Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCf8Ggj5dkF4FNtv48sjRLR5DS0066-782X201700020011610.5935/abc.20170012Original ArticlesAtherosclerosis/Endothelium/VascularResveratrol Treatment Normalizes the Endothelial Function and Blood Pressure in Ovariectomized RatsFabricioVictorOishiJorge CamargoBiffeBruna GabrieleRuffoniLeandro Dias GonçalvesSilvaKarina Ana daNonakaKeico OkinoRodriguesGerson JhonatanUniversidade Federal de São CarlosSão CarlosSPBrazilUniversidade Federal de São Carlos (UFSCar), São Carlos, SP - BrazilUniversidade Federal de São CarlosMailing Address: Victor Fabricio, Rodovia Washington Luís, Km 235. Postal Code 13565-905, Jardim Guanabara, São Carlos, SP - Brazil. E-mail: vicfabricio@gmail.com, malaksoad@gmail.com
Author contributions
Conception and design of the research: Fabricio V, Nonaka KO, Rodrigues GJ; Acquisition of data: Fabricio V, Oishi JC, Biffe BG, Ruffoni LDG, Silva KA; Analysis and interpretation of the data: Fabricio V, Oishi JC, Nonaka KO, Rodrigues GJ; Statistical analysis: Fabricio V, Oishi JC; Obtaining financing: Nonaka KO, Rodrigues GJ; Writing of the manuscript: Fabricio V, Oishi JC, Nonaka KO, Rodrigues GJ; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Oishi JC, Biffe BG, Ruffoni LDG, Silva KA, Nonaka KO, Rodrigues GJ.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
0220171082116121010720161910201621112016This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
Despite knowing that resveratrol has effects on blood vessels, blood pressure and that phytostrogens can also improve the endothelium-dependent relaxation/vasodilation, there are no reports of reveratrol's direct effect on the endothelial function and blood pressure of animals with estrogen deficit (mimicking post-menopausal increased blood pressure).
Objective:
To verify the effect of two different periods of preventive treatment with resveratrol on blood pressure and endothelial function in ovariectomized young adult rats.
Methods:
3-month old female Wistar rats were used and distributed in 6 groups: intact groups with 60 or 90 days, ovariectomized groups with 60 or 90 days, and ovariectomized treated with resveratrol (10 mg/kg of body weight per day) for 60 or 90 days. The number of days in each group corresponds to the duration of the experimental period. Vascular reactivity study was performed in abdominal aortic rings, systolic blood pressure was measured and serum nitric oxide (NO) concentration was quantified.
Results:
Ovariectomy induced blood pressure increase 60 and 90 days after surgery, whereas the endothelial function decreased only 90 days after surgery, with no difference in NO concentration among the groups. Only longer treatment (90 days) with resveratrol was able to improve the endothelial function and normalize blood pressure.
Conclusion:
Our results suggest that 90 days of treatment with resveratrol is able to improve the endothelial function and decrease blood pressure in ovariectomized rats.
Keywords:Blood PressureRats, WistarResveratrolPhytoestrogensOvariectomyEndothelium, VascularFAPESP2012/24477-8This study was funded by CAPES and partially funded by FAPESP (2012/24477-8).Introduction
The endothelium is a monolayer of tissue located inside the blood vessels and can have endocrine and paracrine functions, regulating vascular function by releasing trophic and vasoactive factors that regulate the vascular tone and even control the vascular wall inflammation.1 Endothelial dysfunction is characterized mainly by a direct or indirect decrease of nitric oxide (NO) bioavailability2.
NO release by the endothelium is modulated by several factors, including estrogen. This hormone is able to increase NO bioavailability and production through genomic and non-genomic factors. Among them, we can mention its action on estrogen receptor α (ERα) and the reduction of oxidative stress.3,4 Thus, the reduction of this hormone that is observed after menopause can lead to endothelial dysfunction with a consequent increase in blood pressure.
In order to reduce some negative effects of estrogen deficiency, hormone replacement therapy (HRT) is commonly indicated. However, studies indicate that this treatment may be associated with adverse cardiovascular events, increased risk of the development of breast cancer and deep vein thrombosis in women with a predisposition to these conditions.3,5,6
In an attempt to find alternatives to HRT with fewer side effects, resveratrol (3,4,5'-trihydroxystilbene) has shown promising effect because of its similarity to diethylstilbestrol (a synthetic estrogen) and can be regarded as a phytoestrogen. In addition, resveratrol can exert its action on estrogen receptors and may then be regarded as a SERM (selective estrogen receptor modulator).7,9
Despite knowing that both phytoestrogens and SERMs are reported in the literature as acute improvers of endothelium-dependent relaxation/vasodilation4 and that studies indicate the effect of resveratrol on blood pressure and blood vessels,10,11 there are not many reports of its direct effect on both the endothelial function and blood pressure in animals with estrogen deficit only. Thus, the objective of this study was to verify the effect of two different preventive treatment protocols with resveratrol on blood pressure and endothelial function in young ovariectomized female rats.
