Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC hFQPf5LCDyqHJPjr8tvnxbk S0066-782X2017000400315 10.5935/abc.20170036 Original Articles Exercise Effects of Continuous and Accumulated Exercise on Endothelial Function in Rat Aorta Martinez Juliana Edwiges Taipeiro Elane de Fátima Chies Agnaldo Bruno Faculdade de Medicina de Marília Marília SP Brazil Faculdade de Medicina de Marília, Marília, SP - Brazil Faculdade de Medicina de Marília Mailing Address: Juliana Edwiges Martinez, Alameda Guanabara, 555. Postal Code 17602-110, Ibirapuera, Tupã, SP - Brazil. E-mail: julianaedwmartinez@hotmail.com, julianaedwmartinez@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research, Statistical analysis, Obtaining financing and Writing of the manuscript: Martinez JE, Taipeiro EF; Acquisition of data, Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Martinez JE, Chies AB, Taipeiro EF.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 04 2017 108 4 315 322 08 05 2016 07 11 2016 21 11 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

The practice of exercise in short bouts repeated throughout the day may be an alternative strategy to lift people out of physical inactivity.

 Objective:

to evaluate if accumulated exercise, as occurs in continuous exercise training, improve endothelial function in rat aorta.

 Methods:

Wistar male rats were divided into three groups: continuous exercise (CEx, 1 hour on the treadmill) or accumulated exercise (AEx, 4 bouts of 15 minutes / day) for 5 days/week for 8 weeks, or sedentary (SED). During the training period, body weight gain and increase in exercise performance were recorded. On sacrifice day, aorta was dissected into rings (3-5 mm) and mounted on the organ bath.

 Results:

Fitness was significantly greater in CEx and AEx rats as compared with SED animals. In addition, compared with the SED group, CEx animals had a lower body mass gain, and the aorta obtained from these animals had reduced contractile response to norepinephrine and greater acetylcholine-induced relaxation. These results were not observed in ACEx animals.

 Conclusions:

Both CEx and AEx improved fitness, but only CEx led to reduced body weight gain and improved endothelial function.

 Keywords: Rats Exercise Physical Fitness Endothelium Acetylcholine Norepinephrine Weight Loss Introduction

Exercise has been considered an important instrument for the promotion of health and prevention of cardiovascular diseases. It is defined as any "physical activity that is planned, structured, and repetitive and [that] has as a final or intermediate objective the improvement or maintenance of physical fitness".1,2 The pattern of regular exercise that brings better health benefits is still debated in the literature. Normally, it is recommended exercise of moderate intensity, at least 3 days a week.3 Alternatively, exercise may be performed by bouts of at least 10 minutes of high intensity exercise interspersed with intervals of recovery, i.e., periods of mild exercises or simply rest.4,5 On the other hand, current recommendations also suggest that short sessions of moderate-intensity physical activity accumulated throughout the day to attain a daily goal of 30 min of exercise - named accumulated exercise2 - may be employed to improve the health or as adjuvant treatment of cardiovascular diseases.6 Indeed, the practice of exercise in accumulated sessions can be an alternative to lift people out of physical inactivity.7

Health benefits of the accumulated exercise have already been demonstrated: elevation of high-density lipoprotein levels,8,9 reduction of postprandial triglycerides,10 blood pressure levels,11,12 skinfold thickness and waist circumference,6 and improvement of fitness13 and mood state.6 However, there is no evidence of the influence of accumulated exercise on endothelial function.

The benefits of exercise on endothelial function occur mostly by the increment of shear stress on endothelial surface, thereby stimulating the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) and superoxide dismutase-1 (SOD- 1).14-17However, it has been demonstrated in endothelial cell cultures that the exposure time to the shear stress influences the expression of these enzymes.15,18 Particularly in relation to eNOS, it was demonstrated that the shear stress exposure time influences its degree of phosphorylation, thus regulating its activity.19 Thus, it is reasonable to infer that the exposure to different exercise times may have different effects on the expression of endothelial enzymes. Thus, the aim of the present study was to verify whether training by accumulated exercise improves endothelial function in rat aorta such as it occurs in consequence of training by continuous exercise.

 Methods Animals

Thirty three male Wistar rats weighing 300-400 g were housed in plastic cages (50 x 40 x 20 cm), 5 animals per cage, with food and water "ad libitum". The sample size (n) was established on the basis of studies that evaluated the effects of continuous exercise on endothelial function.16,20 Notably, these studies were the basis for the present investigation that investigate the cardiovascular effects of accumulated exercise. During the exercise protocol, the animals were maintained in the training room under a 12 h light-dark cycle beginning at 7:00 h, at room temperature (25°C). This study was approved by the Ethics Committee on Animal Use of Marilia School of Medicine (protocol n° 627/13).

 Exercise protocol

Rats were initially trained to walk on a treadmill (Movement Technology LX 170) then submitted to daily sessions of 10 minutes, from 0.3 up to 0.5 km/h, without slope, for 2 weeks. At the end of this period, the animals were submitted to the treadmill running test, consisted of graded treadmill exercise at increments of 0.3 km/h every 3 minutes, starting at 0.3 km/h and increased up to the maximal intensity attained for each rat. Based on the results in this test, the animals were randomly assigned to one of the following groups: sedentary (SED), trained by continuous exercise (CEx) or trained by accumulated exercise (AEx), with a similar mean maximal exercise capacity in each group. Subsequently, the animals of the CEx group were exposed to this exercise 5 days per week, 1 hour per day (starting at 09:00am) for 8 weeks. The exercise intensity was increased progressively by a combination of time and velocity, to a maximum of 2 hours per day at a velocity correspondent to 60% of maximal exercise capacity, which was attained by the third week. In parallel, the animals belonging to the AEx group were submitted to 4 short exercise sessions (15 minutes, at similar speed to the CEx group), regularly distributed throughout the day (starting at 07:30am, 10:25am, 01:05pm and 03:45pm), 5 days per week, for 8 weeks. Rats allocated to the SED group were also handled every day and put on a stopped treadmill. Body weight was measured weekly during the training period. Running capacity tests were performed on each rat at the beginning of the protocol and on week 6, for adjustment of exercise intensity and assessment of increase in performance.

