Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC rkWWmL8XLz9nSx49qXW5dqz S0066-782X2017000200154 10.5935/abc.20160205 0066-782X20170050 Original Articles Serotoninergic Modulation of Basal Cardiovascular Responses and Responses Induced by Isotonic Extracellular Volume Expansion in Rats Semionatto Isadora Ferraz 1 Raminelli Adrieli Oliveira 1 Alves Angelica Cristina 1 Capitelli Caroline Santos 1 Chriguer Rosangela Soares 2 Universidade Federal do Triângulo Mineiro Uberaba MG Brazil Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), Uberaba, MG - Brazil Universidade Federal do Triângulo Mineiro Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brazil Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP - Brazil Universidade Federal de São Paulo Mailing Address: Rosangela Soares Chriguer, Rua Silva Jardim, 136. Postla Code 11015-020, Vila Mathias, Santos, SP - Brazil. E-mail: rochriguer@hotmail.com

Author contributions

Conception and design of the research and Statistical analysis: Semionatto IF, Capitelli CS, Chriguer RS; Acquisition of data and Analysis and interpretation of the data: Semionatto IF, Alves AC, Capitelli CS, Chriguer RS; Writing of the manuscript: Semionatto IF, Raminelli AO, Capitelli CS, Chriguer RS; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Capitelli CS, Chriguer RS

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 16 01 2017 02 2017 108 2 154 160 16 06 2016 28 07 2016 19 09 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Isotonic blood volume expansion (BVE) induced alterations of sympathetic and parasympathetic activity in the heart and blood vessels, which can be modulated by serotonergic pathways.

 Objective:

To evaluate the effect of saline or serotonergic agonist (DOI) administration in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) on cardiovascular responses after BVE.

 Methods:

We recorded pulsatile blood pressure through the femoral artery to obtain the mean arterial pressure (MAP), systolic (SBP) and diastolic blood pressure (DBP), heart rate (HR) and the sympathetic-vagal ratio (LF/HF) of Wistar rats before and after they received bilateral microinjections of saline or DOI into the PVN, followed by BVE.

 Results:

No significant differences were observed in the values of the studied variables in the different treatments from the control group. However, when animals are treated with DOI followed by BVE there is a significant increase in relation to the BE control group in all the studied variables: MBP (114.42±7.85 vs 101.34±9.17); SBP (147.23±14.31 vs 129.39±10.70); DBP (98.01 ±4.91 vs 87.31±8.61); HR (421.02±43.32 vs 356.35±41.99); and LF/HF ratio (2.32±0.80 vs 0.27±0.32).

 Discussion:

The present study showed that the induction of isotonic BVE did not promote alterations in MAP, HR and LF/HF ratio. On the other hand, the injection of DOI into PVN of the hypothalamus followed by isotonic BVE resulted in a significant increase of all variables.

 Conclusion:

These results suggest that serotonin induced a neuromodulation in the PVN level, which promotes an inhibition of the baroreflex response to BVE. Therefore, the present study suggests the involvement of the serotonergic system in the modulation of vagal reflex response at PVN in the normotensive rats.

 Keywords: Serotonin Serotonin Agents Rats Hypotalamic Paraventricular Nucleus Arterial Pressure Extracellular Fluid Introduction

Isotonic blood volume expansion (BVE) induces the activation of several areas of the brain that are important in cardiovascular and neuroendocrine adjustments.1,2 BVE activates baroreflex, which promotes hypotension and bradycardia through the excitation of two neural pathways. Hypotension involves excitatory projections of the nucleus of the solitary tract (NST) to the caudal ventrolateral area of the medulla oblongata, and when activated, promotes inhibition of the rostral ventrolateral area of the medulla oblongata, sympathetic-inhibitory pathway, which results in the decrease of sympathetic tone to the heart, reduction of total peripheral resistance, and increase of venous capacitance. Bradycardia involves an excitatory projection of the NST to parasympathetic preganglionic neurons in the dorsal motor nucleus of the vagus and nucleus ambiguous, leading to an increase of vagal efferent in the heart.3,4

BVE also promotes an increase in the plasma concentrations of oxytocin (Oxt), mainly synthesized in the paraventricular nucleus (PVN) and in the supraoptic nucleus of the hypothalamus (SON).4 Evidence that Oxt acts as an important neuromodulator of the autonomic control of the circulation stemmed from studies in which projections of the PVN to the NST were observed and reinforced by the observation that manipulations in PVN's oxytocinergic system resulted in deep alterations in cardiovascular responses to stress and peptidergic stimuli.5-8

The participation of serotonergic mechanisms (5-HT) in PVN responses has also been studied, especially 5-HT action on 5-HT1A and 5-HT2A receptors. Authors have demonstrated the presence of 5-HT1A and 5-HT2A receptors and their respective mRNA in PVN. Moreover, researchers have verified the co-expression of 5-HT1A and 5-HT2A receptors in PVN regions, and a sub-population of these neurons presented double marking, 5-HT2A/Oxt, showing evidence of 5-HT participation in the activation of these receptors in PVN.9,10 Raphe dorsal nucleus afference to PVN regions and the significant density of 5-HT receptors in these hypothalamic nuclei have been described by several authors, and these results show that neuroendocrine responses to volume alterations may be modulated by 5-HT activating 5-HT1A and/or 5-HT2A receptors in the PVN.11,12

Based on the neuro-anatomical evidence of PVN oxytocinergic projections to NST and in works that have demonstrated serotonin neuromodulation over Oxt secretion, which is increased during isotonic BVE, we aim to evaluate serotonergic neuromodulation over 5-HT2 receptors in cardiovascular responses of the PVN in basal conditions or induced by BVE.

 Methods Animals

Thirteen male Wistar rats, weighing between 250-300 g in the beginning of the experiments were obtained and kept in the vivarium Biotério da Disciplina de Fisiologia at the University Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), acclimatized to the controlled room temperature of 23 ± 2°C, with a light-dark cycle of 12h (light - 7 a.m. to 7 p.m.), with food and water ad libitum. These animals were divided into two groups: Control (N=8), and DOI (N=5). All experiments were done between 8 a.m. and 1 p.m., and were previously approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation (CEUAUFTM) under protocol number 273.

