Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC MQmmZjHTHGZwkgs7VLbWvvp S0066-782X2017000300237 10.5935/abc.20170014 S0066-782X2017005004101 Original Articles Effects and Mechanisms of Radiofrequency Ablation of Renal Sympathetic Nerve on Anti-Hypertension in Canine Chen Wei Tang Xiaohong Yang Xiaofang Weng Chunyan Yang Kan Wen Juan Liu Hong Wu Yang Central South University the Third Xiangya Hospital Department of Cardiology Changsha Hunan China Department of Cardiology - the Third Xiangya Hospital - Central South University, Changsha - Hunan Central South University Mailing Address: Xiaohong Tang, The Third Xiangya Hospital of Central South University, Changsha, Hunan 410013, P.R. China, Department of Cardiology. E-mail: xhtang007@126.com

Author contributions

Conception and design of the research: Chen W, Tang X, Yang K. Acquisition of data: Chen W, Yang X. Analysis and interpretation of the data: Chen W, Yang X.

Statistical analysis: Chen W, Yang X. Obtaining financing: Chen W, Tang X, Yang K. Writing of the manuscript: Chen W. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Tang X, Weng C, Wen J, Liu H, Wu Y, Yang K. Supervision / as the major investigador: Tang X, Weng C, Wen J, Yang K.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 06 03 2017 03 2017 108 3 237 245 12 05 2016 08 08 2016 31 08 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Radiofrequency ablation of renal sympathetic nerve (RDN) shows effective BP reduction in hypertensive patients while the specific mechanisms remain unclear.

 Objective:

We hypothesized that abnormal levels of norepinephrine (NE) and changes in NE-related enzymes and angiotensinconverting enzyme 2 (ACE2), angiotensin (Ang)-(1-7) and Mas receptor mediate the anti-hypertensive effects of RDN.

 Methods:

Mean values of systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP) and mean arterial pressure (MAP) were assessed at baseline and follow-up. Plasma and renal norepinephrine (NE) concentrations were determined using highperformance liquid chromatography with electrochemical detection, and levels of NE-related enzyme and ACE2-Ang(1-7)- Mas were measured using real time PCR, Western blot and immunohistochemistry or Elisa in a hypertensive canine model fed with high-fat diet and treated with RDN. The parameters were also determined in a sham group treated with renal arteriography and a control group fed with normal diet.

 Results:

RDN decreased SBP, DBP, MAP, plasma and renal NE. Compared with the sham group, renal tyrosine hydroxylase (TH) expression was lower and renalase expression was higher in the RDN group. Compared with the control group, renal TH and catechol-o-methyl transferase (COMT) were higher and renalase was lower in the sham group. Moreover, renal ACE2, Ang-(1-7) and Mas levels of the RDN group were higher than those of the sham group, which were lower than those of the control group.

 Conclusion:

RDN shows anti-hypertensive effect with reduced NE and activation of ACE2-Ang(1-7)-Mas, indicating that it may contribute to the anti-hypertensive effect of RDN.

 Keywords: Sympatectomy Hypertension Renal Insufficiency Radio Waves Dogs Hunan Provincial Natural Science Foundation of China 10JJ3048 Central Universities of Central South University 2015zzts123 This study was funded by Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (10JJ3048), the Fundamental Research Funds for the Central Universities of Central South University (2015zzts123) Introduction

Hypertension is the leading cause of cardiovascular diseases worldwide,1 resulting in an estimated 7.6 million deaths annually.2 Globally, 40.8% of the population is affected by hypertension, with an awareness rate of 46.5% and a control rate of 32.5%.3 The control of hypertension is a challenge due to the side effects, low compliance and limited efficacy of anti-hypertensive drugs.

The anti-hypertensive effects of radiofrequency ablation of renal sympathetic nerve (RDN) were first reported by Henry Krum in 2009.4 The Symplicity HTN-15 and Symplicity HTN-26 trials showed profound anti-hypertensive effects during a follow-up period of 36 months. A meta-analysis confirmed the effectiveness of RDN therapy for resistant hypertension,7 and was found superior to maximal medical therapy in lowering blood pressure (BP).8 However, the Symplicity HTN-3 study did not show effective BP reduction in resistant hypertensive patients,9 indicating that only a minority of patients was eligible for RDN.

Since the specific anti-hypertensive mechanisms of RDN are not clear, norepinephrine (NE) concentrations are an index of sympathetic neural activity in humans, which is positively correlated to BP. RDN may decrease NE that contributes to low BP, although the effect of RDN on NE is inconsistent.10,11 The inconsistent NE levels after RDN may be caused by tyrosine hydroxylase (TH), renalase, catechol-o-methyl transferase (COMT) and norepinephrine transporter (NET) activity, which are the enzymes associated with the synthesis and metabolism of NE. On the other hand, the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)/ angiotensin (Ang)-(1-7)/Mas axis constitutes an alternative to the renin - angiotensin system (RAS) and represents an intrinsic mechanism to induce vaso-protective actions by counter regulating the ACE/AngII/AT1R axis, thus inducing many beneficial effects on cardiovascular diseases (CVDs). It is inversely related to BP12 and exhibits cardiovascular and renal protection. Therefore, we aim to determine the effect of RDN on renal NE and changes in NE-related enzymes (TH, renalase, COMT and NET). Additionally, we investigated the levels of renal ACE2 - Ang (1-7) - Mas axis after RDN and discussed the potential anti-hypertensive mechanisms of RDN.

 Methods Animal preparation

All procedures on the use and care of animals was approved by the Ethical Committee of Central South University. Beagle dogs (n=28, 10 to 12 months of age, weighing 11 ~ 12kg) were randomly divided into a hypertensive model group (n = 22) and a control group (n = 6). Throughout the study, dogs were fed high-fat diet (lard 0.3 ~ 0.4kg/day was added to 250g/day regular diet) in the model group and regular diet (250g/day including 23% protein, 11% fat, 4.9% fiber, water 10%, 1-3% calcium, 0.8% phosphorus, 0.29% methionine, vitamin A 11000IU / kg, vitamin D3 1000 IU / kg and vitamin E 500 IU / kg) in the control group. After 3 months of high-fat diet, 20 dogs achieved an approximate 50% increase in body weight, and the fat intake was reduced to a maintenance level. This model of canine obesity following a high-fat diet closely mimics the cardiovascular, renal, hormonal, and metabolic changes observed in obese human subjects. The hypertensive group was divided into a surgery group (n = 10) and a sham surgery group (n = 10). Three dogs were excluded for the following reasons: retroperitoneal hematoma caused by femoral artery puncture (n=1) and death due to anesthesia (n=2). The surgery group (n=9) was treated with radiofrequency ablation of the renal sympathetic nerve, and the sham surgery (n=8) and control groups (n=6) were treated with renal arteriography. Six months after RDN, we sacrificed the beagle dogs under deep anesthesia by intramuscular injection of pentobarbital sodium (30-35mg/kg).

