Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCYNcFfsZzZGLS59Wdg6JCNcnS0066-782X201700050043610.5935/abc.20170060Original ArticlesExerciseEffects of a Single Bout of Resistance Exercise in Different Volumes on Endothelium Adaptations in Healthy AnimalsMotaMarcelo Mendonça12SilvaTharciano Luiz Teixeira Braga da12MacedoFabricio Nunes12MesquitaThássio Ricardo Ribeiro1QuintansLucindo JoséJúnior1Santana-FilhoValter Joviniano de1Lauton-SantosSandra1SantosMárcio Roberto Viana1Universidade Federal de SergipeAracajuSEBrazilUniversidade Federal de Sergipe, Aracaju, SE - BrazilUniversidade Federal de SergipeEstácioFaculdade Estácio de SergipeCurso de Educação FísicaAracajuSEBrazilCurso de Educação Física da Faculdade Estácio de Sergipe (Estácio/FASE), Aracaju, SE - BrazilUniversidade Estácio de SáMailing Address: Márcio Roberto Viana dos Santos PhD, Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe. Av Marechal Rondon s/n, Roza Elze. Postal Code 49100-000, São Cristóvão, SE - Brazil. E-mail: marcio@infonet.com.br.
Author contributions
Conception and design of the research: Mota MM, Silva TLTB, Santos MRV; Acquisition of data: Mota MM, Silva TLTB, Macedo FN, Mesquita TRR; Analysis and interpretation of the data: Mota MM, Silva TLTB, Macedo FN, Mesquita TRR; Statistical analysis: Macedo FN, Mesquita TRR; Obtaining funding: Quintans Júnior LJ, Santana-Filho VJ, Lauton-Santos S, Santos MRV; Writing of the manuscript: Macedo FN, Mesquita TRR; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Mota MM, Silva TLTB, Macedo FN, Mesquita TRR, Quintans Júnior LJ, Santana-Filho VJ, Lauton-Santos S, Santos MRV.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
0520171085436442120520160111201619122016This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
Resistance exercise (RE) has been recommended for patients with cardiovascular diseases. Recently, a few studies have demonstrated that the intensity of a single bout of RE has an effect on endothelial adaptations to exercise. However, there is no data about the effects of different volumes of RE on endothelium function.
Objective:
The aim of the study was to evaluate the effects of different volumes of RE in a single bout on endothelium-dependent vasodilatation and nitric oxide (NO) synthesis in the mesenteric artery of healthy animals.
Methods:
Male Wistar rats were divided into three groups: Control (Ct); low-volume RE (LV, 5 sets x 10 repetitions) and high-volume RE (HV, 15 sets x 10 repetitions). The established intensity was 70% of the maximal repetition test. After the exercise protocol, rings of mesenteric artery were used for assessment of vascular reactivity, and other mesenteric arteries were prepared for detection of measure NO production by DAF-FM fluorescence. Insulin responsiveness on NO synthesis was evaluated by stimulating the vascular rings with insulin (10 nM).
Results:
The maximal relaxation response to insulin increased in the HV group only as compared with the Ct group. Moreover, the inhibition of nitric oxide synthesis (L-NAME) completely abolished the insulin-induced vasorelaxation in exercised rats. NO production showed a volume-dependent increase in the endothelial and smooth muscle layer. In endothelial layer, only Ct and LV groups showed a significant increase in NO synthesis when compared to their respective group under basal condition. On the other hand, in smooth muscle layer, NO fluorescence increased in all groups when compared to their respective group under basal condition.
Conclusions:
Our results suggest that a single bout of RE promotes vascular endothelium changes in a volume-dependent manner. The 15 sets x 10 repetitions exercise plan induced the greatest levels of NO synthesis.
Physical activity induces physiological adaptations of the endothelium, contributing to the local control of vascular tone.1 Besides, the beneficial effects of regular exercise on sympathetic and parasympathetic tone,2 blood coagulation,3 myocardial contractility4 and release of endothelium-derived relaxing factors5 are likely to improve cardiovascular health and reduce the risk of diseases.
Exercise training is nowadays one of the main non-pharmacological tool in the maintenance of a healthy life. Its effects involve recurrent exposure to changes in cardiovascular hemodynamics promoted by bouts of physical activity. In response to acute exercise, numerous intra- and extracellular pathways are activated to increase blood flow to active muscles.6,7 At the onset of exercise, the mechanical action of skeletal muscle creates a 'muscle-pump', which causes an immediate increase in blood flow.7,8 This abrupt change in blood flow towards the exercised tissues, promotes a reduction in blood supply in visceral region, phenomena known as exercise hyperemia.7,8
Many evidences suggest that striation in the vascular wall, associated with pulsatile flow, intermittent hypoxia and release of catecholamines are essential factors for nitric oxide (NO) production during a single bout of exercise.9-11 Recently, our group have showed that acute resistance exercise induce an intensity-dependent effect on NO synthesis and vascular relaxation in mesenteric arteries of healthy rats.12,13 The mesenteric artery regulates 20% of the blood flow and effectively participates in the total peripheral resistance, and thus, is directly involved in vascular changes promoted by exercise.9
In addition, our group has recently demonstrated a strong, positive relationship between the magnitude of vascular adaptations to exercise and exercise intensity.12 Nevertheless, exercise prescription depends on two different aspects - intensity and volume of exercise. The volume of exercise directly affects the demand of oxygen and other nutrients in attempt to recover from the stress promoted by consecutive muscle contractions. Thus, it is expected that changes in training volume promote different vascular adaptations, i.e., the higher the volume of exercises the higher the metabolic demand.
In addition, there are no studies investigating acute vascular adaptations to different volumes of resistance exercise. This information could guide the prescription of long-term training in cardiovascular disease conditions. Thus, our study aimed to evaluate the influence of the volume of resistance exercise on endothelium-dependent vasodilatation and NO synthesis in mesenteric artery of healthy animals.
MethodsAnimals
Twenty-four male Wistar rats (250-350 g, 8-10 weeks old) were used for all experiments. The rats were randomized into three groups: control (Ct, n = 8), low-volume (LV, n = 8) and high-volume resistance exercise (HV, n = 8). All procedures were in agreement with the Brazilian Society of Laboratory Animal Sciences and were approved by the Ethics Committee on Animal Research XXX (omitted to the review process), Brazil (protocol # 80/2010).