 Habituation of the animals to experimental procedures

To decrease the influence of stress promoting factors at the time of experiments, the rats were handled daily and trained, for seven days, with the maneuvers used in the experimental protocol, such as: cleaning of the cannula and soft massage in the supra-pubic region for at least one week before the experiment.

 Experimental protocol Cannulas in the PVN

The rats were anaesthetized with tribromoethanol (150mg/kg) and fixed to a stereotaxic device (Insight Equipamentos - model ETX3/99, São Paulo, Brazil). Two anthropometric points of the skull - bregma (union point of sagittal and coronal sutures) and lambda (union point of sagittal and lambdoid sutures) - were used as a reference to level the animals' heads in the horizontal plane. The the bregma, we determined the points for the bilateral introduction of the cannula in the rats's PVN. In these points, we made trepanations of the skull bones with a spherical drill, by opening two orifices of approximately 1.5 mm in diameter. In the PVN, stainless steel cannulas (12 x 0.55 mm d.i) were bilaterally positioned in the brain per the coordinates: 1.2 mm caudal to bregma; 0.5 mm lateral to the median line; and 5.0 mm under the dura-meter, according to the coordinates from the Atlas by Paxinos and Watson.13 The cannulas were positioned 2 mm above the PVN, and fixed to the skull with screws and acrylic dental resin. Metal chucks (0.3 mm d.i) were used to obliterate the cannulas. The rats received prophylactic injections of penicillin (20,000 units, i.m.). During the six days of recovery, before cannulation of the veins and femoral arteries, the rats were handled and trained daily for the procedure and cleaning of the chucks to reduce possible influences of stress responses due to animal manipulation.

 Cannulation of femoral veins and arteries

For the cardiovascular record of the conscious animals, on the day before the experiment, the animals were anaesthetized with tribromoethanol (150 mg/kg) for the implantation of polyethylene catheters (PE-50 and PE-10) in the abdominal aorta through the femoral artery to record the BP, and in the femoral vein to perform the BVE. After implantation, the cannulas were properly filled with a physiological solution and subcutaneously exteriorized in the posterior region of the neck. Before starting to record, the cannulas were heparinized (heparin 2% in physiological solution) to avoid the formation of clots.

 Cardiovascular records

After 24 hours of surgical recovery, the cannulas were washed with heparinized saline solution (0.1 mL of heparin sodium 25000 UI, Liquemine®, Roche, Rio de Janeiro, Brazil, dissolved in 20 mL of saline 0.9%). The arterial catheter was connected to a PA transducer (P23Db, Gould-Statham), and the signs of pulsatile BP were recorded in basal conditions for 30 minutes, and the signal was converted by an analogue-digital board (CODAS, with a sample frequency - 4 kHz, Di220 Dataq Instruments, Inc., Akron, OH, USA). During the experimental procedure, MBP and HR were derived from the pulsatile BP. During the recording, the animals stayed in a room with noise control, at a temperature of 27°C. After positioning of the animals and connection to the equipment, there was a 15-minute adaptation period before recording began. After adaptation of the animals and adequation of signal caption, we began the continuous recording of pulsatile BP for 30 minutes to obtain basal values of BP and HR.

 Microinjections of saline or drug in the brain

Thirty minutes after recording began, saline (1.0 µg/200 ηL; n=8 animals) or serotoninergic dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochloride (DOI - 1.0 µg/200 ηL; n=5 animals) dissolved in physiological saline solution were bilaterally injected in the PVN of the rats using a Hamilton syringe (5 µL) connected by a PE-10 polyethylene tube to an injection needle introduced into the brain by the guide cannula, previously fixed to the brain. During and after the intracerebroventricular microinjections, animal records were done in a period of 30 minutes.

 Blood volume expansion (BVE)

Sixty minutes after beginning the recording, some animals underwent BVE, performed through intravenous infusion (femoral vein) of isotonic NaCL (0.15 M) in a volume of 2 ml/100 g of body weight during 60 seconds. During and after BVE, animal records were done in a 15-minute period.

 Recording of pulsatile BP

On the day of the experiment, between 8 and 9 a.m., the animals were weighed and the arterial cannula was connected to a pressure transducer; basal pulsatile BP was recorded for 30 minutes. After this period, the animals received microinjections of DOI in the PVN (1.0 µg/200 ηL; n=5 animals) or the same volume of vehicle (isotonic saline; n=8 animals). After 30 minutes, the animals underwent isotonic BVE (NaCl 0.15 M/ 2 ml100 g weight), and the pressure was continuously recorded for another 15 minutes (Figure 1) (supplementary figure). After 75 minutes of recording, the animals were euthanized with thiopental sodium (100 mg/Kg) and their brains were removed and fixed in 10% formalin for a few days. Cross sections (40 µm thick) were done in the points of PVN injection with a freezing microtome (MICROM, model HM 5000 M). Histologic sections, assembled onto slides, were stained by the Nissl method and analysed for PVN injection points according to the Atlas by Paxinos and Watson.13

Representative scheme of the seven days of experimental protocol of the groups Control and Serotoninergic Agonist (DOI). PVN: paraventricular nuclei of the hypothalamus; BP, pulsatile BP; HR, BVE HR, extracellular volume expansion with isotonic saline (supplementary figure).