 Radiofrequency ablation of the renal sympathetic nerve

Surgery was performed at room temperature, with prior fasting for 24 hours, and after anesthetizing dogs with an intramuscular injection of sodium pentobarbital (30-35mg / kg). After successful anesthesia, the dogs were placed in the supine position on the operating table, followed by routine disinfection of the right femoral artery. A catheter was inserted through the femoral artery to monitor BP and renal arteriography. The radiofrequency ablation catheter was inserted through the femoral artery into the renal artery and connected to a radiofrequency ablation device (IBI, St. Jude Medical, Inc., St. Paul, MN, USA). Three to four ablation sites were selected from each site and a spiral shape local ablation was performed (5F IBI radiofrequency ablation catheter; St. Jude Medical). Each spot was ablated for 120 sec, with a power limit of 8 W, until the tumor temperature reached 55°C. Renal arteriography was performed immediately after the surgery, pressure was applied at the puncture point for 15 - 30 min, bandaged and fixed.

 Analytic methods

Body weight was determined by electronic scales. SBP, DBP and MAP were measured by BP-2010E (Softron, China), a tail arterial blood pressure measuring instrument. Plasma concentration and renal tissue levels of NE were measured by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC). Renal ACE2 and Mas mRNA levels were measured by real time PCR. Renal Ang (1-7) (Cusabio, China) was estimated by ELISA. TH, renalase, COMT, NET, ACE2 and Mas protein expression levels in renal tissue were measured by Western blot and immunohistochemistry.

 HPLC

NE in acidified release medium, perfusate, and superperfusate samples was identified and quantified by HPLC. The system consists of a Varian Pro-Star solvent delivery system and a model 9090 autosampler (Varian, Walnut Creek, CA), coupled to a C18 column and an ESA Coulochem II detector. Separations were performed isocratically using a filtered and degassed mobile phase, consisting of 12% methanol, 0.1 M sodium phosphate, 0.2 mM sodium octyl sulfate, and 0.1 mM EDTA, adjusted to pH 2.8 with phosphoric acid. The high-pressure liquid chromatography system is coupled to a computer, where the chromatograms were recorded and analyzed using the Varian Star workstation software.

 Western blot

Frozen tissues were lysed with cell lysis buffer containing protease inhibitor. The protein concentration of each specimen was measured based on the Bradford method utilizing the Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) with bovine serum albumin (BSA) as the standard. After the protein denaturing procedure with loading buffer, each sample (50 µg) was resolved on 8-12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) gel (Bio-Rad Laboratories) at room temperature and transferred onto a polyvinylidene fluoride membrane at 4°C. After blocking in 5% non-fatty milk for 1 hour at room temperature, it was incubated overnight at 4°C with polyclonal rabbit anti-TH antibody (1:500 Abcam, USA), polyclonal goat anti-renalase antibody (1:500, biorbyt, USA), polyclonal goat anti-COMT antibody (1:500, LifeSpan BioSciences, USA), polyclonal rabbit anti-NET antibody (1:500, Abcam, USA), polyclonal goat anti- ACE2 antibody (1:200, Santa Cruz, USA) and polyclonal rabbit anti-Mas antibody (1:200, Santa Cruz, USA) with β-actin (1 : 1000, Abcam, USA) as the positive control. The HRP-conjugated rabbit anti-goat (1 : 2000) or goat anti-rabbit (1 : 3000) secondary antibody was added and the membranes were then incubated for 1 hour at room temperature. After washing, signals were visualized by luminol reagents (Bio-Rad Laboratories) and the densitometry of each blot was analyzed with the latest version of Scion Image 4.0.3.2.

 Immunohistochemistry

The staining procedure was performed on paraffin-embedded renal tissue sections (5µm). Antigen was retrieved from all the sections by boiling with sodium citrate buffer (pH 6) and incubating with polyclonal rabbit anti-TH antibody (1:150 Abcam, USA), polyclonal goat anti- renalase antibody (1:150, biorbyt, USA), polyclonal goat anti-COMT antibody (1:150, LifeSpan BioSciences, USA), polyclonal rabbit anti-NET antibody (1:150, Abcam, USA), polyclonal goat anti- ACE2 antibody (1:100, Santa Cruz, USA) and polyclonal rabbit anti-Mas antibody (1:100, Santa Cruz, USA) overnight at 4°C. After staining, all specimens were dehydrated and sealed for microscopic observation. Protein occurrence and distribution in antibody-stained tissue sections were observed using the Nikon eclipse E400 microscope and Digital HyperHAD Color Video Camera (Sony) using the Easy Image Analysis software (NIS-Elements BR v3.0) for evaluation of immunostaining.

 Statistical analyses

Results were expressed as means ± standard error of the means, and all data passed a normality test. Comparisons between the hypertensive model group and control groups were done using the unpaired Student's t-test assuming unequal variance, whereas within 3 groups analysis was performed using one-way ANOVA with a Neuman-Keuls post hoc analysis. Paired Student's t-test was used to compare before and after establishing the hypertensive model, and before and after RDN. Linear correlation was used to evaluate the association between SBP and level of the above mentioned factors. All data were analyzed by SPSS 22.0. P < 0.05 was considered significant.