MethodsAnimals and treatments
The experimental protocol was performed in accordance with the guidelines of the Brazilian College for Animal Experimentation (COBEA) and was approved by the Ethics Committee of the Federal University of Sao Carlos - UFSCar (2-043/2013).
Sixty Wistar (Rattus norvegicus albinis) female rats (90 days old at the beginning of the experiment) were housed under controlled dark-light cycles (14h/10h from 6:00 pm to 8:00 am) and temperature (22 ± 2 °C) receiving standard diet and water ad libitum for 60 or 90 days.
The animals were randomly assigned to six experimental groups: intact - 60 Days Days (INT 60), ovariectomized - 60 days (OVX 60), ovariectomized + resveratrol - 60 days (OVX + RES 60), intact - 90 days (INT 90), ovariectomized - 90 days (OVX 90) and ovariectomized + resveratrol - 90 days (OVX + RES 90). The number of days in each group represented the duration of the experimental period. The animals in the intact groups received no intervention; the ovariectomized groups were ovariectomized and treated with a 0.9% saline solution (0.1ml/100g of body weight per day) by gavage until the end of the experimental period. Those in the ovariectomized + resveratrol group were ovariectomized and treated daily with a solution of 10mg/kg of body weight of resveratrol per day (solubilized in ethanol and diluted with distilled water, with the final concentration of ethanol at 5%), also by gavage for 60 or 90 days. At the end of the experimental period, the rats were anaesthetized with isoflurane and euthanized by decapitation. Blood and aorta artery were collected for experimental analysis.
Blood pressure
Systolic blood pressure (SBP) was measured by tail-cuff plethysmography (model Power Lab 8/35, AD Instruments, Pty Ltda, Colorado Springs, CO) in non-anesthetized animals, as described elsewhere by Rodrigues et al.,12 two days before the animals were killed by decapitation at the end of each experimental period. The average of four consecutive measurements was taken as the mean systolic blood pressure of each animal.
Vascular reactivity studies
The thoracic aortas were isolated, cleaned of adherent connective tissues, and placed in Krebs solution, as described elsewhere.13 The aortas were carefully dissected and mounted as ring preparations (≅4 mm in length) and placed in bath chambers (5 mL) containing Krebs solution at 37 °C (NaCl 130mM, KCl 47 mM, KH2PO4 1.2 mM, CaCl 1.6; MgSO4 1.2mM; NaHCO3 14.9 mM; glucose 5.5 mM) continuously bubbled with 95% O2 and 5% CO2, pH 7.4, in a Mulvany-Halpern isometric myograph (model 610 DMT-USA, Marietta, GA) and recorded by a PowerLab8/SP data acquisition system (AD Instruments Pty Ltd., Colorado Springs, CO). The aortic rings were submitted to a tension of 1.5 g, which was readjusted every 15 min for a 60-min equilibration period before addition of the given drug. Experiments were conducted in aortic rings with intact endothelium and also in endothelium-denuded aortic rings. Endothelial integrity was assessed by the degree of relaxation induced by 1µmol/l acetylcholine (Ach) in the presence of contractile tonus induced by phenylephrine (0.1µM). The ring was considered as with intact endothelium if relaxation with acetylcholine was higher than 80%. In endothelium-denuded aortas, the relaxation to Ach was lower than 5%. After the endothelial integrity test, aortic rings were pre-contracted with phenylephrine (0.1µM). When the plateau was reached, concentration-effect curves to acetylcholine (0.1nM to 0.1mM) in intact endothelium aortic rings or to sodium nitroprusside (SNP) in endothelium-denuded aortic rings were constructed. The potency (pD2) and the maximal relaxant effect (ME) were measured.
Serum Nitrite and Nitrate (NOx)
Serum nitric oxide levels were obtained by measuring the serum concentrations of its stable end-products nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-), collectively known as NOx. The NO/ozone chemiluminescence method was performed using the NO Analizer 280i (Sievers, Boulder, CO, USA). The NOx concentration was corrected by the factor obtained by the quotient of the measured NOx and expected concentrations of sodium nitrate (5, 10, 25, 50, and 100 µM), yielding a standard curve.14
Statistical analysis
Normality of distribution of the variables studied (all quantitative and continuous) was verified by the Kolmogorov-Smirnov test. Differences in means among the groups in each experimental period were compared by one-way analysis of variance (ANOVA). When significance was indicated, a Newman-Keuls post hoc analysis was used with statistical significance set at p<0.05 (Software Statistica 7.0, StatSoft. Inc, Tulsa, USA).
