Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC NyDZmzcpFVgxq4VKZkybKcq S0066-782X2017000500443 10.5935/abc.20170042 S0066-782X2017005006102 Original Articles Ischemia/Myocardial Infarction Effect of Lactation on myocardial vulnerability to ischemic insult in rats Askari Sahar 1 Imani Alireza 1 Sadeghipour Hamidreza 1 Faghihi Mahdieh 1 Edalatyzadeh Zohreh 1 Choopani Samira 1 Karimi Nasser 2 Fatima Sulail 3 Tehran University of Medical Sciences Tehran Iran Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran Tehran University of Medical Sciences Iran University of Medical Sciences Rassoul Akram Hospital Tehran Iran Rassoul Akram Hospital - Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran Iran University of Medical Sciences Tehran University of Medical Sciences Tehran Iran Tehran University of Medical Sciences - International Campus, Tehran, Iran Tehran University of Medical Sciences Mailing Address: Alireza Imani, Physiology Department - School of Medicine -Tehran University of Medical Sciences, Tehran, I.R.Iran. E-mail: aimani@tums.ac.ir

Author contributions

Conception and design of the research and Analysis and interpretation of the data: Askari S, Imani A, Sadeghipour H, Faghihi M, Edalatyzadeh Z, Choopani S, Karimi N, Fatima S; Acquisition of data: Askari S, Edalatyzadeh Z, Choopani S,; Statistical analysis: Askari S, Karimi N; Obtaining financing: Imani A; Writing of the manuscript: Askari S, Karimi N, Fatima S; Critical revision of the manuscript for intellectual contente: Fatima S.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 20 4 2017 05 2017 108 5 443 451 12 05 2016 27 09 2016 13 10 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality and long-term disability worldwide. Various studies have suggested a protective effect of lactation in reducing the risk of cardiovascular diseases.

 Objective:

This study was designed to assess the effects of pregnancy and lactation on the vulnerability of the myocardium to an ischemic insult.

 Methods:

Eighteen female rats were randomly divided into three groups: ischemia-reperfusion (IR), in which the hearts of virgin rats underwent IR (n = 6); lactating, in which the rats nursed their pups for 3 weeks and the maternal hearts were then submitted to IR (n = 6); and non-lactating, in which the pups were separated after birth and the maternal hearts were submitted to IR (n = 6). Outcome measures included heart rate (HR), left ventricular developed pressure (LVDP), rate pressure product (RPP), ratio of the infarct size to the area at risk (IS/AAR %), and ventricular arrhythmias - premature ventricular contraction (PVC) and ventricular tachycardia (VT).

 Results:

The IS/AAR was markedly decreased in the lactating group when compared with the non-lactating group (13.2 ± 2.5 versus 39.7 ± 3.5, p < 0.001) and the IR group (13.2 ± 2.5 versus 34.0 ± 4.7, p < 0.05). The evaluation of IR-induced ventricular arrhythmias indicated that the number of compound PVCs during ischemia, and the number and duration of VTs during ischemia and in the first 5 minutes of reperfusion in the non-lactating group were significantly (p < 0.05) higher than those in the lactating and IR groups.

 Conclusion:

Lactation induced early-onset cardioprotective effects, while rats that were not allowed to nurse their pups were more susceptible to myocardial IR injury.

 Keywords: Lactation Myocardial Infarction Myocardial Ischemia Parturitium Introduction

Coronary artery diseases are the leading cause of mortality worldwide, with about 38% of the deaths attributed to these diseases.1 In addition to hypertension and diabetes, multiple lifestyle factors, including a high-cholesterol diet, smoking, alcohol consumption, and stress, can increase the risk of myocardial infarction.2 Accumulating epidemiological evidence suggests that a woman's decision to breast-feed her children has a significant impact on the maternal risk of developing cardiovascular diseases.3,4 Although national policies to promote breastfeeding have been profoundly implemented in many developed countries, the global rate of exclusive breastfeeding is below 40%.5

Lactation confers significant benefits to the maternal cardiovascular health.6 Lactogenesis has a favorable effect on glucose and lipid metabolism. It increases insulin sensitivity and glucose effectiveness while reducing the risk of type 2 diabetes.3 Nursing promotes high-density lipoprotein production and reduces triglyceride and low-density lipoprotein levels.7,8 Consequently, lactation mobilizes the fat stores generated during pregnancy, thereby reducing the risk of cardiovascular diseases and myocardial infarction.9 Furthermore, lactation reduces maternal blood pressure and heart rate (HR), while improving cardiac output.10 Hanwell and Peaker11 observed that the augmented cardiac output is directly proportional to the intensity of suckling in rats.11 Moreover, certain hormones released during lactation, such as oxytocin, prolactin, glucocorticoids, gherlin and growth hormone, can precondition the myocardium against cardiac injury.12,13 Centrally released endogenous oxytocin and exogenous infusion of oxytocin have been shown to protect heart against a hypoxic insult via activation of brain receptors.14 Furthermore, oxytocin induces cardioprotection through a pathway involving mitochondrial ATP-dependent potassium channels.15 Although, the effect of lactogenic hormones on cardiovascular health has been studied to some extent, the experimental evidence suggesting the cardioprotective role of lactation against ischemia-reperfusion (IR) injury is scarce. Thus, the current was designed to test the hypothesis that lactation reduces the myocardial vulnerability to IR injury.

 Methods Animals

Eighteen female Sprague-Dawley rats (180-230 g) were housed in an air-conditioned colony room at 21-23°C, with a 12-hour light-dark cycle. During the experimental period, the animals had free access to food and water. The experimental protocols followed in this study conformed to the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals published by National Institutes of Health (NIH Publication N°. 85-23, revised 1996) and were further approved by the institutional ethical committee at Tehran University of Medical Sciences (Tehran, Iran).