 Euthanasia and sample collection

At the end of the training period, the animals were sacrificed by inhalation of CO2 and exsanguination by puncture of the vena cava. Blood samples were collected in heparinized syringe and centrifuged (3500 rpm/10 min/4°C) to obtain the plasma, which was stored at -80°C. Later, the aortas were removed and immediately immersed in cold Krebs-Henseleit solution, and the hearts were weighed.

 Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS)

TBARS levels were measured according to a method adapted from Yagi.21 Briefly, the lipid peroxidation was determined by the reaction of malondialdehyde (MDA) with thiobarbituric acid (TBA) to form a pink chromogen that can be quantified by spectrophotometry (in 532 nm). The values of absorbance detected in the samples were interpolated to a tetramethoxypropane standard curve (0 to 100 µM).

 Plasma antioxidant capacity (Ferric Reducing Ability of Plasma FRAP)

The method described by Benzie & Strain22 is based on the ability of plasma to reduce Fe+++ to Fe++ ions in the presence of 2,4,6 tripyridyl-s-triazine (TPTZ) at low pH with the formation of Fe++-tripyridyltriazin, a blue colored complex. Before the beginning of the experiments, three solutions were prepared: A (Acetate buffer: 300 mM, pH 3.6 and 40 mMHCl), B (TPTZ - 2,4,6-tri- [2-pyridyl]-s-triazine - 10 mm) and C (FeCl3.6H2O - 20 mM). The working reagent was prepared by adding A + B + C in the ratio 10: 1: 1 (V/V). Later, the plasma samples (0,08 mL) were added to the mixture of deionized water (2,4 mL) and working reagent (0.25 ml). This solution was placed in microplates in parallel with the blank sample (only working reagent) and the standard curve samples (FeSO4 0-1000 mmol/L). These samples were read in spectrophotometer at 593 nm, and the concentrations (in uM/L) were calculated by interpolation in the standard curve.

 Organ bath studies

In a Petri dish covered with paraffin containing Krebs-Henseleit solution, the aortas were carefully divided into rings (3-5 mm). These rings were, then, set in 2 mL organ baths, fixed to a lower stainless steel hook attached to a stationary support and to an upper one connected to an isometric force transducer. The organ bath contained Krebs-Henseleit solution of the following composition (mM): NaCl 130; KCl 4.7; CaCl2 1.6; KH2PO4 1.2; MgSO4 1.2; NaHCO3 15 and glucose 11.1. The Kreb-Henseleit solution was kept at 37oC, pH 7.4 and continuously bubbled with a mixture of 95% CO2 and 5% O2. Tension was continuously monitored and recorded using a Powerlab 8/30 data acquisition system (Australia ADInstruments). Prior to the addition of drugs, the rings were equilibrated for 60 minutes under a resting tension of 1.5 g.

All preparations were challenged with 10-4 mol/L acetylcholine (ACh), after precontraction induced by10-5 mol/L phenylephrine (Phe), to verify the endothelial integrity. Some preparations had their endothelium mechanically removed, which was confirmed by the absence of relaxation in response to ACh. Later, both intact and endothelium-denuded preparations were challenged with cumulative concentrations of norepinephrine (NE; 10-10 - 10-4 mol/L). Intact preparations were also challenged with cumulative concentrations of NE in presence of Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) 10-4 mol/L, a non-selective NOS inhibitor added 20 minutes before the challenging. In parallel, intact preparations were challenged with single concentrations of ACh (10-4 mol/L) after precontraction induced by10-5 mol/L Phe.

The evoked responses (in g) to the aforementioned vasoactive agents, cumulatively added into the organ bath, were plotted to obtain concentration-response curves. Non-linear regressions (variable slope) of these curves revealed the Rmax (maximal response; highest point of each concentration-response curve) and the pEC50 (negative logarithm of the concentration that evoked 50% of the maximal response). The pEC50 is indicative of the sensitivity to the studied drug.

The following drugs were used: Acetylcholinechloride;L-(-)-norepinephrine(+)-bitartrate salt monohydrate, Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, and phenylephrine hydrochloride, all purchased from Sigma Chemical Co.

 Statistical analysis

Data are reported as mean ± standard error of the mean (SEM). Data obtained from the CEx and AEx groups were compared independently with those obtained from SED group by unpaired Student "t" test. Before applying the Student "t" test, the Gaussian distribution of data was verified by the Shapiro-Wilk normality test. The statistical analysis was performed using the GraphPad Prism 6.0 software. P values less than 0.05 were considered statistically significant.

 Results Running capacity test

During the training period, a significant improvement in running performance was observed in the CEx and AEx groups (Figure 1A and 1B) as compared with the SED animals. In contrast, in the same period, a reduction in performance was observed in the SED group.

Performance gain (%) of animals submitted to continuous exercise training (CEx; A) or accumulated exercise (AEx; B) in comparison to sedentary animals (SED). Columns represent mean ± SEM; in parenthesis, number of independent determinations. *** p < 0.001 compared to SED animals (unpaired Student's t-test).

Body and heart weight

During the training period, body weight gain was significantly (p < 0.05) lower in CEx animals (11.69 ± 3.28%; n = 11) than in SED animals (21.38 ± 1.19%; n = 11). On the other hand, body weight gain in AEx animals (21.38 ± 1.19%; n = 11) was not statistically different in comparison with SED animals. Heart weight in CEx (1.30 ± 0.04 g; n = 11) or AEx (1.37 ± 0.05 g; n = 11) animals was not significantly different from that in SED animals (1.38 ± 0.05g; n = 11).

 TBARS and FRAP

The TBARS values in CEx and AEx animals [17.85 ± 3.57 (n = 11) and 24.91 ± 5.18 (n = 11), respectively] were not significantly different in comparison with SED animals [20.88 ± 5.29 (n = 11)].

