativamente nos grupos Exe (p < 0,01), Cro (p < 0,01) e Cro-Exe (p < 0,001) em comparação com o grupo Con (Figura 2). Uma comparação entre o grupo Cro-Exe com os grupos Exe e Cro apresentou diferença significativa entre esses grupos (p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente).
Efeito da crocina e exercício voluntário sobre os níveis de p-Akt. Os dados são apresentados como média ± DP para n = 7 animais. <italic>***</italic>p < 0.001 e ** p < 0,01 indicam diferenças significativas com o grupo controle, <italic>$$$</italic> p < 0,001 indica uma diferença significativa com o grupo Cro, e <italic>##</italic> p < 0,01 indica uma diferença significativa com o grupo Exe.
Efeitos da crocina combinada com o exercício voluntário nos níveis ERK1/2 no tecido cardíaco
A ANOVA de duas vias mostrou que os níveis de p-ERK1/2 foram significativamente mais elevados em ratos tratados com crocina ou em exercícios voluntários do que nos ratos de controle (Exe: p < 0,01, Cro: p < 0,05 e Cro-Exe: p < 0,001). A administração de crocina combinada com exercício aumentou significativamente os níveis de p-ERK1/2 do tecido cardíaco em comparação com os grupos Exe (p < 0,01) e Cro (p < 0,001) (Figura 3). A Figura 2 também indica que a crocina combinada com o exercício voluntário tem um efeito sinérgico nos níveis de proteína p-ERK1/2 no tecido cardíaco.
Efeito da crocina e exercício voluntário sobre os níveis de p-ERK1/2. Os dados são apresentados como média ± DP para n = 7 animais. * p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p <0,001 indicam diferenças significativas com o grupo de controlo. $$$ p < 0,001 indica uma diferença significativa com o grupo Cro e ## p < 0,01 indica uma diferença significativa com o grupo Exe.
Efeitos da crocina combinada com o exercício voluntário na expressão de miR-126 no tecido cardíaco
A ANOVA bidirecional mostrou que a expressão de miR-126 foi significativamente maior em ratos tratados com crocina (p < 0,001), exercício voluntário (p < 0,01) e combinação de crocina com exercício (p < 0,001) do que em ratos controle. Nos ratos submetidos a exercício voluntário e que simultaneamente receberam crocina durante 8 semanas, a expressão do miR-126 cardíaco aumentou significativamente em comparação com os grupos Exe (p < 0,01) e Cro (p < 0,001) (Figura 4).
Efeito da crocina e exercício voluntário nos níveis de expressão de miR-126. Os dados são apresentados como média ± DP para n = 7 animais. ** p < 0,01 e *** p < 0,001 indicam diferenças significativas com o grupo de controle. <italic>$$$</italic> p < 0,001 indica uma diferença significativa com o grupo Cro e <italic>##</italic> p <0,01 indica uma diferença significativa com o grupo Exe.
Efeitos da crocina combinada com o exercício voluntário na expressão de miR-210 no tecido cardíaco
Conforme ilustrado na Figura 5, após a administração de crocina e a execução de exercícios, o nível de expressão cardíaca de miR-210 foi significativamente aumentado nos grupos Cro e Exe quando comparado com o grupo de controle (p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente). Por outro lado, a expressão de miR-210 aumentou significativamente no grupo Cro-Exe em comparação com o grupo controle (p < 0,001). Além disso, há uma diferença significativa entre os grupos Cro-Exe e Cro (p < 0,01).
Efeito da crocina e exercício voluntário sobre os níveis de expressão de miR-210. Os dados são apresentados como média ± DP para n = 7 animais. **p < 0,01 e ***p < 0,001 indicam diferenças significativas com o grupo de controle e <italic>$ $</italic>p < 0,001 indica uma diferença significativa com o grupo Cro.
Efeitos da crocina combinada com o exercício voluntário em células CD31 + na rede capilar miocárdica
Conforme demonstrado na Figura 6, o número de células CD31 + foi maior nos animais que receberam crocina (p < 0,05) ou realizaram exercícios (p < 0,05) em comparação com o grupo controle (Figuras 6A, B, C). Além disso, as células CD31 + foram significativamente mais elevadas em seções do coração do grupo Cro-Exe do que nos grupos Exe (p < 0,01) e Cro (p < 0,01) (Figura 6D). Assim, a combinação de crocina com o exercício voluntário parece aumentar a resposta vasculogênica.