Study of the variability of BP and HR

Pulsatile BP was processed by a specific software that determined, beat-by-beat, SBP and HR values. HR, SBP, and DBP variability was also evaluated in the frequency domain, with the autoregressive spectral analysis method.14,15

Pulse Intervals (IP), SBP, and DBP time series, collected during 30 basal minutes, were divided into serial segments of 300 beats, and all successive segments overlapped in 50% with the previous segment (Welch method). Using stationary segments of the time series, autoregressive parameters were estimated through the Levinson-Durbin method, and the model order was chosen according to Akaike's criterion.15 After that, over each individual stationary segment of 300 beats, spectral decomposition was done. Normalization of values minimizes interference of the total potency over the components; normalization procedure was done by diving the potency of the low frequency component (LF - 0,15-0,4 Hz) or the high frequency component (HF - 0,04-0,15 Hz) by the total spectral potency, from which we subtracted the potency of the very low frequency band (VLF - 0,01-0,20 Hz), and then multiplied the result by 100.15 Spectral parameters obtained for each individual stationary segment of 300 beats were measured, and mean result values for the 30 basal minutes were collected for each animal. Quotient between LF and HF (LF/HF ratio) was used to express the sympathetic-vagal balance.16

Statistical analysis

Statistical analysis was done through the software R, version 3.3.0. The obtained results were presented as mean ± standard deviation of the mean. To confirm that all continuous variables were normally distributed, we used the Kolmogorov-Smirnov test, and afterwards, to evaluate the effects of groups and evaluations in relation to SBP, DBP, MBP, HR, and LF/HF variables we used the two-way ANOVA with measurements, and Bonferroni's method of multiple comparisons. Significance level was set at 5%.

 Results

Table 1 shows the results (mean ± standard deviation of the mean) of the cardiovascular variables of the control group animals (C) and of the DOI group animals (D). No significant differences were observed in the control group between the values obtained in basal period (Cb), after microinjection with saline (Cm), and saline followed by isotonic BVE (Ce) in the variables MBP, SBP, and DBP. DOI microinjection (Dm) and DOI followed by BVE (De) significantly increased MBP (Figure 2), SBP, and DBP in relation to the control group (Ce) (114.42±7.85 vs 101.34±9.17; 147.23±14.31 vs 129.39±10.70; and 98.01±4.91 vs 87.31±8.61, respectively).

Mean values (± standard deviation of the mean) of mean blood pressure (MBP), systolic blood pressure (SBP), and diastolic blood pressure (DBP), heart rate (HR), low frequency component (LF), and high frequency component (HF) of the animals of the basal control groups (Cb), post saline microinjection in the paraventricular nuclei of the hypothalamus (Cm), control after expansion of the extracellular volume (Ce), and those treated with DOI, in the basal state (Db), after DOI microinjection in the paraventricular nuclei of the hypothalamus (Dm), and after expansion of the extracellular volume (De)
Variables Cb Cm Ce Db Dm De
MBP (mmHg) 100.83 ± 7.98 99.79 ± 7.24 101.34 ± 9.17 105.65 ± 2.25 108.79 ± 9.31 114.42 ± 7.85# ɤ
SBP (mmHg) 130.28 ± 7.62 129.66 ± 6.49 129.39 ± 10.70 136.05 ± 2.74 141.11 ± 14.95 147.23 ± 14.31&*
DBP (mmHg) 86.10 ± 8.53 84.86 ± 7.97 87.31 ± 8.61 90.46 ± 3.63 92.63 ± 6.50 98.01 ± 4.91+ %
HR (bpm)) 354.14 ± 29.53 356.14 ± 32.09 356.35 ± 41.99 399.40 ± 25.09$ 405.08 ± 41.09α 421.02 ± 43.32β
LF/HF ratio 0.36 ± 0.20 0.55 ± 0.22 0.27 ± 0.32 0.67 ± 0.68 2.45 ± 0.82** 2.32 ± 0.80##

p=0.018 vs MBP Ce;

p=0.016 vs MBP Db;

p=0.010 vs SBP Ce;

p=0.035 vs SBP Db;

p=0.047 vs DBP Ce;

p=0.022 vs DBP Db;

p=0.034 vs HR Cb;

p=0.033 vs HR Cm;

p=0.010 vs HR Ce;

p=0.001 vs LF/HF ratio Cm and Db;

p=0.001 vs LF/HF Ce eDb.

Mean values (± standard deviation of the mean) of the MBP of the basal control group animals (Cb), control after microinjection of saline (Cm), control after extracellular volume expansion (Ce) and those treated with DOI, in the basal state (Db), after DOI microinjection (Dm), and after extracellular volume expansion (De). #p=0.018 vs MBP Ce; ɤp=0.016 vs MBP Db.

Animals in the control group presented significant difference in basal HR values (Cb), with microinjection of saline (Cm) and saline followed by BVE, in relation the DOI group with the same treatments (Db, Dm, and De) (354.14±29.53 vs 399.40±25.09; 356.14±32.09 vs 405.08±41.09 and 356.35±41.99 vs 421.02±43.32, respectively). DOI microinjection (Dm), and DOI followed by BVE (De), increased the LF/HF ratio in relation to control animals who received saline microinjection (Cm) and saline followed by isotonic BVE (Ce) (2.45±0.82 vs 0.55±0.22 and 2.32±0.80 vs 0.27±0.32, respectively).

All p values obtained from statistical analysis of the studied variables are depicted in Table 2 (supplementary data).

p values obtained after comparisons between the groups Control (n=8) and DOI (dimethoxy-4-iodoamphetamine) (n=5) of the studies variables: mean blood pressure (MBP), systolic blood pressure (SBP), and diastolic blood pressure (DBP), heart rate (HR), low frequency component (LF), and high frequency component (HF) of the animals of the basal control groups (Cb), post saline microinjection in the paraventricular nuclei of the hypothalamus (Cm), control after expansion of the extracellular volume (Ce), and those treated with DOI, in the basal state (Db), after DOI microinjection in the paraventricular nuclei of the hypothalamus (Dm), and after expansion of the extracellular volume (De). Variance analysis with repeated measurements and Bonferroni’s multiple comparison method were employed in this study. Significance level was set at p<0.05
Comparisons MBP SBP DBP HR LF/HF
Cb vs Cm 0.827 0.937 0.568 0.987 0.704
Cb vsCe 0.828 0.930 0.568 0.988 0.755
Cm vs Ce 0.820 0.934 0.560 0.980 0.704
Db vs Dm 0.293 0.234 0.418 0.730 0.001
Db vs De 0.016 0.035 0.022 0.503 0.001
Dm vs De 0.096 0.230 0.075 0.500 0.711
Cb vs Db 0.287 0.316 0.308 0.034 0.290
Cm vs Dm 0.077 0.076 0.110 0.033 0.001
Ce vs De 0.018 0.010 0.047 0.010 0.001
Discussion