Both continuous and accumulated exercise had no effect on plasma antioxidant capacity, since FRAP values in CEx and AEx groups [1309.00 ± 74.04 (n = 11) and 1222.00 ± 55.98 (n = 11), respectively] were not significantly different than in SED animals [1215.00 ± 57.11 (n = 11)].

 Vascular responses

The CEx reduced the magnitude of responses to NE in the aorta, with a significant reduction in Rmax values compared to SED animals. However, no significant differences in pEC50 were observed between these groups (Figure 2A). This reduction in NE Rmax was not observed in L-NAME pre-treated preparations (Figure 2C) or in preparations without endothelium (Figure 2E). On the other hand, the slight reduction of NE responses induced by ExA did not result in significant reduction of Rmax or pEC50 (Figure 2B), and was suppressed by the presence of L-NAME (Figures 2C and D) or the endothelium removal (Figures 2E and F).

Concentration-response curves to norepinephrine determined in intact thoracic aorta preparations obtained from animals trained by continuous (ExA) or accumulated exercise (ExA), in comparison to sedentary animals (SED), not treated (A and B) or treated with 10<sup>-4</sup> mol/L L-NAME (C and D) as well as in not treated endothelium denuded thoracic aorta preparations (E and F). In parentheses, the number of independent determinations (n) followed by pEC50 values. Data in mean ± SEM. * p < 0.05 compared with the SED group ("t" test of Student).

Moreover, the CEx also increased the 10-4 mol/L ACh-induced relaxation of intact aorta precontracted with 10-5 mol/L Phe (Figure 3A). This effect was not observed in AEx (Figure 3B).

Relaxation induced by acetylcholine (ACh; 10<sup>-4</sup> mol/L), in % of phenylephrine-induced pre-contraction (Phe; 10<sup>-5</sup> mol/L), in animals submitted to continuous exercise (ExC; A) or accumulated exercise (ExA; B) training, in comparison with sedentary animals (SED). Columns represent mean ± SEM; in parenthesis, number of independent determinations. *p < 0.05 compared to the SED animals (unpaired Student's t-test).

Discussion

The practice of regular exercises has been proven effective in reducing the risk of cardiovascular diseases.3 However, the concept that only intense and long-lasting sessions of exercises are beneficial to health may compromise the adherence to this practice.23Indeed, the flexibility of exercise plan, including intensity, duration and frequency, can lead to improved adherence.6,24 The practice of short, but repeated exercise bouts throughout the day, may be an alternative way to get exercise benefits.3

Regarding cardiovascular diseases, further studies are needed to confirm the beneficial effects of exercise accumulated in several short bouts on vascular endothelium. In this context, we compared one continuous bout of exercise (1 hour/day) with the same amount of exercise distributed in short, repeated bouts (4 bouts/day), to assess the beneficial, cumulative effects of exercise. Although it was not the objective of this study to propose an exercise program that could be used in humans, which limits the extrapolation of our results to humans, the study raises the discussion about the usefulness of accumulated exercise in the clinical practice.

Interestingly, in the present study, not only continuous exercise, but also accumulated exercise increased the animals' running capacity on the treadmill. Despite the limitations of experimental models to reproduce exercise training protocols designed for humans, these findings suggest that the positive effects of accumulated exercise on fitness observed in animals, may also occur in humans.11 For example, accumulated exercise can be an alternative approach to help individuals to get away from a sedentary lifestyle.

The improvements in running capacity on treadmill were not accompanied by changes in heart weight or in TBARS or FRAP values. These results indicate that, although the CEx and the AEx protocols were not able to increase the antioxidant defenses, no significant changes in plasma levels of free radicals were observed either. This may be explained by the intensity of exercise applied - 50-60% of maximum capacity - which is considered moderate.

In addition, accumulated aerobic exercise has been suggested as a strategy in weight control.6,13It has been proven effective in reducing blood pressure,7,12post prandial triglycerides,10 skinfold thickness and waist circumference,6 and in increasing high-density lipoprotein levels.8,9 In the present study, however, as compared with SED group animals, body weight gain was significantly lower in the CEx group but not in the AEx group.

Exercise may also increase the laminar blood flow on endothelial surface, thereby increasing the shear stress on this surface.25An increased shear stress on the endothelium may induce the expression of several enzymes involved in the synthesis of substances that regulate vascular tone, local oxidative balance, coagulation process and endothelial inflammation.26,27Therefore, exercise may increase the endothelial production of vasodilator substances, and hence modulate the NE responses in several vascular beds, including rat aorta.14,16

The present study showed that the CEx decreased the responses to NE in aorta with a reduction of Rmax, indicating an improvement in endothelial function. The main endothelium-derived relaxing factor is NO, a diffusible gas synthesized mainly by eNOS in the vascular endothelium. In our study, the reduction of Rmax was suppressed by L-NAME, a non-selective NOS inhibitor, or reversed in preparations without endothelium. Since the eNOS expression may be increased by shear stress, thereby increasing the synthesis of NO,18,20,27 the reduction of NE responses in rat aorta induced by the CEx may be due to a greater efficiency of endothelial NO-related mechanisms, resulting from an increased expression of endothelial eNOS. The involvement of endothelium-derived NO in the reduction of NE responses in aorta of animals exposed to CEx has been also described by other studies.16,20,28

The increased NE response, characterized by elevation of Rmax and pEC50, induced by CEx in aorta preparations without endothelium was unexpected, but also reinforces the pivotal role of the endothelium in the modulation of this response in these preparations. In addition, it has been proposed that NO is the principal mediator of the ACh-induced relaxation in rat aorta preparations.29 In this manner, as previously described, the increased ACh-induced relaxation corroborates the involvement of NO-related mechanisms in the endothelium in these preparations.