Resistance exercise protocol
Animals were exercised following a model described by Tamaki et al.14 Electrical stimulation (20 V, 0.3 s duration, at 3 s intervals) was applied on the tail of the rat through a surface electrode. The animals underwent three days of familiarization; firstly, they were placed on the apparatus and left on exercise position for 5 min to reduce the stress caused by the equipment and handling of the animals. After the familiarization period, the animals performed one maximum repetition (1RM) test, which consisted of determining the maximum lifted load in one repetition. After 2 days, the animals underwent the protocol of leg extension exercise - 5 (LV) or 15 (HV) sets with 10 repetitions and a 180s resting period between each set. The animals exercised in intensity of 70% of 1RM. Animals of the Ct group were maintained under the same conditions of the LV and HV animals but at resting position.
Vascular reactivity studies
Immediately after exercise, the animals were sacrificed. The superior mesenteric artery was removed, stripped of connective and adipose tissues, and sectioned into rings (1-2 mm). Rings were suspended in organ baths containing 10 mL of Tyrode's solution by fine stainless steel hooks connected to a force transducer (Letica, Model TRI210; Barcelona, Spain) with cotton threads. This solution was continually gassed with carbogen (95% O2 and 5% CO2) and maintained at 37°C and the rings maintained at a resting tension of 0.75 g for 60 min (stabilization period). The functionality of the endothelium was assessed by the ability of acetylcholine (ACh, 1 µM; Sigma-Aldrich, USA) to induce more than 75% relaxation of precontracted vascular rings with phenylephrine (Phe, 1 µM; Sigma-Aldrich, USA). After that, changes in vascular reactivity were assessed by obtaining concentration-response curves for insulin (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) (10−13-10−6 M). The rings were then washed out and new insulin-induced relaxation was obtained after incubation with a non-specific inhibitor of nitric oxide synthase, L-NG-Nitroarginine methyl ester (L-NAME, 100 µMol/L; Sigma-Aldrich, USA), for 30 min. This was used to evaluate the role of NO on insulin-induced vascular relaxation.
Measurement of NO Production
NO production in mesenteric artery ring was determined by using a fluorescent cell permeable dye for NO, DAF-FM (4,-amino-5 methylamino-2',7'-diaminofluorescein diacetate, Molecular Probes, USA), as previously described.15 In order to detect NO, freshly isolated mesenteric artery was loaded with 10 µM of the probe for 40 min at 37°C. Twenty minutes after the onset of the probing, some rings were stimulated with 10 nM of regular human insulin for 20 min and then washed for 40 min with Tyrode´s solution. Mesenteric segments were frozen and cut into 20µm-thick sections. Images were recorded using a fluorescence microscope (IX2-ICB, Olympus®, USA) under identical settings. The fluorescence intensity was measured using ImageJ software (NIH, USA). A minimum of ten regions were randomly selected from the endothelial and smooth muscle layers of each mesenteric section. It is worth to note that smooth muscle exhibits an autofluorescence, therefore, in order to avoid misleading fluorescence measurements, analyses of images were carefully performed selecting the region of interest within the smooth muscle fibers.
Statistical Analysis
Initially, all data underwent the Kolmogorov-Smirnov test to determine whether the probability distributions were parametric or non-parametric. All data had normal distribution. The values were expressed as mean ± standard error of the mean (SEM). One-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Bonferroni`s test were performed using GraphPad Prism Software (San Diego, CA, USA). The NO fluorescence microscopy images were analyzed according to the intensity of the fluorescence per normalized area, represented in arbitrary unit (a.u.). The values were considered statistically significant when p < 0.05.
ResultsAcute effect of different resistance exercise volumes on endothelium-dependent vasodilation
As shown in the Figure 1a, in all groups, insulin caused a concentration-dependent vasodilation in superior mesenteric arteries. Despite the tendency to increase the insulin-induced vasodilation in LV group, no significant difference was found in comparison to the Ct group (Figure 1a). However, resistance exercise at HV significantly increased the relaxation induced by insulin compared to Ct and LV groups (Figure 1a). The effect of NOS on insulin-induced vascular relaxation was evaluated in the presence of L-NAME. As shown in the Table 1, insulin-induced vasodilation was significantly reduced in Ct group; however, in both exercised groups the vasodilation was completely abolished showing a significant reversion of the curve when compared to Ct. No statistically significant differences were observed between the LV and HV groups. (Figure 1b).
Effects of a single bout of resistance exercise in different levels of volume on endothelium-dependent relaxation. (a) Concentration-response curves for insulin (10<sup>-13</sup> - 10<sup>-6</sup>M) in rings isolated from the superior mesenteric artery with functional endothelium and pre-contracted with phenylephrine (Phe) (1 <italic>µ</italic>M). (b) Concentration-response curves for insulin in rings pre-incubated with nitric oxide inhibitor (L-NAME: 100 <italic>µ</italic>M). Ct: control, LV: low-volume and HV: high-volume. Statistical differences were determined by one-way ANOVA followed by Bonferroni's test. Results are expressed as mean ± SEM. *p < 0.05.
Values of Rmax obtained from concentration-response curves for insulin in mesenteric arteries before and after incubation with L-NAME
Groups
Insulin (%)
Insulin + L-NAME (%)
Control
7.66 ± 0.83
2.01 ± 0.24§
Low volume
10.77 ± 0.86
–0.36 ± 0.36§,†
High volume
18.01 ± 0.97*, #
–2.08 ± 0.19§,†
The experiments were performed in the absence of L-NAME (insulin) and in the presence of 100 µM of L-NAME (L-NAME). Statistical differences were determined by one-way ANOVA followed by the Bonferroni post-hoc test. The data are expressed as mean ± SEM.
p < 0.05 vs. control,
p < 0.05 vs. low volume,
p < 0.05 vs. respective group without L-NAME and
p < 0.05 vs. control + L-NAME.