Our study showed that isotonic BVE did not promote alterations in MBP, SBP, and DBP, or in HR and sympathetic-vagal ratio (LF/HF). As previously shown by other authors, acute BVE induces a series of hemodynamic events, including an increase in central venous pressure, right atrial pressure, central and peripheral blood volume, cardiac debit, and systolic volume. On the other hand, HR decreases significantly, and total peripheral resistance decreases slightly during volume overload, while MBP remains unaltered.17 These findings differ from those obtained by Godino et al., 2005, who performed BVE through infusion of a great intra atrial volume for one minute and observed a reduction not only in HR, but also in MBP. This hypotension can be mediated by a quick and pronounced release of oxytocin and atrial natriuretic peptide, which have a diuretic and vasodilatory effect.18 Moreover, these peptides are involved in the baroreflex control of the HR, facilitating vagal response in the increase of reflex bradycardia during baroreceptor discharge.19-23

In the present work, the animals who received intracerebroventricular microinjection of the serotonergic agonist DOI in the PVN, followed by BVE, presented a significant increase in MBP, SBP, DBP, HR, and LF/HF, suggesting that the serotonergic agonist DOI leads to the inhibition of Oxt secretion as a response to BVE, when it is bilaterally microinjected into the PVN, or even that is exerts a neuromodulation in the PVN level, which then promotes an inhibition in the baroreflex response to BVE.

Intravenous administration of 8-OHDPAT (5-HT1A receptor agonist) or DOI (5-HT2A receptor agonist) promotes an increase in plasma concentrations of Oxt. Both responses are significantly attenuated when the animals receive intravenous pre-treatment with antagonists of these receptor, suggesting that this increase occurs by the serotoninergic activation of these receptors, instead of stimulation by interneurons.11,12,24,25 5-HT2A receptors stimulation in the central nervous system can induce an increase in BP, partly through the increase in vasoconstrictor sympathetic activity due to sympathetic premotor neuron activation in the rostral ventrolateral medulla oblongata, and also through vasopressin release.26

PVN is reciprocally connected to several other areas of the brain involved in the cardiovascular function control.27 PVN also contains pre-autonomic neurons, which directly and indirectly project to sympathetic preganglionic neurons inside the spinal cord mediolateral cell column, via the rostral ventrolateral medulla oblongata.28

Several studies have reported the contribution of PVN parvocellular neurons in the compensatory autonomic response during physical training for volume overload, suggesting that the volume overload stimulates vagal cardiac receptors, especially by the activation of PVN parvocellular neurons, which successively induces the inhibition of the sympathetic nervous activity.29-35 Several works have suggested that the increase in neuron activity in the PVN is associated to sympathetic excitation during cardiac collapse.36-38 Moreover, some works have found that an altered GABAergic mechanism in the PVN may be involved in the regulation of the sympathetic afferent in the cardiac collapse, and that alterations in the inhibitory mechanism can contribute to an increase in sympathetic activity.39-40

This is the first study to explore serotoninergic neuromodulation via 5-HT2A receptors in the PVN level about cardiovascular responses to isotonic BVE, which proved to be inhibitory. However, it is noteworthy that further, more in depth studies are necessary to check if this neuromodulation directly affects sympathetic and/or baroreflex activity or if it is accompanied by neuroendocrine alterations, especially concerning Oxt, arginine, vasopressin, and atrial natriuretic peptide secretion.

 Conclusion

The present work provides evidence that serotonin performs neuromodulation in the PVN level, which promotes an inhibition of the baroreflex response to BVE. Thus, this work suggests the serotoninergic involvement in the neuromodulation in the PVN level in the vagal reflex response in normotensive rats.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

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Right atrial stretch induces renal nerve inhibition and c-fos expression in parvocellular neurones of the paraventricular nucleus in rats. Exp Physiol. 2002;87(1):25-32. Pyner S Deering J Coote JH Right atrial stretch induces renal nerve inhibition and c-fos expression in parvocellular neurones of the paraventricular nucleus in rats Exp Physiol 2002 87 1 25 32 35 Higa KT, Mori E, Viana FF, Morris M, Michelini LC. Baroreflex control of heart rate by oxytocin in the solitary-vagal complex. Am J Physiol. 2002;282(2):R537-45. Higa KT Mori E Viana FF Morris M Michelini LC Baroreflex control of heart rate by oxytocin in the solitary-vagal complex Am J Physiol 2002 282 2 R537 R545 36 Patel KP, Zhang PL, Krukoff TL. Alterations in brain hexokinase activity associated with heart failure in rats. Am J Physiol. 1993;265(4 Pt 2):R923-8. 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Hassan Z Sattar MZ Suhaimi FW Yusoff NH Abdulla MH Yusof AP Blunted endogenous GABA-mediated inhibition in the hypothalamic paraventricular nucleus of rats with streptozotocin-induced diabetes Acta Neurologica Belgica 2013 113 3 319 325 Artigos Originais Modulação Serotoninérgica de Respostas Cardiovasculares Basais e Induzidas pela Expansão Isotônica do Volume Extracelular em Ratos Semionatto Isadora Ferraz 1 Raminelli Adrieli Oliveira 1 Alves Angelica Cristina 1 Capitelli Caroline Santos 1 Chriguer Rosangela Soares 2 Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), Uberaba, MG - Brasil Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, SP - Brasil Correspondência: Rosangela Soares Chriguer, Rua Silva Jardim, 136. CEP 11015-020, Vila Mathias, Santos, SP - Brasil. E-mail: rochriguer@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Análise estatística: Semionatto IF, Capitelli CS, Chriguer RS; Obtenção de dados e Análise e interpretação dos dados: Semionatto IF, Alves AC, Capitelli CS, Chriguer RS; Redação do manuscrito: Semionatto IF, Raminelli AO, Capitelli CS, Chriguer RS; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Capitelli CS, Chriguer RS.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Expansão de volume extracelular (EVEC) promove alterações da atividade simpática e parassimpática no coração e vasos sanguíneos, os quais podem ser moduladas por vias serotoninérgicas.

 Objetivo:

Avaliar o efeito da administração de salina ou agonista serotoninérgico (DOI) nos núcleos paraventriculares hipotalâmico (NPV) sobre respostas cardiovasculares após EVEC.