Unfortunately, evidence of an exercise-induced enhancement in endothelial function has been demonstrated only by continuous or intermittent exercise studies. Evidences of a direct effect of AEx on the endothelium are scarce in the literature. Thus, once verified that CEx may improve the endothelial function in our experimental conditions, we began to investigate whether splitting the exercise in short bouts (with a total time corresponding to one continuous session) promoted similar effects on the endothelium. No significant increases in NE and ACh responses, induced by AEx were found in rat aorta preparations, suggesting that this type of exercise has no effect on endothelial function. It is worth mentioning that previous reports have shown that the effects of shear stress on the enzymes involved in the endothelial production of modulatory substances depends on time of exposure to exercise.18,19,27 Our results suggest that the beneficial effects of exercise on endothelial function are achieved only if exercise are practiced for a long enough period.30,31 However, the minimum time required for such effects remains to be determined.

The findings on the effect of AEx on vascular endothelium are not conclusive and may not be extrapolated to the clinical setting, since, to our knowledge, this is the first study investigating a direct effect of AEx on vascular endothelium in experimental conditions. Yet, in the present study, the concentration-response curves to NE had a descending trend. Thus, the improvement in endothelial function induced by AEx may occur in animals with endothelial dysfunction caused by aging, hypertension, atherosclerosis or diabetes and those chronically exposed to alcohol and/or smoke.32 In fact, one of the few studies on the direct effect of AEx on the endothelial function was performed in adolescent boys submitted to an ingestion of a high-fat breakfast and lunch. This diet has induced endothelial dysfunction in these boys, which was reversed by short bouts of exercise that were repeated throughout a day.33Also, it was demonstrated that 30 min walk divided into sessions of 10 min (with intervals of 50 minutes to rest) was effective in reducing systolic blood pressure in pre-hypertensive individuals.34 Such reduction in blood pressure may be involved at least partially in the exercised-induced improvement of endothelial function. Thus, further studies on endothelial dysfunction models are required to better understand the therapeutic potential of AEx.

 Conclusion

In conclusion, the continuous and accumulated exercise protocols employed in this study increased the fitness of the animals, which suggests the usefulness of the AEx as a strategy to introduce people to physical training programs. However, as compared with CEx, AEx was not as effective in preventing body weight gain or improving the endothelial function of aorta of these animals.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Juliana Edwiges Martinez, from Faculdade de Medicina de Marília.

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Pate RR Pratt M Blair SN Haskell WL Macera CA Bouchard C Physical activity and public health. A recommendation from the Centers for Disease Control and Prevention and the American College of Sports Medicine JAMA 1995 273 5 402 407 24 Perri MG, Anton SD, Durning PE, Ketterson TU, Sydeman SJ, Berlant NE, et al. Adherence to exercise prescriptions: effects of prescribing moderate versus higher levels of intensity and frequency. Health Psychol. 2002;21(5):452-8. Perri MG Anton SD Durning PE Ketterson TU Sydeman SJ Berlant NE Adherence to exercise prescriptions: effects of prescribing moderate versus higher levels of intensity and frequency Health Psychol 2002 21 5 452 458 25 Rodríguez-Núñez I, Romero F, Saavedra MJ. Exercise-induced shear stress: Physiological basis and clinical impact. Arch Cardiol Mex. 2016;86(3):244-54. Rodríguez-Núñez I Romero F Saavedra MJ Exercise-induced shear stress: Physiological basis and clinical impact Arch Cardiol Mex 2016 86 3 244 254 26 Marin T, Gongol B, Chen Z, Woo B, Subramaniam S, Chien S, et al. Mechanosensitive microRNAs-role in endothelial responses to shear stress and redox state. Free Radic Biol Med. 2013;64:61-8. Marin T Gongol B Chen Z Woo B Subramaniam S Chien S Mechanosensitive microRNAs-role in endothelial responses to shear stress and redox state Free Radic Biol Med 2013 64 61 68 27 Topper JN, Cai J, Falb D, Gimbrone MA Jr. Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(19):10417-22. Topper JN Cai J Falb D Gimbrone MA Jr Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress Proc Natl Acad Sci U S A 1996 93 19 10417 10422 28 Chen HI, Li HT, Chen CC. Physical conditioning decreases norepinephrine-induced vasoconstriction in rabbits. Possible roles ofnorepinephrine-evoked endothelium-derived relaxing factor. Circulation. 1994;90(2):970-5. Chen HI Li HT Chen CC Physical conditioning decreases norepinephrine-induced vasoconstriction in rabbits. Possible roles ofnorepinephrine-evoked endothelium-derived relaxing factor Circulation 1994 90 2 970 975 29 Freitas MR, Schott C, Corriu C, Sassard J, Stoclet JC, Andriantsitohaina R, et al. Heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in conductance and resistance arteries from Lyon normotensive and hypertensive rats. 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Trott DW Gunduz F Laughlin MH Woodman CR Exercise training reverses age-related decrements in endothelium-dependent dilation in skeletal muscle feed arteries J Appl Physiol 2009 106 6 1925 1934 32 Favero G, Paganelli C, Buffoli B, Rodella LF, Rezzani R. Endothelium and its alterations in cardiovascular diseases: life style intervention. Biomed Res Int. 2014;801896. Favero G Paganelli C Buffoli B Rodella LF Rezzani R Endothelium and its alterations in cardiovascular diseases: life style intervention Biomed Res Int 2014 801896 801896 33 Sedgwick MJ, Morris JG, Nevill ME, Barrett LA.The accumulation of exercise and postprandial endothelial function in boys. Scand J Med Sci Sports.2014;24(1):e11-9. Sedgwick MJ Morris JG Nevill ME Barrett LA The accumulation of exercise and postprandial endothelial function in boys Scand J Med Sci Sports 2014 24 1 e11 e19 34 Park S, Rink L, Wallace J. Accumulation of physical activity: blood pressure reduction between 10-min walking sessions. J Hum Hypertens. 2008;22(7):475-82. Park S Rink L Wallace J Accumulation of physical activity: blood pressure reduction between 10-min walking sessions J Hum Hypertens 2008 22 7 475 482 Artigos Originais Exercício Efeitos do Exercício Acumulado e Contínuo sobre a Função Endotelial em Aorta de Ratos Martinez Juliana Edwiges Taipeiro Elane de Fátima Chies Agnaldo Bruno Faculdade de Medicina de Marília, Marília, SP - Brasil Correspondência: Juliana Edwiges Martinez, Alameda Guanabara, 555. CEP 17602-110, Ibirapuera, Tupã, SP - Brasil. E-mail: julianaedwmartinez@hotmail.com, julianaedwmartinez@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Análise e interpretação dos dados, Obtenção de financiamento e Redação do manuscrito: Martinez JE, Taipeiro EF; Obtenção de dados, Análise estatística e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Martinez JE, Chies AB, Taipeiro EF.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A prática de exercícios em sessões curtas que se repetem ao longo do dia pode ser uma alternativa para tirar as pessoas da inatividade física.