Acute effect of different resistance exercise volumes on the endothelial NO synthesis
Interestingly, under basal condition, there was a significant volume-dependent increase in NO production in endothelium and smooth muscle layer (Figure 2a and 2b). After insulin stimulation, we found an enhanced endothelial NO production in Ct and LV, but not in HV when compared to their respective group under basal conditions (Figure 2a). On the other hand, in smooth muscle layer, NO fluorescence was significantly increased in all groups when compared to their respective group at baseline (Figure 2b). However, it is important to highlight that insulin-stimulation in the LV group reached similar DAF fluorescence level as the Ct group (Figure 2b).
Effects of a single bout of resistance exercise in different levels of volume on endothelium-derived nitric oxide production. Detection of nitric oxide by DAF (diaminofluorescein) fluorescence at baseline and after stimulation with insulin (10 nM) (top). (a) Quantitative analyses of DAF fluorescence in endothelial layer before and after insulin stimulation; (b) quantitative analyses of DAF fluorescence in smooth muscle layer before and after insulin stimulation. Scale: 20<italic>µ</italic>m. Ct: control, LV: low-volume and HV: high-volume. Statistical differences were determined by one-way ANOVA followed by Bonferroni's test. Results are expressed as mean ± SEM. *p < 0.05 vs. Ct(-); <sup>§</sup>p < 0.05 vs. LV(-); <sup>δ</sup>p < 0.05 vs. Ct (+); <sup>#</sup>p < 0.05 vs. LV(+); Ψp < 0.05 vs. HV(-).
In order to precisely evaluate the global increase in NO synthesis, the endothelial and smooth muscle layer fluorescence data were pooled and normalized to their respective group under basal conditions. The results were expressed as percentage of increase in comparison of baseline. In this experimental approach, we found a reduction in the additional production of NO in a volume-dependent way (Figure 3).
Effect of a single bout of resistance exercise in different levels of volume on additional NO synthesis in mesenteric artery stimulated by insulin (10 nmol/L). The graph shows the ratio of NO fluorescence in insulin-stimulated rings and NO fluorescence at baseline. Ct: control, LV: low-volume and HV: high-volume. Statistical differences were determined by one-way ANOVA followed by Bonferroni's test. Results are expressed as mean ± SEM. *p < 0.05 vs. Ct and <sup>#</sup>p < 0.05 vs. LV.
Discussion
In the present study, we demonstrated that one single bout of different volumes but same intensity of resistance exercise promotes acute endothelial adaptations in healthy animals in a volume-dependent way. The animals subjected to 15 sets / 10 repetitions (HV group) had a more pronounced vasodilatory response. In summary, our results indicate that high volume of resistance exercise promotes an improvement in the arterial relaxation induced by insulin due an enhanced NO production.
Insulin is well known to exert a crucial role in the maintenance of metabolic homeostasis; however, this hormone also plays a key role in the cardiovascular system. In vascular bed-specific endothelial cells, insulin causes a rapid and concentration-dependent increase in the production of NO through the activation of endothelial NO synthase.16,17 In our study, low-volume of resistance exercise was not able to promote an increase in the vascular relaxation. On the other hand, high-volume of resistance exercise produced an increased insulin-induced vasodilation in superior mesenteric artery. Similarly, Mota et al.13 observed that high-intensity resistance exercise enhanced the relaxation induced by insulin in mesenteric artery of healthy animals. Thus, we hypothesize that both, high-volume and -intensity, are linked with enhanced vascular function.
To understand the participation of NO synthase in the insulin-induced relaxation, we performed concentration-response curves for insulin in pre-incubated vascular rings with L-NAME. Our data showed that insulin-induced relaxation was fully abolished by L-NAME in all groups, reinforcing the great contribution of NO in the arterial relaxation promoted by insulin.
In addition, our group has previously reported insulin-induced vasoconstriction in exercised animals via activation of MAPK/endothelin-1 pathway. This corroborates our finding on the contraction response in NO synthase inhibition in animals submitted to a single section of resistance exercise. Thus, as previously reported by our group, the functional interaction between these intracellular signaling pathways plays an essential role in the regulation of the myogenic tone in the vasculature.12
Our in situ results of NO production in superior mesenteric artery of exercised animals at different volumes demonstrated a volume-dependent increase of NO production in the endothelium and smooth muscle layers. Interestingly, in mesenteric artery rings stimulated with insulin, the additional synthesis of NO was lower in exercised animals than in the Ct group. Furthermore, our data showed that the exercised groups already had increased baseline levels of NO, and hence it is reasonable to suggest that resistance exercise might increase NO synthase activity to a sub-maximal level, preventing a substantial increase of NO synthesis in insulin-stimulated mesenteric rings.
Indeed, to exert its biological effects, endothelium-derived NO must reach the underlying smooth muscle cells.5 Although the time-dependent diffusion rate of NO across the cell membrane is poorly understood, new molecular players have been described to be involved on the NO transport mechanisms.18 Studies have consistently suggested that NO activates and permeates hemichannels formed by connexins (Cxs 37, 40 or 43) which are required to transfer NO from endothelial to smooth muscle cells. Therefore, differently from the HV group, in which a significant increase in vasodilation was observed, the existence of a positive trend but not significant in the LV group may be explained, at least in part, by the achievement of only suboptimal levels of NO in the smooth muscle cells. In addition, despite this mechanism was not investigated in the present study, further studies should evaluate whether resistance exercise improves gap junction channel function, and subsequently, promotes vasodilation.
Several studies using a single bout of aerobic19 or resistance20,21 exercise observed an enhanced vascular relaxation, suggesting an increased NO bioavailability after a session of exercise. Furthermore, the role of resistance exercise has been evaluated in the prevention and treatment of several cardiovascular diseases.20,22 However, although the majority of the studies focus on the vascular effects of aerobic exercise, our data are the first that demonstrate the volume-dependent effect on vascular adaptations after a single bout of resistance exercise. Finally, the current findings may contribute to the establishment of safe limits of exercise for patients with endothelial dysfunction and insulin resistance.
Conclusion
In summary, we demonstrated that a single bout of resistance exercise is able to improve insulin-induced vasodilation and increase NO production in a volume-dependent manner in healthy animals. Therefore, our results suggest that vascular response to resistance exercise is directly related its volume and, hence, high-volume exercise plans should be further investigated in the treatment of cardiovascular diseases and/or maintenance of a healthy life.