 Preparation of isolated hearts

The animals were anesthetized using intraperitoneal sodium thiopental (60 mg/kg). Heparin (500 IU/kg) was also injected to prevent blood coagulation. Once the animals were anesthetized, a transabdominal incision was made, and their hearts were exposed. Following cannulation of the aorta, the heart was excised and mounted on a Langendorff apparatus. The hearts were perfused retrogradely with Krebs-Henseleit bicarbonate buffer containing (in mmol/L): NaHCO3 25; KCl 4.7; NaCl 118.5; MgSO4 1.2; KH2PO4 1.2; glucose 11; CaCl2 2.5, gassed with 95% O2 and 5% CO2 (pH 7.35-7.45 at 37 C°). A saline-filled latex balloon was introduced into the left ventricle and inflated to yield a preload of 8-10 mmHg. The balloon was connected to a pressure transducer (Harvard, March-Hugsteten, Germany) which allowed a real time measurement of the pressures from the ventricle. Electrocardiographic recording was performed by fixation of thin electrodes on the ventricular apex and right atrium. A surgical needle (6-0 silk suture) was passed under the origin of the left anterior descending coronary artery, and the ends of the suture were passed through two plastic pipette tips to form a snare. Regional ischemia was induced by tightening the snare (30 min), and reperfusion was performed by releasing the ends of the suture (60 min). The hearts were allowed to beat spontaneously throughout the experiments.

 Sample size estimation

The sample size was estimated using the Resource Equation Method.16

E = N - T

E = degrees of freedom (analysis of variance [ANOVA]; between 10 and 20)

N = total number of animals

T = number of treatment groups

"N" was obtained from a previously published study17 and was adjusted accordingly to attain a valid "E".

 Experimental groups

The effects of pregnancy and lactation on myocardial IR injury were studied in 18 rats randomly divided into three groups:

IR group (IR; n = 6): isolated hearts of virgin rats in the diestrus period underwent 30 min of regional ischemia followed by 60 min of reperfusion.

Lactating group (n = 6): the rats nursed their pups for 3 weeks and, after that, the maternal hearts underwent 30 min of regional ischemia followed by 60 min of reperfusion.

Non-lactating group (n = 6): after parturition, the rats were separated from their pups, and 3 weeks later, the maternal hearts underwent 30 min of regional ischemia followed by 60 min of reperfusion.

Hemodynamic functions

The left ventricular developed pressure (LVDP) and the HR were continuously monitored and recorded using BioLab data acquisition system. The rate pressure product (RPP) was calculated by multiplying LVDP by the HR.

 Assessment of area at risk and infarct size

At the end of reperfusion, the left coronary artery was reoccluded and Evans blue (0.3-0.5 ml) dye was infused via aorta to differentiate the ischemic zone (area at risk; AAR) from the non-ischemic zone. The hearts were frozen at - 20°C and sliced into 2.0 mm traverse sections (using a stainless steel slicer matrix with 2.0 mm coronal section slice intervals) from apex to the base. The slices were incubated in 1% triphenyltetrazolium chloride (TTC in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, 37 ºC) for 20 min followed by tissue fixation (10% phosphate-buffered formalin) for 24 h. TTC reacts with the viable tissue, producing a red formazan derivative which is distinct from the white necrotic area. Sections were scanned to determine non-ischemic area, AAR (ischemic area) and the infarct size (IS) by calculating the pixels occupied by each area using the Adobe PhotoShop software (Adobe Systems Seattle, WA). The AAR was expressed as a percentage of left ventricular volume for each heart. The IS was determined by using computer-aided planimetry and expressed as a percentage of the AAR.18-20

Assessment of ventricular arrhythmias

Ischemia-induced ventricular arrhythmias were assessed during the occlusion period and were determined in accordance with the Lambeth Conventions.21 Ventricular tachycardia (VT) and premature ventricular contraction (PVC) including compound PVCs (such as bigeminy, couplet and salvos) were counted during ischemic period and the first 5 minutes of the reperfusion period.

 Statistical analysis

All data were statistically analyzed using GraphPad InStat, version 3.06 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The data followed Gaussian distribution (Kolmogorov-Smirnov test). All results are expressed as mean ± standard error of the mean (SEM). Outcome measures between the groups were analyzed using one-way ANOVA followed by the Bonferroni post hoc test. For intragroup comparisons, repeated measures ANOVA followed by the Bonferroni post hoc test (for selected columns) was performed. Statistical significance was defined as p < 0.05.

 Results Hemodynamic Parameters

Table 1 demonstrates the changes in HR, LVDP, and RPP in the IR, lactating and non-lactating groups during different periods of the experiment.

Hemodynamic Parameters
Groups Baseline Ischemia Reperfusion
HR (Beats/min) LVDP (mmHg) RPP (mmHg x bpm) HR (Beats/min) LVDP (%Baseline) RPP (%Baseline) HR (Beats/min) LVDP (%Baseline) RPP (%Baseline)
IR 146.0 ± 4.9 58.4 ± 11.9 8519.6 ± 1805.2 134.6 ± 3.9 62.5 ± 8.3* 57.5 ± 7.3# 131.2 ± 5.2$ 64.3 ± 8.6*$ 57.4 ± 6.8#
L 138.0 ± 3.6 115.2 ± 34.2 15673.2 ± 4219.6 120.7 ± 9.1 28.3 ± 3.7* 25.2 ± 4.6* 71.7 ± 18.4 20.8 ± 7.8# 12.6 ± 7.2#
NL 148.6 ± 8.3 66.9 ± 11.9 9797.3 ± 1652.5 137.4 ± 9.7 73 ± 8.5$ 67.2 ± 7.7.*$ 145.4 ± 11.9$ 73.1 ± 8.5$ 74.0 ± 13$

p < 0.05 versus the baseline period in the group,

p < 0.001 versus the baseline period in the group,

p < 0.05 versus the lactating group.

Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). For LVDP, RPP and HR, the means were compared between the groups using one-way ANOVA and within the groups using repeated measure ANOVA. The post hoc test used was Bonferroni.

IR: ischemia-reperfusion; L: lactating; NL: non-lactating; LVDP: left ventricular developed pressure (mmHg); HR: heart rate (beats/min), RPP: rate pressure product (mmHg x bpm); bpm: beats per minute

In IR group, LVDP and RPP were reduced (p < 0.05 and p < 0.001, respectively) at the end of ischemia and reperfusion period as compared with the baseline. In lactating group, LVDP and RPP reduced significantly at the end of the ischemia (p < 0.05) and reperfusion (p < 0.001) periods when compared with baseline. Furthermore, in the lactating group, the HR was markedly reduced in the reperfusion period when compared with baseline. Non-lactating animals demonstrated lower RPP during ischemia when compared with baseline (p < 0.05).

Intergroup analysis showed that LVDP at the end of ischemia, and RPP in the ischemia and reperfusion periods were significantly higher in the non-lactating when compared to the lactating group (p < 0.05). In addition, HR and LVDP in reperfusion were markedly increased in the IR and non-lactating groups, when compared with the lactating group (p < 0.05).

 Area at risk and infarct size

As shown in Figure 1, there was no significant difference in AAR between the groups. However, the IS/AAR was significantly reduced in the lactating group as compared with the non-lactating and IR groups (13.2 ± 2.5 versus 39.7 ± 3.5 and 34.0 ± 4.7, respectively).

Myocardial area at risk in relation to the left ventricle (AAR/V %) and infarct size (IS/AAR %). Data are presented as mean ± S.E.M. standard error of the mean (SEM). The mean values between the groups were compared using one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test. # p < 0.05 versus the lactating group, *** p < 0.001 versus the lactating group. IR: ischemia-reperfusion; L: lactating; NL: Non-lactating.

Ventricular arrhythmias

During the ischemic phase, the number of compound PVCs was statistically higher in the non-lactating group as compared with the lactating group (p < 0.05) (Figure 2). During the first 5 min of the reperfusion phase, the number of compound PVCs did not differ significantly between the groups (Figure 3). During ischemia and the first 5 min of reperfusion, the number of VTs was significantly lower in the lactating and IR groups as compared with the non-lactating group (p < 0.001) (Figure 4). In addition, the duration of VTs during ischemia and the first 5 min of reperfusion were markedly reduced in the lactating and IR groups as compared with the non-lactating group (p < 0.01, Figure 5).

Number of compound PVCs (including bigeminy, couplet and salvos) in different groups. Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). The mean values between the groups were compared using one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test. * p < 0.05 versus the lactating group. IR: ischemia-reperfusion; L: lactating; NL: Non-lactating.

Number of compound PVCs (including bigeminy, couplet and salvos) in the first 5 min of reperfusion. Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). The mean values between the groups were compared using one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test. IR: ischemia-reperfusion; L: lactating; NL: Non-lactating.

Number of ventricular tachycardia (VT) in different groups. Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). The mean values between the groups were compared using one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test. *** p < 0.001 versus the lactating group; $$$ p < 0.001 versus the IR group. IR: ischemia-reperfusion; L: lactating; NL: Non-lactating.

Duration of ventricular tachycardia (VT) in different groups. Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). The mean values between the groups were compared using one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test. IR: ischemia-reperfusion; L: lactating; NL: non-lactating. ** p < 0.001 versus the lactating group; $$ p < 0.001 versus the IR group.

Discussion

The current study demonstrates the effect of pregnancy and lactation on myocardial vulnerability to an ischemic insult. We observed that lactation, and not pregnancy alone, preconditioned the maternal heart against ischemia-induced myocardial infarction. Furthermore, nursing reduces the incidence and duration of ventricular arrhythmias during ischemia.

Growing evidence has indicated short-term and long-term beneficial effects of lactation on the risk factors associated with cardiovascular morbidity.22,23 The only study indicating cardioprotective effects of lactation against IR injury was recently performed by Shekarforoush and Safari.17 However, their study did not take into account if the cardioprotection was conferred by the pregnancy alone. In addition, these authors were unable to observe antiarrhythmic effects of lactation during myocardial ischemia.17 In the current study, in vitro Langendorff model was used. Thus, the early-onset cardioprotective effects of lactation can be attributed to the intrinsic characteristics of the heart independent of the complex physiology of lactation. We observed that pregnancy increases the ischemia-induced IS and the incidence and duration of arrhythmias. Previous studies suggest that pregnancy enhances the maternal risk of cardiovascular events by increasing central fat accumulation,24 blood pressure,25 and insulin resistance.26 During pregnancy, the maternal heart transforms into "a better functioning heart" and undergoes physiological hypertrophy in order to increase the cardiac pumping capacity. However, Lain et al.26 demonstrated that the heart during late pregnancy is more susceptible to IR injury when subjected to coronary occlusion. Furthermore, during late pregnancy in mice, the IS was greater and the post-ischemic functional recovery was found to be extremely poor. Interestingly, the hemodynamic alterations and increased IS were partially restored in the post-partum mice.

The opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) at the onset of reperfusion is a critical determinant of myocardial cell death.27 In this regard, a study demonstrated that pregnancy lowers the threshold for the mPTP opening, which can be attributed to pregnancy-induced increase in cardiac reactive oxygen species (ROS) generation. Some authors have hypothesized that lactation may induce a resetting effect to the heart and improve pregnancy-induced alterations in cardiovascular dynamics.(3, 28)

The protective effect of lactation may be attributed to an increased metabolic expenditure of a nursing mother,29 explaining the decrease in body mass index and cholesterol levels following lactation. In addition, initiation and maintenance of lactation involve many hormones such as oxytocin, prolactin, growth hormone, thyroxine, adrenal corticoids, and parathyroid hormone.30 Cardiac tissue expresses a wide variety of hormone receptors, including receptors for lactogenic hormones,31,32 and nursing-induced changes in hormonal milieu have been reported to improve the cardiovascular profiles.

Suckling is the major stimulus for the release of oxytocin from the posterior pituitary. The protective effect of oxytocin against IR injury has been previously depicted.14 Faghihi et al.33 demonstrated that oxytocin preconditioning reduces ischemia-induced ventricular arrhythmias by scavenging free radicals and delaying the opening of mPTP. Das and Sarkar15 have suggested an involvement of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels in oxytocin -induced cardioprotection. Furthermore, oxytocin has been shown to promote the release of atrial natriuretic peptide - a well-known cardioprotective hormone, which reduces the incidence of reperfusion- induced arrhythmias.34,35 Oxytocin also exerts negative inotropic and chronotropic effects36 which, in turn may decrease the oxygen demand of the myocardium and produce a smaller infarct following occlusion of the coronary artery. In addition to oxytocin, pretreatment with thyroid hormone has been shown to protect myocardium against lethal ischemia, in a pattern similar to that of ischemic preconditioning.37 We observed that lactation reduced the LVDP, RPP, and HR in ischemic animals. This indicates a positive effect of nursing as it reduces myocardial oxygen consumption and improves oxygen supply to demand ratio.

Suckling does not only stimulate the release of oxytocin but also induces the secretion of prolactin (PRL) and adrenocorticotropic hormone, which are essential for galactopoesis.38 The experimental evidence for the effect of prolactin on the cardiovascular system is quite limited. A cohort study reported the direct association of prolactin levels with endothelial dysfunction and increased risk of cardiovascular events and mortality.39 Conversely, Krzeminski et al.40 observed the antiarrhythmic effects of prolactin (isoform) against IR injury. A 15-day prolactin treatment markedly reduced the adrenaline-induced rise in HR, blood pressure, cardiomyocyte necrosis, and granulocyte infiltration in female rats.41 Moreover, corticosteriods confer cardioprotection by binding to glucocorticoid receptors.42 Glucocorticoids activate the endothelium-derived nitric oxide synthase (eNOS) and exert anti-inflammatory, antiatherogenic, and anti-ischemic effects.43

The autonomic system is an important regulator of lactation and milk ejection. Vagal nerve stimulation (VNS) is essential for suckling-induced oxytocin and prolcatin release.44 Efferent signals from the vagus nerve can inhibit the production of proinflammtory cytokines, thereby improving the pathological outcomes of diseases like sepsis, myocardial ischemia and other inflammatory disorders.45 Interestingly, VNS has been shown to prevent reperfusion injury through inhibition of mPTP.46

In the current study, the protective effect of lactogenesis against IR injury can involve the potential role of lactogenic hormones, which can directly influence the cardiac dynamics via cardiac receptors. Furthermore, lactation may have improved the IR injury via VNS. A plausible confounder in this study was the emotional stress imposed on the maternal health due to the separation of the mothers from their pups. Although according to the research protocol the rats in the non-lactated group did not undergo surgery until 21 days after parturition (similar to the rats in the lactating group), the potential effect of emotional stress on cardiovascular dynamics cannot be definitely ruled out.

 Conclusion

Taken together, our findings demonstrate the cardioprotective effects of lactation on maternal health, independent of pregnancy. Moreover, rats which were not allowed to breast-feed their pups, demonstrated high vulnerability to myocardial ischemic insult.

Sources of Funding

This study was funded by Tehran University of Medical Sciences.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Sahar Askari, from Tehran University of Medical Sciences.

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Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Análise e interpretação dos dados: Askari S, Imani A, Sadeghipour H, Faghihi M, Edalatyzadeh Z, Choopani S, Karimi N, Fatima S; Obtenção de dados: Askari S, Edalatyzadeh Z, Choopani S; Análise estatística: Askari S, Karimi N; Obtenção de financiamento: Imani A; Redação do manuscrito: Askari S, Karimi N, Fatima S; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Fatima S.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade e invalidez a longo prazo a nível mundial. Diversos estudos têm sugerido um efeito protetor da lactação na redução do risco para doenças cardiovasculares.

 Objetivo:

Este estudo foi desenvolvido para avaliar os efeitos da gestação e da lactação sobre a vulnerabilidade do miocárdio ao insulto isquêmico.

 Métodos:

Dezoito ratas foram divididas aleatoriamente em três grupos: isquemia-reperfusão (IR), no qual os corações de ratas virgens foram submetidos à IR (n = 6); lactantes, no qual as ratas amamentaram seus filhotes por 3 semanas e os corações maternos foram, em seguida, submetidos à IR (n = 6); e não lactantes, no qual os filhotes foram separados após o nascimento e os corações maternos foram submetidos à IR (n = 6). As medidas de desfecho incluíram frequência cardíaca (FC), pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE), duplo produto (DP), razão do tamanho do infarto sobre a área sob risco (TI/ASR %) e arritmias ventriculares - contração ventricular prematura (CVP) e taquicardia ventricular (TV).