 Objetivo:

Verificar se o exercício acumulado, tal como ocorre com o treinamento com exercício contínuo, melhora a função endotelial na aorta de ratos.

 Métodos:

Ratos Wistar machos foram divididos em 3 grupos: treinamento com exercício contínuo (ExC; 1 hora em esteira) ou com exercício acumulado (ExA; 4 sessões de 15 minutos ao longo do dia) por 5 dias/semana, durante 8 semanas, ou grupo sedentário (SED). Durante o treinamento, foram registrados o ganho de peso corporal e desempenho na esteira. No dia do sacrifício, anéis (3-5 mm) da aorta foram obtidos e montados em banho de órgãos.

 Resultados:

Animais ExC e ExA mostraram aptidão física significativamente maior em comparação com os SED. Paralelamente, em comparação com SED, animais ExC tiveram menor ganho de massa corporal, e aortas retiradas desses animais mostraram respostas contrácteis à noradrenalina reduzidas e maior relaxamento induzido pela acetilcolina. Esses resultados não foram observados no grupo ExA.

 Conclusões:

Tanto o ExC quanto o ExA melhoraram a aptidão física, mas somente o ExC foi capaz de reduzir o ganho de peso corporal dos animais e melhorar a função endotelial.

Palavras-chave: Ratos Exercício Aptidão Física Endotélio Acetilcolina Norepinefrina Perda de Peso Introdução

O exercício é considerado um importante instrumento na promoção da saúde e prevenção de doenças cardiovasculares. É definido como qualquer "atividade física planejada, estruturada e repetitiva que tem como objetivo final ou intermediário a melhora ou manutenção da forma física".1,2 O padrão de atividade física que traz melhor benefício à saúde ainda é discutido na literatura. Normalmente, recomenda-se a prática de exercícios de intensidade moderada no mínimo 3 dias por semana,3 ou por sessões de 10 minutos ou mais em alta intensidade intercalados com intervalos de recuperação, i.e., períodos de exercícios leves ou repouso.4,5 Por outro lado, recomendações atuais também sugerem que sessões curtas de atividade física de intensidade moderada acumuladas ao longo do dia, até alcançar a meta de 30 minutos de exercícios - o chamado exercício acumulado2 - podem ser aplicadas para melhorar a saúde ou como tratamento adjuvante de doenças cardiovasculares.6 De fato, a prática de exercício acumulado pode ser uma alternativa para tirar as pessoas da inatividade física.7

Os benefícios do exercício acumulado para a saúde já foram demonstrados: aumento dos níveis de lipoproteína de alta densidade,8,9 redução dos níveis pós-prandiais de triglicerídeos,10 dos níveis de pressão sanguínea,11,12 das dobras cutâneas e circunferência da cintura, e melhora da forma física e estado de humor.6,13 No entanto, não há evidências sobre a influência do exercício acumulado sobre a função endotelial.

Os benefícios do exercício na função endotelial ocorrem principalmente pelo aumento da tensão de cisalhamento na superfície endotelial, estimulando assim, a expressão do óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), ciclooxigenase 2 (COX-2) e superóxido dismutase-1 (SOD-1).14-17 No entanto, foi demonstrado, em culturas de células endoteliais, que o tempo de exposição à tensão de cisalhamento tem influência sobre a expressão dessas enzimas.15,18 Particularmente em relação ao eNOS, foi demonstrado que o tempo de exposição influencia o grau de fosforilação e, dessa forma, regula sua atividade.19 Portanto, pode-se inferir que a exposição a diferentes tempos de exercício possa ter diferentes efeitos na expressão de enzimas endoteliais. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar se o treinamento por exercício acumulado melhora a função endotelial em aorta de rato similarmente ao que ocorre em consequência do treinamento por exercício contínuo.

 Métodos Animais

Trinta e três ratos machos Wistar pesando 300-400g foram mantidos em gaiolas plásticas (50 x 40 x 20 cm), 5 animais por gaiola, com comida e água "ad libitum". O tamanho da amostra (n) foi determinado com base em estudos que avaliaram os efeitos do exercício contínuo sobre a função endotelial.16,20 Esses estudos serviram de base para o presente estudo que investiga os efeitos cardiovasculares do exercício acumulado. Durante o protocolo de exercício, os animais foram mantidos na sala de treinamento em ciclo claro/escuro de 12 horas, com início às 7h, à temperatura ambiente (25°C). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Marília (protocolo número 627/13).