 Results Canine model of hypertension and response to RDN

After 3 months on high-fat diet, there was a marked increase in body weight, HR, SBP, DBP and MAP of the hypertensive group (*p < 0.05 vs. baseline, # p < 0.05 vs. control group). SBP, DBP and MAP of hypertensive group increased by approximately 28±10mmHg, 17±8mmHg and 21±8mmHg, respectively, along with the target weight gain of 45.2%. Moreover, plasma NE in the hypertensive group was remarkably increased after 3 months of high-fat diet (*p < 0.05 vs. baseline, # p < 0.05 vs. control group). (Figure 1). SBP, DBP and MAP of the surgery group dramatically decreased by approximately 24±9mmHg, 13±6mmHg and 16±7mmHg 6 months after surgery, respectively. When compared with the sham surgery group, SBP, DBP and MAP of the surgery group also declined significantly. (Figure 2A) Six months after RDN, plasma NE of the surgery group was significantly reduced (*p < 0.05 vs. pre-surgery of surgery group, # p < 0.05 vs. sham surgery group). In addition, renal NE in the surgery group was also lower than the in the sham surgery group (p < 0.05). (Figure 2B)

Effects of high-fat diet on body weight, HR and BP (SBP, DBP and MAP) of beagle dogs (A). Body weight, HR and BP (SBP, DBP and MAP) responses to RDN (B). Values are mean ± SEM.*p < 0.05 versus baseline, # p < 0.05 versus control group in figure 2A. *p < 0.05 versus pre-surgery of surgery group, # p < 0.05 versus sham surgery group in figure 2B. SBP: Systolic blood pressure; DBP: Diastolic blood pressure; MAP: Mean arterial pressure; HR: Heart rate.

BP (SBP, DBP and MAP)(A) and NE (plasma and renal) (B) in response to RDN. Values are mean ± SEM.*p < 0.05 versus pre-surgery of surgery group, # p < 0.05 versus sham surgery group in figure 2. BP: blood pressure; SBP: Systolic blood pressure; DBP: Diastolic blood pressure; MAP: Mean arterial pressur; NE: norepinephrine.

Levels of renal TH, renalase, COMT and NET response to RDN

Six months after surgery, renal TH protein expression in the surgery group was lower than in the sham surgery group (p < 0.05). TH immunohistochemical staining (brown) was located in the cytoplasm of renal tubules in beagle dogs (Figure 3A). Kidney level of renalase in the surgery group was significantly higher than in the sham surgery group (p < 0.05). Immunohistochemical results showed that renalase protein was expressed in the cytoplasm of renal tubular epithelial cells (Figure 3B). The renal COMT protein expression in the sham surgery group was lower than in the control group (p < 0.05). In the immunohistochemical study, COMT was located in the cytoplasm of renal tubules in beagle dogs (Figure 3C). NET was located in the cytoplasm of renal tubules in beagle dogs. However, there was no statistical difference of the renal NET among the 3 groups (Figure 3D).

Effects of RDN on renal TH, renalase, COMT and NET protein expression of beagle dogs. Values are mean±SEM. * p < 0.05 versus control group, # p < 0.05 versus sham surgery group. TH: tyrosine hydroxylase ; COMT: catechol-o-methyl transferase; NET: norepinephrine transporter.

Levels of renal ACE2, Ang-(1-7) and Mas response to RDN

Renal ACE2 mRNA and protein expression in the surgery group were significantly higher than in the sham surgery group (p < 0.05). Immunohistochemical staining (brown) of ACE2 was located in the cytoplasm and membrane of renal tubules in beagle dogs. Six months after surgery, values with positive area density in the surgery group were significantly stronger than in the sham group (p < 0.05) (Figure 4A). Similar to ACE2, renal tissue Ang-(1-7) concentration in the sham surgery group was the lowest, dramatically lower than in the surgery group and control group (p < 0.05) (Figure 4B). And the level of renal Mas was also higher in the surgery group and control group than in the sham surgery group. Immunohistochemical staining (brown) of Mas was located in the renal glomeruli and proximal tubule cell cytoplasm and cell membrane in beagle dogs (Figure 4C).

Effects of RDN on renal ACE2 mRNA and protein expression (A), Ang-(1-7) concentration (B) and Mas mRNA and protein expression(C) of beagle dogs. Values are mean±SEM. * p < 0.05 versus control group, # p < 0.05 versus sham surgery group. ACE2 mRNA: angiotensin-converting enzyme 2.

Discussion

In our study, obesity-related hypertension, induced by high-fat diet, was associated with increase in body weight, HR, SBP, DBP and MAP, and this was in agreement with the results of previous studies.13 RDN effectively reduced blood pressure for SBP, DBP and MAP by approximately 24±9mmHg, 13±6mmHg and 16±7mmHg in the surgery group after 6 months of surgery, respectively. SBP, DBP and MAP of the surgery group also declined significantly when compared with the sham surgery group, which was similar to findings of previous clinical studies5,6 and animal experiment14. The Symplicity HTN-1 trial enrolled 153 resistant hypertensive patients, of whom 111 agreed to the 36-month follow-up. SBP (-32.0mmHg) and DBP(-14.4mmHg) decreased significantly.5 The Symplicity HTN-2 trial randomized 106 subjects with resistant hypertension, whose SBP and DBP were reduced by 33 mmHg and 14 mmHg at 36 months, respectively.6 However, the Symplicity HTN-3 study did not show effective BP reduction in resistant hypertensive patients,9 indicating that only a minority of patients was eligible for RDN.

NE is an important indicator of sympathetic neural activity, and is elevated in diseases with high sympathetic activity. Tiroch et al.10 found that RDN resulted in a marked decrease of the NE spillover rate, while Machino et al.11 observed no significant difference after RDN of systemic NE in spontaneously hypertensive rats (SHR). We observed that plasma NE increased significantly in an obesity-related hypertensive canine model, and decreased nearly 44% with RDN. Furthermore, RDN was effective in reducing renal NE concentration, consistent with the results of Rimoldi et al.15 As reported, RDN was associated with additional benefits16 and improvement of the cardiac and renal functions.17,18 It was also proposed as a promising treatment in diseases with sympathetic overactivation.19,20 In this study, we determined the antihypertensive value of RDN using an obesity-related hypertensive canine model with high NE levels.

Renal TH level was also increased in obesity-related hypertension in this study. In addition, RDN decreased the renal TH protein expression in the hypertensive model, which is substantially similar to previous studies. Down-regulation of TH in the adrenal medulla of SHR was accompanied by a potent decrease of NE and SBP,21 suggesting that RDN may influence NE concentrations by affecting the renal TH level. On the other hand, renalase was remarkably lower in the obesity-related hypertensive canine model in this study, suggesting an inverse relationship with hypertension similar to findings of previous studies.22 Desir GV showed that recombinant renalase in vitro or in vivo lowers blood pressure by degrading plasma adrenaline, with its antihypertensive effect directly related to its enzymatic activity.23 SHR plasma and renal renalase levels were profoundly increased after RDN compared with the baseline, sham and control groups, with MAP significantly decreased,24 which is consistent with this study, suggesting that RDN may lower the NE concentrations by elevating the renal renalase expression. COMT and NET are major enzymes involved in degrading catecholamines, which is inversely related to hypertension. As shown in our study, renal COMT level profoundly lowered obesity-related hypertension compared with the control group, while RDN was ineffective against the expression of renal COMT and NET. As they are mainly expressed in nerve endings, it suggested that renal COMT and NET may have had no significant change after RDN.

