Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC CMNmWKHNmGz3tF6k4pNPYrc S0066-782X2017000100012 10.5935/abc.20160194 Original Articles Nuclear Cardiology and PET Comparison between Radionuclide Ventriculography and Echocardiography for Quantification of Left Ventricular Systolic Function in Rats Exposed to Doxorubicin Oliveira Luciano Fonseca Lemos de 1 O'Connell João Lucas 2 Carvalho Eduardo Elias Vieira de 1 Pulici Érica Carolina Campos 2 Romano Minna Moreira Dias 1 Maciel Benedito Carlos 1 Simões Marcus Vinicius 1 Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Centro de Cardiologia Brazil Centro de Cardiologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (USP) - Brazil Universidade de São Paulo Universidade Federal de Uberlândia MG Brazil Universidade Federal de Uberlândia (UFU), MG - Brazil Universidade Federal de Uberlândia Mailing address: Marcus Vinícius Simões, Cardiology Division - Internal Medicine Department, Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 3900 Bandeirantes Avenue- Postal Code 14048-900 - Ribeirão Preto - SP - Brazil. Email: msimoes@fmrp.usp.br

Author contributions

Conception and design of the research: O'Connell JL, Pulici ECC, Romano MMD, Maciel BC, Simões MV; Acquisition of data: Oliveira LFL, O'Connell JL, Carvalho EEV, Pulici ECC, Romano MMD; Analysis and interpretation of the data: Oliveira LFL, O'Connell JL, Carvalho EEV, Pulici ECC, Simões MV; Statistical analysis: Oliveira LFL, Simões MV; Obtaining financing: Simões MV; Writing of the manuscript: Oliveira LFL, Carvalho EEV, Simões MV; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Oliveira LFL, Romano MMD, Maciel BC, Simões MV.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 01 2017 108 1 12 20 06 03 2016 18 03 2016 28 06 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Radionuclide ventriculography (RV) is a validated method to evaluate the left ventricular systolic function (LVSF) in small rodents. However, no prior study has compared the results of RV with those obtained by other imaging methods in this context.

 Objectives:

To compare the results of LVSF obtained by RV and echocardiography (ECHO) in an experimental model of cardiotoxicity due to doxorubicin (DXR) in rats.

 Methods:

Adult male Wistar rats serving as controls (n = 7) or receiving DXR (n = 22) in accumulated doses of 8, 12, and 16 mg/kg were evaluated with ECHO performed with a Sonos 5500 Philips equipment (12-MHz transducer) and RV obtained with an Orbiter-Siemens gamma camera using a pinhole collimator with a 4-mm aperture. Histopathological quantification of myocardial fibrosis was performed after euthanasia.

 Results:

The control animals showed comparable results in the LVSF analysis obtained with ECHO and RV (83.5 ± 5% and 82.8 ± 2.8%, respectively, p > 0.05). The animals that received DXR presented lower LVSF values when compared with controls (p < 0.05); however, the LVSF values obtained by RV (60.6 ± 12.5%) were lower than those obtained by ECHO (71.8 ± 10.1%, p = 0.0004) in this group. An analysis of the correlation between the LVSF and myocardial fibrosis showed a moderate correlation when the LVSF was assessed by ECHO (r = -0.69, p = 0.0002) and a stronger correlation when it was assessed by RV (r = -0.79, p < 0.0001). On multiple regression analysis, only RV correlated independently with myocardial fibrosis.

 Conclusion:

RV is an alternative method to assess the left ventricular function in small rodents in vivo. When compared with ECHO, RV showed a better correlation with the degree of myocardial injury in a model of DXR-induced cardiotoxicity.

 Keywords: Radionuclide Ventriculography / methods Echocardiography / methods Ventricular Function, Left Comparative Study Rats Doxorubicin Introduction

In recent decades, imaging methods assessing functional and structural cardiac parameters in small animals in vivo have been widely used to study the pathophysiological mechanisms of ventricular dysfunction in different models of cardiac disease, and to develop new therapies for heart failure (HF).1-7 These methods allow a longitudinal study of the animals, increasing the power of observation at lower costs.

Among measurable parameters, the left ventricular systolic function (LVSF) is a key variable to evaluate myocardial remodeling, degree of ventricular dysfunction, and prognosis of myocardial disease. Echocardiography (ECHO) has been widely used to assess the ventricular function in humans and models of cardiac disease, as it is a low-cost tool for rapid acquisition of images without requirement of radioactive isotopes.1,2,8 However, the echocardiographic evaluation, especially in small rodents, depends largely on the observer and has restricted interobserver reproducibility, limiting the detection of subtle changes.9

Radionuclide ventriculography (RV) is a technique often used in clinical practice with good accuracy and high reproducibility levels in serial evaluations for LVSF quantification.10,11 In addition, RV is considered by many as the gold-standard method to assess ventricular function, as it faithfully represents the volumes of the ventricular chambers at each moment of the cardiac cycle without assumptions of myocardial shape and/or geometry.12-14 However, few studies have demonstrated its application in models of cardiac diseases in small animals.15,16

Although the use of RV in models of experimental cardiac disease in small rodents has been described for quite some time,15,16 there have been no studies comparing results obtained with RV with those obtained by other imaging methods in vivo. The objective of this study was to conduct a comparative analysis of the ability of ECHO and RV in evaluating the global systolic performance of the left ventricle and correlate these results with the severity of cardiac structural changes detected by histopathological analysis in a model of anthracycline-induced cardiotoxicity.

 Methods Experimental animals

After approval by the Ethics Committee on Animal Experimentation of our institution, the study was performed in 29 male Wistar rats weighing approximately 250 g, obtained from the institution's animal room. The animals were kept in an air-conditioned room, with free access to water and standard chow, subjected to a rhythm of 12 hours of light/dark and controlled temperature. During all procedures, maximum care was taken to avoid inflicting unnecessary suffering to the animals.

 General Study Design

To achieve a broader observation of the accuracy of both imaging methods in variable ranges of LVSF impairment, we used different doses of intravenous infusion of doxorubicin (DXR). This approach also allowed us to obtain a wide dispersion of the investigated variables to correlate better the changes in cardiac function measured in vivo and the degree of in vitro histological lesions that served as the gold-standard method to assess myocardial injury.