 Protocolo de exercício

Os ratos foram inicialmente treinados para caminhar em uma esteira (Movement Technology LX 170). Em seguida, foram submetidos a sessões diárias de 10 minutos de 0,3 a 0,5 km/h, sem inclinação, por duas semanas. No final desse período, os animais foram submetidos ao teste de desempenho de corrida na esteira. O teste consistia de exercício graduado na esteira com aumentos de 0,3 km/h a cada 3 minutos, iniciando a 0,3 km/h e aumentado até a intensidade máxima alcançada por cada rato. Com base nos resultados nesse teste, os animais foram aleatoriamente alocados em um dos seguintes grupos: sedentários (SED), treinados por exercício contínuo (ExC), ou treinados por exercício acumulado (ExA), com média de capacidade máxima de exercício similar em cada grupo. Em seguida, os animais do grupo ExC foram expostos a esse exercício 5 dias por semana, 1 hora por dia (iniciando à 9h da manhã) por 8 semanas. A intensidade do exercício foi aumentada progressivamente até a terceira semana, combinando-se tempo e velocidade, até o máximo de 2 horas por dia de exercício, a 60% da capacidade máxima de exercício. Paralelamente, os animais do grupo ExA foram submetidos a quatro sessões curtas de exercício (15 minutos, à mesma velocidade que aplicado ao grupo ExC) distribuídas regularmente ao longo do dia (07:30am, 10:25am, 01:05pm e 03:45pm), 5 dias por semana, por 8 semanas. Os ratos do grupo SED eram diariamente colocados na esteira parada. O peso corporal era medido semanalmente durante o período de treinamento. Cada animal foi submetido aos testes de capacidade de corrida no início do protocolo e na semana 6, para ajuste da intensidade do exercício e avaliação da melhora no desempenho.

 Eutanásia e coleta das amostras

Ao final do período de treinamento, os animais foram sacrificados por inalação de CO2 e exsanguinação por punção da veia cava. As amostras de sangue foram coletadas em seringas heparinizadas e centrifugadas (3500 rpm/10 min/4°C) para obtenção do plasma, que foi armazenado a -80°C. Em seguida, as aortas foram removidas e imersas em solução gelada de Krebs-Henseleit, e os corações foram pesados.

 Substâncias Reativas com Ácido Tiobarbitúrico (TBARS)

Os níveis de TBARS foram determinados pelo método de Yagi21 adaptado. Em resumo, a peroxidação lipídica foi determinada por reação do malondialdeído (MDA) com o ácido tiobarbitúrico para formar um composto cromogênico de cor de rosa que pode ser quantificado por espectrofotometria (em 532 nm). Os valores de absorbância detectados nas amostras foram interpolados na curva padrão do tetrametoxipropano (0-100 µM).

 Capacidade antioxidante do plasma (Capacidade do plasma em reduzir íon férrico - FRAP)

O método descrito por Benzie e Strain22 baseia-se na capacidade do plasma em reduzir íons Fe+++ a Fe++ (FRAP, Ferric Reducing Ability of Plasma) na presença de 2,4,6 tripiridil-s-triazina (TPTZ) em pH baixo, com a formação de Fe++-tripiridiltriazina, de cor azul. Três soluções foram preparadas antes do início dos experimentos: A (tampão acetato: 300 mM, pH 3,6 e 40 mMHCl), B (TPTZ - 2,4,6-tri- [2-piridil]-s-triazina -10 mm), e C (FeCl3.6H2O - 20 mM). O reagente de trabalho foi preparado adicionando-se A + B + C na razão 10:1:1 (V/V). Em seguida, as amostras de plasma (0,08 mL) foram adicionadas à mistura de água deionizada (2,4 mL) e reagente de trabalho (0,25mL). Essa solução foi distribuída em microplaca em paralelo com a usada como branco (somente reagente de trabalho) e as amostras da curva padrão (FeSO4 0-1000 mmol/L). As amostras foram lidas em espectofotômetro a 593 nm, e suas concentrações calculadas (em uM/L) por interpolação na curva padrão.

 Banho de órgãos

Em uma placa de Petri coberta com parafina, contendo solução de Krebs-Henseleit, as aortas foram cuidadosamente divididas em anéis (3-5mm). Esses anéis foram colocados em banho de órgãos de 2mL, fixado a um ganho de aço inoxidável ligado a um suporte estacionário e a um gancho conectado a um transdutor de força isométrica. O banho de órgãos continha uma solução de Krebs-Henseleit composta de (em mM): NaCl 130; KCl 4,7; CaCl2 1,6; KH2PO4 1,2; MgSO4 1,2; NaHCO3 15 e glicose 11,1). A solução de Kreb-Henseleit foi mantida a 37°C e pH 7,4, e continuamente borbulhada com uma mistura de 95% de CO2 e 5% de O2. A tensão foi monitorada constantemente e registrada utilizando-se o sistema de aquisição de dados Powerlab 8/30 d (ADInstruments, Austrália). Antes de se adicionar o medicamento, os anéis foram equilibrados durante 60 minutos sob uma tensão de repouso de 1,5 g.

Todas as preparações foram desafiadas com 10-4 mol/L de acetilcolina (ACh) após contração induzida por fenilefrina para se verificar a integridade endotelial. Algumas tiveram o endotélio removido mecanicamente, o que foi confirmado pela ausência de relaxamento em resposta à ACh. Posteriormente, as preparações intactas e as preparações sem endotélio foram desafiadas com concentrações cumulativas de noradrenalina (10-10 - 10-4 mol/L). As preparações intactas também foram desafiadas com concentrações cumulativas de noradrenalina na presença de Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 10-4 mol/L), um inibidor não seletivo de NOS, adicionado 20 minutos antes do desafio. Ainda, as preparações intactas foram desafiadas com concentrações simples de ACh (10-4 mol/L) após contração induzida por fenilefrina 10-5 mol/L.

Curvas de concentração-resposta foram construídas com as respostas (g) a esses agentes vasoativos (adicionados em concentrações cumulativas ao banho de órgãos). Regressões não lineares (inclinações variáveis) revelaram a Rmax (resposta máxima; ponto mais elevado de cada curva concentração-resposta) e o pEC50 (logaritmo negativo da concentração que provocou 50% da resposta máxima). O pEC50 é indicativo da sensibilidade à droga estudada.

As seguintes drogas foram utilizadas: cloreto de acetilcolina, bitartarato de norepinefrina L monohidratada, hidrocloreto d Nw-nitro-L-arginina metil éster, e hidrocloreto de fenilefrina, todos adquiridos da Sigma Chemical Co.

