Desenvolvido a partir de mecanismos moleculares do sistema imunológico bacteriano, o sistema CRISPR possibilita a edição do genoma através de clivagem do DNA por uma endonuclease (Cas9), guiada a partir de uma sequência de RNA, que é capaz de se parear com as bases de uma sequência-alvo (Figura 1).5 A estrutura genética do CRISPR, no sistema bacteriano, é constituída de repetições palindrômicas curtas, agrupadas e regularmente interespaçadas. As repetições e os espaçadores (que podem conter sequências virais intercalantes), quando transcritos, formam o RNA transativador (ou RNA guia), que serve para direcionar a enzima Cas9, uma nucleasse, ao alvo (neste caso, a sequência do vírus parasita). Aproveitando-se desta estratégia, tanto a proteína Cas9 quanto o RNA guia, podem ser introduzidos in vitro em outras células e direcionados a locais específicos do genoma, para que provoquem quebras na fita dupla. Após esta clivagem, a maquinaria molecular intrínseca do organismo, responsável pela correção de erros no genoma, é utilizada para alterar a sequência de DNA, adotando a modificação. Desta forma, o sistema pode ser utilizado tanto para reparar mutações (restaurando a função gênica) quanto para introduzir mutações novas (causando o "nocaute" gênico). Assim, conciliando sofisticadas técnicas moleculares e biotecnológicas, o sistema CRISPR/Cas9 foi proposto para aplicação em edição genômica e hoje já se encontra comercialmente disponível para milhares de alvos.6 Ambos, RNA guia e proteína Cas9, produzidos in vitro, podem ser entregues às células usando diferentes mecanismos, tais como uso de vetores ou agentes químicos.

Figura 1

A aplicabilidade mais simples do sistema CRISPR está relacionada à modificação de únicas ou poucas bases em genes com relação alélica bem definida. É importante salientar que esta relação de dominância mendeliana deve ser considerada para que se atinja a função gênica, tanto para ativá-la quanto para inibi-la. Entretanto, modificações bialélicas também têm sido obtidas com sucesso.7 Além disso, o uso do CRISPR/Cas9 também tem sido proposto para estágio embrionário em modelos animais, onde a progênie pode gerar organismos "fundadores" (por recombinação), contendo mutações alélicas que levam ao efeito "nocaute" ou de expressão diminuída.8 Nesse contexto, o sistema CRISPR/Cas9 está sendo rapidamente adotado para a edição e modificação de genomas em vários tipos celulares, incluindo células-tronco,9 e mostrando bons resultados na edição de genes humanos.10 Recentemente, a imprensa reportou que pesquisadores da Universidade da Pensilvânia receberam aprovação do Food and Drug Administration (FDA) para conduzir um estudo clínico a ser iniciado em 2017, tendo como alvo 3 genes envolvidos em câncer. Assim, surge o questionamento sobre a possibilidade de aplicação do sistema CRISPR/Cas9 para uma situação tão biologicamente complexa como a da doença cardiovascular.

O primeiro passo para se sugerir o uso do sistema CRISPR/Cas9 para uma determinada DCV deve basear-se em um estudo aprofundado sobre os potenciais alvos moleculares envolvidos com a doença. Neste cenário, a utilização de ferramentas de bioinformática e bancos de sequências gênicas disponíveis na internet (como o National Center for Biotechnology Information, NCBI; e DNA Data Bank of Japan, DBDJ) e de proteínas preditas (como o Universal Protein Resource, UniProt, alocado no European Molecular Biology Laboratory, EMBL), além de bancos de polimorfismos únicos, SNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp), podem auxiliar no processo. Uma vez que os alvos tenham sido escolhidos, uma análise detalhada sobre a função dos exons (sequências codificadoras dos genes) também deverá ser realizada. De posse de todas as informações necessárias, os RNA guia podem ser projetados e adquiridos comercialmente. Atualmente, já existem muitos laboratórios de pesquisa que estão utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9 para editar genes envolvidos com DCV e testando em sistemas celulares, realizando ensaios pré-clínicos e projetando estudos clínicos. Embora o contexto cardiovascular seja complexo, algumas patologias estão mais ou menos relacionadas a determinados produtos gênicos, cuja interação com outras moléculas já é conhecida, conforme descrito a seguir, facilitando a viabilidade de utilização do sistema CRISPR/Cas9.