 Métodos:

Foram obtidos registros da pressão arterial pulsátil, por meio da artéria femoral, para obtenção dos valores da pressão arterial média (PAM), sistólica (PAS), diastólica (PAD), frequência cardíaca (FC) e razão simpático-vagal (LF/HF) de ratos Wistar antes e após receberem microinjeções bilaterais no NPV de salina ou DOI seguida de EVEC.

 Resultados:

Não foram observadas diferenças significativas dos valores das variáveis estudadas nos diferentes tratamentos do grupo controle. Entretanto, quando os animais são tratados com DOI seguida de EVEC ocorre aumento significativo em relação ao grupo controle com EVEC em todas as variáveis estudadas: PAM (114,42±7,85 vs 101,34±9,17), PAS (147,23±14,31 vs 129,39±10,70), PAD (98,01 ±4,91 vs 87,31±8,61), FC (421,02±43,32 vs 356,35±41,99) e LF/HF (2,32±0,80 vs 0,27±0,32).

 Discussão:

O presente estudo mostrou que a indução de EVEC isotônica não promoveu alterações na PAM, PAD, PAS, FC e LF/HF. Por outro lado, os animais que receberam microinjeção de DOI no NPV seguida de EVEC apresentaram aumento significativo de todas as variáveis.

 Conclusão:

Esses resultados sugerem que a serotonina exerce uma neuromodulação em nivel do NPV, e essa promove uma inibição da resposta barorreflexa frente à EVEC. Assim, o presente trabalho sugere o envolvimento serotoninérgico na neuromodulação no nivel do NPV na resposta reflexa vagal em ratos normotensos.

 Palavras-chave: Serotoninérgicos Serotonina Ratos Núcleo Paraventricular do Hipotálamo Pressão Arterial Líquido Extracelular Introdução

A expansão de volume extracelular (EVEC) induz a ativação de várias áreas cerebrais importantes nos ajustes cardiovasculares e neuroendócrinos.1,2 A EVEC ativa o barorreflexo, o qual promove hipotensão e bradicardia através da excitação de duas vias neurais. A hipotensão envolve projeções excitatórias do núcleo do trato solitário (NTS) para a área ventrolateral caudal da medula oblonga, e quando ativada, promove inibição da área ventrolateral rostral da medula oblonga, via simpato-inibitória, a qual resulta na diminuição do tônus simpático para o coração, redução da resistência periférica total e aumento da capacitância venosa. A bradicardia envolve uma projeção excitatória do NTS para os neurônios pré-ganglionares parassimpáticos no núcleo motor dorsal do vago e núcleo ambíguo, resultando em aumento de eferentes vagais para o coração.3,4

A EVEC também promove aumento das concentrações plasmáticas de ocitocina (OT), sintetizado principalmente nos núcleos paraventriculares (NPV) e supraóptico do hipotálamo (NSO).4 Evidências de que a OT age como um importante neuromodulador do controle autonômico da circulação surgiram a partir de estudos nos quais foram observadas projeções do NPV para o NTS, que foi reforçada pela observação de que manipulações no sistema ocitocinérgico do NPV resultavam em profundas alterações das respostas cardiovasculares em relação a estímulos estressores e peptidérgicos.5-8

A participação de mecanismos serotoninérgicos (5-HT) nas respostas do NPV também tem sido estudada, principalmente sobre a ação de 5-HT em receptores 5-HT1A e 5-HT2A. Autores demonstraram a presença de receptores 5-HT1A e 5-HT2A e seus respectivos RNAm no NPV. Adicionalmente, verificou-se a co-expressão de receptores 5-HT1A e 5-HT2A nas regiões do NPV, e uma sub-população desses neurônios apresentou dupla marcação, 5-HT2A/OT, demonstrando evidência da participação de 5-HT na ativação desses receptores no NPV.9,10 Aferências do núcleo dorsal da rafe para regiões do NPV e significativa densidade de receptores 5-HT nesses núcleos hipotalâmicos têm sido descritas por vários autores e esses resultados evidenciam que respostas neuroendócrinas frente à alteração de volume podem ser moduladas por 5-HT ativando receptores 5-HT1A e/ou 5-HT2A no NPV.11,12

Com base nas evidências neuro-anatômicas de projeções ocitocinérgicas do NPV para o NTS e em trabalhos que têm demonstrado a neuromodulação da serotonina sobre a secreção de OT, estando esta aumentada durante a EVEC isotônica, objetivamos avaliar a neuromodulação serotoninérgica, sobre receptores 5-HT2, nas respostas cardiovasculares do NPV em condições basais ou induzidas por EVEC.

 Métodos Animais

Treze Ratos Wistar machos pesando 250-300g no início dos experimentos foram obtidos e mantidos no Biotério da Disciplina de Fisiologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), aclimatados à temperatura ambiental controlada (23 ± 2ºC), em regime de luz com ciclo claro-escuro de 12h (luz 7:00-19:00 h) com ração e água "ad libitum". Esses animais foram divididos em dois grupos: Controle (N=8) e DOI (N=5). Todos os experimentos foram realizados entre 8:00 e 13:00 h. Todos os experimentos foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA/UFTM) sob o número de protocolo 273.

 Habituação dos animais aos procedimentos experimentais

Para diminuir a influência de fatores que promovam o estresse no momento dos experimentos, os ratos foram diariamente manipulados e treinados, durante sete dias, com as manobras utilizadas no protocolo experimental tais como: limpeza da cânula e leve massagem na região supra-púbica por pelo menos uma semana antes do experimento.