 Análise estatística

Os dados são descritos em média ± erro padrão da média. Os dados obtidos nos grupos ExC e ExA foram comparados independentemente com os obtidos no grupo SED pelo teste t de Student. Antes da aplicação do teste, a normalidade dos dados foi testada pelo teste de Shapiro-Wilk. A análise estatística foi realizada usando-se o programa GraphPad Prism versão 6.0. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

 Resultados Teste de capacidade de corrida

Durante o período de treinamento, uma melhora significativa no desempenho da corrida foi observada nos grupos ExC e ExA (Figura 1A e 1B) em comparação aos animais SED. Em contraste, no mesmo período, observou-se uma diminuição no desempenho no grupo SED.

Ganho de desempenho (%) nos animais submetidos ao treinamento com exercício contínuo (ExC; A) ou exercício acumulado (ExA; B), em comparação aos animais sedentários (SED). As colunas representam média ± erro padrão da média; em parênteses, número de medidas independentes. ***p < 0,001 em comparação aos animais SED (teste t de Student não pareado).

Peso corporal e peso do coração

Durante o período de treinamento, o ganho de peso corporal foi significativamente menor (p < 0,05) nos ratos do grupo ExC (11,69 ± 3,28%; n = 11) em comparação aos animais SED (21,38 ± 1,19%; n = 11). Por outro lado, o ganho de peso corporal em animais do grupo ExA (21,38 ± 1,19%; n = 11) não foi estatisticamente diferente em comparação aos animais SED. O peso do coração no grupo ExC (1,30 ± 0,04 g; n = 11) ou ExA (1,37 ± 0,05 g; n = 11) não foi estatisticamente diferente daquele encontrado no grupo SED (1,38 ± 0,05 g; n = 11).

 TBARS e FRAP

Os valores de TBARS nos animais ExC e ExA [17,85 ± 3,57 (n = 11) e 24,91 ± 5,18 (n = 11), respectivamente] não foram significativamente diferentes que no grupo SED [20,88 ± 5,29 (n = 11)].

Tanto o exercício contínuo como o exercício acumulado não tiveram efeito sobre a capacidade antioxidante do plasma, uma vez que os valores de FRAP nos grupos ExC e ExA [1309,00 ± 74,04 (n = 11) e 1222,00 ± 55,98 (n = 11), respectivamente] não foram significativamente diferentes que no grupo SED [1215,00 ± 57,11 (n = 11)].

 Respostas vasculares

O ExC reduziu a magnitude das respostas à noradrenalina na aorta, com redução significativa nos valores da Rmax em comparação aos animais do grupo SED. No entanto, não foram observadas diferenças significativas nos valores pEC50 entre os grupos (Figura 2A). Tal redução na Rmax à noradrenalina não foi observada nas preparações pré-tratadas com L-NAME (Figura 2C) ou em preparações sem endotélio (Figura 2E). Por outro lado, a pequena diminuição nas respostas à noradrenalina induzida por ExA não resultou em reduções significativas na Rmax ou pEC50 (Figura 2B), e foi suprimida pela presença de L-NAME (Figuras 2C e D) ou pela remoção do endotélio (Figuras 2E e F).

Curvas de concentração-resposta à noradrenalina determinadas em preparações intactas de aorta obtida de animais submetidos a exercício contínuo (ExC) ou exercício acumulado (ExA), em comparação a animais sedentários (SED) não tratados (A e B) ou tratados com L-NAME 10<sup>-4</sup> mol/L (C e D), e de preparações de aorta torácica sem endotélio não tratadas (E e F). Em parênteses, número de medidas independentes (n) seguido pelos valores de pEC50. Dados em média ± erro padrão da média.*p < 0,05 em comparação ao grupo SED (teste t de Student não pareado).

Ainda, o ExC aumentou o relaxamento induzido por ACh (10-4 mol/L) da aorta intacta previamente contraída com fenilefrina (10-5 mol/L) (Figura 3A). Tal efeito não foi observado com o ExA (Figura 3B).

Relaxamento induzido por acetilcolina (ACh; 10<sup>-4</sup> mol/L), em % da pré-contração induzida por fenilefrina (Phe; 10<sup>-5</sup> mol/L), em animais submetidos ao treinamento com exercício contínuo (ExC, A) ou exercício acumulado (ExA, B) em comparação a animais sedentários (SED). As colunas representam média ± erro padrão da média; em parênteses, número de medidas independentes. *p < 0,001 em comparação aos animais SED (teste t de Student não pareado).

Discussão

A eficácia da prática de exercícios regulares na redução do risco de doenças cardiovasculares foi comprovada.3 No entanto, a ideia de que somente longas sessões de exercícios ou exercícios intensos são benéficos à saúde pode comprometer a adesão a essa prática.23 De fato, a flexibilidade no regime de exercício, incluindo intensidade, duração e frequência, pode levar à melhora na adesão.6,24 A prática de exercício em sessões curtas, porém repetidas ao longo do dia pode ser uma maneira alternativa de se alcançar os benefícios do exercício.3

Em relação a doenças cardiovasculares, mais estudos são necessários para se confirmar os efeitos benéficos do exercício acumulado praticado em várias sessões curtas sobre o endotélio vascular. Nesse contexto, nós comparamos uma sessão de exercício contínuo (1 hora/dia) com a mesma quantidade de exercício distribuído em quatro sessões curtas, repetidas ao longo do dia para avaliar os efeitos benéficos e cumulativos do exercício. Apesar de não ter sido objetivo deste estudo, propor um programa de exercício que pudesse ser usado em humanos (o que limita a extrapolação de nossos dados a humanos), o estudo levanta a discussão sobre a utilidade do exercício acumulado na prática clínica.

Interessante ressaltar que, neste estudo, não só o exercício contínuo, como também o exercício acumulado aumentou a capacidade de corrida na esteira dos animais. Apesar das limitações de modelos experimentais em reproduzir protocolos de treinamento destinados a humanos, esses achados sugerem que os efeitos positivos do exercício acumulado sobre a forma física observada nos animais também possam ocorrer em humanos.11 Por exemplo, o exercício acumulado pode ser uma abordagem alternativa para ajudar indivíduos a abandonarem um estilo de vida sedentário.