 Resultados:

O TI/ASR foi substancialmente menor no grupo de lactantes quando comparado ao grupo de não lactantes (13,2 ± 2,5 versus 39,7 ± 3,5, p < 0,001) e ao grupo IR (13,2 ± 2,5 versus 34,0 ± 4,7, p < 0,05). A avaliação das arritmias ventriculares induzidas pela IR indicou que o número de CVPs compostas na isquemia, e o número e a duração das TVs na isquemia e nos primeiros 5 minutos de reperfusão no grupo de não lactantes foram significativamente (p < 0,05) mais elevados do que os encontrados nos grupos IR e de lactantes.

 Conclusão:

A lactação induziu o aparecimento precoce de efeitos cardioprotetores, enquanto ratas que não foram permitidas a amamentar seus filhotes se mostraram mais suscetíveis à lesão miocárdica por IR.

 Palavras-chave: Lactação Infarto do Miocárdio Isquemia Miocárdica Parto Introdução

As doenças coronarianas são a principal causa de mortalidade em todo o mundo, com cerca de 38% das mortes sendo atribuídas a estas doenças.1 Além da hipertensão arterial e do diabetes, múltiplos fatores relacionados ao estilo de vida podem aumentar o risco de infarto do miocárdio, como dietas ricas em colesterol, tabagismo, consumo de álcool e estresse.2 Um acúmulo de evidências epidemiológicas sugere que a decisão da mulher de amamentar seus filhos tem um impacto significativo sobre o risco materno para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares.3,4 Embora as políticas nacionais de promoção da amamentação estejam sendo profundamente implementadas em muitos países desenvolvidos, a taxa global de aleitamento materno exclusivo está abaixo de 40%.5

A lactação confere benefícios significativos à saúde cardiovascular materna.6 A lactogênese tem um efeito favorável sobre o metabolismo glicídico e lipídico. Ela aumenta a sensibilidade à insulina e eficácia da glicose, reduzindo o risco de diabetes tipo 2.3 A amamentação promove a produção de lipoproteínas de alta densidade e reduz os níveis de triglicérides e lipoproteínas de baixa densidade.7,8 Por conseguinte, a lactação mobiliza os depósitos de gordura produzidos durante a gravidez, reduzindo assim o risco de doenças cardiovasculares e infarto do miocárdio.9 Além disso, a lactação reduz a pressão arterial e a frequência cardíaca (FC) maternas, melhorando o débito cardíaco.10 Hanwell e Peaker11 observaram em ratas que o aumento do débito cardíaco é diretamente proporcional à intensidade da sucção. Além disso, certos hormônios liberados durante a lactação, tais como a ocitocina, prolactina, glicocorticoides, grelina e hormônio do crescimento podem precondicionar o miocárdio contra a lesão cardíaca.12,13 Já foi demonstrado que a ocitocina endógena liberada centralmente e a infusão exógena de ocitocina protegem o coração contra insulto hipóxico através da ativação de receptores cerebrais.14 Além disso, a ocitocina induz à cardioproteção através de uma via que envolve canais de potássio dependentes de ATP na mitocôndria.15 Embora o efeito dos hormônios lactogênicos sobre a saúde cardiovascular tenha sido estudado até certa medida, evidências experimentais sugerindo um papel cardioprotetor da lactação contra lesão induzida por isquemia-reperfusão (IR) ainda são escassas. Assim, o presente estudo foi desenvolvido para testar a hipótese de que a lactação reduz a vulnerabilidade do miocárdio à lesão por IR.

 Métodos Animais

Dezoito ratas Sprague-Dawley (180-230 g) foram alojadas em uma sala climatizada a 21-23 °C, com ciclos claro/escuro de 12 horas. Durante o período experimental, as ratas tiveram acesso livre a ração e água. Os protocolos experimentais seguidos neste estudo estiveram em conformidade com as Recomendações para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, publicadas pelo National Institutes of Health (NIH, Publicação no. 85-23, revisada em 1996) e foram aprovados pelo comitê de ética institucional em Tehran University of Medical Sciences (Teerã, Irã).

 Preparação de corações isolados

Os animais foram anestesiados com tiopental sódico intraperitoneal (60 mg/kg). Heparina (500 UI/kg) foi também administrada para evitar coagulação sanguínea. Uma vez anestesiadas, as ratas foram submetidas a uma incisão transabdominal com exposição do coração. Após canulação da aorta, o coração foi removido e colocado em um sistema de Langendorff. Os corações foram perfundidos retrogradamente com solução-tampão de Krebs-Henseleit-bicarbonato (contendo, em mmol/L: NaHCO3 25; KCl 4,7; NaCl 118,5; MgSO4 1,2; KH2PO4 1,2; glicose 11; e CaCl2 2,5) oxigenada com 95% de O2 e 5% de CO2 (pH 7,35-7,45 a 37 °C). Um balão de látex com solução salina foi introduzido no ventrículo esquerdo e insuflado para proporcionar uma pré-carga de 8 -10 mmHg. O balão foi conectado a um transdutor de pressão (Harvard, March-Hugstetten, Alemanha) que permitiu a realização de medidas em tempo real das pressões do ventrículo. Um registro eletrocardiográfico foi realizado através da fixação de eletrodos finos no ápice ventricular e no átrio direito. Uma agulha cirúrgica (sutura de seda 6-0) foi passada sob a origem da artéria coronária descendente anterior esquerda e as extremidades da sutura foram passadas por duas pontas de pipetas de plástico para formar um laço. Uma isquemia regional foi induzida através de um aperto do laço (30 min) e a reperfusão foi realizada através da liberação das extremidades da sutura (60 min). Os corações bateram espontaneamente durante todos os experimentos.