Drugs and chemicals
Acetylcholine, phenylephrine and sodium nitroprusside, were purchased from Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA). Resveratrol was purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA).
Results
In Table 1 we can observe that 60 days of ovariectomy did not change the endothelium-dependent and independent vascular relaxation of aortic rings, and resveratrol supplementation had no effect in the OVX group. The maximal relaxant effect (ME) did not change in aortic rings with or without endothelium for all groups. Also, a decrease in the potency of acetylcholine in inducing relaxation (pD2 OVX 90: 6.99 ± 0.10) was observed after 90 days of ovariectomy when compared to intact animals (pD2 INT 90: 7.51 ± 0.07, p<0.05). Ninety days of resveratrol supplementation was able to increase the pD2 to acetylcholine (pD2: OVX+RES: 7.50 ± 0.15, p <0.05) and also bring it to values similar to those of the intact groups, normalizing the endothelial function. In denuded aortic rings, no change was observed in the endothelium-independent relaxant effect in pD2 values in all groups. ME did not change after 90 days of ovariectomy or resveratrol supplementation in endothelium-dependent and independent relaxation induced by acetylcholine or sodium nitroprusside, respectively.
Values of power (pD2) and maximal relaxant effect (ME) to relaxation induced by acetylcholine and sodium nitroprusside, in aortic rings with (E+) or without (E-) its endothelium from intact (INT), ovariectomized (OVX) and ovariectomized + resveratrol (OVX + RES) groups in both experimental periods. Values are expressed as Mean±SD. Comparisons were made using One-way ANOVA followed by the Newman-Keuls post- hoc test. *p<0.05 compared to INT 60 group; +p<0.05 compared to INT 90 group; # p< 0.05 compared to OVX 90 group
Relaxation induced by acetyilcholine (E+) and sodium nitroprusside (E-)
60 DAYS
INT 60
OVX 60
OVX+ RES 60
pD2 E+
7.69 ± 0.15
7.43 ± 0.18
7.63 ± 0.16
ME E+
94.28 ± 4.80
84.66 ± 4.93
89.00 ± 4.43
pD2 E-
8.55 ± 0.09
8.51 ± 0.11
8.56 ± 0.09
ME E-
105.40 ± 2.12
103.30 ± 2.17
105.50 ± 2.71
90 DAYS
INT 90
OVX 90
OVX+ RES 90
pD2 E+
7.51 ± 0.07
7.00 ± 0.10+
7.50 ± 0.15#
ME E+
86.18 ± 4.32
85.50 ± 2.45
81.67 ± 3.61
pD2 E-
8.45 ± 0.02
8.45 ± 0.02
8.43 ± 0.01
ME E-
105.70 ± 2.62
105.20 ± 1.76
102.20 ± 4.21
In Table 2 we can observe that ovariectomy induced an increase in systolic blood pressure (SBP) 60 and 90 days after surgery. The treatment with resveratrol for 60 days did not prevent the increase in blood pressure. However, 90 days of treatment with resveratrol prevented it, and normalized blood pressure. Nevertheless, no difference could be observed in serum NO concentration (Figures 1 and 2) in both treatment periods (60 and 90 days).
Systolic blood pressure (SBP) and serum Nitric Oxide concentration (NO) in intact (INT), ovariectomized (OVX) and ovariectomized + resveratrol (OVX + RES) groups of both experimental periods. Values expressed as Mean±SD. Comparisons were made using One-way ANOVA followed by the Newman-Keuls post- hoc test. *p<0.05 compared to INT 60 group; +p<0.05 compared to INT 90 group; # p< 0.05 compared to OVX 90 group
60 DAYS
INT 60
OVX 60
OVX+ RES 60
SBP (mmHg)
120.39 ± 4.58
138.16 ± 5.42*
135.18 ± 5.42*
NO (uM)
33.91 ± 8.55
28.51 ± 7.47
30.42 ± 9.68
90 DAYS
INT 90
OVX 90
OVX+ RES 90
SBP (mmHg)
123.92 ± 4.98
145.21 ± 9.79+
123.33 ± 3.66#
NO (uM)
30.96 ± 5.17
31.26 ± 9.06
30.61 ± 10.38
Serum nitric oxide concentration in µM in intact - 60 days (INT 60), ovariectomized - 60 days (OVX 60) and ovariectomized + resveratrol - 60 days (OVX + RES 60) groups. Values expressed as Mean±SD. Comparisons were made using One-way ANOVA followed by the Newman-Keuls post- hoc test. No differences were observed between the groups.
