Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC PGtqzNQ8gbzmrCxgvzPrm9F S0066-782X2016004500542 10.5935/abc.20160179 Original Articles Cell Physiology Functional Effects of Hyperthyroidism on Cardiac Papillary Muscle in Rats Vieira Fabricio Furtado 1 Olivoto Robson Ruiz 1 Silva Priscyla Oliveira da 1 Francisco Julio Cesar 2 Fogaça Rosalvo Tadeu Hochmuller 1 Universidade Federal do Paraná Laboratório de Fisiologia da Contração Muscular Brazil Laboratório de Fisiologia da Contração Muscular - Universidade Federal do Paraná - Brazil Universidade Federal do Paraná Instituto de Pesquisa Pelé Pequeno Príncipe Curitiba PR Brazil Instituto de Pesquisa Pelé Pequeno Príncipe, Curitiba, PR - Brazil Mailing Address: Fabricio Furtado Vieira, Rua 15 de Setembro, 1491. Postal Code 84020-050, Ponta Grossa, PR - Brazil. E-mail: fabriciofurvi@yahoo.com.br

Author contributions

Conception and design of the research: Vieira FF, Olivoto RR, Fogaça RTH; Acquisition of data: Vieira FF, Silva PO, Francisco JC, Fogaça RTH; Analysis and interpretation of the data: Vieira FF, Olivoto RR, Silva PO, Fogaça RTH; Statistical analysis and Writing of the manuscript: Vieira FF, Fogaça RTH; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Vieira FF, Olivoto RR, Francisco JC, Fogaça RTH.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 12 2016 107 6 542 549 27 01 2016 24 05 2016 27 06 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Hyperthyroidism is currently recognized to affect the cardiovascular system, leading to a series of molecular and functional changes. However, little is known about the functional influence of hyperthyroidism in the regulation of cytoplasmic calcium and on the sodium/calcium exchanger (NCX) in the cardiac muscle.

 Objectives:

To evaluate the functional changes in papillary muscles isolated from animals with induced hyperthyroidism.

 Methods:

We divided 36 Wistar rats into a group of controls and another of animals with hyperthyroidism induced by intraperitoneal T3 injection. We measured in the animals' papillary muscles the maximum contraction force, speed of contraction (+df/dt) and relaxation (-df/dt), contraction and relaxation time, contraction force at different concentrations of extracellular sodium, post-rest potentiation (PRP), and contraction force induced by caffeine.

 Results:

In hyperthyroid animals, we observed decreased PRP at all rest times (p < 0.05), increased +df/dt and -df/dt (p < 0.001), low positive inotropic response to decreased concentration of extracellular sodium (p < 0.001), reduction of the maximum force in caffeine-induced contraction (p < 0.003), and decreased total contraction time (p < 0.001). The maximal contraction force did not differ significantly between groups (p = 0.973).

 Conclusion:

We hypothesize that the changes observed are likely due to a decrease in calcium content in the sarcoplasmic reticulum, caused by calcium leakage, decreased expression of NCX, and increased expression of a-MHC and SERCA2.

 Keywords: Hyperthyroidism / metabolism Rats Myocardium Myocardial Contraction Thyroid Hormones Introduction

A normal endocrine function is essential for the cardiovascular health.1 Hyperthyroidism is among the most common endocrine disorders, with a prevalence of 1.3% in the United States2 and 0.7% (95% confidence interval [CI] 0.2-1.1%) in Brazil.3 This condition is defined by increased levels of thyroid hormones (T3 and/or T4) and suppressed or decreased levels of TSH.2

It is now recognized that thyroid hormones affect the cardiovascular system. Changes in these hormones' circulating levels influence the cardiac contractility and electrophysiological function.4 Increased thyroid hormone levels (hyperthyroidism) result in increased cardiac contractility, speed of contraction and relaxation, cardiac output, and heart rate.1,5

Thyroid hormones regulate a variety of proteins in the cardiac myocyte (including myosin heavy chains [MHC] a and β, β-adrenergic receptors, SERCA2, and phospholamban [PLB]) and may lead to cardiac hypertrophy.6-8 These molecular changes ultimately affect the cellular calcium cycling.9

Due to the great importance of calcium as a signaling pathway in the generation of membrane depolarization, induction of calcium release by the sarcoplasmic reticulum (SR), and activation of the contractile machinery, pathophysiological conditions that alter the control of calcium in the myocyte are the main causes of contractile dysfunction in the cardiac muscle and development of arrhythmias.10

However, little is known about the thyroid hormones influence on cellular events associated with increased and decreased cytoplasmic calcium in the excitation-contraction coupling process in the cardiac muscle.11 The largest amount of information available comprises changes in gene expression of proteins involved in the excitation-contraction coupling. Still, the functional consequences of these proteins in hyperthyroidism are still largely unknown. Much less is known about the consequences of changes in the sodium/calcium exchanger (NCX) on the cardiac muscle function in hyperthyroidism.