A) Imagens representativas da coloração CD31 (castanha) em vasos cardíacos de grupos de controle, exercício, crocina e exercício-crocina (Ampliação × 400). A: Con, B: Exe, C: Cro, D: Cro-Exe. B) A densidade de microvasos foi analisada por imunohistoquímica para CD31. A densidade de microvasos foi quantificada utilizando 6 lâminas por animal e 10 campos por lâmina. Os dados são apresentados como média ± DP para n = 7 animais. *** p < 0,001 indica uma diferença significativa com o grupo de controle. <italic>###</italic>p < 0,001 e <italic>$$$</italic>p < 0,001 indicam diferenças significativas com o grupo de exercício e grupo de crocin, respectivamente.
Discussão
No presente estudo, demonstramos que a expressão de miR-126 e miR-210 do tecido cardíaco de ratos aumentou nos grupos de crocina, exercício voluntário e exercício-crocina. Além disso, a crocina e o exercício voluntário estimularam as proteínas Akt e ERK1/2 e a angiogênese no tecido cardíaco. Pela primeira vez, nosso estudo demonstrou que o miR-126 cardíaco e suas vias relacionadas incluindo Akt e ERK1/2 aumentaram em resposta à crocina combinada com o exercício voluntário em ratos. Além disso, nossos achados mostraram que a administração de crocina e a realização de exercício voluntário aumentaram a expressão do miR-210 cardíaco.
MiR-210, um miRNA específico da hipóxia, depende da ativação de HIF e aumentou após a hipóxia.25 Quando o miR-210 é superexpressado em células endoteliais, a capacidade dessas células para formar vasos sanguíneos torna-se mais pronunciada do que a das células com níveis normais de expressão. Confirmando o papel pró-angiogênico do miR-210, a regulação positiva do miR-210 em células CD34 + aumentou a perfusão tecidual e a densidade capilar em um modelo de isquemia de membros posteriores em ratos.26 Pesquisas prévias indicaram que o miR-210 pode melhorar a angiogênese através da regulação negativa de seu gene alvo, a efrina A3, que é um membro importante da família de efrinas de genes reguladores da angiogênese.27 O tecido cardíaco expressa uma variedade de miRNAs, mas pouco se sabe sobre a resposta angiogênica cardíaca à crocina e exercício.28 O trabalho pré-clínico demonstrou que as injeções intracardíacas com um vetor minicírculo transportando miR-210 em um modelo murino de infarto do miocárdio promoveu melhora significativa do encurtamento fracionário ventricular esquerdo, diminuição da apoptose celular e aumento da neovascularização.29 No presente estudo, observamos que a crocina e o exercício voluntário aumentaram os níveis de expressão de miR-210 no tecido cardíaco usando análise quantitativa da PCS em tempo real. O aumento do miR-210 parece ser dependente do exercício realizado porque o grupo que realizou exercício voluntário mostrou uma expressão mais forte do miR-210 do que o grupo crocina. Um mecanismo provável é que, durante o exercício, podem ocorrer condições hipóxicas locais no músculo cardíaco e a situação hipóxica desencadear um número de respostas fisiológicas como a angiogênese através da expressão de miR-210 induzida por HIF-1α.30,31 stes dados estão de acordo com as observações feitas por Bye et al.32 quanto ao aumento significativo da expressão de miR-210 em indivíduos com baixa Vo2max após a atividade de exercício.