Serum nitric oxide concentration in µM in intact - 90 days (INT 90), ovariectomized - 90 days (OVX 90) and ovariectomized + resveratrol - 90 days (OVX + RES 90) groups. Values are expressed as Mean±SD. Comparisons were made using One-way ANOVA followed by the Newman-Keuls post- hoc test. No differences were observed between the groups.
Discussion
The main finding of this study was that the treatment with resveratrol for 90 days prevented the changes in blood pressure and endothelial function induced by estrogen deficiency. In this trial period, we have verified that ovariectomy was effective to induce endothelial dysfunction and elevation of blood pressure. The 60-day estrogen deficiency was not enough to induce changes in endothelial function in aortic ring of rats; however, this period was enough to increase the blood pressure value and resveratrol treatment did not modify endothelial function and blood pressure.
The increase in blood pressure due to ovariectomy and its subsequent reduction in the group treated with resveratrol in the 90-day experimental protocol also was observed previously by Patki et al,15 who treated Wistar ovariectomized rats with frozen grape powder (in which one of the components is resveratrol). Still, the authors suggest that the effect of ovariectomy on blood pressure is induced by elevation in oxidative stress triggered by estrogen deficit and the effect of frozen grape powder may be related to its strong antioxidant effect,15 a feature also verified with resveratrol.16
The decrease in endothelium-dependent relaxation in aortic rings and consequent increase with the treatment with resveratrol in the 90-day experimental protocol agrees with the results presented by Mizutani and colleagues10 in stroke-prone spontaneously hypertensive ovariectomized rats, supplemented dietetically with 5mg/kg of body weight of resveratrol. However, these authors indicate that the effect of the substance on the endothelium is through the increased bioavailability of NO, as reported by other studies17,18, a fact not confirmed by our study.
An interesting result was that only prolonged resveratrol treatment (90 days) was able to improve the endothelial function and normalize blood pressure. Sixty days after surgery, no endothelium dysfunction was verified, and no improvement was induced by resveratrol. Thus, our result suggests that the improvement in the endothelial function induced by resveratrol normalizes the blood pressure in OVX rats by a NO independent mechanism.
Vanhoute et al4 point out that in addition to NO there are other endothelium factors which can induce vasodilation, including the endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF). Furthermore, Dolinsky et al11 suggested that the effect of resveratrol on blood pressure can be different in accordance to the experimental model used, and these differences could result from the distinct mechanisms of hypertension developing. Considering that there are few studies that have evaluated the effect of estrogen deficiency on blood pressure and endothelial function in young/adult animal models, the results of this study represent an important contribution of resveratrol as a preventive treatment for postmenopausal cardiovascular effects.
Conclusion
Our results suggest that ninety days of treatment with resveratrol (10 mg/kg body weight per day) is able to normalize the endothelial function and blood pressure of ovariectomized rats via a NO-independent mechanism.
Limitations
There was not enough budget to perform other analyzes, such as the quantification of NO and of oxidative stress markers in blood vessels, that could better consolidate the causes of impairment and / or improvement in systolic blood pressure and vascular reactivity.
Sources of Funding
This study was funded by CAPES and partially funded by FAPESP (2012/24477-8).
Study Association
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Victor Fabricio, from Universidade Federal de São Carlos.
Acknowledgements
Profª. Drª. Evelin Capellari Carnio and Marcelo Eduardo Batalhão (Laboratory Expert) of Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto (USP) for the performance of nitric oxide analyzes.
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Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Fabricio V, Nonaka KO, Rodrigues GJ; Obtenção de dados: Fabricio V, Oishi JC, Biffe BG, Ruffoni LDG, Silva KA; Análise e interpretação dos dados: Fabricio V, Oishi JC, Nonaka KO, Rodrigues GJ; Análise estatística: Fabricio V, Oishi JC; Obtenção de financiamento: Nonaka KO, Rodrigues GJ; Redação do manuscrito: Fabricio V, Oishi JC, Nonaka KO, Rodrigues GJ; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Oishi JC, Biffe BG, Ruffoni LDG, Silva KA, Nonaka KO, Rodrigues GJ.
Potencial conflito de interesse
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamentos:
Apesar de se saber que o resveratrol apresenta efeitos sobre a pressão arterial e os vasos sanguíneos, e que os fitoestrógenos podem melhorar o relaxamento/vasodilatação dependente do endotélio, não há relatos do efeito direto do resveratrol sobre a pressão arterial e a função endotelial em animais com deficiência de estrógeno (mimetizando a pressão arterial aumentada pós-menopausa).