The objective of this study was to evaluate the effects of hyperthyroidism on the cardiac function, including cardiac strength and contraction time and speed in papillary muscles isolated from rats.

 Methods

The study included 36 male Wistar rats weighing 250-300 g, provided by the Animal Facility of the Department of Biological Sciences at Federal University of Paraná (UFPR). All animals were kept in cages under controlled temperature and 12-hour light-dark cycles, with free access to food and water. All procedures performed in this study were approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA) at the Department of Biological Science, Federal University of Paraná (UFPR); Certificate No. 23075.098041/2011-11.

The animals were randomly divided into two groups: control (n = 18) and hyperthyroid (n = 18). Hyperthyroidism was induced by daily intraperitoneal injections of T3 (15 µg/100 g) during 10 days. The control group received daily injections of saline solution during the same period.12,13

After 10 days of treatment, the animals were anesthetized with ketamine (50 mg/kg) and xylazine (20 mg/kg), and subjected to thoracotomy. Their hearts were removed and placed in Ringer solution (pH = 7.4; 110 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM TRIS, 11 mM glucose). The hearts were subsequently weighed and fixed in a petri dish containing oxygenated Ringer solution prior to dissection of the left ventricle papillary muscles.

After dissection and removal of the papillary muscles, one end of the muscle was fixed to a micromanipulator and the other was attached to a force transducer (Fort 10 WPI, Transduction Laboratories Co.), which, in turn, was connected to a data acquisition system (LabChart - ADinstruments). The muscle was stretched to the length at which the active voltage was maximal (Lmax) and kept in a chamber with a continuously oxygenated saline solution at 32ºC.

Before each experiment, a calibration curve was obtained for the force transducer using known masses. The length of the papillary muscle was measured using a microscope eyepiece graticule. At the end of each experiment, the papillary muscles were weighed. The area of the transverse section was calculated using the formula: area = mass / (length x density), assuming the density as 1.0. Thus, the strength produced by the papillary muscles was normalized by their cross-sectional area. After these steps, the experimental protocol was initiated.

To evaluate the effects of the thyroid hormone administration, the animals in both groups were exposed to two experimental protocols. The first protocol involved several contractility measurements of isolated and electrically stimulated papillary muscles. The second protocol evaluated the contraction force induced by caffeine in quiescent papillary muscles (not electrically stimulated).

Experiments with electrically stimulated papillary muscle

After the papillary muscles were isolated and attached to a force transducer, as described above, the muscles were electrically stimulated with suprathreshold voltage pulses (10 to 15 V), with a maximum duration of 5 milliseconds, using a pair of platinum electrodes positioned along the entire muscle length. Using a micromanipulator, the muscle was then stretched to the Lmax. The standard stimulation frequency was 0.5 Hz (stabilized condition). The preparations were maintained in this condition during a stabilization period of 20-30 minutes and the experimental protocols were then conducted. The resultant force was recorded by a data acquisition system (LabChart - ADinstruments) connected to a computer.

The following contractile parameters were analyzed: maximum isometric force developed; post-rest potentiation (PRP), which is the increase in isometric contraction force obtained after electric stimulation pauses of 1, 3, 5, 10, and 20 seconds; maximum speed of contraction (+df/dt) and relaxation (-df/dt); total contraction time; time to peak contraction; time to maximum relaxation; and maximum contraction force at different concentrations of extracellular sodium.

For the PRP protocol, the electrical stimulation of the papillary muscles was interrupted after periods of stabilization of 1, 3, 5, 10, and 20 seconds. The amplitude of the first contraction after rest was compared with the amplitude of the force obtained before the resting period. These data were analyzed and expressed as percentage values of force obtained in the steady state prior to the resting period.