A melhora na capacidade de corrida na esteira não foi acompanhada por mudanças no peso do coração ou nos níveis de TBARS ou FRAP. Esses resultados indicam que, apesar de os protocolos de ExC e ExA não haverem aumentado as defesas antioxidantes, também não aumentaram significativamente os níveis plasmáticos de radicais livres. Tal fato pode ser explicado pela intensidade de exercícios aplicada - 50-60% da capacidade máxima - considerada uma intensidade moderada.

Além disso, o exercício aeróbico foi sugerido como uma estratégia no controle de peso.6,13 Sua efetividade foi comprovada na redução da pressão sanguínea,7,12 dos níveis pós-prandiais de triglicerídeos,10 das pregas cutâneas e da circunferência da cintura,6 e no aumento nos níveis de lipoproteína de alta densidade.8,9 No presente estudo, contudo, em comparação aos animais do grupo SED, o ganho de peso corporal foi significativamente mais baixo no ExC mas não no grupo ExA.

Ainda, o exercício pode causar um aumento do fluxo laminar na superfície endotelial, aumentando, assim, a tensão de cisalhamento nessa superfície.25 Uma tensão de cisalhamento aumentada no endotélio pode induzir a expressão de várias enzimas envolvidas na síntese de substâncias que regulam o tônus vascular, o equilíbrio oxidativo local, o processo de coagulação e inflamação do endotélio.26,27 Assim, o exercício pode aumentar a produção endotelial de substâncias vasodilatadoras e, dessa forma, modular as respostas à noradrenalina em leitos vasculares, incluindo a aorta em ratos.14,16

O presente estudo mostrou que o ExC diminuiu as respostas à noradrenalina na aorta, com redução da Rmax, o que indica uma melhora na função endotelial. O principal fator relaxante derivado do endotélio é o NO, um gás difusível sintetizado principalmente pela enzima eNOS no endotélio vascular. Em nosso estudo, a redução da Rmax foi suprimida pelo L-NAME, um inibidor não-seletivo de NOS, ou revertida em preparações sem endotélio. Uma vez que a expressão de eNOS pode aumentar com a tensão de cisalhamento, aumentando, assim, a síntese de NO,18,20,27 a redução das respostas à noradrenalina na aorta de rato induzida pelo ExC pode ser explicada pela maior eficiência dos mecanismos relacionados ao NO endotelial, em consequência de uma maior expressão de eNOS endotelial. O envolvimento do NO derivado do endotélio na redução das respostas à noradrenalina em aorta de animais expostos ao ExC também foi descrito por outros estudos.16,20,28

O aumento na resposta à noradrenalina, caracterizada por elevação da Rmax e pEC50, induzido por ExC nas preparações da aorta sem endotélio foi inesperado, mas reforça o papel fundamental do endotélio na modulação dessa resposta nessas preparações. Além disso, o NO parece ser o principal mediador do relaxamento induzido por ACh nas preparações com aorta de ratos.29 Dessa forma, o aumento no relaxamento induzido por ACh corrobora o envolvimento de mecanismos relacionados ao NO no endotélio dessas preparações.

Infelizmente, a evidência de uma melhora na função endotelial foi demonstrada somente por estudos envolvendo exercício contínuo ou intermitente. Evidências de um efeito direto do ExA sobre o endotélio são escassas na literatura. Assim, uma vez que verificamos que o ExC melhora a função endotelial em nossas condições experimentais, começamos a investigar se a distribuição do exercício em sessões curtas (com duração total correspondente a uma sessão de exercício contínuo) levava a efeitos similares sobre o endotélio. O ExA não levou a aumentos significativos nas respostas à noradrenalina ou à ACh nas preparações da aorta, sugerindo que essa modalidade de exercício não exerce nenhum efeito sobre a função endotelial. Vale ressaltar que estudos prévios demonstraram que os efeitos da tensão de cisalhamento sobre as enzimas envolvidas na produção endotelial de substâncias regulatórias dependem do tempo de exposição ao exercício.18,19,27 Nossos achados sugerem que os efeitos benéficos do exercício sobre a função endotelial são alcançados somente se o exercício for praticado por um período suficiente.30,31 Contudo, o tempo mínimo necessário para que tais efeitos sejam observados é ainda desconhecido.

Nossos achados sobre o efeito do ExA sobre o endotélio vascular não são conclusivos e não podem ser extrapolados à prática clínica, dada a natureza experimental deste estudo, e ao fato de que, em nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que investiga esse efeito nessas condições. Ainda, em nosso estudo, as curvas de concentração-resposta à noradrenalina apresentou uma tendência descendente. Assim, é possível que a melhora na função endotelial induzida por ExA ocorra em animais com disfunção endotelial causada por envelhecimento, hipertensão, aterosclerose ou diabetes, e animais com exposição crônica ao álcool e/ou fumo.32 Na realidade, um dos poucos estudos sobre o efeito direto do ExA sobre a função endotelial foi realizado em adolescentes do sexo masculino submetidos à ingestão de café da manhã e almoço ricos em gordura. A dieta induziu a disfunção endotelial nesses indivíduos, a qual foi revertida por sessões curtas de exercício repetidas ao longo de um dia.33 Além disso, foi demonstrado que 30 minutos de caminhada divididos em sessões de 10 minutos (com intervalos de 50 minutos de descanso) foi eficaz na redução da pressão sistólica em indivíduos hipertensos.34 Tal redução pode estar envolvida, ao menos em parte, com a melhora na função endotelial induzida pelo exercício. Portanto, outros estudos com modelos de disfunção endotelial são necessários para melhor compreensão do potencial terapêutico do ExA.

 Conclusão

Os protocolos de exercício contínuo e acumulado utilizado neste estudo melhorou a forma física dos animais, o que sugere a utilidade do ExA como estratégia para introduzir os indivíduos a programas de treinamento físico. No entanto, em comparação ao ExC, o ExA não foi efetivo na prevenção do ganho de peso corporal ou na melhoria da função endotelial da aorta desses animais.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Juliana Edwiges Martinez pela Faculdade de Medicina de Marília.