Objetivo:
Verificar o efeito de dois diferentes períodos de tratamento preventivo com resveratrol sobre a pressão arterial e a função endotelial em ratas adultas jovens ovariectomizadas.
Métodos:
Foram utilizadas ratas Wistar com 3 meses de idade, distribuídas em 6 grupos: grupos intactas com 60 ou 90 dias, grupos ovariectomizadas com 60 ou 90 dias, grupos ovariectomizadas e tratadas com resveratrol na dose de 10mg/kg de massa corporal por dia, durante 60 ou 90 dias, sendo o número de dias em cada grupo relativo à duração do período experimental. Foi realizado um estudo de reatividade vascular em anéis da aorta abdominal, mensurada a pressão arterial sistólica e quantificada a concentração sérica de óxido nítrico (NO).
Resultados:
A ovariectomia induziu aumento da pressão arterial 60 e 90 dias após a cirurgia, enquanto a função endotelial decaiu apenas após 90 dias, e não houve diferença na concentração de NO entre os grupos. Apenas o tratamento prolongado com resveratrol (90 dias) foi capaz de melhorar a função endotelial e normalizar a pressão arterial.
Conclusão:
Nossos resultados sugerem que o tratamento por 90 dias com resveratrol é capaz de melhorar a função endotelial e diminuir a pressão sanguínea em ratas ovariectomizadas.
O endotélio é uma monocamada de tecido localizada no interior dos vasos sanguíneos e pode ter funções endócrinas e parácrinas, regulando a função vascular através da liberação de fatores tróficos e vasoativos que controlam o tônus vascular e até mesmo a inflamação da parede vascular.1 A disfunção endotelial caracteriza-se principalmente pela diminuição, direta ou indireta, da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO).2
A liberação de NO pelo endotélio é modulada por vários fatores, incluindo o estrógeno. Este hormônio é capaz de aumentar a biodisponibilidade e a produção de NO através de fatores genômicos e não genômicos, entre os quais podemos mencionar a ação sobre o receptor α estrogênico (ERα) e a redução do estresse oxidativo.3,4 Assim, a redução deste hormônio, que é observada após a menopausa, pode levar à disfunção endotelial, com consequente aumento da pressão arterial.
A fim de reduzir alguns efeitos negativos da deficiência estrogênica, geralmente se indica a terapia de reposição hormonal (TRH). No entanto, estudos indicam que este tratamento pode estar associado a eventos cardiovasculares adversos, aumento do risco de desenvolvimento de câncer de mama e trombose venosa profunda em mulheres com predisposição para estas doenças.3,5,6
Numa tentativa de encontrar alternativas à TRH com menos efeitos colaterais, o resveratrol (3,4,5'-trihidroxiestilbeno) tem mostrado efeito promissor devido à sua semelhança com o dietilestilbestrol (um estrógeno sintético), podendo ser considerado um fitoestrógeno. Além disso, o resveratrol pode exercer sua ação sobre os receptores de estrógeno, podendo ser considerado um modulador seletivo do receptor de estrógeno (MSRE).7-9
Apesar de se saber que há relatos na literatura tanto dos fitoestrógenos quanto dos MSRE como melhoradores agudos do relaxamento/vasodilatação endotélio-dependente4 e que há estudos mostrando o efeito do resveratrol sobre a pressão arterial e os vasos sanguíneos,10,11 não há muitos relatos de seu efeito direto sobre a função endotelial e a pressão arterial em animais com com deficiência isolada de estrógenos. Assim, o objetivo deste estudo foi verificar o efeito de dois diferentes protocolos de tratamento preventivo com resveratrol sobre a pressão arterial e a função endotelial em ratas jovens ovariectomizadas.
MétodosAnimais e tratamentos
O protocolo experimental foi realizado de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro para Experimentos em Animais (COBEA), tendo sido aprovado pelo comitê de ética da Universidade Federal de São Carlos - UFSCar (2-043/2013).
Sessenta ratas Wistar (Rattus norvegicus albinis) (90 dias de vida no início do experimento) foram abrigadas sob ciclos claro-escuro (14h/10h das 18:00 às 8:00 horas) e temperatura (22 ± 2 °C) controlados, recebendo dieta padrão à vontade durante 60 ou 90 dias.