The ACE2-Ang-(1-7)-Mas axis is involved in hypertension. Transgenic mice overexpressing growth hormone showed increased SBP, a high degree of both cardiac and renal fibrosis and a markedly decreased level of ACE2-Ang-(1-7)-Mas, and Ang-(1-7) administration reduced SBP.25 Activation of the ACE2-Ang-(1-7)-Mas pathway reduces oxygen-glucose deprivation-induced tissue swelling, ROS production, and cell death in mouse brain associated with angiotensin II overproduction.26 Consistent with the previous study, in addition to the reduction of ACE2, we also observed that renal Ang-(1-7) concentration and Mas mRNA and protein expression decreased in obesity-related hypertension. We first found that RDN increased renal ACE2-Ang-(1-7)-Mas axis in an obesity-related hypertensive canine model.

RDN shows anti-hypertensive effect with reduced NE and activation of ACE2-Ang-(1-7)-Mas, indicating that this may contribute to the anti-hypertensive effect of RDN. However, the relationship between these two pathways was not clear in this study. Ang-(1-7) elicits a facilitatory presynaptic effect on peripheral noradrenergic neurotransmission,27,28 and is inhibitory at the central nervous system through the Mas receptor.29,30 It is suggested that ACE2-Ang(1-7)-Mas may decrease the concentration of NE to achieve the anti-hypertensive effect, however, this needs to be confirmed by further studies.

Nevertheless, this study has limitations as follows. Firstly, the number of dogs is small, and this may lead to a bias result. Secondly, changes of NE, NE-related enzymes and ACE2-Ang-(1-7)-Mas were detected during the procedure, while the relationship between these changes was unclear. The variation of renal TH, renalase and ACE2-Ang-(1-7)-Mas may have affected the level of NE to contribute to the anti-hypertensive effect of RDN. These limitations should be addressed in further studies to clarify the possible mechanisms of RDN, thus contributing to develop and improve this new treatment method.

 Conclusions

The initial question that motivated our study was to determine whether NE and ACE2-Ang-(1-7)-Mas would prove to participate in the antihypertensive effect of RDN. Our study confirmed that RDN shows an antihypertensive effect with reduced plasma and renal NE, which may be related to the decrease of TH and increase of renalase in the kidney. Furthermore, RDN activates the ACE2-Ang-(1-7)-Mas pathway and this may contribute to the antihypertensive effect of RDN. Although the application of RDN is not clear because of its varying effectiveness, our data suggested that it may be an excellent choice in obesity-related hypertension patients with high levels of NE and over-activation of the renin-angiotensin system.

Sources of Funding

This study was funded by Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (10JJ3048), the Fundamental Research Funds for the Central Universities of Central South University (2015zzts123).

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Wei Chen, from Central South University, Changsha - Hunan.

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Davies JE Manisty CH Petraco R Barron AJ Unsworth B Mayet J First-in-man safety evaluation of renal denervation for chronic systolic heart failure: primary outcome from REACH-Pilot study Int J Cardiol 2013 162 3 189 192 21 Kumai T, Tateishi T, Tanaka M, Watanabe M, Shimizu H, Kobayashi S. Tyrosine hydroxylase antisense gene therapy causes hypotensive effects in the spontaneously hypertensive rats. J Hypertens. 2001;19(10):1769-73. Kumai T Tateishi T Tanaka M Watanabe M Shimizu H Kobayashi S Tyrosine hydroxylase antisense gene therapy causes hypotensive effects in the spontaneously hypertensive rats J Hypertens 2001 19 10 1769 1773 22 Wybraniec MT, Mizia-Stec K, Trojnarska O, Chudek J, Czerwienska B, Wikarek M, et al. Low plasma renalase concentration in hypertensive patients after surgical repair of coarctation of aorta. J Am Soc Hypertens. 2014;8(7):464-74. 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Gironacci MM Valera MS Yujnovsky I Peña C Angiotensin-(1-7) inhibitory mechanism of norepinephrine release in hypertensive rats Hypertension 2004 44 5 783 787 30 Lopez Verrilli MA, Rodriguez Fermepín M, Longo Carbajosa N, Landa S, Cerrato BD, García S, et al. Angiotensin-(1-7) through Mas receptor up-regulates neuronal norepinephrine transporter via Akt and Erk1/2-dependent pathways. J Neurochem. 2012;120(1):46-55. Lopez Verrilli MA Rodriguez Fermepín M Longo Carbajosa N Landa S Cerrato BD García S Angiotensin-(1-7) through Mas receptor up-regulates neuronal norepinephrine transporter via Akt and Erk1/2-dependent pathways J Neurochem 2012 120 1 46 55 Artigos Efeitos e Mecanismos da Denervação Simpática Renal por Radiofrequência na Anti-Hipertensão em Cães Chen Wei 1 Tang Xiaohong 1 Yang Xiaofang 1 Weng Chunyan 1 Yang Kan 1 Wen Juan 1 Liu Hong 1 Wu Yang 1 Department of Cardiology - the Third Xiangya Hospital - Central South University, Changsha - Hunan Correspondência: Xiaohong Tang, The Third Xiangya Hospital of Central South University, Changsha, Hunan 410013, P.R. China, Departamento de Cardiologia. E-mail: xhtang007@126.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Chen W, Tang X, Yang K. Obtenção de dados: Chen W, Yang X. Análise e interpretação dos dados: Chen W, Yang X.

Análise estatística: Chen W, Yang X. Obtenção de financiamento: Chen W, Tang X, Yang K. Redação do manuscrito: Chen W. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Tang X, Weng C, Wen J, Liu H, Wu Y, Yang K. Supervisão / como investigador principal: Tang X, Weng C, Wen J, Yang K.

Potencial Conflito de Interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

A denervação simpática renal por radiofrequência (DSR) mostra redução eficaz da pressão arterial (PA) de pacientes hipertensos, ainda que os mecanismos específicos permaneçam obscuros.

 Objetivo:

Fizemos a hipótese de que níveis alterados de noradrenalina (NA) e mudanças nas enzimas relacionadas à NA e enzima conversora de angiotensina 2 (ECA-2), angiotensina (Ang)-(1-7) e receptor Mas são mediadores dos efeitos antihipertensivos da DSR.