Sources of Funding
This study was funded by FAPITEC/SE and partially funded by CNPq and CAPES.
Study Association
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Marcelo Mendonça Mota and Tharciano Luiz Teixeira Braga, from Universidade Federal de Sergipe.
References1 Newcomer SC, Thijssen DH, Green DJ. Effects of exercise on endothelium and endothelium/smooth muscle cross talk: role of exercise-induced hemodynamics. J Appl Physiol (1985). 2011;111(1):311-20.NewcomerSCThijssenDHGreenDJEffects of exercise on endothelium and endothelium/smooth muscle cross talk: role of exercise-induced hemodynamicsJ Appl Physiol (1985)201111113113202 Malfatto G, Facchini M, Sala L, Branzi G, Bragato R, Leonetti G. Effects of cardiac rehabilitation and beta-blocker therapy on heart rate variability after first acute myocardial infarction. Am J Cardiol. 1998;81(7):834-40.MalfattoGFacchiniMSalaLBranziGBragatoRLeonettiGEffects of cardiac rehabilitation and beta-blocker therapy on heart rate variability after first acute myocardial infarctionAm J Cardiol19988178348403 El-Sayed MS, Sale C, Jones PG, Chester M. Blood hemostasis in exercise and training. Med Sci Sports Exerc. 2000;32(5):918-25.El-SayedMSSaleCJonesPGChesterMBlood hemostasis in exercise and trainingMed Sci Sports Exerc20003259189254 Fernandes AA, Faria TO, Ribeiro Junior RF, Costa GP, Marchezini B, Silveira EA, et al. A single resistance exercise session improves myocardial contractility in spontaneously hypertensive rats. Braz J Med Biol Res. 2015;48(9):813-21.FernandesAAFariaTORibeiroRFJuniorCostaGPMarcheziniBSilveiraEAA single resistance exercise session improves myocardial contractility in spontaneously hypertensive ratsBraz J Med Biol Res20154898138215 Ignarro LJ. Endothelium-derived nitric oxide: actions and properties. FASEB J. 1989;3(1):31-6.IgnarroLJEndothelium-derived nitric oxide: actions and propertiesFASEB J19893131366 Walløe L, Wesche J. Time course and magnitude of blood flow changes in the human quadriceps muscles during and following rhythmic exercise. J Physiol. 1988;405:257-73.WalløeLWescheJTime course and magnitude of blood flow changes in the human quadriceps muscles during and following rhythmic exerciseJ Physiol19884052572737 Joyner MJ, Casey DP. Regulation of increased blood flow (Hyperemia) to muscles during exercise: a hierarchy of competing physiological needs. Physiol Rev. 2015;95(2):549-601.JoynerMJCaseyDPRegulation of increased blood flow (Hyperemia) to muscles during exercise: a hierarchy of competing physiological needsPhysiol Rev20159525496018 Laughlin MH. Skeletal muscle blood flow capacity: role of muscle pump in exercise hyperemia. Am J Physiol. 1987;253(5 Pt 2):H993-1004.LaughlinMHSkeletal muscle blood flow capacity: role of muscle pump in exercise hyperemiaAm J Physiol19872535Pt 2H99310049 Blanco-Rivero J, Roque FR, Sastre E, Caracuel L, Couto GK, Avendaño MS, et al. Aerobic exercise training increases neuronal nitric oxide release and bioavailability and decreases noradrenaline release in mesenteric artery from spontaneously hypertensive rats: J Hypertens. 2013;31(5):916-26.Blanco-RiveroJRoqueFRSastreECaracuelLCoutoGKAvendañoMSAerobic exercise training increases neuronal nitric oxide release and bioavailability and decreases noradrenaline release in mesenteric artery from spontaneously hypertensive ratsJ Hypertens201331591692610 Balon TW, Nadler JL. Nitric oxide release is present from incubated skeletal muscle preparations. J Appl Physiol (1985). 1994;77(6):2519-21.BalonTWNadlerJLNitric oxide release is present from incubated skeletal muscle preparationsJ Appl Physiol (1985)19947762519252111 Roberts CK, Barnard RJ, Jasman A, Balon TW. Acute exercise increases nitric oxide synthase activity in skeletal muscle. Am J Physiol. 1999;277(2 Pt 1):E390-4.RobertsCKBarnardRJJasmanABalonTWAcute exercise increases nitric oxide synthase activity in skeletal muscleAm J Physiol19992772Pt 1E390E39412 Fontes MT, Silva TL, Mota MM, Barreto AS, Rossoni LV, Santos MR. Resistance exercise acutely enhances mesenteric artery insulin-induced relaxation in healthy rats. Life Sci. 2014;94(1):24-9.FontesMTSilvaTLMotaMMBarretoASRossoniLVSantosMRResistance exercise acutely enhances mesenteric artery insulin-induced relaxation in healthy ratsLife Sci2014941242913 Mota MM, Mesquita TR, Silva TL, Fontes MT, Lauton-Santos S, Capettini LS, et al. Endothelium adjustments to acute resistance exercise are intensity-dependent in healthy animals. Life Sci 2015; 142:86-91.MotaMMMesquitaTRSilvaTLFontesMTLauton-SantosSCapettiniLSEndothelium adjustments to acute resistance exercise are intensity-dependent in healthy animalsLife Sci2015142869114 Tamaki T, Uchiyama S, Nakano S. A weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of rats. Med Sci Sports Exerc. 1992;24(8):881-6.TamakiTUchiyamaSNakanoSA weight-lifting exercise model for inducing hypertrophy in the hindlimb muscles of ratsMed Sci Sports Exerc199224888188615 Macedo FN, Mesquita TR, Melo VU, Mota MM, Silva TL, Santana MN, et al. Increased nitric oxide bioavailability and decreased sympathetic modulation are involved in vascular adjustments induced by low-intensity resistance training. Front Physiol. 2016;7:265.MacedoFNMesquitaTRMeloVUMotaMMSilvaTLSantanaMNIncreased nitric oxide bioavailability and decreased sympathetic modulation are involved in vascular adjustments induced by low-intensity resistance trainingFront Physiol2016726526516 Salt IP. Examining the role of insulin in the regulation of cardiovascular health. Future Cardiol. 