Os animais foram randomicamente distribuídos em seis grupos experimentais: intactas - 60 dias (INT 60); ovariectomizadas - 60 dias (OVX 60); ovariectomizadas + resveratrol - 60 dias (OVX + RES 60); intactas - 90 dias (INT 90); ovariectomizadas - 90 dias (OVX 90); e ovariectomizadas + resveratrol - 90 dias (OVX + RES 90), sendo que o número de dias em cada grupo representou a duração do período experimental. Os animais dos grupos intactas não receberam nenhuma intervenção; as ratas dos grupos ovariectomizadas foram ovariectomizadas e tratadas com soro fisiológico a 0,9% (0,1 mL/100 g de peso corporal por dia) por gavagem até o fim do período experimental; e as dos grupos ovariectomizadas + resveratrol foram ovariectomizadas e tratadas diariamente com uma solução de resveratrol a 10mg/kg de peso corporal por dia (solubilizado em etanol e diluído em água destilada, com a concentração final de etanol a 5%), igualmente por gavagem, durante 60 ou 90 dias. Ao final do período experimental, as ratas foram anestesiadas com isoflurano e submetidos a eutanásia por decapitação, sendo coletados sangue e a aorta para análise.
Pressão arterial
A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda com manguito (modelo Power Lab 8/35, AD Instruments, Pty Ltd, Colorado Springs, CO) com os animais não anestesiados, conforme descrito anteriormente por Rodrigues et al.,12 dois dias antes de os animais serem mortos por decapitação ao final de cada período experimental. A média de quatro medidas sucessivas foi considerada como a média da pressão arterial sistólica de cada animal.
Estudos da reatividade vascular
As aortas torácicas foram isoladas, sendo removido o tecido conjuntivo nelas aderido, e colocadas em solução de Krebs, como descrito anteriormente.13 As aortas foram cuidadosamente dissecadas e montadas em anéis (≅4 mm de extensão), sendo colocadas em câmaras de banho (5 mL) contendo solução de Krebs à 37 °C (NaCl 130mM, KCl 47 mM, KH2PO4 1,2 mM, CaCl 1,6; MgSO4 1,2mM; NaHCO3 14,9 mM; glicose 5,5 mM) continuamente borbulhada com 95% de O2 e 5% de CO2, pH 7,4, em miógrafo isométrico Mulvany-Halpern (modelo 610 DMT-USA, Marietta, GA), com registro através de um sistema de aquisição de dados PowerLab8/SP (AD Instruments Pty Ltd., Colorado Springs, Colorado). Os anéis aórticos foram submetidos a uma tensão de 1,5g, que foi reajustada a cada 15 minutos durante um período de equilíbrio de 60 minutos antes de ser adicionada a droga especificada. Os experimentos foram realizados em anéis aórticos com endotélio intacto e também em anéis aórticos desprovidos de endotélio. A integridade endotelial foi avaliada através do grau de relaxamento induzido por acetilcolina (Acl) a 1µmol/L na presença de tônus ccontrátil induzido por fenilefrina (0.1µM). Considerava-se que o anel possuía endotélio intacto se o relaxamento com acetilcolina fosse maior que 80%. Em aortas desprovidas de endotélio, o relaxamento com Acl foi menor que 5%. Após o teste de integridade endotelial, os anéis aórticos foram pré-contraídos com fenilefrina (0,1µM). Após o platô de contração ser atingido, curvas concentração-efeito foram construídas para acetilcolina (0,1nM a 0,1mM) em anéis aórticos com endotélio intacto, ou para o nitroprussiato de sódio (NPS) em anéis aórticos sem endotélio. A potência (pD2 ) e o efeito relaxante máximo (EM) foram mensurados
Nitrito e Nitrato Séricos (NO<sub>X</sub>)
Foram obtidos os níveis de óxido nítrico sérico através da medida das concentrações séricas de seus produtos finais estáveis nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), coletivamente conhecidos como NOX. O método de quimioluminescência de NO/ozônio foi realizado através do aparelho NO Analizer 280i (Sievers, Boulder, CO, EUA). A concentração de NOX foi corrigida pelo fator obtido pelo quociente entre o NOX medido e as concentrações esperadas de nitrato de sódio (5, 10, 25, 50 e 100 µM), que fornecessem uma curva padrão.14
Análise estatística
Foi verificada a distribuição normal das váriaveis estudadas (todas quantitativas e contínuas) através do teste de Kolmogorov-Smirnof.
As diferenças das médias entre os grupos em cada período experimental foram comparadas através da análise de variância de uma via (ANOVA). Quando havia significância, foi usada a análise de Newman-Keul post hoc, sendo o nível de significância estatística estabelecido a p<0,05 (Software Statistica 7.0, StatSoft. Inc, Tulsa, EUA).
Drogas e substâncias químicas
A acetilcolina, fenilefrina e nitroprussiato de sódio foram adquiridas de Sigma-Alddrich (St Louis, MO, EUA). O resveratrol foi adquirido de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA).