 Estimativa do tamanho da amostra

O tamanho da amostra foi estimado através do método da equação de recursos.16

E = N - T

E = graus de liberdade (análise de variância [ANOVA]; entre 10 e 20)

N = número total de animais

T = número de grupos de tratamento

"N" foi considerado a partir de um estudo publicado anteriormente17 e foi ajustado de modo a atingir um valor válido para "E".

 Grupos experimentais

Para estudar os efeitos da gestação e da lactação sobre a lesão miocárdica induzida por IR, 18 ratas foram divididas aleatoriamente em três grupos:

Grupo IR (n = 6): corações isolados de ratas virgens no período de diestro foram submetidos a 30 min de isquemia regional, seguida por 60 min de reperfusão.

Grupo de lactantes (n = 6): as ratas cuidaram dos seus filhotes por 3 semanas e, em seguida, os corações maternos foram submetidos a 30 min de isquemia regional, seguido por 60 min de reperfusão.

Grupo de não lactantes (n = 6): após o parto, as ratas foram separadas de seus filhotes e 3 semanas depois, os corações maternos foram submetidos a 30 min de isquemia regional, seguida por 60 min de reperfusão.

Funções hemodinâmicas

A pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE) e a FC foram monitoradas continuamente e registradas através do sistema de aquisição de dados BioLab. O duplo produto (DP) foi calculado através da multiplicação da PDVE pela FC.

Avaliação da área sob risco e tamanho do infarto

Ao final da reperfusão, a artéria coronária esquerda foi reocluída e o corante azul de Evans (0,3-0,5 mL) foi infundido via aorta para diferenciar a zona isquêmica (área sob risco; ASR) da zona não isquêmica. Os corações foram congelados a -20°C e seccionados transversalmente em fatias de 2,0 mm (com uso de uma matriz fatiadora de aço inoxidável com intervalos entre as fatias de 2,0 mm em cortes coronais) no sentido do ápice para a base. As fatias foram incubadas em cloreto de trifeniltetrazólio a 1% (CTF em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4, 37°C) por 20 min, seguido de fixação tecidual (10% formalina tamponada com fosfato) por 24 h. A CTF reage com o tecido viável, produzindo um derivado formazan de cor vermelha que é distinto da área necrótica branca. Os cortes histológicos foram escaneados para determinação da área não isquêmica, ASR (área isquêmica) e tamanho do infarto (TI) por meio de cálculo dos píxeis ocupados por cada área com utilização do programa Adobe Photoshop (Adobe Systems, Seattle, WA, EUA). A ASR foi expressa como uma percentagem do volume ventricular esquerdo para cada coração. O tamanho do infarto foi determinado com utilização de planimetria assistida por computador e expressa como porcentagem da ASR.18-20

Avaliação das arritmias ventriculares

As arritmias ventriculares induzidas pela isquemia foram avaliadas durante o período de oclusão e determinadas de acordo com as Convenções de Lambeth.21 A taquicardia ventricular (TV) e a contração ventricular prematura (CVP), incluindo CVPs compostas (como bigeminismo, pares e salvas), foram contadas durante o período de isquemia e nos primeiros 5 minutos do período de reperfusão.

 Análise estatística

Todos os dados foram analisados estatisticamente com o programa GraphPad InStat, versão 3.06 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Os dados seguiram uma distribuição gaussiana (teste de Kolmogorov-Smirnov). Todos os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média (EPM). As medidas de desfecho entre os grupos foram analisadas com ANOVA unifatorial, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. Para comparações intragrupos, foi realizada ANOVA com medidas repetidas, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni (para colunas selecionadas). A significância estatística foi definida como p < 0,05.

 Resultados Parâmetros hemodinâmicos

A Tabela 1 mostra as alterações na FC, na PDVE e no DP nos grupos IR, lactantes e não lactantes durante períodos diferentes do experimento.

Parâmetros hemodinâmicos
Grupos Basal Isquemia Reperfusão
FC (bpm) PDVE (mmHg) DP (mmHg x bpm) FC (bpm) PDVE (%Basal) DP (%Basal) FC (bpm) PDVE (%Basal) DP (%Basal)
IR 146 ± 4,9 58,4 ± 11,9 8519,6 ± 1805,2 134,6 ± 3,9 62,5 ± 8,3* 57,5 ± 7,3# 131,2 ± 5,2$ 64,3 ± 8,6*$ 57,4 ± 6,8#
L 138 ± 3,6 115,2 ± 34,2 15673,2 ± 4219,6 120,7 ± 9,1 28,3 ± 3,7* 25,2 ± 4,6* 71,7 ± 18,4 20,8 ± 7,8# 12,6 ± 7,2#
NL 148,6 ± 8,3 66,9 ± 11,9 9797,3 ± 1652,5 137,4 ± 9,7 73 ± 8,5$ 67,2 ± 7,7*$ 145,4 ± 11,9$ 73,1 ± 8,5$ 74 ± 13$

p < 0,05 versus basal do grupo

p < 0,001 versus basal do grupo,

p < 0,05 versus grupo de lactantes.

Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Para PDVE, DP e FC, as médias foram comparadas entre os grupos com ANOVA unifatorial e dentro de cada grupo, com ANOVA com medidas repetidas. O teste post hoc de Bonferroni foi utilizado.