 Protocolo experimental Cânulas no NPV

Os ratos foram anestesiados com tribromoetanol (150 mg/kg) e fixados a um aparelho estereotáxico (Insight Equipamentos - modelo ETX3/99, SP, Brasil). Dois pontos antropométricos do crânio - o bregma (ponto de união das suturas sagital e coronal) e o lâmbda (ponto de união das suturas sagital e lambdóide) - foram utilizados como referência para nivelar a cabeça dos animais no plano horizontal. Utilizando-se o bregma, foram determinados os pontos de introdução das cânulas bilateralmente no NPV dos ratos. Nesses pontos, foram feitas trepanações dos ossos do crânio com uma broca esférica, abrindo-se dois orifícios de aproximadamente 1,5 mm de diâmetro. No NPV, cânulas de aço inoxidável (12 x 0.55 mm d.i) foram posicionadas bilateralmente no cérebro conforme as coordenadas: 1,2 mm caudal ao bregma, 0,5 mm lateral à linha mediana e 5,0 mm abaixo da dura-máter de acordo com as coordenadas do Atlas de Paxinos e Watson.13 As cânulas foram posicionadas 2 mm acima do NPV e fixadas ao crânio usando-se parafusos e resina acrílica dental. Mandris metálicos (0,3 mm d.i) foram utilizados para obliteração das cânulas. Os ratos receberam injeções profiláticas de penicilina (20.000 unidades, intramuscular). Durante os seis dias de recuperação dos animais, previamente à canulação das veias e artéria femorais, os ratos foram manipulados e treinados diariamente para o procedimento e limpeza do mandril visando reduzir as possíveis influências de respostas estressoras decorrentes da manipulação animal.

 Canulação da artéria e veia femorais

Para o registro cardiovascular dos animais acordados, no dia que antecedeu ao experimento, os animais foram submetidos à anestesia com tribromoetanol (150 mg/kg) para implantação de cateteres de polietileno (PE-50 e PE-10) na aorta abdominal através da artéria femoral, para registro da PA e na veia femural para a realização da EVEC. Após o implante, as cânulas foram devidamente preenchidas com solução fisiológica e exteriorizadas subcutaneamente na região posterior do pescoço. Antes do início dos registros, as cânulas foram heparinizadas (heparina 2% em solução fisiológica) para evitar a formação de coágulos.

 Registros cardiovasculares

Após 24 horas de recuperação cirúrgica, as cânulas foram lavadas com solução de salina heparinizada (0,1 mL de heparina sódica 25000UI, Liquemine®, Roche, RJ, Brasil, dissolvida em 20 mL de salina 0,9 %). O cateter arterial foi conectado a um transdutor de PA (P23Db, Gould-Statham), e os sinais da PA pulsatil foram gravados em condições basais por um período de trinta minutos, e o sinal foi convertido por placa análogo-digital (CODAS, com frequência de amostragem - 4-kHz, Di220 Dataq Instruments, Inc., Akron, OH, USA). Durante o procedimento experimental, a PAM e a FC foram derivadas da PA pulsátil. Durante o registro, os animais permaneceram em uma sala, com controle de ruído, a uma temperatura de 27ºC. Após o posicionamento dos animais e conexão ao equipamento, eles passaram por um período de adaptação de 15 minutos para, em seguida, realizarem os registros. Após o período de adaptação do animal e adequação da captação do sinal, iniciou-se o registro contínuo da PA pulsátil por 30 minutos para obtenção dos valores basais da PA e FC.

 Microinjeções de salina ou fármaco no cérebro

Trinta minutos após o início dos registros, salina (1,0 µg/200 ηL; n=8 animais) ou agonista hidrocloreto de dimetoxi-4-iodoanfetamina (DOI - 1,0 µg/200 ηL; n=5 animais) serotoninérgico (5-HT2) dissolvidos em solução salina fisiológica foram injetados bilateralmente no NPV dos ratos utilizando-se uma seringa Hamilton (5 µL) conectada por um tubo de polietileno PE-10 a uma agulha injetora introduzida no cérebro pela cânula guia previamente fixada ao cérebro. A cânula injetora (0,3 mm d.i.) era 2,0 mm mais longa do que a cânula guia. Durante e após as microinjeções intracerebroventriculares, os registros dos animais foram realizados em um período de trinta minutos.

 Expansão de volume extracelular (EVEC)

Sessenta minutos após o início dos registros, os animais foram submetidos ou não à EVEC realizada por meio da infusão intravenosa (veia femural) de solução de NaCl isotônica (0,15 M) em volume de 2 ml/100 g de peso corporal durante 60 segundos. Durante e após a EVEC, os registros dos animais foram realizados em um período de quinze minutos.

 Registro da PA pulsátil

No dia do experimento, entre oito e nove da manhã, os animais foram pesados e a cânula arterial conectada a um transdutor de pressão; a PA pulsátil basal foi registrada durante 30 minutos. Decorrido esse período, os animais receberam microinjeções no NPV de DOI (1,0 µg/200 ηL; n=5 animais) ou mesmo volume de veículo (salina isotônica; n=8 animais). Após 30 minutos, os animais foram submetidos à EVEC isotônica (NaCl 0,15 M; 2 ml/100 g de peso), e a pressão foi continuamente registrada por mais 15 minutos (Figura 1). Concluídos setenta e cinco minutos de registro, os animais foram eutanasiados com tiopental sódico (100 mg/Kg), e o cérebro de cada um removido e fixado em formalina 10% por alguns dias. Cortes transversais (40 µm de espessura) foram realizados nos pontos de injeção do NPV com o auxílio de um micrótomo de congelamento (MICROM, modelo HM 5000 M). Os cortes histológicos, montados em lâminas, foram corados pelo Método Nissl e analisados quanto aos pontos das injeções no NPV de acordo com o Atlas de Paxinos e Watson.13

Esquema representativo dos sete dias do protocolo experimental dos grupos Controle e Agonista Serotoninérgico (DOI). NPV, núcleos paraventriculares do hipotálamo; PA, PA pulsátil; FC, FC EVEC, expansão de volume extracelular com salina isotônica.