 Métodos:

Foram avaliados os valores médios de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e pressão arterial média (PAM) no início e durante o seguimento. Foram medidas as concentrações plasmática e renal de noradrenalina (NA) por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica, e os níveis de enzima relacionada à NA e ECA2-Ang-(1-7)-Mas através de PCR em tempo real, Western blot e imunohistoquímica ou Elisa em um modelo canino de hipertensão que recebeu ração rica em gordura e foi tratado com DSR. Os parâmetros também foram determinados em um grupo de cirurgia simulada submetido à arteriografia renal e em um grupo controle que recebeu dieta normal.

 Resultados:

DSR causou diminuição da PAS, PAD, PAM e das concentrações plasmática e renal de NA. Em comparação ao grupo placebo, a expressão da tirosina hidroxilase (TH) renal foi menor e a da renalase foi maior no grupo DSR. Em comparação ao grupo controle, os níveis de TH renal e de catecol-o-metil-transferase (COMT) foram maiores e os de renalase foram menores no grupo cirurgia simulada. Além disso, os níveis renais de ECA2, Ang-(1-7) e Mas foram maiores no grupo DSR do que no grupo cirurgia simulada, que, por sua vez, foram menores do que no grupo controle.

 Conclusões:

A DSR mostra efeitos anti-hipertensivos com redução da NA e ativação da ECA2-Ang-(1-7)-Mas, o que indica que pode contribuir com o efeito anti-hipertensivo da DSR.

 Palavras-chave: Simpatectomia Hipertensão Insuficiência Renal Ondas de Rádio Cães Fundação da Ciência Natural da Província de Hunan 10JJ3048 Universidades Centrais da Universidade Centro-Su 2015zzts123 O presente estudo foi patrocinado pela Fundação da Ciência Natural da Província de Hunan, China (10JJ3048), e por Fundos De Pesquisas Fundamentais para as Universidades Centrais da Universidade Centro-Sul (2015zzts123). Introdução

A hipertensão é principal causa de doenças cardiovasculares no mundo todo,1 resultando numa estimativa de 7,6 milhões de mortes por ano.2 Globalmente, 40,8% da população sofre de hipertensão, com uma taxa de conhecimento da doença de 46,5% e taxa de controle de 32,5%.3 O controle da hipertensão é um desafio devido aos efeitos colaterais, baixa aderência e eficácia limitada das drogas anti-hipertensivas.

Os efeitos anti-hipertensivos da denervação simpática renal por radiofrequência (DSR) foram descritos pela primeira vez por Krum et al.,4 em 2009. Os estudos Symplicity HTN-15 e Symplicity HTN-26 mostraram efeitos anti-hipertensivos profundos durante um seguimento de 36 meses. Uma metanálise confirmou que o tratamento com DSR é eficaz para hipertensão resistente,7 e se mostrou superior ao tratamento clínico otimizado na redução da pressão arterial (PA).8 No entanto, o estudo Symplicity HTN-3 não mostrou redução eficaz da PA em pacientes portadores de hipertensão resistente,9 indicando que apenas uma minoria dos pacientes era candidata a DSR.

Uma vez que os mecanismos anti-hipertensivos específicos da DSR não são claros, as concentrações de noradrenalina (NA) são um índice da atividade neural simpática em humanos, a qual está positivamente correlacionada com a PA. A DSR pode reduzir a NA que contribui para baixar a PA, embora o efeito da DSR sobre a NA seja inconsistente.10,11 Os níveis variáveis de NA após DSR podem ser decorrentes da atividade de tirosina hidroxilase (TH), renalase, catecol-o-metil transferase (COMT) e transportador de noradrenalina (TNA), que são as enzimas associadas à síntese e metabolismo da NA. Por outro lado, o eixo da enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2)/angiotensina (Ang)-(1-7)/Mas constitui uma alternativa ao sistema renina-angiotensina (SRA) e representa um mecanismo intrínseco na indução de ações vasoprotetoras através da contrarregulação do eixo ECA/AngII/AT1R, induzindo, assim, muitos efeitos benéficos nas doenças cardiovasculares (DCVs), estando inversamente relacionado à PA,12 e exibindo proteção cardiovascular e renal. Assim, o objetivo deste estudo foi determinar o efeito da DSR sobre a NA renal e as alterações nas enzimas relacionadas à NA (TH, renalase, COMT e TNA). Além disso, investigamos os níveis renais do eixo ECA2 - Ang-(1-7) - Mas após DSR e discutimos os mecanismos anti-hipertensivos potenciais da DSR.

 Métodos Preparo dos animais

Todos os procedimentos relativos ao uso e cuidados dos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Central South University. Cães beagle (n=28, 10 a 12 meses de idade, pesando 11-12kg) foram divididos aleatoriamente em um grupo modelo de hipertensão (n = 22) e um grupo controle (n = 6). Ao longo do estudo, os cães foram alimentados com dieta rica em gordura (foram acrescentados 0,3 a 0,4 kg de toucinho à dieta normal de 250g/dia) no grupo modelo, e com dieta normal (250g/dia, incluindo 23% de proteína, 11% de gordura, 4,9% de fibras, 10% de água, 1-3% de cálcio,0,8% de fósforo, 0,29% de metionina, 11000UI de vitamina A/kg, 1000UI de vitamina D3 / kg e 500 UI de vitamina E / kg) no grupo controle. Após 3 meses de dieta rica em gordura, 20 cães atingiram cerca de 50% de aumento no peso corporal, sendo a ingesta de gordura reduzida a um nível de manutenção. Esse modelo de obesidade canina após dieta rica em gordura mimetiza de perto as alterações cardiovasculares, renais, hormonais e metabólicas observadas em indivíduos humanos obesos. O grupo hipertenso foi dividido em um grupo cirurgia (n = 10) e um grupo cirurgia simulada (n = 10). Três animais foram excluídos pelos seguintes motivos: hematoma retroperitoneal por puntura da artéria femoral (n=1) e morte decorrente da anestesia (n=2). O grupo cirurgia (n = 9) foi tratado com denervação simpática renal por radiofrequência, enquanto que o grupo cirurgia simulada (n= 8) e o grupo controle (n = 6) foram tratados com arteriografia renal. Seis meses após DSR, sacrificamos os cães beagle sob anestesia profunda por injeção intramuscular de pentobarbital sódico (30-35 mg/kg).