IR: isquemia-reperfusão; L: lactantes; NL: não lactantes; PDVE: pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (mmHg); FC: frequência cardíaca (bpm); DP: duplo produto (mmHg x min); bpm: batimentos por minuto.

No grupo IR, a PDVE e o DP se mostraram reduzidos (p < 0,05 e p < 0,001, respectivamente) ao final do período de isquemia e reperfusão em comparação com o período basal. No grupo de lactantes, a PDVE e o DP estiveram significativamente reduzidos ao final da isquemia (p < 0,05) e da reperfusão (p < 0,001) em comparação com o momento basal. Além disso, no grupo de lactantes, a FC se mostrou substancialmente reduzida na reperfusão em comparação com o momento basal. Os animais não lactantes demonstraram um menor DP na isquemia quando comparado ao observado no período basal (p < 0,05).

A análise intergrupos mostrou que a PDVE ao final da isquemia e o DP na isquemia e reperfusão estiveram significativamente mais altos no grupo de não lactantes quando comparados ao de lactantes (p < 0,05). Além disso, a FC e a PDVE estiveram acentuadamente aumentadas na reperfusão nos grupos IR e de não lactantes, quando comparados com o grupo de lactantes (p < 0,05).

 Área sob risco e tamanho do infarto

A Figura 1 mostra que não houve diferença significativa entre os grupos em relação à ASR. No entanto, o TI/ASR foi significativamente menor no grupo de lactantes em comparação aos grupos de não-lactantes e IR (13,2 ± 2,5 versus 39,7 ± 3,5 e 34,0 ± 4,7, respectivamente).

Área miocárdica sob risco em relação ao ventrículo esquerdo (ASR/VE %) e tamanho do infarto (TI/ASR %). Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os valores médios entre os grupos foram comparados com ANOVA unifatorial, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. # p < 0,05 versus grupo lactantes, *** p < 0,001 versus grupo lactantes. IR: isquemia-reperfusão; L: lactantes; NL: não lactantes.

Arritmias ventriculares

Durante a fase isquêmica, o número de CVPs compostas foi estatisticamente mais alto no grupo de não lactantes em comparação ao grupo de lactantes (p < 0,05) (Figura 2). Durante os primeiros 5 minutos da fase de reperfusão, o número de CVPs compostas não diferiu significativamente entre os grupos (Figura 3). Durante a isquemia e nos primeiros 5 min de reperfusão, o número de TVs foi significativamente mais baixo nos grupos IR e de lactantes em comparação ao grupo de não lactantes (p < 0,001) (Figura 4). Além disso, a duração das TVs durante a isquemia e nos primeiros 5 min da reperfusão foi substancialmente menor nos grupos de lactantes e IR quando comparados com o grupo de não lactantes (p < 0,01) (Figura 5).

Número de contrações ventriculares prematuras (CVPs) compostas (incluindo bigeminismo, pares e salvas) nos diferentes grupos. Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os valores médios entre os grupos foram comparados com ANOVA unifatorial, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. * p < 0,05 versus grupo de lactantes. IR: isquemia-reperfusão; L: lactantes; NL: não lactantes.

Número de contrações ventriculares prematuras (CVPs) compostas (incluindo bigeminismo, pares e salvas) nos diferentes grupos. Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os valores médios entre os grupos foram comparados com ANOVA unifatorial, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. IR: isquemia-reperfusão; L: lactantes; NL: não lactantes.

Número de taquicardias ventriculares (TVs) nos diferentes grupos. Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os valores médios entre os grupos foram comparados com ANOVA unifatorial, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. ***p < 0,001 versus grupo de lactantes; $$$p < 0,001 versus grupo IR. IR: isquemia-reperfusão; L: lactantes; NL: não lactantes.

Duração da taquicardia ventricular (TV) nos diferentes grupos. Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os valores médios entre os grupos foram comparados com ANOVA unifatorial, seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. IR: isquemia-reperfusão; L: lactantes; NL: não lactantes. **p < 0,001 versus grupo de lactantes; $$p < 0,001 versus grupo IR.

Discussão

O presente estudo mostrou o efeito da gravidez e da lactação sobre a vulnerabilidade do miocárdio a um insulto isquêmico. Observamos que a lactação, e não somente a gravidez, precondicionou o coração materno contra o infarto do miocárdio induzido por isquemia. Além disso, a amamentação reduziu a incidência e duração de arritmias ventriculares durante a isquemia.

Evidências crescentes têm indicado efeitos benéficos da lactação a curto e longo prazo sobre fatores de risco associados com a morbidade cardiovascular.22,23 O único estudo indicando efeitos cardioprotetores da lactação contra a lesão por IR foi realizado recentemente por Shekarforoush e Safari.17 No entanto, o estudo desses autores não considerou se a cardioproteção teria sido conferida apenas pela gravidez. Além disso, esses autores não puderam observar efeitos antiarrítmicos da lactação durante a isquemia miocárdica.17 No presente estudo, foi utilizado um modelo in vitro de Langendorff. Assim, o aparecimento precoce de efeitos cardioprotetores da lactação pode ser atribuído às características intrínsecas do coração independentes da complexa fisiologia da lactação. Observamos que a gravidez aumenta o tamanho do infarto induzido pela isquemia, além da incidência e duração das arritmias. Estudos anteriores sugerem que a gravidez aumenta o risco materno de eventos cardiovasculares através de um aumento no acúmulo de gordura central,24 na pressão arterial25 e na resistência à insulina.26 Durante a gravidez, o coração materno se transforma em "um coração de melhor funcionamento" e sofre hipertrofia fisiológica, a fim de aumentar a sua capacidade de bombeamento. No entanto, Lain et al.26 demonstraram que o coração durante fases avançadas da gravidez é mais suscetível à lesão por IR quando submetido à oclusão coronariana. Além disso, em ratas em fase avançada de gravidez, o TI foi maior e a recuperação funcional pós-isquêmica foi observada como sendo extremamente pobre. É interessante notar que as alterações hemodinâmicas e o aumento do TI foram parcialmente restaurados no pós-parto em camundongos.

A abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm) no início da reperfusão é um fator crítico determinante de morte celular miocárdica.27 Um estudo a este respeito demonstrou que a gravidez diminui o limiar para a abertura dos PTPm, que pode ser atribuído a um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) no coração induzido pela gravidez. Alguns autores levantaram a hipótese de que a lactação pode induzir um efeito de redefinição sobre o coração e melhorar as alterações induzidas pela gravidez na dinâmica cardiovascular.3,28

O efeito protetor da lactação pode ser atribuído a um aumento do gasto metabólico na nutriz,29 explicando a diminuição do índice de massa corporal e dos níveis de colesterol após a lactação. Além disso, a iniciação e manutenção da lactação envolvem vários hormônios, como a ocitocina, prolactina, hormônio do crescimento, tiroxina, corticoides adrenais e hormônio da paratireoide.30 O tecido cardíaco expressa uma grande variedade de receptores hormonais, incluindo receptores para hormônios lactogênicos,31,32 e alterações no meio hormonal induzidas pela amamentação têm sido relatadas como melhorando os perfis cardiovasculares.

A sucção é o principal estímulo para a liberação de ocitocina a partir da hipófise posterior. O efeito protetor da ocitocina contra a lesão por IR já foi previamente descrito.14 Faghihi et al.33 demonstraram que um precondicionamento com ocitocina reduz as arritmias ventriculares induzidas por isquemia por eliminar radicais livres e retardar a abertura dos PTPms. Das e Sarkar15 sugeriram um envolvimento dos canais de potássio dependentes de ATP na mitocôndria na cardioproteção induzida por ocitocina. Além disso, tem sido demonstrado que a ocitocina promove a liberação de peptídeo natriurético atrial - um hormônio cardioprotetor bem conhecido que reduz a incidência de arritmias induzidas por reperfusão.34,35 A ocitocina também exerce efeitos inotrópicos e cronotrópicos negativos36 que, por sua vez, podem diminuir a demanda de oxigênio do miocárdio, produzindo um infarto menor após oclusão da artéria coronária. Além da ocitocina, o pré-tratamento com hormônio tireoidiano tem sido mostrado como protetor contra a isquemia letal em um padrão semelhante ao do precondicionamento isquêmico.37 Observamos que a lactação reduz a PDVE, o DP e a FC em animais submetidos à isquemia. Isto indica um efeito positivo da amamentação, já que ela reduz o consumo de oxigênio pelo miocárdio e melhora a relação oferta-demanda de oxigênio.

A sucção não apenas estimula a liberação de ocitocina, mas também provoca secreção de prolactina e hormônio adrenocorticotrófico, que são essenciais para a galactopoiese.38 As evidências experimentais para o efeito da prolactina sobre o sistema cardiovascular são bastante limitadas. Um estudo de coorte relatou uma associação direta entre os níveis de prolactina com disfunção endotelial e aumento do risco de eventos cardiovasculares e mortalidade.39 Por outro lado, Krzeminski et al.40 observaram efeitos antiarrítmicos da prolactina (isoforma) contra a lesão por IR. Em ratas, 15 dias de tratamento com prolactina reduzem substancialmente o aumento induzido pela adrenalina na FC, pressão arterial, necrose e infiltração de granulócitos em cardiomiócitos.41 Além disso, os corticosteroides conferem cardioproteção através da ligação a receptores glicocorticoides.42 Os glicocorticoides ativam a sintase endotelial (eNOS) e exercem efeitos anti-inflamatórios, antiaterogênicos e anti-isquêmicos.43

O sistema autônomo é um regulador importante da lactação e da ejeção de leite. A estimulação do nervo vago (ENV) é essencial para a liberação de ocitocina e prolactina induzidas pela sucção.44 Sinais eferentes do nervo vago podem inibir a produção de citocinas proinflamatórias, melhorando assim os desfechos patológicos de doenças como a sepse, isquemia miocárdica e outros distúrbios inflamatórios.45 Curiosamente, demonstrou-se que a ENV previne a lesão por reperfusão através da inibição dos PTPms.46

No presente estudo, o efeito protetor da lactogênese contra a lesão por IR pode envolver um papel potencial dos hormônios lactogênicos, que podem influenciar diretamente a dinâmica cardíaca através de receptores cardíacos. Além disso, a lactação pode ter melhorado a lesão por IR através da ENV. Um confundidor plausível neste estudo foi o estresse emocional imposto sobre a saúde das mães pela separação dos seus filhotes. Embora, pelo protocolo da pesquisa, as ratas no grupo de não lactantes não tenham sido operadas até 21 dias após o parto (de maneira semelhantes às ratas no grupo de lactantes), o efeito potencial do estresse emocional na dinâmica cardiovascular não pode ser definitivamente excluído.

 Conclusão

Nossos achados, como um todo, demonstram um efeito cardioprotetor da lactação sobre a saúde materna, independente da gravidez. Além disso, ratas que não foram permitidas a amamentar seus filhotes demonstraram uma alta vulnerabilidade ao insulto miocárdico isquêmico.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo Tehran University of Medical Sciences.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Sahar Askari pela Tehran University of Medical Sciences.