MiR-126 é um miR pró-angiogênico, que é fortemente expresso no endotélio cardíaco e aponta diretamente para SPRED1 e PIK3R2 para repressão e funções afim de promover a sinalização VEGF.14,15 e fato, o miR-126 ativa quinases de sobrevivência incluindo ERK e Akt por regulação negativa dos seus alvos e aumenta as ações do VEGF.16,17 as células endoteliais, o VEGF promove a angiogénese através da fosforilação de ERK1 e Akt. ERK e Akt são quinases bem conhecidas que ativam e promovem a proliferação celular estimulando fatores de crescimento.18
No presente estudo, mostramos que o miR-126 regula a angiogênese cardíaca através das vias Akt e ERK1/2 em resposta à crocina e exercício voluntário. No entanto, existem alguns estudos disponíveis que sinalizam que o exercício pode aumentar a expressão miR no tecido cardíaco. Em linha com nossos resultados, Uhlemann et al.33 relataram que a expressão de miR-126 aumentou após exercício de resistência aguda. Importantes conclusões também surgem de Fernandes et al.,34 indicando que o exercício físico restabeleceu os níveis de miR-126 periférico associado à revascularização na hipertensão. Apesar da observação de que o exercício afeta a função endotelial, o mecanismo exato permanece especulativo. Está bem estabelecido que o exercício pode aumentar os níveis de VEGF, que é um dos principais reguladores da angiogênese e da sobrevivência celular.35 O VEGF liga-se ao VEGFR2 e promove os sinais de sobrevivência e angiogénese endoteliais que são intermediados pela PI3K e o seu alvo a jusante do Akt e ERK1/2. Além disso, mostraram que os níveis de ERK1/2 e Akt aumentaram sob alta expressão de miR-126. Portanto, parece que o exercício voluntário alivia a influência repressiva de Spred-1/PI3K na superexpressão de Akt e ERK1/2 por miR-126, o que finalmente melhora a angiogênese cardíaca. Este achado está de acordo com um estudo prévio que mostrou que a expressão de ARNm de PI3KR2 no coração diminuiu nos grupos de exercícios e foi associada ao aumento na expressão protéica de PI3K e Akt fosforilado.36
Neste estudo, também mostramos que a crocina regula a angiogênese cardíaca através do miR-126 e as vias relacionadas a Akt e ERK1/2. A crocina, um pigmento carotenóide do açafrão, tem diferentes funções farmacológicas nos sistemas nervoso,37 cardíaco38 e renal.39 Efeitos cardioprotetores da crocina têm sido relatados em alguns estudos que estão relacionados à melhoria das atividades antioxidantes e biomarcadores cardíacos.3,40
Embora muitos pesquisadores tenham explorado os papéis da crocina em diferentes tecidos, apenas alguns estudos têm investigado os efeitos da crocina sobre a angiogênese no tecido cardíaco. Bie et al.,41 demonstraram que o açafrão aumentou a expressão de VEGF-R2 e promoveu angiogênese após lesão cerebral em ratos. Além disso, tem sido relatado que as vias PI3K/Akt são activadas pela crocina na camada de células ganglionares após lesão de retina IR.42 Kang et al.,43 também mostraram que o açafrão aumentou a fosforilação de proteínas-quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), como um membro da família ERK, nas células musculares. Também o nosso estudo anterior confirma que a crocina aumenta os níveis de VEGF-A no tecido cardíaco de ratos diabéticos e não diabéticos.40
Com base nos presentes resultados, pode concluir-se que o pré-tratamento com crocina melhorou a angiogénese cardíaca, efeito que pode ser atribuído à sua capacidade de aumentar os níveis de Akt e ERK1/2 através do aumento de miR-126. A preservação da histo-arquitectura do tecido cardíaco pelo pré-tratamento com crocina confirma estes efeitos. Em relação às limitações deste estudo, não se avaliaram outros fatores envolvidos na angiogênese e nos referimos a estudos prévios. São necessários mais estudos para explorar outros possíveis mecanismos e vias que possam estar direta ou indiretamente envolvidos nos seus efeitos cardioprotectores. Por conseguinte, sugerimos que o incremento do miR-126 pela crocina e o aumento das vias de sinalização do VEGF através de Akt e ERK1/2 pode induzir a formação de capilares cardíacos. Além disso, mostramos que a combinação de crocina com exercício voluntário tem efeitos sinérgicos sobre a expressão do miR-126 e os níveis de Akt, ERK1/2 no tecido cardíaco, o qual foi o primeiro estudo na angiogénese cardíaca de ratos.
Conclusão
Este estudo mostra que a crocina combinada com o exercício voluntário promove angiogênese cardíaca e isso pode estar relacionado à expressão do miRNA-126 e do miR-210. Novos estudos sobre o mecanismo da crocina e exercício voluntário na angiogênese cardíaca podem fornecer uma base para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas ou preventivas para superar doenças cardiovasculares.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pelo Drug Applied Research Center of Tabriz University of Medical Sciences.
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Vajiheh Ghorbanzadeh pela Tabriz University of Medical Sciences.