Estudo da variabilidade da PA e da FC

A PA pulsátil foi processada por um software específico que determina, batimento-a-batimento, valores da PAS e FC. A variabilidade da FC, PAS e PAD foi também avaliada no domínio da frequência, empregando-se o método de análise espectral autorregressivo.14,15

Séries temporais de Intervalos de Pulso, PAS e PAD, coletadas durante os 30 minutos basais, foram divididas em segmentos seriados de 300 batimentos, sendo que todo segmento sucessivo sobrepunha-se em 50% ao segmento anterior (método de Welch). Usando-se segmentos estacionários das séries temporais, parâmetros autorregressivos foram estimados por meio do método de Levinson-Durbin, e a ordem do modelo foi escolhida de acordo com o critério de Akaike.15 Em seguida, sobre cada segmento estacionário individual de 300 batimentos, a decomposição espectral foi realizada. A normalização dos valores minimiza a interferência da potência total sobre os componentes, o procedimento de normalização foi realizado pela divisão da potência do componente de baixa frequência (low frequency - LF; 0,15-0.4 Hz) ou de alta frequência (high frequency - HF; 0.04 -0,15 Hz) pela potência espectral total, da qual se subtraiu a potência da banda de muito baixa frequência (very low frequency - VLF, 0.01-0.20 Hz) multiplicando-se o resultado por 100.15 Os parâmetros espectrais obtidos para cada segmento estacionário individual de 300 batimentos foram medidos, e valores médios resultantes para os 30 minutos basais foram coletados para cada animal. O quociente entre LF e HF (razão LF/HF) foi utilizado para expressar o balanço simpato-vagal.16

Análise estatística

A análise estatística foi realizada pelo software R versão 3.3.0. Os resultados obtidos foram apresentados como média ± desvio padrão da média. Para confirmar que todas as variáveis ​​contínuas eram normalmente distribuídas, utilizamos o teste de Kolmogorov- Smirnov e, posteriormente, para avaliar o efeito dos grupos e avaliações em relação às variáveis PAS, PAD, PAM, FC e LF/HF, foi empregado o modelo de análise de variância (ANOVA) de duas vias com medidas e o método de comparações múltiplas de Bonferroni. O nível de significância estatística adotado foi de 5%.

 Resultados

A Tabela 1 apresenta os resultados (média ± desvio padrão da média) das variáveis cardiovascular dos animais do grupo controle (C) e do grupo DOI (D). Não foram observadas diferenças significantes no grupo controle entre os valores obtidos no período basal (Cb), após microinjeção com salina (Cm) e esta seguida de EVEC isotônica (Ce) em todas as variáveis investigadas. Os animais do grupo DOI basal (Db) não apresentaram diferença significativa em relação aos animais do grupo controle após microinjeção com salina (Cm) e esta seguida da EVEC isotônica (Ce) nas variáveis PAM, PAS, PAD. A microinjeção de DOI (Dm) e esta seguida de EVEC (De) promoveu aumento significativo na LF/HF em relação ao mesmo grupo em condições basais (Db) (2,45±0,82 vs 0,67±0,68 e 2,45±0,82 vs 0,67±0,68, respectivamente). A microinjeção de DOI seguida de EVEC (De) aumentou, significativamente, a PAM (Figura 2), PAS e PAD em relação ao grupo controle (Ce) (114,42±7,85 vs 101,34±9,17; 147,23±14,31 vs 129,39±10,70 e 98,01±4,91 vs 87,31±8,61, respectivamente).

Valores médios (± desvio padrão da média) das pressões arteriais média (PAM), sistólica (PAS) e diastólica (PAD), frequência cardíaca (FC), componente de baixa frequência (LF) e componente de alta frequência (HF) dos animais dos grupos controle basal (Cb), controle após microinjeção de salina nos núcleos paraventriculares do hipotálamo (Cm), controle após expansão de volume extracelular (Ce) e dos tratados com DOI, no estado basal (Db), após microinjeção de DOI nos núcleos paraventriculares do hipotálamo (Dm) e posterior à expansão do volume extracelular (De)
Variáveis Cb Cm Ce Db Dm De
PAM (mmHg) 100,83 ± 7,98 99,79 ± 7,24 101,34 ± 9,17 105,65 ± 2,25 108,79 ± 9,31 114,42 ± 7,85# ɤ
PAS (mmHg) 130,28 ± 7,62 129,66 ± 6,49 129,39 ± 10,70 136,05 ± 2,74 141,11 ± 14,95 147,23 ± 14,31&*
PAD (mmHg) 86,10 ± 8,53 84,86 ± 7,97 87,31 ± 8,61 90,46 ± 3,63 92,63 ± 6,50 98,01 ± 4,91+ %
FC (bpm)) 354,14 ± 29,53 356,14 ± 32,09 356,35 ± 41,99 399,40 ± 25,09$ 405,08 ± 41,09α 421,02 ± 43,32β
Razão LF/HF 0,36 ± 0,20 0,55 ± 0,22 0,27 ± 0,32 0,67 ± 0,68 2,45 ± 0,82** 2,32 ± 0,80##

p=0,018 vs PAM Ce;

p=0,016 vs PAM Db;

p=0,010 vs PAS Ce;

p=0,035 vs PAS Db;

p=0,047 vs PAD Ce;

p=0,022 vs PAD Db;

p=0,034 vs FC Cb;

p=0,033 vs FC Cm;

p=0,010 vs FC Ce;

p=0.001 vs razão LF/HF Cm e Db;

p=0,001 vs LF/HF Ce eDb.

Valores médios (± desvio padrão da média) da pressão arterial média (PAM) dos animais dos grupos controle basal (Cb), controle após microinjeção de salina (Cm), controle após expansão de volume extracelular (Ce) e dos tratados com DOI, no estado basal (Db), após microinjeção de DOI (Dm), e posterior à expansão do volume extracelular (De). #p=0,018 vs PAM Ce; ɤp=0,016 vs PAM Db.

Os animais do grupo controle apresentaram diferença significativa nos valores da FC basal (Cb), com microinjeção de salina (Cm) e esta seguida de EVEC, em relação ao Grupo DOI com os mesmos tratamentos (Db, Dm e De) (354,14±29,53 vs 399,40±25,09; 356,14±32,09 vs 405,08±41,09 e 356,35±41,99 vs 421,02±43,32, respectivamente). A microinjeção de DOI (Dm), e esta seguida de EVEC (De), aumentou a relação LF/HF em relação aos animais controles que receberam microinjeção de salina (Cm) e esta seguida de EVEC isotônica (Ce) (2,45±0,82 vs 0,55±0,22 e 2,32±0,80 vs 0,27±0,32, respectivamente).