Based on that, the animals received three different cumulative doses of DXR over 8 weeks: D-8 mg: total infusion of DXR 8 mg/kg administered as four weekly injections of 2 mg/kg (n = 8); D-12 mg: 12 mg/kg accumulated over six weekly injections of 2 mg/kg (n = 7); D-16 mg: 16 mg/kg administered as eight weekly injections of 2 mg/kg (n = 7). Seven control animals received injections of saline solution over 8 weeks.

All animals underwent noninvasive LVSF evaluation with in vivo imaging methods, ECHO, and RV at baseline and 2 weeks after the end of the period of infusion of the respective doses of DXR or saline.

 Medications administered

Adriablastina® RD (doxorubicin hydrochloride, Pharmacia, Milan, Italy) was dissolved in saline solution (10 mg/5 mL) and infused intravenously. A solution containing ketamine hydrochloride (Vetbrands, Jacareí, São Paulo, Brazil; 20 mg/kg) and xylazine (Bayer, São Paulo, Brazil; 8 mg/kg) was administered by intramuscular injection for anesthetic induction before each intravenous injection of DXR and imaging evaluations. To euthanize the animals, we used an overdose of these anesthetics (40 and 16 mg/kg, respectively).

 Echocardiography

After sedation and trichotomy of the anterior chest region, the animals, while breathing spontaneously, were placed in the left lateral decubitus position and evaluated with ECHO Doppler with a two-dimensional, high-resolution ECHO system (Sonos 5500 Philips, Andover, MA, USA) and a sectorial transducer with a frequency of 12 MHz. The ventricular function was estimated by the calculation of the left ventricular fractional shortening, measured from the short-axis view of the left ventricle. The area shortening was determined by the formula: Delta Areas = (AD - AS)/AD x 100,17 in which AD and AS are the areas in the diastole and systole, respectively. The fractional area shortening has been shown to be effective in detecting left ventricular systolic dysfunction in experimental models of myocardial infarction in rats18-20 and has the advantage of considering the two-dimensional image of the short axis of the left ventricle, compared with the ventricular shortening fraction (ΔD%), which takes into account only a linear ventricular dimension in the diastole and systole.

The images obtained were recorded and archived for later off-line analysis by an observer blinded to the group to which the animals were allocated. All measurements were obtained by the same investigator and revised by another; both were experienced in obtaining and analyzing ECHOs in small animals.

 Radionuclide ventriculography

After anesthesia, 75 μg of stannous agent was injected into the tail vein. After an interval of 15 min, the animals received a new tail vein injection of 15 mCi of technetium pertechnetate-99m. Immediately after the administration of Tc-99m, the animals were taken to the gamma camera and positioned in a dorsal decubitus position under the detector. Three electrodes were implanted in the animals' hypodermis for electrocardiographic monitoring, positioned in the two anterior limbs and on the upper portion of the abdomen, as shown in Figure 1.

Positioning of the animal and the electrodes for radionuclide ventriculography.

RV was performed with the gamma camera Orbiter-Siemens (Siemens, Erlangen, Germany), equipped with a pinhole collimator with a 4-mm aperture. Images were obtained in the left anterior oblique projection in a word format, 64 x 64 pixels matrices, synchronized with the electrocardiogram (ECG) with an acceptance window of 20% around the mean QRS duration value and with 32 frames per cardiac cycle. We acquired 200,000 counts per frame. The symmetric energy window of 20% focused on the Tc-99m energy photopeak was 140 keV.

To process the images, we used a commercially available software (planar gated blood pool, SMV America) in a dedicated workstation (NXT-P, Sopha Medical Vision). After semiautomatic detection of the edges of the left ventricle and with the help of parametric images of phase and count amplitude variation, a time versus activity curve was generated. From this curve, we calculated the LVSF, expressed as percentage (%), defined as the difference between the values corrected for the background radiation of the end diastolic and systolic counts divided by the value of the end diastolic count (Figure 2).

Images of the cardiac blood compartment labeled with <sup>99m</sup>Tc in the left anterior oblique projection, in diastolic (A) and systolic (B) frames, allowing quantification of the LVSF after regions of interest were traced. LVSF = 76%.

Histology

After the animals had been euthanized, we quantified the extent of the myocardial fibrosis by measuring the collagen area in the myocardium. The hearts were sliced transversely, embedded in paraffin, and stained with picrosirius red. To quantify the collagen, we used the Leica QWin Software V 3.2.0 (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, England) along with an optical microscope Leica DMR (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Germany), a video camera (Leica DC300F, Leica Microsystems AG Heerbrugg, Switzerland), and an online computer. The values corresponding to the areas of fibrosis were obtained in relation to the total area of the left and right ventricles and septum, expressed as percentages. We evaluated 10 fields in the free left ventricular wall.

 Statistical analysis

To calculate the sample size, we established a (two-tailed) confidence interval of 95% and test power of 90%, assuming a standard deviation of 5 and 3 percentage units of LVSF for ECHO and RV, respectively; these values were obtained from a pilot study in control animals. As a result, a sample size of 22 animals was deemed appropriate to detect a difference of 5 ejective units between the methods. The sample size was calculated with a tool available online at http://www.openepi.com.

The results are expressed as mean and standard deviation. The Gaussian distribution of the variables was assessed with the Kolmogorov-Smirnov test. For comparison between mean LVSF values evaluated by the methods, we used paired Student's t test. To compare the mean values of the extension of the myocardial fibrosis between the control animals and the animals that received DXR, we used non-paired Student's t test. To analyze the correlation of the LVSF obtained by the imaging methods, we used the linear regression test and the least squares correlation. The Bland-Altman plot method was used for further analysis of the agreement between the LVSF measurements obtained by the two evaluated methods. Linear regression was also used to evaluate the correlation between the LVSF and the area of fibrosis.

All analyses were performed using the software GraphPad InStat, version 3.05, with a significance level of 5% (p < 0.05, two-tailed) for differences.

 Results Assessment of the left ventricular systolic function

Table 1 and Figure 3 summarize the results obtained.

Summary of the mean and standard deviation results obtained from the evaluation of the left ventricular systolic function by echocardiography and radionuclide ventriculography in animals in the control group and animals that received doxorubicin
ECHO (%) RV (%) Fibrosis (%)
DXR (n=22) 71.8 ± 10.1 60.6 ± 12.5 8.7 ± 3.2
Control (n=7) 83.5 ± 5 82.8 ± 2.8 2.3 ± 1
p 0.002 <0.0001 <0.0001

ECHO: echocardiography; RV: radionuclide ventriculography, DXR: doxorubicin.