 Denervação simpática renal por radiofrequência

A cirurgia foi realizada a temperatura ambiente, com jejum prévio de 24 horas e após anestesia com injeção intramuscular de pentobarbital sódico (30-35 mg/kg). Após a anestesia bem-sucedida, os cães eram colocados na posição supina sobre a mesa cirúrgica e, em seguida, era feita antissepsia de rotina da artéria femoral direita. Inseria-se um cateter através da artéria femoral para monitorar a PA e a arteriografia renal. O cateter de ablação por radiofrequência era inserido na artéria femoral até a artéria renal e conectado ao aparelho de ablação por radiofrequência (IBI, St. Jude Medical, Inc., St. Paul, MN, EUA). De 3 a 4 locais de ablação eram selecionados para cada local, sendo realizada ablação local em forma espiral (cateter de ablação por radiofrequência 5F IBI, St. Jude Medical). Cada ponto era submetido a ablação durante 120 segundos, com limite de energia de 8 W, até que a temperatura do tumor atingisse 55°C. Realizava-se arteriografia renal imediatamente após a cirurgia, pressão sobre o local de puntura durante 15 a 30 minutos, curativo e fixação.

 Métodos analíticos

O peso corporal foi medido por balança eletrônica. Foi utilizado o BP-2010E (Softron, China), que é um aparelho de medida de pressão arterial de cauda, para medir PAS, PAD e PAM. Foram medidas a concentração plasmática e tecidual renal de NA através de cromotografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (CLAE). Os níveis de ECA2 e mRNA Mas renais foram medidos através de PCR em tempo real. A Ang-(1-7) (Cusabio, China) renal foi estimada por ELISA. Os níveis de TH, renalase, COMT, TNA, ECA2 e expressão da proteína Mas no tecido renal foram medidos por Western blot e imuno-histoquímica.

 CLAE

Amostras de NA em meio de liberação acidificado, perfusato e superperfusato foram identificadas e quantificadas por CLAE. O sistema consiste de um sistema de liberação de solvente Varian Pro-Star e um auto-amostrador modelo 9090 (Varian, Walnut Creek, CA), acoplado a uma coluna C18 e a um detector ESA Coulochem II. As separações foram feitas forma isocrática através de uma fase móvel filtrada e desgaseificada consistindo de 12% de metanol, 0,1 M de fosfato sódico, 0,2 mM de octil sulfato sódico e 0,1 mM de EDTA, ajustada a um pH de 2.8 com ácido fosfórico. O sistema de cromotografia líquida de alta pressão é acoplado a um computador, onde os cromatogramas são gravados e analisados através do software de estação de trabalho Varian Star.

 Western blot

Tecidos congelados foram lisados com tampão de lise celular contendo inibidor de protease. A concentração proteica de cada amostra foi medida com base no método de Bradford através do kit de ensaio proteico Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) tendo a albumina sérica bovina (ASB) como padrão. Após procedimento de desnaturação proteica com tampão de carga, cada amostra (50 µg) foi separada em gel de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 8-12% (PAGE) (Bio-Rad Laboratories) a temperatura ambiente e transferida para uma membrana de fluoreto de polivinilideno a 4°C. Após bloqueio em leite magro a 5% por 1 hora a temperatura ambiente, a amostra foi incubada durante a noite a 4°C com anticorpo policlonal de coelho anti-TH(1:500 Abcam, EUA); anticorpo policlonal de cabra anti-renalase (1:500, biorbyt, EUA), anticorpo policlonal de cabra anti-COMT (1:500, LifeSpan BioSciences, EUA); anticorpo policlonal de coelho anti-TNA (1:500, Abcam, EUA); anticorpo policlonal de cabra anti-ECA2 (1:200, Santa Cruz, EUA); e anticorpo policlonal de coelho anti-Mas (1:200, Santa Cruz, EUA), tendo a β-actina (1 : 1000, Abcam, EUA) como controle positivo. Foi adicionado anticorpo secundário de coelho anti-cabra conjugado com HRP (1:2000) ou anticorpo de cabra anti-coelho (1:3000) sendo as membranas então incubadas por 1 hora a temperatura ambiente. Após lavagem, os sinais foram visualizados por reagentes luminol (Bio-Rad Laboratories) e a densitometria de cada blot foi analisada através da versão mais recente do Scion Image 4.0.3.2.

 Imuno-histoquímica

O procedimento de marcação foi realizado em cortes de tecido renal colocado em parafina (5 µm). O antígeno foi recuperado de todos os cortes através de fervura com tampão de citrato de sódio (pH 6) e incubação com anticorpo policlonal de coelho anti-TH (1:150, Abcam, EUA); anticorpo policlonal de cabra anti- renalase (1:150, biorbyt, EUA); anticorpo policlonal de cabra anti-COMT (1:150, LifeSpan BioSciences, EUA); anticorpo policlonal de coelho anti-TNA (1:150, Abcam, EUA); anticorpo policlonal de cabra anti- ECA2 (1:100, Santa Cruz, EUA); e anticorpo policlonal de coelho anti-Mas (1:100, Santa Cruz, EUA) durante a noite, a 4°C. Após a marcação, todas as amostras foram desidratadas e seladas para observação ao microscópio. Foram observadas a ocorrência e distribuição de proteína em cortes de tecido marcados por anticorpo através do microscópio Nikon eclipse E400 e da vídeo-câmara digital colorida HyperHAD (Sony), através do software Easy Image Analysis (NIS-Elements BR v3.0) para avaliação da imunomarcação.