Um dos grandes problemas na manutenção da doença arterial coronariana (DAC) é a elevação dos níveis de LDL, em que a intervenção farmacológica busca sua redução através do uso de estatinas. Uma vez que alguns pacientes são intolerantes ou refratários a este fármaco, estão sendo conduzidas muitas pesquisas com foco na inibição da pró-proteína convertase subtilisina tipo 9 (PCSK9), que auxilia na degradação de receptores do LDL, o que causa aumento do nível da lipoproteína na corrente sanguínea. Através do sistema CRISPR/Cas9, Ding e colaboradores (2014) introduziram perda de função para o gene da PCSK9 no fígado de camundongos, utilizando adenovírus como "veículos", e mostraram diminuição dos níveis de colesterol em mais de 40%.11 Em um estudo com coelhos, também focado na diminuição da progressão da placa aterosclerótica, foram desenvolvidos animais "nocautes", por edição genômica, através da inibição de diversos genes, como a Apolipoproteína E (ApoE), CD36, o receptor de LDL, leptina, o receptor rianodínico tipo 2 (RyR2), entre outros.12 Estes estudos apontam que o sistema CRISPR/Cas9 é viável para alterar a função de genes relacionados a DCV. Isto favorece a exploração do uso da ferramenta molecular para outros mecanismos que concernem à DCV.

Um bom alvo de estudo para possível utilização do CRISPR/Cas9 é o sistema β-adrenérgico, um dos responsáveis pela vasoconstrição/vasodilatação e manutenção da pressão arterial e do ritmo cardíaco. Somado a isto, o sistema renina-angiotensina-aldosterona também possui papel primordial na manutenção da estabilidade hemodinâmica. Ambos os sistemas são regulados por uma extensa rede de efetores, como hormônios e peptídeos, receptores, proteínas quinases e outras enzimas, tanto atuantes no meio extracelular como no interior das células. Neste sentido, seria muito interessante testar e avaliar a ferramenta de edição genômica para auxiliar no tratamento da hipertensão arterial sistêmica.

Nosso grupo, em concomitância à aplicação de terapias alternativas, como a celular e gênica, para tratamento de DCV, desenvolveu o primeiro estudo clínico do país para promoção de angiogênese, por expressão exógena, através da administração de um plasmídeo contendo o cDNA relativo ao gene do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em pacientes portadores de angina refratária, mostrando que a técnica é segura e melhora a fração de ejeção ventricular.13 Atualmente, temos concentrado nossos esforços no entendimento de mecanismos que possam auxiliar nas intervenções (cirúrgicas, farmacológicas, dietéticas, etc.) para DCV, principalmente para cardiomiopatia dilatada (CMD) e cardiopatias isquêmicas.14 Em colaboração com pesquisadores do Instituto do Câncer, estamos utilizando o sistema CRISPR/Cas9 para alcançar a inativação da função de uma MAP quinase tecido-específica, codificada pelo gene TNNI3K, que interage com a troponina I cardíaca e, quando exacerbada, causa progressão da CMD levando à insuficiência cardíaca e aumentando o risco de morte.15

Não apenas o contexto inibitório, mas a possibilidade de edição para ativação de genes de maneira a estimular funções relacionadas, por exemplo, à sobrevivência de cardiomiócitos no pós-infarto, indução de homing (migração, proliferação e diferenciação de células-tronco), aumento do nível de citocinas anti-inflamatórias e de proteínas inibidoras de metaloproteinases (que levam ao remodelamento ventricular patológico), além de outros mecanismos, pode vir a ser explorada no âmbito das DCV. Entretanto, devido às condições multifatoriais atribuídas à etiologia e prognóstico dessa classe de patologias, a transposição clínica de resultados obtidos por análises moleculares em sistemas celulares in vitro ou em modelos animais, assim como ocorre para outras abordagens mais inovadoras, ainda é um desafio.

Na maioria dos casos, fatores genéticos, ambientais e comportamentais atuam em conjunto para o estabelecimento de DCV. Embora, em alguns casos, sejam observados prováveis fatores preditores dos desfechos, ainda não é possível prever com exatidão a influência da ativação/inativação de genes em relação aos quadros clínicos. Finalmente, como para qualquer nova tecnologia, os riscos, as adaptações fisiológicas, as implicações com a resposta imune, a manutenção da homeostasia, que venham a ser modulados pelo sistema CRISPR/Cas9, precisam ser muito bem avaliados. Mas a possibilidade de uso da nova ferramenta molecular na Cardiologia pode ser vislumbrada e talvez, em um futuro próximo, vir a beneficiar a saúde da população.