Graph showing the left ventricular systolic function obtained by two-dimensional echocardiography (2D-ECHO) and radionuclide ventriculography (RV) in animals in the control group and animals exposed to DXR.

The analysis of the LVSF in control animals showed values comparable to those obtained with RV and two-dimensional ECHO (82.8 ± 2.8% versus 83.5 ± 5%, p > 0.05).

A comparison between the control animals and the animals that received DXR indicated that both imaging methods showed lower LVSF values in the group receiving DXR (p < 0.005). These animals also showed a greater area of fibrosis when compared with the control animals (8.7 ± 3.2% versus 2.3 ± 1%, respectively, p < 0.05).

Additionally, the animals that received DXR exhibited significantly lower LVSF values assessed by RV (60.6 ± 12.5%) when compared with those obtained with ECHO (71.8 ± 10.1%, p < 0.05).

 Analysis of correlation and agreement

Considering the entire study sample (including controls and animals exposed to DXR), individual LVSF measurements obtained by RV showed a significant and moderate positive correlation with those obtained by ECHO (r = 0.72, p < 0.0001) (Figure 4).

Graph correlating the left ventricular systolic function (LVSF) assessed by two-dimensional echocardiography (2D-ECHO) and radionuclide ventriculography (RV) in animals receiving different doses of doxorubicin (r = 0.72, p < 0.0001). (*Statistical test performed: linear regression analysis and Pearson's correlation coefficient).

A Bland-Altman plot analysis of the agreement between measurements (Figure 5) showed a mean difference (RV - ECHO) of -7.6 ± 10.3%, with limits of agreement of -28.1% to 12.9%. Analyzing the dispersion plot, we observed a significant positive correlation (r = 0.47, p = 0.01) between the mean values of the measurements obtained by RV and ECHO plotted against the difference of these same measurements, indicating that the methods do not have a good agreement for different ranges of LVSF values. This result suggests that RV estimates lower LVSF values than those estimated by ECHO in animals with a more compromised global systolic function.

Bland-Altman plot indicating poor agreement between the imaging methods, showing lower values observed by radionuclide ventriculography (RV) in animals with decreased left ventricular systolic function.

Correlation between the methods of in vivo functional evaluation and histological analysis

After applying linear regression, we observed a moderate and significant negative correlation between the LVSF values measured by ECHO and the area of accumulated collagen on histology (r = -0.69, p = 0.0002). We found a stronger significant negative correlation between the LVSF assessed by RV and the area of accumulated collagen (r = -0.79, p < 0.0001) (Figure 6). Using multiple regression analysis, in which both imaging methods were included in the regression model, only the ventricular function measured by RV correlated independently with the percentage of accumulated collagen in the myocardium.

Graph correlating the mean left ventricular systolic function (LVSF) values evaluated by (A) two-dimensional echocardiography (2D-ECHO) and (B) radionuclide ventriculography (RV) and the percentage of accumulated collagen on histological analysis in animals receiving an infusion of 8, 12, and 16 mg/kg of doxorubicin.

Discussion

In many experimental models of cardiac disease in small animals, the serial assessment of the LVSF is the most widely used parameter to follow the changes in myocardial function due to disease progression or the impact of pharmacological intervention.4

In the present study using in vivo imaging methods, we evaluated the LVSF in control animals and in animals subjected to an experimental model of cardiotoxicity induced by DXR. This allowed us to compare two-dimensional ECHO and RV in the quantification of the LVSF in animals with different degrees of LVSF impairment, as well as to correlate these data with the quantification of the area of collagen tissue on histopathological analysis, which is considered a gold-standard method to assess the degree of myocardial injury in this cardiotoxicity model.

Our results showed that the LVSF values obtained by RV and ECHO were similar in control animals. However, in animals with severe ventricular dysfunction due to the cumulative infusion of DXR, the LVSF values obtained by RV were lower when compared with those obtained by ECHO.

Additionally, we observed a significant moderate Correlation between the LVSF results obtained by RV and ECHO. However, this type of analysis does not necessarily demonstrate the agreement between both methods.21-23 The Bland-Altman plot analysis indicated that despite showing a significant correlation in the regression analysis, the measurements were not in agreement in regards to different ranges of LVSF values. This analysis shows that, in addition to very wide agreement limits, ECHO evaluates relatively higher LVSF levels than does RV in animals with a more depressed systolic function.

Overall, these results indicate a greater sensitivity of RV when compared with ECHO in detecting left ventricular systolic dysfunction in this experimental model.

This interpretation of the data is reinforced by the results of the agreement analysis between the LVSF values obtained by each method and the extension of the collagen accumulation, which is an index of the degree of myocardial injury in this model. For this analysis, the RV results reached a stronger correlation than that obtained with ECHO, with the RV emerging as the only method displaying an independent correlation in the multiple regression model. This set of data reinforces the impression that RV provides a more accurate assessment of the LVSF.

Although no experimental studies have compared both imaging methods, prior clinical studies are consistent with our results when they showed that although ECHO and RV have a good general Correlation for LVSF measurement, both methods only have a moderate degree of agreement.24-26

In a study in patients after acute myocardial infarction (AMI), Ray et al. (1995) demonstrated a mean difference of -8 ± 10% in the LVSF evaluation between RV and ECHO, with limits of agreement of -28% to +12%,27 results that mirror to some degree those described in this study. Another study in patients after AMI has also shown that the LVSF was overestimated when evaluated by ECHO in comparison with RV, with wide limits of agreement.28 Bellenger et al.,29 while studying patients with stable HF, have shown a significant difference in LVSF evaluated by both methods. They also showed a moderate correlation (r = 0.44), but with wide limits of agreement between them, from -45% to 13%.

A low agreement between both methods of LVSF assessment has also been observed in patients with permanent pacemaker30 and after cardiac transplantation,31 studies in which ECHO overestimated the LVSF when compared with RV and cardiac magnetic resonance.