Resultados
Na Tabela 1, pode-se observar que 60 dias de ovariectomia não alteraram o relaxamento vascular endotélio dependente e independente dos anéis aórticos, sendo que a suplementação com reverastrol não teve nenhum efeito no grupo OVX. O efeito relaxante máximo (EM) não se alterou nos anéis aórticos com ou sem endotélio para todos os grupos. Além disso, 90 dias após a ovariectomia, observou-se uma queda na potência de relaxamento à acetilcolina (pD2 OVX 90: 6,99 ± 0,10) em comparação com os animais intactos (pD2 INT 90: 7,51 ± 0,07, p<0,05). A suplementação com resveratrol por 90 dias foi capaz de aumentar o pD2 (pD2: OVX+RES: 7,50 ± 0,15, p <0,05) trazendo-o ao nível dos do grupo de intactas, normalizando a função endotelial. Em anéis aórticos desprovidos de endotélio, não foram observadas mudanças no efeito de relaxamento independente de endotélio em valores de pD2 para todos os grupos. Não houve mudança no EM 90 dias após a ovariectomia ou suplementação com resveratrol no relaxamento endotélio dependente ou independente induzido por acetilcolina ou nitroprussiato de sódio, respectivamente.
Valores de potência (pD2) e efeito relaxante máximo (EM) para relaxamento induzido por acetilcolina e nitroprussiato de sódio em anéis aórticos com (E+) ou sem (E-) endotélio dos grupos intacta (INT), ovariectomizada (OVX) e ovariectomizada + resveratrol (OVX + RES) nos dois períodos experimentais. Os valores são expressos como média ± DP. As comparações foram feitas através de ANOVA de uma via seguida de teste de Newman-Keuls post-hoc. *p<0,05 comparado com o grupo INT 60; +p<0,05 comparado com o grupo INT 90; # p< 0,05 comparado com o grupo OVX 90
Relaxamento induzido por acetilcolina (E+) e nitroprussiato de sódio (E-)
60 DIAS
INT 60
OVX 60
OVX+ RES 60
pD2 E+
7,69 ± 0,15
7,43 ± 0,18
7,63 ± 0,16
EM E+
94,28 ± 4,80
84,66 ± 4,93
89,00 ± 4,43
pD2 E-
8,55 ± 0,09
8,51 ± 0,11
8,56 ± 0,09
EM E-
105,40 ± 2,12
103,30 ± 2,17
105,50 ± 2,71
90 DIAS
INT 90
OVX 90
OVX+ RES 90
pD2 E+
7,51 ± 0,07
7,00 ± 0,10+
7,50 ± 0,15#
EM E+
86,18 ± 4,32
85,50 ± 2,45
81,67 ± 3,61
pD2 E-
8,45 ± 0,02
8,45 ± 0,02
8,43 ± 0,01
EM E-
105,70 ± 2,62
105,20 ± 1,76
102,20 ± 4,21
Na tabela 2, podemos observar que a ovariectomia induziu a um aumento na pressão arterial sistólica (PAS) 60 e 90 dias após a cirurgia. O tratamento com resveratrol por 60 dias não preveniu o aumento na pressão arterial. No entanto, o tratamento com resveratrol por 90 dias preveniu esse aumento, e normalizou a pressão arterial. Ainda, não foram observadas diferenças na concentração de NO sérica (Figuras 1 e 2) em ambos os períodos de tratamento (60 e 90 dias).
Pressão arterial sistólica (PAS) e concentração sérica de óxido nítrico (NO) nos grupos intacta (INT), ovariectomizada (OVX) e ovariectomizada + resveratrol (OVX + RES) nos dois períodos experimentais. Os valores são expressos como média ±DP. As comparações foram feitas por ANOVA de uma via seguida de teste de Newman-Keuls post-hoc. p<0,05 comparado com o grupo INT 60; +p<0,05 comparado com o grupo INT 90; # p< 0,05 comparado com o grupo OVX 90
60 DIAS
INT 60
OVX 60
OVX+ RES 60
PAS (mmHg)
120,39 ± 4,58
138,16 ± 5,42*
135,18 ± 5,42*
NO (uM)
33,91 ± 8,55
28,51 ± 7,47
30,42 ± 9,68
90 DIAS
INT 90
OVX 90
OVX+ RES 90
PAS (mmHg)
123,92 ± 4,98
145,21 ± 9,79+
123,33 ± 3,66#
NO (uM)
30,96 ± 5,17
31,26 ± 9,06
30,61 ± 10,38
Concentração de óxido nítrico sérico em µ M nos grupos intacta - 60 dias (INT 60), ovariectomizada - 60 dias (OVX 60) e ovariectomizada + resveratrol - 60 dias (OVX + RES 60). Os valores são apresentados como média ±DP. As comparações foram feitas com ANOVA de uma via seguida de teste de Newman-Keuls post-hoc. Não foram observadas diferenças entre os grupos.