After stabilization in Ringer solution containing 110 mm NaCl, the preparation was placed in chambers with Ringer solution containing 90, 70, and 50 mM of NaCl. To maintain their osmolarity and ionic strength, the solutions were supplemented with lithium chloride (LiCl) at concentrations of up to 110 mM. The contraction amplitude was analyzed and expressed as percentage relative to the force value obtained in the solution with 110 mM of NaCl.

Both +df/dt and -df/dt were calculated in real time using the LabChart software. Data are expressed as force produced per cross-sectional area of muscle per second (mN/mm2/sec). Time to 100% of maximum force and time to maximum contraction force until 100% relaxation are expressed in seconds.

 Evaluation of the contraction in quiescent papillary muscles

Dissection and assembly of the papillary muscles in this experiment followed the same protocols described above, with the exception of the electrical stimulation.

This protocol was then carried out in three chambers containing different solutions. The first chamber contained Ringer solution. The second contained Ringer solution without sodium or calcium (Ringer 0Na+ - 0Ca2+), in which the sodium and calcium ions were replaced by lithium chloride in order to maintain the osmolarity and ionic strength equal to those in the Ringer solution. The third chamber was filled with Ringer solution 0Na+ - 0Ca2+ plus 30 mM of caffeine. According to the literature, caffeine is a known agonist of ryanodine receptors, and induces calcium release from the SR at concentrations of 30 mM.14

The preparation was initially immersed in Ringer solution for at least 30 minutes. It was then transferred to the Ringer solution 0Na+ 0Ca2+ and maintained for enough time to allow the force to reach the steady state (usually between 5 to 10 minutes). Then the papillary muscles were transferred to the chamber containing Ringer 0Na+ - 0Ca2+ plus 30 mM caffeine. The contraction force induced by caffeine was then compared between groups.

 Statistical analysis

The results were collected from at least six observations from each experiment and are expressed as mean ± standard error. The normality of the data was analyzed with the Shapiro-Wilk test, and the data were compared using Student's t test for independent samples. Statistical differences among groups were considered when p < 0.05. The software SigmaPlot (version 11.0) was used for data analysis.

 Results

Table 1 shows the body weight values on treatment days 1 and 10 and the heart weight values in both groups. After 10 days of treatment with the thyroid hormone, the animals in the hyperthyroid group showed a statistically significant decrease in body weight (p = 0.034) and increase in heart weight (p < 0.001) when compared with the animals in the control group.

Animals’ weights on the first and tenth days after treatment
n Animals’ weights (g) on the 1st day Animals’ weights (g) on the 10th day Heart weight (g)
Control 18 311 ± 10.94 336.2 ± 7.32 1.528 ± 0.036
Hyperthyroid 18 310 ± 9.57 309.7 ± 9.51 * 2.153 ± 0.074 #

p = 0.034;

p < 0.001

The results of the maximum isometric contraction force in electrically stimulated papillary muscles, +df/dt, -df/dt, and total contraction time are shown in Table 2 and Figure 1.

Force, speed, and contraction time parameters (n = 36)
Control Hyperthyroid p Value
Maximum force of isometric contraction (mN/mm2) 4.903 ± 0.13 4.917 ± 0.35 0.973
+df/dt (mN/mm2/s) 69.88 ± 2.77 105.90 ± 7.31 <0.001
-df/dt (mN/mm2/s) 51.92 ± 2.04 67.32 ± 3.59 <0.001
Total time of contraction (s) 0.441 ± 0.00 0.350 ± 0.00 <0.001
Time to peak contraction (s) 0.138 ± 0.01 0.108 ± 0.01 <0.001
Time to maximum relaxation (s) 0.303 ± 0.01 0.241 ± 0.01 <0.001

Maximum speed of contraction (+df/dt) and relaxation (-df/dt). The hyperthyroid group (n = 18) showed an increase in +df/dt and -df/dt when compared with the control group (n = 18).

Regarding the PRP, the hyperthyroid group had a significant reduction in the percentage of strength gain at all pause times when compared with the control group (Figures 2 and 3).

Percentage of strength after rest. The force gain at all resting times was significantly lower in the hyperthyroid group (n = 18) compared with the control group (n = 18) (*p < 0.001, # p < 0.05). Post-rest potentiation (PRP). The increase in isometric contraction force after electrical stimulation pauses of 1, 3, 5, 10, and 20 seconds was lower in the hyperthyroid group (n = 18) compared with the control group (n = 18).