These differences between techniques, which have already been observed in the clinical setting, can be enhanced in the experimental scenario given the mechanical and geometrical differences of the myocardium in small animals. It should be noted that the contribution of the apical shortening in rodents can be different from that observed in humans, which would further compromise the geometric assumptions adopted in the ECHO for volume estimates.32

ECHO is the imaging method most widely used in large clinical trials and experimental studies, but it is dependent on geometric myocardial assumptions to estimate the LVSF. This becomes disadvantageous in several situations, as in the case of progressive dilation and consequent geometric changes of the left ventricle in HF.33 In this sense, biplane methods are considered more accurate than the M-mode method; however, they still extrapolate ventricular volumes measurements through geometric assumptions of the left ventricular cavity.29 In experimental animal models, especially rodents, another limiting factor of two-dimensional ECHO in quantifying the ventricular function is the loss of image quality in apical windows, generating poor endocardium definition and impairing the measurement of the left ventricular cavity shortening.34-36

It is plausible to assume that this limitation in accurately estimating the LVSF in dilated ventricular cavities with a more spherical conformation, concomitant to a more severe systolic dysfunction, is the main explanation for the results obtained in the present study. It is worth mentioning that to estimate the left ventricular ejection fraction, the RV assessment is based on the variation of counts directly proportional to the volume of blood in the ventricular cavity, and is a method, therefore, that is not significantly influenced by changes in the left ventricular cavity shape and geometry. In contrast, values obtained with two-dimensional ECHO are based on planar measurements, which are highly dependent on the geometric shape of the left ventricular cavity. Due to that, their accuracy changes in situations with more severe ventricular dysfunction in which the left ventricle takes a more spherical shape, in addition to presenting other deformations in cavity shape. The advent of three-dimensional ECHO and its availability in new equipment dedicated to small animals will probably bring substantial accuracy improvement in estimating the LVSF by ECHO, as it allows a direct measurement of the volumes of the ventricular cavities.34-36

It is important to remember that RV has several technical limitations, such as low spatial resolution, need for background correction, structure overlap, attenuation errors, and need for manipulation of ionizing radiation.37 In small rodents, limited spatial resolution is the greatest limitation of acquiring scintigraphic images with a gamma camera dedicated for clinical use. In fact, as the structures to be imaged in small rodents are 10 times smaller than the human organs, the spatial resolution of a conventional scintigraphic study (around 1.0 cm) should be proportionately increased to 1 mm. In our study, the use of a pinhole collimator with a 4-mm aperture was sufficient to considerably increase the spatial resolution of the image, with due visualization of the separation between the right and left ventricles (Figure 2) and maintenance of the 15-minute image acquisition, which is still suitable for an experimental study.

On the other hand, it is essential to emphasize that despite the high performance of RV in measuring the LVSF, this imaging method is more expensive and lacks information on other parameters of left ventricular remodeling such as diameter, wall thickness, and changes in the valvar apparatus. Therefore, we believe that RV, combined with ECHO, may become an additional tool for a thorough evaluation of models of cardiac diseases in small animals.

Study limitations

Some limitations of this study should be highlighted. For example, we were unable to quantify the left ventricular ejection fraction by ECHO using the biplane Simpson's method due to a limitation in the resolution of the endocardium in the animals' apical images. It is possible that the use of a high-resolution ECHO equipment and a 30-MHz transducer dedicated to obtaining and analyzing images in small rodents could have yielded more reliable results. Similarly, a three-dimensional ECHO might have allowed the measurement of ventricular volumes and provided a far more accurate LVSF assessment. It is also noteworthy that our study did not include a gold-standard in vivo imaging method to measure the LVSF, such as cardiac magnetic resonance imaging.

 Conclusion

RV is an alternative method to evaluate the degree of left ventricular dysfunction in vivo in small rodents. When compared with ECHO, RV showed a better correlation with the degree of myocardial injury assessed by histopathology in a model of cardiotoxicity by DXR.

Our results suggest that although ECHO is a more available option, easy to use, and of low cost, RV may have in comparison a better performance, especially in sequential LVSF measurements in models of cardiac disease with changes in the left ventricular geometry.

Sources of Funding

This study was funded by FAEPA.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by João Lucas O'Connell, from Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

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Corbett JR Akinboboye OO Bacharach SL Borer JS Botvinick EH DePuey EG Quality Assurance Committee of the American Society of Nuclear Cardiology Equilibrium radionuclide angiocardiography J Nucl Cardiol 2006 13 6 e56-79 Artigos Originais Cardiologia Nuclear e PET Comparação entre a Ventriculografia Radioisotópica e a Ecocardiografia na Quantificação da Função Sistólica Ventricular Esquerda em Ratos Expostos à Doxorrubicina Oliveira Luciano Fonseca Lemos de 1 O'Connell João Lucas 2 Carvalho Eduardo Elias Vieira de 1 Pulici Érica Carolina Campos 2 Romano Minna Moreira Dias 1 Maciel Benedito Carlos 1 Simões Marcus Vinicius 1 Centro de Cardiologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (USP) - Brasil Universidade Federal de Uberlândia (UFU), MG - Brasil Correspondência: Marcus Vinícius Simões, Centro de Cardiologia - Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Avenida Bandeirantes 3900 - CEP 14048-900 - Ribeirão Preto - SP - Brasil. Email: msimoes@fmrp.usp.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: O'Connell JL, Pulici ECC, Romano MMD, Maciel BC, Simões MV; Obtenção de dados: Oliveira LFL, O'Connell JL, Carvalho EEV, Pulici ECC, Romano MMD; Análise e interpretação dos dados: Oliveira LFL, O'Connell JL, Carvalho EEV, Pulici ECC, Simões MV; Análise estatística: Oliveira LFL, Simões MV; Obtenção de financiamento: Simões MV; Redação do manuscrito: Oliveira LFL, Carvalho EEV, Simões MV; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Oliveira LFL, Romano MMD, Maciel BC, Simões MV.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A ventriculografia radioisotópica (VRI) é um método validado para avaliação da função sistólica do ventrículo esquerdo (FSVE) em pequenos roedores. Contudo, nenhum estudo prévio comparou os resultados obtidos com VRI com os obtidos por outros métodos de imagem neste contexto.

 Objetivos:

Comparar os resultados de FSVE obtidos por VRI e por ecocardiografia (ECO) em modelo experimental de cardiotoxicidade por doxorrubicina (DXR) em ratos.

 Métodos:

Ratos Wistar machos adultos controles (n = 7) e tratados com DXR (n = 22) em doses acumuladas de 8, 12 e 16 mg/kg, foram avaliados com ECO com equipamento Sonos 5500 Philips (transdutor de 12 MHz) e VRI adquirida em gama-câmara Orbiter-Siemens com colimador pinhole de 4 mm de abertura. Após eutanásia, foi realizada a quantificação histopatológica da fibrose miocárdica.