 Análises estatísticas

Os resultados foram expressos como médias ± erro padrão das médias, e todos os dados passaram por teste de normalidade. As comparações entre o grupo modelo de hipertensão e o grupo controle foram feitas através do teste t de Student não pareado assumindo-se variância desigual, ao passo que as análises entre 3 grupos foram feitas através do teste de ANOVA unidirecional com análise post-hoc de Neuman-Keuls. Foi usado teste t de Student pareado para comparar antes e depois de se estabelecer o modelo hipertensivo, e antes e depois de DSR. Foi usada correlação linear para avaliar a associação entre PAS e o nível dos fatores acima mencionados. Todos os dados foram analisados por SPSS 22.0. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

 Resultados Modelo canino de hipertensão e resposta à DSR

Após 3 meses sob dieta rica em gordura, houve importante aumento do peso corporal, FC, PAS, PAD e PAM no grupo hipertenso (*p < 0,05 vs. início, # p < 0,05 vs. grupo controle). Houve aumento da PAS, PAD e PAM no grupo hipertenso de aproximadamente 28±10mmHg, 17±8mmHg e 21±8mmHg, respectivamente, junto a um ganho de peso almejado de 45,2%. Além disso, houve aumento importante de NA plasmática no grupo hipertenso após 3 meses de dieta rica em gordura (*p < 0,05 vs. início, # p < 0,05 vs. grupo controle). (Figura 1). Houve redução importante de aproximadamente 24±9mmHg, 13±6mmHg and 16±7mmHg da PAS, PAD e PAM, respectivamente, no grupo cirurgia 6 meses após a cirurgia. Quando comparados com os valores do grupo cirurgia simulada, a PAS, PAD e PAM do grupo cirurgia também caíram significativamente (Figura 2A). Seis meses após DSR, os níveis plasmáticos de NA no grupo cirurgia mostraram-se significativamente reduzidos (*p < 0,05 vs. pré-cirurgia no grupo cirurgia, # p < 0,05 vs. grupo cirurgia simulada). Além disso, a NA renal no grupo cirurgia também se mostrou mais baixa do que no grupo cirurgia simulada (p < 0,05) (Figura 2B).

Efeitos da dieta rica em gordura sobre o peso corporal, FC e PA (PAS, PAD e PAM) em cães beagle (A). Respostas do peso corporal, FC e PA (PAS, PAD e PAM) à DSR (B). Os valores estão expressos em média ± EPM. .*p < 0,05 versus valores iniciais, # p < 0,05 versus grupo controle na figura 2A. *p < 0,05 versus pré-cirurgia do grupo cirurgia, # p < 0,05 versus grupo cirurgia simulada na figura 2B. PAS: Pressão Arterial Sistólica; PAD: Pressão Arterial Diastólica; PAM: Pressão Arterial Média; FC: Frequência Cardíaca.

PA (PAS, PAD e PAM) (A) e NA (plasmática e renal) (B) em resposta à DSR. Os valores estão expressos em média ± EPM. *p < 0,05 versus pré-cirurgia do grupo cirurgia, # p < 0,05 versus grupo cirurgia simulada na figura 2. PAS: Pressão Arterial Sistólica; PAD: Pressão Arterial Diastólica; PAM: Pressão Arterial Média; NA: noradrenalina.

Níveis renais de TH, renalase, COMT e resposta do TNA à DSR

Seis meses após a cirurgia, a expressão da proteína TH renal no grupo cirurgia foi menor do que no grupo cirurgia simulada (p < 0,05). A marcação imuno-histoquímica da TH (marrom) mostrou-se localizada no citoplasma dos túbulos renais dos cães beagle (Figura 3A). Os níveis renais de renalase no grupo cirurgia foram significativamente maiores do que no grupo cirurgia simulada (p < 0,05). Os resultados imuno-histoquímicos mostraram que a proteína renalase estava expressa no citoplasma das células epiteliais do túbulo renal (Figura 3B). A expressão da proteína COMT renal no grupo cirurgia simulada foi menor do que no grupo controle (p < 0,05). No estudo imuno-histoquímico, a COMT estava localizada no citoplasma dos túbulos renais dos cães beagle (Figura 3C). TNA estava localizado no citoplasma dos túbulos renais dos cães beagle. No entanto, não houve diferença estatística do TNA renal entre os 3 grupos (Figura 3D).

Efeitos da DSR sobre os níveis renais de TH, renalase, COMT e expressão da proteína TNA em cães beagle. Os valores estão expressos em média ± EPM. .*P < 0,05 versus grupo controle, # P < 0,05 versus grupo cirurgia simulada. TH: tirosina hidroxilase; COMT: catecol-o-metil transferase; NET: norepinephrine transporter.

Níveis renais de ECA2, Ang-(1-7) e resposta do Mas à DSR

O nível de ECA2 mRNA renal e a expressão proteica no grupo cirurgia foi significativamente maior do que no grupo cirurgia simulada (p < 0,05). A marcação imuno-histoquímica da ECA2 (marrom) estava localizada no citoplasma e na membrana de túbulos renais dos cães beagle. Seis meses após a cirurgia, valores com densidade de área positivos no grupo cirurgia foram significativamente mais fortes do que no grupo simulação (p < 0,05) (Figura 4A). À semelhança da ECA2, a concentração de Ang-(1-7) no tecido renal no grupo cirurgia simulada foi o mais baixo, muito menor do que no grupo cirurgia e no grupo controle (p < 0,005) (Figura 4B). O nível de Mas renal também foi mais alto no grupo cirurgia e no grupo controle do que no grupo cirurgia simulada. A marcação imuno-histoquímica (marrom) do Mas mostrou-se localizada no citoplasma das células dos glomérulos renais e túbulo proximal e na membrana celular dos cães beagle (Figura 4C).

Efeitos da DSR sobre a ECA2 mRNA renal e expressão proteica (A), concentração de Ang-(1-7) (B) e Mas mRNA e expressão proteica (C) de cães beagle. Os valores estão expressos em média ± EPM. *P < 0,05 versus grupo controle, # P < 0,05 versus grupo cirurgia simulada. ECA2: enzima conversora de angiotensina 2

Discussão

Em nosso estudo, a hipertensão relacionada à obesidade induzida por dieta rica em gordura mostrou-se associada ao aumento de peso corporal, FC, PAS, PAD e PAM, o que corrobora os resultados de estudos anteriores.13 A DSR reduziu efetivamente a PA para PAS, PAD e PAM em aproximadamente 24±9mmHg, 13±6mmHg e 16±7mmHg, respectivamente, no grupo cirurgia após 6 meses de cirurgia. A PAS, PAD e PAM no grupo cirurgia também caíram significativamente quando comparadas ao grupo cirurgia simulada, o que foi semelhante aos achados de estudos clínicos anteriores5,6 e experimentos em animais.14 O estudo Symplicity HTN-1 incluiu 153 pacientes com hipertensão resistente, dos quais 111 consentiram em ser acompanhados por 36 meses. A PAS (-32,0mmHg) e PAD (-14,4mmHg) caíram significativamente.5 O estudo Symplicity HTN-2 randomizou 106 indivíduos portadores de hipertensão resistente, cuja PAS e PAD foram reduzidas em 33 mmHg e 14 mmHg, respectivamente, em 36 meses.6 No entanto, o estudo Symplicity HTN-3 não mostrou redução eficaz da PA em pacientes com hipertensão resistente,9 indicando que apenas uma minoria de pacientes era candidata a DSR.