Variations in the percentages of force generated at different extracellular sodium concentrations are expressed with reference to the force produced in a solution with 110 mM of extracellular sodium. A significant difference between groups was detected only at extracellular sodium concentrations of 70 mM (p < 0.001) and 50 mM (p < 0.001). At both times, the percentage of force gain in the hyperthyroid group was lower than that in the control group (Figure 4).

Percentage of force variation for different extracellular sodium concentrations. The force gain at different extracellular sodium concentrations was significantly lower in the hyperthyroid group in two conditions: extracellular sodium concentrations of 70 and 50 mM (n = 36, *p < 0.001).

Regarding the maximum contraction force (mN/mm2) induced by caffeine in quiescent papillary muscle, we found statistically significant differences between the groups (p < 0.001). The contraction force in the hyperthyroid group was lower than that in the control group (3.26 ± 0.88 mN/mm2 versus 8.13 ± 1.07 mN/mm2, respectively).

 Discussion

In this study, we found that papillary muscles isolated from hyperthyroid rats showed decreased PRP, increased +df/dt and -df/dt, reduced contraction and relaxation total times, reduced maximal force induced by caffeine, and low positive inotropic response to decreased concentration of extracellular sodium. However, no difference in the isometric contraction force was observed.

The increase in +df/dt and the reduction in the contraction time may be explained by increased a-MHC expression.6-7,15,16 Although evidence is limited, an increased expression and function of ryanodine receptors, SERCA2, and L-type calcium channels may have contributed to these results.11,17,18 These changes lead to increased calcium influx, rate of calcium release by ryanodine receptors, speed reuptake of calcium by SERCA2, and a-MHC ATPase activity, which may explain the increase in +df/dt, ultimately leading to a decreased time to reach the contraction peak.15,19,20

The SERCA2 to PLB ratio is an important determinant in calcium uptake kinetics in cardiac myocytes, influencing both the relaxation rate and force production.21 Hyperthyroid animals have shown an increased SERCA2/PLB ratio, due to a decreased amount of PLB and increased SERCA2.7,21-24 Increases in the amount of phosphorylated compared with non-phosphorylated PLB have also been reported.7 Altogether, these changes promote increases in the calcium uptake rate by the SR, causing increased relaxation speed of the cardiac muscle (-df/dt) and, consequently, decreased relaxation time.21,24

In the myocardium of most mammals, PRP is believed to be produced by the release of a larger amount of calcium stored in the SR during the pause period.25,26 However, a loss of cellular calcium during rest is well described in the ventricles of rabbits, cats, and guinea pigs. These animals, therefore, lack PRP, especially over long periods of rest. However, PRP occurs in mice and is accompanied by increased calcium stored in the SR.26

In this study, papillary muscles isolated from hyperthyroid animals showed both a reduction in the PRP and maximal force induced by caffeine, an agonist of the ryanodine receptor. The concentration of caffeine used in this study (30 mM) is sufficient to deplete the calcium from the SR. These data suggest that hyperthyroidism reduces the amount of calcium stored in the SR.

This decrease in calcium content in the SR may be due to three not mutually excluding possibilities: a) an increase in NCX expression and/or activity, which in the resting stimulation period would increase the extrusion of calcium from the cell, decreasing the amount of calcium available for uptake by the SR; b) decreased SERCA2 expression and/or activity, and c) increased calcium leakage from the SR through the ryanodine receptors.27

Our results on contractility, along with data from the literature, lead us to hypothesize that the SERCA2 function is increased and the NCX function is decreased. However, these two changes are unable to reduce the PRP, so we believe that this occurred due to the release of calcium by the SR ryanodine receptors.

Another factor that could have contributed to the decreased calcium content in the SR is the phosphorylation of the ryanodine receptors by calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII). Studies have shown that hypertrophic conditions and heart failure, both common in hyperthyroidism, increase the expression of CaMKII, favoring the opening of ryanodine receptors that lead to leakage of calcium from the SR.28

Ai et al.27 found increased levels of CaMKII and phosphorylation of ryanodine receptors in animals with heart failure, strengthening the hypothesis of the receptors opening and favoring diastolic calcium leakage from the SR.29,30

Song et al.31 induced cardiac hypertrophy with thyroid hormone in rats and observed a decrease in the content of calcium in the SR due to increased calcium leakage by ryanodine receptors. They observed in animals that developed hypertrophy that the reduction in the release of calcium during contraction could be due to increased spontaneous calcium release at rest.