2013;9(1):39-52.SaltIPExamining the role of insulin in the regulation of cardiovascular healthFuture Cardiol201391395217 Muniyappa R, Montagnani M, Koh KK, Quon MJ. Cardiovascular actions of insulin. Endocr Rev. 2007;28(5):463-91.MuniyappaRMontagnaniMKohKKQuonMJCardiovascular actions of insulinEndocr Rev200728546349118 Figueroa XF, Lillo MA, Gaete PS, Riquelme MA, Sáez JC. Diffusion of nitric oxide across cell membranes of the vascular wall requires specific connexin-based channels. Neuropharmacology. 2013;75:471-8.FigueroaXFLilloMAGaetePSRiquelmeMASáezJCDiffusion of nitric oxide across cell membranes of the vascular wall requires specific connexin-based channelsNeuropharmacology20137547147819 Sun MW, Zhong MF, Gu J, Qian FL, Gu JZ, Chen H. Effects of different levels of exercise volume on endothelium-dependent vasodilation: roles of nitric oxide synthase and heme oxygenase. Hypertens Res. 2008;31(4):805-16.SunMWZhongMFGuJQianFLGuJZChenHEffects of different levels of exercise volume on endothelium-dependent vasodilation: roles of nitric oxide synthase and heme oxygenaseHypertens Res200831480581620 Silva TL, Mota MM, Fontes MT, Araújo JE, Oliveira Carvalho V, Bonjardim LR, et al. Effects of one resistance exercise session on vascular smooth muscle of hypertensive rats. Arq Bras Cardiol. 2015;105(2):160-7.SilvaTLMotaMMFontesMTAraújoJEOliveira CarvalhoVBonjardimLREffects of one resistance exercise session on vascular smooth muscle of hypertensive ratsArq Bras Cardiol2015105216016721 Faria Tde O, Targueta GP, Angeli JK, Almeida EA, Stefanon I, Vassallo DV, et al. Acute resistance exercise reduces blood pressure and vascular reactivity, and increases endothelium-dependent relaxation in spontaneously hypertensive rats. Eur J Appl Physiol. 2010;110(2):359-66.Faria TdeOTarguetaGPAngeliJKAlmeidaEAStefanonIVassalloDVAcute resistance exercise reduces blood pressure and vascular reactivity, and increases endothelium-dependent relaxation in spontaneously hypertensive ratsEur J Appl Physiol2010110235936622 Araújo AJ, Santos AC, Souza KS, Aires MB, Santana-Filho VJ, Fioretto ET, et al. Resistance Training controls arterial blood pressure from L-NAME induced hypertensive rats. Arq Bras Cardiol. 2013;100(4):339-46.AraújoAJSantosACSouzaKSAiresMBSantana-FilhoVJFiorettoETResistance Training controls arterial blood pressure from L-NAME induced hypertensive ratsArq Bras Cardiol20131004339346Artigos OriginaisExercícioEfeitos de uma Sessão de Exercício Resistido em Diferentes Volumes sobre Adaptações Endoteliais em Animais SaudáveisMotaMarcelo Mendonça12SilvaTharciano Luiz Teixeira Braga da12MacedoFabricio Nunes12MesquitaThássio Ricardo Ribeiro1QuintansLucindo JoséJúnior1Santana-FilhoValter Joviniano de1Lauton-SantosSandra1SantosMárcio Roberto Viana1Universidade Federal de Sergipe, Aracaju, SE - BrasilCurso de Educação Física da Faculdade Estácio de Sergipe (Estácio/FASE) - BrasilCorrespondência: Márcio Roberto Viana dos Santos PhD, Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe. Av Marechal Rondon s/n, Roza Elze. CEP 49100-000, São Cristóvão, SE - Brasil. E-mail: marcio@infonet.com.br
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Mota MM, Silva TLTB, Santos MRV; Obtenção de dados: Mota MM, Silva TLTB, Mesquita TRR; Análise e interpretação dos dados: Mota MM, Silva TLTB, Macedo FN, Mesquita TRR; Análise estatística: Mesquita TRR; Obtenção de financiamento: Quintans Júnior LJ, Santana-Filho VJ, Lauton-Santos S, Santos MRV; Redação do manuscrito: Macedo FN, Mesquita TRR; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Mota MM, Silva TLTB, Macedo FN, Mesquita TRR, Quintans Júnior LJ, Santana-Filho VJ, Lauton-Santos S, Santos MRV.
Potencial conflito de interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamentos:
O exercício resistido (ER) tem sido recomendado para pacientes com doenças cardiovasculares. Recentemente, alguns estudos demonstraram que a intensidade de uma sessão de ER exerce um efeito sobre a disfunção endotelial. No entanto, não há dados sobre os efeitos de diferentes volumes de ER sobre a função endotelial.
Objetivo:
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de diferentes volumes de ER, realizados em uma única sessão, sobre a vasodilatação dependente do endotélio e síntese de óxido nítrico (NO) em artéria mesentérica de animais saudáveis.
Métodos:
Ratos Wistar machos foram divididos em três grupos: Controle (Ct); baixo volume (BV, 5 séries x 10 repetições) e alto volume de ER (AV, 15 séries x 10 repetições). Foi estabelecida a intensidade de 70% do teste de repetição máxima. Após o protocolo de exercício, anéis de artéria mesentérica foram utilizados na avaliação da reatividade vascular, e outras artérias mesentéricas foram preparadas para a detecção da produção de NO por fluorescência com para do DAF-FM. A resposta à insulina pela síntese de NO foi avaliada estimulando-se os anéis vasculares com insulina (10nM).
Resultados:
A resposta máxima do relaxamento induzido por insulina foi aumentada somente no grupo AV em comparação ao grupo Ct. Além disso, a inibição da síntese do NO (L-NAME), aboliu completamente o relaxamento vascular induzido por insulina em ratos exercitados. A produção de NO mostrou um aumento dependente do volume no endotélio e no músculo liso. No endotélio, apenas os grupos Ct e BV mostraram aumento significativo na síntese de NO quando comparado aos seus respectivos grupos sob condição basal. No entanto, no músculo liso, a fluorescência foi aumentada em todos os grupos quando comparados aos seus respectivos grupos sob a condição basal.