A NA é um importante indicador da atividade neural simpática, estando elevada em doenças com alta atividade simpática. Tiroch et al.10 relataram que a DSR resultou em redução importante da taxa de liberação de NA, ao passo que Machino et al.11 não observaram nenhuma diferença significativa na NA sistêmica de ratos espontaneamente hipertensos (REH) após DSR. Observamos que a NA plasmática aumentou significativamente em um modelo canino de hipertensão relacionada a obesidade, diminuindo aproximadamente 44% através de DSR. Além disso, a DSR foi eficaz na redução da concentração de NA renal, o que corrobora os resultados de Rimoldi et al.15 Como relatado, a DSR mostrou-se associada a benefícios addicionais16 e à melhoria das funções cardíaca e renal.17,18 Foi, ainda, proposta como tratamento promissor em doenças que cursam com hiperativação simpática.19,20 Neste estudo, determinamos o valor anti-hipertensivo da DSR usando um modelo canino de hipertensão relacionada à obesidade com altos níveis de NA.

O nível de TH renal também se mostrou aumentado na hipertensão relacionada à obesidade neste estudo. Além disso, a DSR reduziu a expressão da proteína TH renal no modelo hipertensivo, o que é substancialmente semelhante a estudos anteriores. A regulação negativa da TH na medula adrenal de REH mostrou-se acompanhada de uma queda importante da NA e da PAS,21 sugerindo que a DSR pode influenciar as concentrações de NA por afetar o nível renal de TH. Por outro lado, neste estudo, os níveis de renalase foram muito menores no modelo canino de hipertensão relacionada à obesidade, sugerindo uma relação inversa com hipertensão semelhante ao observado em estudos anteriores.22 Desir GV observou que a renalase recombinante in vitro ou in vivo reduz a pressão arterial através da degradação da adrenalina plasmática com seu efeito anti-hipertensivo diretamente relacionado à sua atividade enzimática.23 Os níveis plasmático e renal de renalase em REH aumentaram intensamente após DSR em comparação aos dados iniciais e aos dos grupos cirurgia simulada e controle, com redução significativa da PAM,24 o que corrobora este estudo, sugerindo que a DSR pode reduzir as concentrações de NA através da elevação da expressão da renalase renal. A COMT e o TNA são as principais enzimas envolvidas na degradação das catecolaminas, o que está inversamente relacionado à hipertensão. Como foi mostrado em nosso estudo, o nível renal de COMT reduziu significativamente a hipertensão relacionada à obesidade em comparação com o controle grupo, enquanto que a DSR foi ineficaz contra a expressão da COMT e TNA renais. Uma vez que são expressas principalmente nas terminações nervosas, esse dado sugeriu que a COMT e TNA renais podem não ter tido nenhuma alteração significativa após DSR.

O eixo ECA2-Ang-(1-7)-Mas está envolvido na hipertensão. Camundongos transgênicos com superexpressão de hormônio do crescimento mostraram aumento do PAS, alto grau de fibrose cardíaca e renal, e redução acentuada do nível de ECA2-Ang-(1-7)-Mas, sendo que a administração de Ang-(1-7) reduziu a PAS.25 A ativação da via ECA2-Ang-(1-7)-Mas reduz o edema tecidual induzido por privação de oxigênio-glicose. A ativação da via ACE2-Ang-(1-7)-Mas reduz o edema tecidual induzido por privação de oxigênio-glicose, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a morte celular em cérebro de camundongo associada a superprodução de angiotensina II.26 Corroborando o estudo anterior, além da redução da ECA2, também observamos que a concentração renal de Ang-(1-7) e Mas mRNA e a expressão proteica diminuíram na hipertensão relacionada à obesidade. Verificamos primeiramente que a DSR aumentava o eixo ECA2-Ang-(1-7)-Mas renal num modelo canino de hipertensão relacionado à obesidade.

A DSR mostra efeito anti-hipertensivo com redução de NA e ativação do ECA2-Ang-(1-7)-Mas, indicando que isso pode contribuir para o efeito anti-hipertensivo da DSR. No entanto, a relação entre essas duas vias não ficou clara neste estudo. A Ang-(1-7) induz um efeito pré-sináptico facilitatório na neurotransmissão noradrenérgica periférica,27,28 além de ser inibitória no sistema nervoso central através do receptor Mas.29,30 Sugere-se que ECA2-Ang-(1-7)-Mas possa reduzir a concentração de NA para alcançar seu efeito anti-hipertensivo, o que requer a confirmação de estudos futuros.

Porém, este estudo tem limitações. Em primeiro lugar, o número de cães é pequeno, o que pode levar a um viés de resultados. Em segundo lugar, foram detectadas mudanças na NA, enzimas relacionadas à NA e ECA2-Ang-(1-7)-Mas durante o processo, enquanto que a relação entre essas mudanças não está clara. A variação da TH, renalase e ECA2-Ang-(1-7)-Mas renais pode ter afetado o nível de NA para contribuir com o efeito anti-hipertensivo da DSR. Essas limitações deverão ser mais estudadas para esclarecer os possíveis mecanismos da DSR, assim contribuindo para desenvolver e melhorar este novo método de tratamento.

 Conclusões

A questão inicial que motivou nosso estudo foi determinar se seria confirmada a participação da NA e ECA2-Ang-(1-7)-Mas no efeito anti-hipertensivo da DSR. Nosso estudo confirmou que a DSR mostra efeitos anti-hipertensivos com níveis plasmáticos e renais de NA reduzidos, o que pode estar relacionado à redução de TH e aumento de renalase no rim. Além disso, a DSR ativa a via da ECA2-Ang-(1-7)-Mas, o que pode contribuir para o efeito anti-hipertensivo da DSR. Embora a aplicação da DSR não esteja clara devido à sua eficácia variável, nossos dados sugerem que pode ser uma excelente escolha em pacientes portadores de hipertensão relacionada à obesidade com altos níveis de NA e hiperativação do sistema renina-angiotensina.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi patrocinado pela Fundação da Ciência Natural da Província de Hunan, China (10JJ3048), e por Fundos De Pesquisas Fundamentais para as Universidades Centrais da Universidade Centro-Sul (2015zzts123).

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Wei Chen pela Central South University, Changsha - Hunan.