 Resultados:

Os animais controles apresentaram valores comparáveis na análise da FSVE à ECO e à VRI (83,5 ± 5% e 82,8 ± 2,8%, respectivamente, p > 0,05). Os animais que receberam DXR apresentaram valores menores de FSVE quando comparados aos dos controles (p < 0,05); entretanto, observou-se neste grupo menores valores de FSVE obtidos por VRI (60,6 ± 12,5%) quando comparados aos obtidos pela ECO (71,8 ± 10,1%, p = 0,0004). A análise da correlação entre a FSVE e a fibrose miocárdica mostrou uma correlação moderada quando a FSVE foi estimada com a ECO (r = -0,69, p = 0,0002) e mais forte quando a FSVE foi obtida por VRI (r = -0,79, p < 0,0001). Apenas a VRI apresentou correlação de forma independente com a fibrose miocárdica à análise de regressão múltipla.

 Conclusão:

A VRI é um método alternativo para avaliação da função ventricular esquerda in vivo em pequenos roedores, exibindo comparativamente à ECO melhor correlação com o grau de lesão miocárdica no modelo de cardiotoxicidade por DXR.

 Palavras-chave: Ventriculografia com Radionuclídeos /métodos Ecocardiografia / métodos Função Ventricular Esquerda Estudo Comparativo Ratos Doxorrubicina Introdução

Nas últimas décadas, métodos de imagem para avaliação in vivo de parâmetros funcionais e estruturais cardíacos em pequenos animais têm sido amplamente utilizados tanto no estudo de mecanismos fisiopatológicos de disfunção ventricular em vários modelos de cardiopatia, quanto no desenvolvimento de novas terapias para insuficiência cardíaca (IC).1-7 Esses métodos permitem um estudo longitudinal dos animais, aumentando o poder de observação a custos mais reduzidos.

Dentre os parâmetros mensuráveis, a função sistólica do ventrículo esquerdo (FSVE) é uma variável-chave na avaliação do remodelamento miocárdico, grau de disfunção ventricular e prognóstico da doença miocárdica. A ecocardiografia (ECO) tem sido amplamente utilizada para avaliação da função ventricular em humanos e em modelos de cardiopatia por ser uma ferramenta de baixo custo e com rápida obtenção de imagens sem necessidade de isótopos radioativos.1,2,8 Entretanto, a avaliação ecocardiográfica, especialmente em pequeno roedores, depende amplamente do avaliador e tem reprodutibilidade interobservador limitada, o que restringe a detecção de alterações discretas.9

A ventriculografia radioisotópica (VRI) é uma técnica frequentemente utilizada na prática clínica e que demonstra boa acurácia e níveis elevados de reprodutibilidade em avaliações seriadas para quantificação da FSVE.10,11 Além disso, a VRI é considerada por muitos o método padrão-ouro na avaliação da função ventricular, pois representa fielmente os volumes das câmaras ventriculares em cada momento do ciclo cardíaco sem assunções de forma e/ou geometria miocárdica.12-14 Entretanto, poucos estudos têm demonstrado sua aplicação em modelos de cardiopatia em pequenos animais.15,16

Embora o emprego da VRI em modelos de cardiopatia experimental em pequenos roedores tenha sido descrita há bastante tempo,15,16 não há estudos comparando resultados de VRI com os de outros métodos de imagem in vivo. O objetivo do presente estudo foi analisar comparativamente a capacidade da ECO e da VRI em avaliar o desempenho sistólico global do ventrículo esquerdo e correlacionar esses resultados com a gravidade das alterações estruturais cardíacas detectadas pela análise histopatológica em modelo de cardiotoxicidade por antraciclinas.

 Métodos Animais experimentais

Após aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal da nossa instituição, o estudo foi realizado com 29 ratos Wistar machos, com peso aproximado de 250 g, obtidos do Biotério Central da instituição. Os animais foram mantidos em alojamento climatizado, com acesso livre a água e ração padrão, submetidos a um ritmo de 12 horas de luz/sombra e temperatura controlada. Em todos os procedimentos, foi realizado esforço máximo para evitar sofrimento desnecessário dos animais.

 Delineamento geral do estudo

Para alcançarmos uma observação mais ampla da acurácia dos dois métodos de imagem em faixas variáveis de comprometimento da FSVE, utilizamos diferentes doses de infusão intravenosa de doxorrubicina (DXR). Esta abordagem nos permitiu também obter uma dispersão ampla das variáveis investigadas para melhor correlação das alterações da função cardíaca medida in vivo e o grau de lesão histológica in vitro que serviu como padrão-ouro de lesão miocárdica.

Dessa forma, os animais receberam ao longo de 8 semanas três diferentes doses acumuladas de DXR: D-8 mg: infusão total de 8 mg/kg de DXR através de quatro injeções semanais de 2 mg/kg (n = 8); D-12mg: 12 mg/kg acumulada ao longo de seis injeções semanais de 2 mg/kg (n = 7); D-16mg: 16 mg/kg através de oito injeções semanais de 2 mg/kg (n = 7). Sete animais controles receberam injeções de solução salina ao longo de 8 semanas.

Todos os animais foram submetidos à avaliação não invasiva da FSVE mediante emprego de métodos de imagem in vivo, ECO e VRI na condição basal e 2 semanas após o término do período de infusão das respectivas doses de DXR ou salina.

 Medicações administradas

O fármaco Adriablastina® RD (cloridrato de doxorrubicina, Pharmacia, Milão, Itália) foi dissolvido em salina (10 mg/5 mL) e infundido por via intravenosa. Uma solução contendo cloridrato de ketamina (Vetbrands, Jacareí, São Paulo, Brasil - 20 mg/kg) e xilazina (Bayer, São Paulo, Brasil - 8 mg/kg) foi administrada por via intramuscular para a indução anestésica antes de cada injeção intravenosa de DXR e da realização dos exames de imagem. Para a eutanásia dos animais, foi utilizada uma sobredose destes anestésicos (40 e 16 mg/kg, respectivamente).