Conclusões:
Nossos resultados sugerem que uma única sessão de ER foi capaz de promover adaptações no endotélio vascular. Além disso, nós observamos que este efeito é volume-dependente e o volume de 15 séries x10 repetições induziu o maior aumento na síntese de NO.
A atividade física induz, sistematicamente, as adaptações fisiológicas do endotélio, contribuindo para o controle local do tônus vascular.1 Além disso, os efeitos benéficos do exercício físico regular sobre o tônus simpático e parassimpático,2 coagulação sanguínea,3 contratilidade do miocárdio4 e liberação de fatores relaxantes derivados do endotélio5 podem melhorar a saúde cardiovascular e reduzir o risco de doenças.
Atualmente, o exercício físico é uma das principais ferramentas não-farmacológicas na manutenção de uma vida saudável. Seus efeitos envolvem a exposição recorrente as mudanças na hemodinâmica cardiovascular promovidas pelas sessões de atividade física. Em resposta ao exercício agudo, várias vias intra- e extracelulares são ativadas para aumentar o fluxo sanguíneo nos músculos ativos.6,7 No início do exercício, a ação mecânica do músculo esquelético cria uma "bomba" muscular, que provoca um aumento imediato no fluxo sanguíneo.7,8 Essa mudança abrupta no fluxo sanguíneo em direção aos tecidos mobilizados no exercício promove uma redução no fluxo à região visceral, fenômeno conhecido como hiperemia induzida pelo exercício.7,8
Diversas evidências apontam que a distensão na parede vascular, juntamente com o fluxo pulsátil, hipóxia intermitente e liberação de catecolaminas são fatores essenciais para a produção de óxido nítrico (NO) durante uma sessão de exercício.9-11 Recentemente, nosso grupo demonstrou que uma sessão de exercício resistido induz um efeito dependente da intensidade do exercício sobre a síntese de NO e o relaxamento vascular em artérias mesentéricas de ratos saudáveis.12,13 A artéria mesentérica regula 20% do fluxo sanguíneo e participa ativamente na resistência periférica total e, portanto, está diretamente envolvida nas mudanças vasculares promovidas pelo exercício.9
Além disso, nosso grupo também demonstrou recentemente uma forte e positiva relação entre a magnitude das alterações vasculares induzidas pelo exercício e a intensidade do exercício.12 No entanto, a prescrição de exercício depende de dois aspectos - intensidade e volume de exercício. O volume de exercício afeta diretamente a demanda de oxigênio e de outros nutrientes na tentativa de se recuperar do estresse promovido pelas consecutivas contrações musculares. Portanto, é de se esperar que mudanças no volume de treinamento promovam diferentes adaptações vasculares, i.e., quanto maior o volume de exercícios, maior a demanda metabólica.
Em adição, não existem estudos que investiguem as adaptações vasculares agudas de diferentes volumes do exercício resistido. Essa informação poderia orientar a prescrição do treinamento de longa duração nas doenças cardiovasculares. Assim, nosso estudo teve como objetivo avaliar a influência do volume do exercício resistido sobre a vasodilatação dependente do endotélio e, a síntese de NO na artéria mesentérica de animais saudáveis.
MétodosAnimais
Vinte e quatro ratos Wistar machos (250-350 g, 8-10 semanas) foram usados em todos os experimentos. Os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos: controle (Ct, n = 8), baixo volume (BV, n = 8) e alto volume de exercício de resistência (AV, n = 8). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório, e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais, Brasil (número de protocolo 80/2010).
Protocolo de exercício resistido
Os animais foram submetidos à exercícios segundo modelo descrito por Tamaki et al.,14 Estímulo elétrico (20 V, 0,3 segundo de duração com intervalos de 3 segundos) foi aplicado na cauda dos animais por meio de um eletrodo de superfície. Os animais foram submetidos à três dias de familiarização; primeiro, os ratos foram colocados sobre o aparelho e deixados na posição de exercício por 5 minutos para reduzir o estresse causado pelo equipamento e pela manipulação. Após o período de familiarização, os animais realizaram o teste de uma repetição máxima (1RM), que consistiu na determinação da máxima carga suspensa pelos animais em uma única repetição. Após 2 dias, os animais foram submetidos aos protocolos de exercícios de extensão de pernas - 5 (BV) ou 15 (AV) séries com 10 repetições e um período de descanso de 180 segundos entre cada série. Os animais se exercitaram em intensidade de 70% da 1RM. Os animais do grupo Ct foram mantidos nas mesmas condições que os animais dos grupos BV e AV, porém em posição de repouso.
Reatividade vascular
Imediatamente após o exercício, a artéria mesentérica foi removida e limpa de tecido conectivo e adiposo, e então seccionada em anéis vasculares (1-2mm). Os anéis foram suspensos em banho de órgãos contendo 10 mL de solução de Tyrode através de ganchos finos de aço inoxidável ligados à um transdutor de força (Letica, Modelo TRI210; Barcelona, Espanha) com fios de algodão. A solução foi continuamente gaseificada com uma mistura de 95% O2 e 5% CO2, e os anéis mantidos à 37°C sob uma tensão de 0,75 g por 60 min (período de estabilização). A funcionalidade do endotélio foi avaliada pela capacidade da acetilcolina (ACh, 1 µM; Sigma-Aldrich, USA) induzir mais de 75% de relaxamento dos anéis vasculares pré-contraídos com fenilefrina (Phe, 1 µM; Sigma-Aldrich, USA). Em seguida, mudanças na reatividade vascular foram avaliadas através de curvas de concentração-resposta para insulina (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) (10−13-10−6 M). Posteriormente, os anéis foram lavados e um novo relaxamento induzido por insulina foi obtido após incubação com NG-Nitroarginina metil éster (L-NAME, 100 µMol/L; Sigma-Aldrich, USA), um inibidor não específico da enzima NO sintase, por 30 minutos. Essa técnica foi usada para se avaliar o papel do NO.