Concentração de óxido nítrico sérico em µ M nos grupos intacta - 90 dias (INT 90), ovariectomizada - 90 dias (OVX 90) e ovariectomizada + resveratrol - 90 dias (OVX + RES 90). Os valores são expressos como média±DP. As comparações foram feitas através de ANOVA de uma via seguida de teste de Newman-Keuls post-hoc. Não foram observadas diferenças entre os grupos.
Discussão
O principal achado deste estudo foi que o tratamento com resveratrol durante 90 dias preveniu alterações na pressão arterial e na função endotelial induzidas por deficiência estrogênica. Neste período experimental, verificamos que a ovariectomia foi eficaz em induzir disfunção endotelial e aumento de pressão arterial. A deficiência estrogênica por 60 dias não foi suficiente para induzir mudanças na função endotelial em anéis aórticos de ratos; no entanto, este período foi capaz de aumentar o valor de pressão arterial, sendo que o tratamento com resveratrol não modificou a função endotelial nem a pressão arterial.
O aumento na pressão arterial decorrente de ovariectomia e subsequente redução da pressão no grupo tratado com resveratrol no protocolo experimental de 90 dias já havia sido anteriormente observado por Patki et al,15 que trataram ratas Wistar ovariectomizadas com pó de uva congelada (no qual um dos componentes é o resveratrol). Ainda assim, os autores sugerem que o efeito da ovariectomia na pressão arterial seja induzido pelo aumento do estresse oxidativo desencadeado pelo déficit de estrógeno e que o efeito do pó de uva congelada possa estar relacionado a seu grande efeito antioxidante,15 característica que também foi verificada com o resveratrol.16
A diminuição do relaxamento dependente do endotélio em anéis aórticos e seu consequente aumento com o tratamento com resveratrol no protocolo experimental de 90 dias também foi encontrado por Mizutani et al.10 em ratas ovariectomizadas espontaneamente hipertensas com predisposição a AVC, dieteticamente suplementadas com resveratrol (5mg/kg de peso corporal). Entretanto, esses autores indicam que o efeito da substância sobre o endotélio se dá através da biodisponibilidade aumentada de NO, como relatado por outros estudos,17,18 o que não foi confirmado em nosso estudo.
Um resultado interessante foi que apenas o tratamento prolongado com resveratrol (90 dias) foi capaz de melhorar a função endotelial e normalizar a pressão arterial. Sessenta dias após a cirurgia, não se verificou disfunção endotelial, nem foi induzida nenhuma melhora com o resveratrol. Assim, nossos resultados sugerem que a melhora na função endotelial induzida pelo resveratrol normaliza a pressão arterial em ratas OVX através de um mecanismo independente de NO.
Vanhoute et al.4 mostram que além do NO há outros fatores endoteliais que podem induzir vasodilatação, incluindo o fator hiperpolarizante derivado de endotélio. Além disso, Dolinsky et al.11 sugeriram que o efeito do resveratrol sobre a pressão arterial pode ser diferente de acordo com o modelo experimental usado, e essas diferenças poderiam ser decorrentes dos mecanismos distintos de hipertensão em desenvolvimento. Considerando-se que há uma escassez de estudos avaliando o efeito da deficiência de estrógeno sobre a pressão arterial e a função endotelial em modelos animais jovens/adultos, os resultados deste estudo apresentam uma importante contribuição sobre o resveratrol como tratamento preventivo de efeitos cardiovasculares pós-menopausa.
Conclusão
Nossos resultados sugerem que o tratamento com resveratrol por 90 dias (10 mg/kg de peso corporal por dia) é capaz de normalizar a função endotelial e a pressão arterial de ratas ovariectomizadas através de um mecanismo independente de NO.
Limitações
Não houve orçamento suficiente para realizar outras análises que pudessem consolidar melhor as causas de comprometimento e/ou melhora na pressão arterial sistólica e na reatividade vascular, como a quantificação de NO e de marcadores de estresse oxidativo nos vasos sanguíneos.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pela CAPES e parcialmente pela FAPESP (2012/24477-8).
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Victor Fabricio pela Universidade Federal de São Carlos.
Agradecimentos
Profª. Drª. Evelin Capellari Carnio e Marcelo Eduardo Batalhão (Especialista em Laboratório) da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto (USP) pela realização das análises de Óxido Nitrico.