 Ecocardiografia

Após sedação e tricotomia da região anterior do tórax, os animais, sob ventilação espontânea, foram posicionados em decúbito lateral esquerdo e avaliados com ecodopplercardiografia com um sistema de ECO bidimensional de alta resolução (Sonos 5500 Philips, Andover, MA, EUA), com transdutor setorial com 12 MHz de frequência. A função ventricular foi avaliada pelo cálculo da fração de encurtamento da área do ventrículo esquerdo, medida a partir do eixo curto do ventrículo. O encurtamento da área foi determinado pela fórmula: Delta Áreas = (AD - AS)/AD x 100,17 na qual AD e AS são as áreas na diástole e sístole, respectivamente. A fração de encurtamento de áreas tem se mostrado efetiva na detecção de disfunção sistólica do ventrículo esquerdo em modelos experimentais de infarto do miocárdico em ratos18-20 e traz a vantagem de considerar a imagem bidimensional do ventrículo no eixo curto, em comparação à fração de encurtamento ventricular (ΔD%), que leva em consideração apenas uma dimensão linear ventricular na diástole e na sístole.

As imagens obtidas foram gravadas e arquivadas para posterior análise off-line por observador cego ao grupo de estudo ao qual o animal pertencia. Todas as medidas foram obtidas pelo mesmo investigador e revisadas por outro, ambos com experiência na obtenção e análise de ECO em pequenos animais.

 Ventriculografia radioisotópica

Após a anestesia, foi administrada uma injeção com 75 μg de agente estanhoso na veia da cauda. Após um intervalo de 15 min, os animais receberam nova injeção na veia da cauda de 15 mCi de pertecnetato de Tc-99m. Imediatamente após a administração do Tc-99m, os animais foram levados à gama-câmara e posicionados em decúbito dorsal sob o detector. Foram implantados três eletrodos na hipoderme dos animais para monitorização eletrocardiográfica, posicionados nos dois membros anteriores e na porção superior do abdômen, como mostra a Figura 1.

Posicionamento do animal e dos eletrodos para realização da ventriculografia radioisotópica.

A VRI foi realizada com gama-câmara Orbiter-Siemens (Siemens, Erlangen, Alemanha), equipada com um colimador pinhole com orifício de abertura de 4 mm. Foram obtidas imagens na projeção oblíqua anterior esquerda em formato word, matrizes de 64 por 64 pixels, sincronizadas com a eletrocardiografia (ECG) com janela de aceitação de 20% em torno do valor médio da duração do QRS e com 32 quadros por ciclo cardíaco. Foram adquiridas 200.000 contagens por quadro. A janela de energia simétrica de 20% centrada no fotopico de energia do Tc-99m foi de 140 keV.

Para o processamento das imagens, foi utilizado um programa disponível comercialmente (planar gated blood pool, SMV America) em uma estação de trabalho dedicada (NXT-P, Sopha Medical Vision). Após detecção semiautomática das bordas do ventrículo esquerdo, com auxílio das imagens paramétricas de fase e de amplitude de variação de contagens, uma curva tempo versus atividade foi gerada. A partir da curva, foi calculada a FSVE, expressa em valores percentuais (%), definida como a diferença entre os valores corrigidos para a radiação de fundo das contagens diastólicas e sistólicas finais dividida pelo valor das contagens diastólicas finais (Figura 2).

Imagens do compartimento sanguíneo cardíaco marcado com <sup>99m</sup>TC, na projeção oblíqua anterior esquerda, nos quadros diastólico (A) e sistólico (B), permitindo quantificar a função sistólica ventricular esquerda (FSVE) mediante desenho de regiões de interesse. FSVE = 76%.

Histologia

Após a eutanásia dos animais, foi realizada a quantificação da extensão da fibrose miocárdica através da medida da área de colágeno miocárdico. Foram utilizados os corações cortados transversalmente, incluídos em parafina e corados com picrosírius vermelho. Para quantificação do colágeno, foi utilizado o programa Leica QWin Software V 3.2.0 (Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, Inglaterra) em conjunto com um microscópio óptico Leica DMR (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Wetzlar, Alemanha), videocâmera (Leica DC300F, Leica Microsystems AG, Heerbrugg, Suíça) e um computador online. Os valores referentes às áreas de fibrose foram obtidos em relação à área total dos ventrículos esquerdo e direito e do septo, expressos em porcentagem. Foram avaliados 10 campos da parede livre do ventrículo esquerdo.

 Análise estatística

Para o cálculo do tamanho da amostra, estabelecemos um intervalo de confiança de 95% (bicaudal) e poder de teste de 90%, assumindo um desvio padrão de 5 e 3 unidades percentuais da FSVE para a ECO e a VRI, respectivamente, valores obtidos em um estudo piloto em animais controles. Desta forma, o tamanho amostral de 22 animais seria adequado para detectarmos uma diferença de 5 unidades ejetivas entre os métodos. O tamanho da amostra foi calculado com a utilização da ferramenta disponível no site eletrônico http://www.openepi.com.

Os resultados estão expressos como média e desvio padrão. A distribuição Gaussiana das variáveis foi verificada mediante emprego do teste de Kolmogorov-Smirnov. Para comparação entre os valores médios de FSVE avaliados pelos métodos, utilizamos o teste t de Student pareado. Para comparação entre os valores médios da extensão da fibrose miocárdica entre os animais controles e os animais que receberam DXR, utilizamos o teste t de Student não pareado. Para análise de correlação da FSVE obtida pelos métodos de imagem, utilizamos o teste de regressão linear e correlação pelo método dos mínimos quadrados. O método gráfico de Bland-Altman foi utilizado para análise adicional da concordância entre as medidas de FSVE obtidas pelos dois métodos empregados. O teste de regressão linear também foi utilizado para avaliar a correlação entre a FSVE e a área de fibrose.

Todas as análises foram realizadas com o programa GraphPad InStat, versão 3.05, com um nível de significância para as diferenças de 5% (p < 0,05, bicaudal).

 Resultados Avaliação da função sistólica do ventrículo esquerdo

A Tabela 1 e a Figura 3 resumem os resultados obtidos.

Sumário dos resultados em média e desvio-padrão obtidos na avaliação da função sistólica do ventrículo esquerdo pela ecocardiografia e pela ventriculografia radioisotópica nos animais controles e nos que receberam doxorrubicina
ECO (%) VRI (%) Fibrose (%)
DXR (n=22) 71,8±10,1 60,6±12,5 8,7±3,2
Controle (n=7) 83,5±5 82,8±2,8 2,3±1
p 0,002 <0,0001 <0,0001

ECO: ecocardiografia; VRI: ventriculografia radioisotópica; DXR: doxorrubicina.