Medida da produção de NO
A produção de NO no anel de artéria mesentérica foi determinada utilizando-se um marcador para NO permeável à célula, o DAF-FM (4,-amino-5 metilamino-2',7'-diacetato de diaminofluoresceína, Molecular Probes, EUA), conforme descrito anteriormente.15 Para a detecção de NO, 10µM do marcador foi adicionado à artéria mesentérica recém isolada, e mantido por 40 minutos à 37°C. Vinte minutos após o início da marcação, alguns anéis foram estimulados com 10 nM de insulina regular humana por 20 minutos e em seguida lavados com solução de Tyrode por 40 minutos. Os segmentos mesentéricos foram congelados e seccionados à uma espessura de 20 µm. As imagens foram registradas utilizando-se um microscópio de fluorescência (IX2-ICB, Olympus®, EUA) sob condições idênticas. A intensidade da fluorescência foi medida utilizando-se o programa ImageJ (NIH,EUA). Um mínimo de dez regiões foram aleatoriamente selecionadas no endotélio e no músculo liso de cada secção da artéria mesentérica. É importante ressaltar que o músculo liso exibe uma autofluorescência e, por isso, para se evitar medidas errôneas, as análises das imagens foram cuidadosamente realizadas em regiões de interesse determinadas entre as fibras de músculo liso.
Análise estatística
Inicialmente, todos os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov para determinar se as distribuições de probabilidade eram paramétricas ou não paramétricas. Todos os dados tinham distribuição normal. Os dados foram expressos em média ± erro padrão da média. Análise de variância (ANOVA) univariada, seguida do teste de Bonferroni, foi realizado pelo programa GraphPad Prism (San Diego, CA, EUA). Imagens de microscopia fluorescente do NO foram analisadas de acordo com a intensidade de fluorescência normalizada pela área, representada em unidade arbitrária (u.a.). Os valores foram considerados estatisticamente significativos para p < 0,05.
ResultadosEfeito agudo de diferentes volumes de exercício resistido sobre vasodilatação dependente do endotélio
Como mostrado na Figura 1a, em todos os grupos, a insulina causou uma vasodilatação dependente de concentração em artérias mesentéricas superiores. Apesar da tendência do aumento da vasodilatação induzida por insulina no grupo BV, não foi observada diferença significativa em comparação ao grupo Ct (Figura 1a). No entanto, o exercício resistido aumentou significativamente o relaxamento induzido por insulina no grupo AV em comparação aos grupos Ct e BV (Figura 1a). A participação do NO sobre o relaxamento vascular induzido por insulina foi avaliado na presença de L-NAME. Como mostrado na Tabela 1, a vasodilatação induzida por insulina foi reduzida significativamente no grupo Ct. No entanto, em ambos os grupos submetidos a exercício, a vasodilatação foi completamente abolida, mostrando uma reversão significativa da curva quando comparados ao grupo Ct. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos BV e AV (Figura 1b).
Efeitos de diferentes volumes de exercício resistido realizado em uma sessão sobre o relaxamento dependente do endotélio. (a) Curvas concentração-resposta à insulina (10-13 - 10-6M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior com endotélio intacto e pré-contraídos com fenilefrina (Phe) (1 <italic>µ</italic>M). (b) Curvas concentração-resposta à insulina em anéis pré-incubados com inibidor de óxido nítrico (L-NAME: 100 <italic>µ</italic>M). Ct: controle, BV: baixo volume e AV: alto volume. Diferenças estatísticas foram determinadas por análise de variância (ANOVA) univariada seguida pelo teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média. *p < 0,05.
Valores de Rmax obtidos de curvas de concentração-resposta à insulina nas artérias mesentéricas antes e após incubação com L-NAME
Grupos
Insulina (%)
Insulina + L-NAME (%)
Controle
7,66 ± 0,83
2,01 ± 0,24§
Baixo volume
10,77 ± 0,86
– 0,36 ± 0,36§,†
Alto volume
18,01 ± 0,97*,#
– 2,08 ± 0,19§,†
Os experimentos foram realizados na ausência de L-NAME (insulina) e na presença de 100 µM de L-NAME (L-NAME). As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de variância (ANOVA) univariada seguida pelo teste de Bonferroni’s. Os resultados estão expressos em média ± erro padrão da média.
p < 0,05 vs. controle,
p < 0.05 vs. baixo volume,
p < 0,05 vs. respectivo grupo sem L-NAME e
p < 0,05 vs. controle + L-NAME.
Efeito agudo de diferentes volumes de exercício resistido sobre a síntese de NO endotelial
Um resultado interessante foi que, em condições basais, houve um aumento significativo, volume-dependente, na produção de NO na camada endotelial e de músculo liso (Figura 2a e 2b). Após estímulo com insulina, observamos uma produção endotelial de NO aumentada nos grupos Ct e BV, mas não no grupo AV quando comparados aos seus respectivos grupos em condição basal (Figura 2a). Por outro lado, no músculo liso, a fluorescência do NO foi significativamente aumentada em todos os grupos quando comparados à condição basal (Figura 2b). No entanto, é importante ressaltar que o estímulo da insulina no grupo BV atingiu um nível de fluorescência do DAF similar ao grupo Ct (Figura 2b).
Efeitos de diferentes volumes de exercício resistido realizado em uma sessão sobre a produção de óxido nítrico derivado do endotélio. Detecção de óxido nítrico por fluorescência (DAF, diacetato de diaminofluoresceína) nas condições basais e após estímulo com insulina (10 nM). (a) Análises quantitativas da fluorescência no endotélio antes e após estímulo com insulina; (b), Análises quantitativas da fluorescência no músculo liso antes e após estímulo com insulina. Escala: 20<italic>µ</italic>m. Ct: controle, BV: baixo volume e AV: alto volume. Diferenças estatísticas foram determinadas por análise de variância (ANOVA) univariada seguida pelo teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média.. *p < 0,05 vs. Ct(-); <sup>§</sup>p < 0,05 vs. BV(-); <sup>δ</sup>p < 0,05 vs. Ct (+); <sup>#</sup>p < 0,05 vs. BV(+); Ψp < 0.05 vs. AV(-).