Todos os valores de p obtidos das análises estatísticas das variáveis estudadas estão apresentados na Tabela 2.

Valores de p obtidos após comparações entre os grupos Controle (n=8) e DOI (dimetoxi-4-iodoanfetamina) (n=5) das variáveis estudadas: pressões arteriais média (PAM), sistólica (PAS) e diastólica (PAD), frequência cardíaca (FC), componente de baixa frequência (LF) e componente de alta frequência (HF) dos animais dos grupos controle basal (Cb), controle após microinjeção de salina nos núcleos paraventriculares do hipotálamo (Cm), controle após expansão de volume extracelular (Ce) e dos tratados com DOI, no estado basal (Db), após microinjeção de DOI nos núcleos paraventriculares do hipotálamo (Dm) e posterior à expansão do volume extracelular (De). Análise da Variância com medidas repetidas e método de comparações múltiplas de Bonferroni foram empregados no estudo. Nível de significância foi fixado em p<0,05
Comparações PAM PAS PAD FC LF/HF
Cb vs Cm 0,827 0,937 0,568 0,987 0,704
Cb vsCe 0,828 0,930 0,568 0,988 0,755
Cm vs Ce 0,820 0,934 0,560 0,980 0,704
Db vs Dm 0,293 0,234 0,418 0,730 0,001
Db vs De 0,016 0,035 0,022 0,503 0,001
Dm vs De 0,096 0,230 0,075 0,500 0,711
Cb vs Db 0,287 0,316 0,308 0,034 0,290
Cm vs Dm 0,077 0,076 0,110 0,033 0,001
Ce vs De 0,018 0,010 0,047 0,010 0,001
Discussão

Nosso estudo mostrou que a EVEC isotônica não promoveu alteração nas pressões PAM, PAS e PAS, como também na FC e relação simpático-vagal (LF/HF). Como mostrado anteriormente por outros autores, a EVEC aguda induz uma série de eventos hemodinâmicos, incluindo um aumento na pressão venosa central, pressão atrial direita, volume sanguíneo central e periférico, débito cardíaco e volume sistólico. Por outro lado, a FC diminui acentuadamente, e a resistência periférica total diminui ligeiramente durante a sobrecarga de volume, enquanto a PAM não se altera.17 Esses achados contradizem Godino et al., 2005, que realizaram EVEC por infusão de um grande volume intra atrial por um minuto e observaram não só uma redução na FC como também na PAM. Essa hipotensão pode ser mediada por uma rápida e pronunciada liberação de ocitocina e do peptídeo natriurético atrial que possuem efeito diurético e vasodilatador.18 Adicionalmente, esses peptídeos estão envolvidos no controle barorreflexo da FC facilitando a resposta vagal no aumento da bradicardia reflexa durante a descarga dos barorreceptores.19-23

No presente trabalho, os animais que receberam microinjeção intracerebroventricular do agonista serotoninérgico DOI no NPV seguida de EVEC, apresentaram aumento significativo da PAM, PAS, PAD, FC e LF/HF, sugerindo que o agonista serotoninérgico DOI leva à inibição da secreção de OT frente à EVEC quando microinjetado bilateralmente no NPV, ou mesmo que exerça uma neuromodulação no nivel do NPV, e esta promova uma inibição na resposta barorreflexa frente à EVEC.

A administração intravenosa de 8-OHDPAT (agonista de receptor 5-HT1A) ou de DOI (agonista de receptor 5-HT2A) promove aumento das concentrações plasmáticas de OT. Ambas as respostas são significativamente atenuadas quando os animais recebem pré-tratamento intravenoso com antagonistas desses mesmos receptores, sugerindo que esse aumento ocorre por ativação serotoninérgica desses receptores em vez da estimulação por interneurônios.11,12,24,25 A estimulação de receptores 5-HT2A no sistema nervoso central pode induzir a um aumento da PA, em parte pelo aumento da atividade simpática vasoconstritora decorrente da ativação de neurônios pré-motores simpáticos na medula oblonga ventrolateral rostral, e também pela libertação de vasopressina.26

O NPV é reciprocamente conectado a várias outras áreas cerebrais envolvidas no controle da função cardiovascular.27 O NPV também contém neurônios pré-autonômicos, que projetam para neurônios pré-ganglionares simpáticos dentro da coluna celular intermediolateral da medula espinhal, ambos, direta e indiretamente, via medula oblonga ventrolateral rostral.28

Diversos estudos precedentes têm relatado a contribuição de neurônios parvocelulares do NPV na resposta autonômica compensatória durante o treinamento físico para a sobrecarga de volume, sugerindo que a sobrecarga de volume causa estimulação de receptores cardíacos vagais, principalmente pela ativação de neurônios parvocelulares no NPV que, sucessivamente, induz a inibição da atividade nervosa simpática.29-35 Vários trabalhos têm sugerido que o aumento da atividade de neurônios no NPV está associado à excitação simpática durante o colapso cardíaco.36-38 Adicionalmente, trabalhos encontraram que um mecanismo GABAérgico alterado no NPV pode estar envolvido na regulação do aferente simpático no colapso cardíaco, e que alterações desse mecanismo inibitório podem contribuir para o aumento da atividade simpática.39,40

Este estudo é o primeiro a explorar a neuromodulação serotoninérgica, via receptores 5-HT2A em nível do NPV sobre as respostas cardiovasculares frente à EVEC isotônica, que se mostrou inibitória. Porém, vale ressaltar que é necessário um estudo mais aprofundado para verificar se essa neuromodulação afeta diretamente a atividade simpática e/ou barorreflexa ou vem acompanhada ou não com alterações neuroendócrinas, principalmente no que se refere à secreção de OT, arginina, vasopressina e peptídeo natriurétrico atrial.

 Conclusão

O presente trabalho fornece evidências de que a serotonina exerce uma neuromodulação no nivel do NPV e essa promove uma inibição da resposta barorreflexa frente à EVEC. Assim, o presente trabalho sugere o envolvimento serotoninérgico na neuromodulação no nivel do NPV na resposta reflexa vagal em ratos normotensos.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.