Gráfico evidenciando a função sistólica ventricular esquerda obtida por ecocardiografia bidimensional (ECO-2D) e ventriculografia radioisotópica (VRI) em animais do grupo controle e animais que receberam doxorrubicina.

A análise da FSVE nos animais controles revelou valores comparáveis aos obtidos mediante o emprego da VRI e da ECO bidimensional (82,8 ± 2,8% versus 83,5 ± 5%, p > 0,05).

A comparação entre os animais controles e animais que receberam DXR mostrou que ambos os métodos de imagem evidenciaram valores de FSVE mais reduzidos no grupo de animais que receberam DXR (p < 0,005). Esses animais apresentaram também uma área maior de fibrose quando comparados aos animais controles (8,7 ± 3,2% versus 2,3 ± 1%, respectivamente, p < 0,05).

Adicionalmente, os animais que receberam DXR exibiram valores significativamente menores de FSVE avaliada pela VRI (60,6 ± 12,5%) quando comparados aos obtidos com a ECO (71,8 ± 10,1%, p < 0,05).

 Análise de correlação e de concordância

Considerando toda a amostra estudada (incluindo controles e animais expostos à DXR), medidas individuais da FSVE obtidas por VRI mostraram uma correlação positiva moderada e significativa com as obtidas por ECO (r = 0,72, p < 0,0001) (Figura 4).

Gráfico de correlação entre a função sistólica ventricular esquerda (FSVE) avaliada por ecocardiografia bidimensional (ECO-2D) e ventriculografia radioisotópica (VRI) nos animais que receberam doses diferentes de doxorrubicina (r = 0,72, p < 0,0001). (*Teste estatístico realizado: análise de regressão linear e coeficiente de correlação de Pearson)

A análise de concordância entre as medidas com emprego do método gráfico de Bland-Altman (Figura 5) mostrou uma diferença média (VRI - ECO) de -7,6 ± 10,3%, com limites de concordância de -28,1% a 12,9%. Na análise da nuvem de dispersão, observou-se uma correlação positiva significativa (r = 0,47, p = 0,01) entre os valores da média das medidas obtidas pela VRI e ECO plotadas contra a diferença entre as mesmas medidas, indicando que os métodos não exibem boa concordância para diferentes faixas de valores de FSVE. Esse resultado sugere que a VRI estima valores de FSVE inferiores aos estimados pela ECO em animais com uma função sistólica global mais comprometida.

Gráfico de Bland-Altman evidenciando fraca concordância entre os métodos de imagem apresentando menores valores observados pela ventriculografia radioisotópica (VRI) em animais com a função sistólica do ventrículo esquerdo rebaixada.

Correlação entre os métodos de avaliação funcional in vivo e análise histológica

Pela aplicação da regressão linear, foi observada uma moderada correlação negativa e significativa entre a FSVE medida pela ECO e a área de colágeno acumulado determinada na análise histológica (r = -0,69, p = 0,0002). Foi verificada uma correlação negativa significativa e mais forte entre a FSVE avaliada pelo uso da VRI e a área de colágeno acumulado (r = -0,79, p < 0,0001) (Figura 6). Mediante análise de regressão múltipla, na qual ambos os métodos de imagem foram inseridos no modelo de regressão, apenas a função ventricular medida pela VRI correlacionou-se de forma independente com a porcentagem de colágeno acumulado no miocárdio.

Gráfico de correlação entre os valores médios da função sistólica ventricular esquerda (FSVE) avaliada por (A) ecocardiografia bidimensional (ECO-2D) e (B) ventriculografia radioisotópica (VRI) e a porcentagem de colágeno acumulado à análise histológica nos animais que receberam infusão de 8, 12 e 16 mg/kg de doxorrubicina.

Discussão

Em muitos modelos experimentais de cardiopatia em pequenos animais, a avaliação seriada da FSVE é o parâmetro mais amplamente empregado para acompanhar as mudanças na função miocárdica decorrente da evolução da doença ou do impacto da intervenção medicamentosa.4

No presente estudo, mediante o emprego de métodos de imagens in vivo, avaliamos a FSVE em animais controles e animais submetidos a um modelo experimental de cardiotoxicidade por DXR. Isso nos permitiu comparar a ECO bidimensional e a VRI na quantificação da FSVE em animais com diferentes graus de comprometimento da FSVE, assim como correlacionar esses dados com a quantificação da área de colágeno tecidual na análise histopatológica, considerada padrão-ouro na avaliação do grau de lesão miocárdica neste modelo de cardiotoxicidade.

Nossos resultados mostram que os valores de FSVE obtidos por VRI e ECO eram semelhantes nos animais controles. Entretanto, nos animais com disfunção ventricular consequente à infusão cumulativa de DXR, os valores de FSVE obtidos por VRI foram menores quando comparados aos obtidos por ECO.

Adicionalmente, observamos uma correlação moderada significativa entre os resultados da FSVE medidos pela VRI e pela ECO. Entretanto, essa forma de análise não demonstra necessariamente a concordância entre os dois métodos.21-23 A análise gráfica de Bland-Altman mostrou que apesar dos dados exibirem uma correlação significativa na análise de regressão, as medidas não foram concordantes para diferentes faixas de valores da FSVE. Esta análise mostra que além de limites de concordância muito amplos, em animais com função sistólica mais deprimida, o ECO avalia valores relativamente mais elevados de FSVE do que a VRI.

No conjunto, esses resultados indicam uma maior sensibilidade da VRI, comparativamente à ecocardiografia, para detectar disfunção sistólica no ventrículo esquerdo neste modelo experimental.

Essa interpretação dos dados é reforçada pelos resultados da análise de correlação entre os valores de FSVE obtidos por cada método e a extensão de acúmulo de colágeno, sendo este um índice do grau de lesão miocárdica neste modelo. Por esta análise, os resultados da VRI alcançaram correlação mais forte do que a obtida com a ECO, sendo a VRI a única a exibir correlação independente num modelo de regressão múltipla. Esse conjunto de dados reforça a impressão de que a VRI fornece uma avaliação mais acurada da FSVE.