A fim de se avaliar o aumento na síntese global de NO, os dados de fluorescência no endotélio e no músculo liso foram agrupados e normalizados aos respectivos grupos sob condição basal. Os resultados foram expressos em porcentagem do aumento em comparação ao basal. Nesse experimento, houve uma redução na produção suplementar de NO de forma volume-dependente (Figura 3).
Efeitos de uma única sessão de exercício resistido realizado em diferentes volumes sobre a produção adicional de NO em artéria mesentérica estimulada com insulina (10 nmol/L). O gráfico mostra a razão entre a fluorescência do NO nos anéis estimulados por insulina e a fluorescência do NO em condições basais. Ct: controle, BV: baixo volume e AV: alto volume. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de variância (ANOVA) univariada seguida pelo teste de Bonferroni's. Os resultados estão expressos em média ± erro padrão da média. *p < 0,05 vs. Ct e <sup>#</sup>p < 0,05 vs. BV.
Discussão
No presente estudo, nós demonstramos que uma sessão de exercício resistido em diferentes volumes, mas mesma intensidade promove adaptações agudas no endotélio em animais sadios de maneira volume-dependente. Assim, o grupo submetido à 15 séries x10 repetições (grupo AV) apresentou uma resposta vasodilatadora mais acentuada. Em resumo, nossos resultados indicam que um alto volume de exercício resistido promove uma melhora no relaxamento arterial induzido por insulina devido a uma produção aumentada de NO.
A insulina é conhecida por exercer um papel importante na manutenção da homeostase metabólica. No entanto, esse hormônio também exerce um papel chave no sistema cardiovascular. Em células endoteliais do leito vascular, a insulina provoca um rápido aumento dependente de concentração na produção de NO pela ativação de NO sintase.16,17 Em nosso estudo, um baixo volume de exercício resistido não foi capaz de promover um aumento no relaxamento vascular. Por outro lado, um alto volume de exercício levou a um aumento na vasodilatação induzida por insulina na artéria mesentérica superior. De maneira semelhante, Mota et al.,13 observaram que o exercício resistido de alta intensidade aumentou o relaxamento induzido por insulina em artéria mesentérica de animais sadios. Assim, nossa hipótese é de que, tanto um alto volume de exercício, como uma alta intensidade, estejam relacionados com melhora na função vascular.
Para entender a participação do NO sobre o relaxamento induzido pela insulina, nós construímos curvas de concentração-resposta para insulina em anéis vasculares pré-incubados com L-NAME. Nossos dados mostraram que o relaxamento induzido pela insulina foi completamente abolido pelo L-NAME em todos os grupos, o que reforça a grande contribuição do NO no relaxamento arterial promovido pela insulina.
Além disso, nosso grupo relatou previamente vasoconstrição induzida por insulina em animais submetidos à exercício via ativação da via MAPK/endotelina-1. Esse fato corrobora nosso resultado da presença de contração na inibição da NO sintase em animais submetidos à uma única sessão de exercício resistido. Portanto, como descrito por nosso grupo em outro estudo, a interação funcional entre vias de sinalização intracelular tem um papel essencial na regulação do tônus miogênico na vasculatura.12
Nossos resultados in situ da produção de NO em artéria mesentérica superior de animais submetidos à diferentes volumes de exercício demonstraram um aumento volume-dependente da produção de NO no endotélio e na musculatura lisa. Em anéis da artéria mesentérica estimulados com insulina, o aumento na síntese de NO foi menor nos animais que se exercitaram que no grupo Ct. Nossos resultados demonstram ainda que os grupos de animais submetidos à exercício já apresentavam níveis basais aumentados de NO. Assim, pode-se sugerir que o exercício resistido aumenta a atividade da NO sintase para níveis submáximos, prevenindo um aumento substancial da síntese de NO nos anéis da artéria mesentérica estimulados com insulina.
De fato, o NO derivado do endotélio necessita atingir as células do músculo liso subjacente.5 Apesar de pouco se conhecer sobre a taxa de difusão tempo-dependente do NO através da membrana plasmática, novos agentes moleculares foram descritos por estarem envolvidos nos mecanismos de transporte do NO.18 Estudos têm sugerido que o NO ativa e permeia hemicanais formados por conexinas (Cxs 37, 40 ou 43) envolvidos na transferência de NO das células endoteliais para as células do músculo liso. Portanto, apesar de que, diferentemente do grupo AV, em que foi observado um aumento significativo na vasodilatação, a existência de uma tendência positiva, mas não significativa no grupo BV pode ser explicada, ao menos em parte, pelo alcance de valores relativamente baixos de NO nas células do músculo liso. Além disso, apesar deste mecanismo não ter sido investigado em nosso estudo, outros estudos são necessários para avaliar se o exercício resistido melhora o funcionamento de junções comunicantes e, consequentemente, promove vasodilatação.
Vários estudos utilizando uma sessão de exercício aeróbico19 ou de resistido20,21 observaram um aumento no relaxamento vascular, sugerindo uma maior biodisponibilidade de NO após uma sessão de exercício. Além disso, o papel do exercício resistido foi avaliado na prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares.20,22 Contudo, apesar de a maioria dos estudos focarem nos efeitos vasculares do exercício aeróbico, nossos dados são os primeiros à demonstrarem o efeito volume-dependente sobre alterações vasculares induzidas pelo exercício resistido. Finalmente, os achados deste estudo podem contribuir para o estabelecimento de limites seguros de exercício para pacientes com disfunção endotelial e resistência à insulina.
Conclusão
Em resumo, nós demonstramos que uma única sessão de exercício resistido é capaz de melhorar a vasodilatação induzida por insulina e aumentar a produção de NO de maneira volume-dependente em animais sadios. Assim, nossos resultados sugerem que a resposta vascular ao exercício resistido está diretamente relacionada ao volume de exercício e, por isso, programas com alto volume de exercícios devem ser investigados no tratamento de doenças cardiovasculares e/ou manutenção de um estilo de vida saudável.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pela FAPITEC/SE e parcialmente financiado pelo CNPq e CAPES.
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Marcelo Mendonça Mota e Tharciano Luiz Teixeira Braga da Silva pela Universidade Federal de Sergipe.