Embora não exista nenhum trabalho no cenário experimental comparando ambos os métodos de imagem, estudos clínicos prévios são concordantes com nossos resultados ao mostrarem que embora a ecocardiografia e a VRI apresentem uma boa correlação geral para mensuração da FSVE, ambos os métodos apresentam apenas um grau moderado de concordância.24-26

Em um estudo em pacientes pós-IAM, Ray et al. (1995) demonstraram uma diferença média na avaliação da FSVE entre a VRI e a ECO de -8 ± 10%, com limites de concordância de -28% a +12%,27 resultados que espelham em certo grau os descritos neste trabalho. Outro estudo em pacientes pós-IAM também demonstrou uma superestimação da FSVE quando avaliada pela ecocardiografia em comparação à VRI e com amplos limites de concordância.28 Bellenger et al.,29 ao estudarem pacientes com IC estável, demonstraram uma diferença significativa da FSVE avaliada pelos dois métodos. Evidenciaram ainda uma moderada correlação (r = 0,44), mas com amplos limites de concordância entre eles, de -45% a 13%.

A baixa concordância entre as duas técnicas de avaliação da FSVE também foi evidenciada em pacientes portadores de marca-passo permanente,30 e em pacientes após transplante cardíaco,31 estudos nos quais a ecocardiografia superestimou a FSVE em comparação à VRI e à ressonância nuclear magnética cardíaca.

Essas diferenças entre as técnicas, que já foram bem observadas no cenário clínico, podem se acentuar no cenário experimental dadas as diferenças mecânicas e geométricas do miocárdio de pequenos animais. Cabe ressaltar ainda que a contribuição do encurtamento apical em roedores possa ser diferente daquela observada em humanos, o que comprometeria ainda mais as assunções geométricas adotadas na ECO para estimativas de volumes.32

A ECO é o método de imagem mais amplamente utilizado em grandes estudos clínicos e trabalhos experimentais, mas é dependente de assunções geométricas miocárdicas para estimativa da FSVE. Isso se torna desvantajoso em várias situações, como no caso da dilatação progressiva e consequente alteração geométrica do ventrículo esquerdo na IC.33 Neste sentido, os métodos biplanares são considerados mais precisos que o modo M; entretanto, continuam a extrapolar as quantificações de volumes ventriculares através de assunções geométricas da cavidade do ventrículo esquerdo.29 Em modelos animais experimentais, principalmente roedores, outro fator limitante da ECO bidimensional na quantificação da função ventricular é a perda da qualidade de imagem em janelas apicais, gerando pobre definição do endocárdio e dificultando a medida do encurtamento da cavidade do ventrículo esquerdo.34-36

É plausível supor que esta limitação na estimativa acurada da FSVE em cavidades ventriculares dilatadas e com conformação mais esférica, concomitante à disfunção sistólica mais grave, seja a principal explicação dos resultados obtidos no presente estudo. Vale ressaltar que para estimar a FEVE, a VRI se baseia na variação de contagens diretamente proporcionais ao volume de sangue na cavidade ventricular, sendo, portanto, um método que não sofre influência significativa das modificações de forma e geometria da cavidade ventricular esquerda. Em contrapartida, as avaliações obtidas com a ECO bidimensional se baseiam em medidas planares e são altamente dependentes da conformação geométrica da cavidade do ventrículo esquerdo. Sendo assim, sofrem alterações da sua acurácia em situações com disfunção ventricular mais graves nas quais o ventrículo esquerdo assume conformação mais esférica além de apresentar outras deformações de formato em sua cavidade. O advento da ECO tridimensional e sua disponibilidade em novos equipamentos dedicados a pequenos animais provavelmente trará uma melhora substancial na acurácia da estimativa da FSVE pelo método ecocardiográfico, ao permitir uma aferição direta dos volumes das cavidades ventriculares.34-36

É importante lembrar que a VRI sofre várias limitações técnicas, como baixa resolução espacial, necessidade de correções de fundo, sobreposição de estruturas, erros de atenuação e necessidade de manipulação de radiação ionizante.37 A maior limitação no emprego de uma gama-câmara de uso clínico para aquisições de imagens cintilográficas de pequenos roedores é a resolução espacial limitada. De fato, como as estruturas de pequenos roedores a serem avaliadas com imagem são de ordem de grandeza 10 vezes menor que os órgãos humanos, a resolução espacial de um estudo cintilográfico convencional (em torno de 1,0 cm) deveria ser aumentada proporcionalmente para 1 mm. No nosso estudo, a utilização de um colimador pinhole com abertura de 4 mm foi suficiente para aumentar consideravelmente a resolução espacial da imagem, com a devida visualização da separação entres os ventrículos direito e esquerdo (Figura 2) e manutenção do tempo de aquisição da imagem de 15 min, ainda adequado para um estudo experimental.

Por outro lado, é fundamental salientar que apesar do elevado desempenho da VRI na medição da FSVE, este método de imagem é mais dispendioso e não fornece informações sobre outros parâmetros de remodelamento do ventrículo esquerdo como diâmetros, espessura de paredes e alterações do aparelho valvar. Portanto, acreditamos que a VRI possa vir a ser uma ferramenta adicional aliada à ECO em uma avaliação mais completa dos modelos de cardiopatia em pequenos animais.

Limitações do estudo

Algumas limitações deste estudo devem ser apontadas. Por exemplo, não foi possível quantificar a fração de ejeção do ventrículo esquerdo pela ECO através do método biplanar de Simpson, devido à limitação na resolução do endocárdio nas imagens apicais dos animais. É provável que o emprego de um equipamento de ECO de alta resolução e um transdutor de 30 MHz, dedicado à obtenção e análise de imagens de pequenos roedores, poderia ter obtido resultados mais fidedignos. Da mesma forma, a eventual utilização da ECO tridimensional poderia ter permitido a medida de volumes ventriculares e proporcionado uma medida mais acurada da FSVE. Vale também ressaltar que nosso estudo não incluiu o uso de um método de imagem padrão-ouro in vivo para medir a FSVE, como a ressonância magnética cardíaca.

 Conclusão

A VRI é um método alternativo para avaliação do grau de disfunção ventricular esquerda em pequenos roedores in vivo, exibindo comparativamente à ECO uma melhor correlação com o grau de lesão miocárdica avaliada pela histopatologia no modelo de cardiotoxicidade por DXR.

Nossos resultados sugerem que embora a ECO seja uma opção mais disponível, de fácil emprego e baixo custo, a VRI possa ter, em comparação, um melhor desempenho, especialmente em medidas sequenciais da FSVE em modelos de cardiopatia com modificações da geometria ventricular esquerda.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAEPA.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de João Lucas O'Connell pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.