Therefore, phosphorylation of ryanodine receptors by CaMKII increasing the spontaneous diastolic release of calcium from the SR could contribute to the decreased calcium in the SR.27,28 However, our model of hypertrophy was induced by thyroid hormone, and we were unable to find studies evaluating the expression of CaMKII in this model of hypertrophy.

The reduction in extracellular sodium concentration induces a positive inotropic response. Decreases in the electrochemical gradient of sodium reduce or even revert the NCX function, leading to increased intracellular concentration of calcium and, consequently, increased force.28,32,33

Diedrichs et al.33 have shown that the cardiac muscle in patients with heart failure is more sensitive to a reduction in extracellular sodium, exhibiting a greater increase in contractile force when compared with the muscle in normal individuals. According to the authors, this is due to intracellular calcium accumulation via NCX, whose expression and function is increased in heart failure.

Our results show that the contraction force in hyperthyroid animals was slightly increased when compared with that in controls. This may be explained by a reduced NCX function in hyperthyroidism. It is well described that hyperthyroid animals have decreased NCX expression.8,9

The strength of this study is the evaluation of the functional changes in isolated papillary muscles in hyperthyroidism. The major limitation, which is also a suggestion to be explored in other studies, is the lack of molecular biology experiments evaluating the expression of membrane proteins that control intracellular calcium and the calcium content in the SR.

 Conclusions

We demonstrated in this study that isolated papillary muscles from hyperthyroid animals presented decreased PRP, increased +df/dt and -df/dt, low positive inotropic response to decreased concentrations of extracellular sodium, decreased production of maximum force induced by caffeine, and decreased time to reach both the contraction peak and maximum relaxation. We hypothesize that these changes are likely due to a decrease in calcium content in the SR, probably caused by calcium leakage, decreased expression and/or activity of NCX, and increased expression of a-MHC and SERCA2.

Sources of Funding

This study was funded by CAPES.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Fabricio Furtado Vieira from Universidade Federal do Paraná.

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Ai X Curran JW Shannon TR Bers DM Pogwizd SM Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase modulates cardiac ryanodine receptor phosphorylation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in heart failure Circ Res 2005 97 12 1314 1322 28 Bers DM, Despa S. Cardiac myocytes Ca2+ and Na+ regulation in normal and failing hearts. J Pharmacol Sci. 2006;100(5):315-22. Bers DM Despa S Cardiac myocytes Ca2+ and Na+ regulation in normal and failing hearts J Pharmacol Sci 2006 100 5 315 322 29 Wehrens XH, Lehnart SE, Marks AR. Intracellular calcium release and cardiac disease. Annu Rev Physiol. 2005;67:69-98. Wehrens XH Lehnart SE Marks AR Intracellular calcium release and cardiac disease Annu Rev Physiol 2005 67 69 98 30 Zalk R, Lehnart SE, Marks AR. Modulation of the ryanodine receptor and intracellular calcium. Annu Rev Biochem. 2007;76:367-85. Zalk R Lehnart SE Marks AR Modulation of the ryanodine receptor and intracellular calcium Annu Rev Biochem 2007 76 367 385 31 Song LJ, Wang GL, Liu J, Qiu QY, Ou JH, Guan YY. Cellular mechanisms of reduced sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in L-thyroxin induced rat ventricular hypertrophy. Acta Pharmacol Sin. 2008;29(4):430-6. Song LJ Wang GL Liu J Qiu QY Ou JH Guan YY Cellular mechanisms of reduced sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in L-thyroxin induced rat ventricular hypertrophy Acta Pharmacol Sin 2008 29 4 430 436 32 Philipson KD, Nicoll DA. Sodium-calcium exchange: a molecular perspective. Annu Rev Physiol. 2000;62:111-33. Philipson KD Nicoll DA Sodium-calcium exchange: a molecular perspective Annu Rev Physiol 2000 62 111 133 33 Diedrichs H, Frank K, Schneider CA, Burst V, Hagemeister J, Zobel C, et al. Increased functional importance of the Na, Ca-exchanger in contracting failing human myocardium but unchanged activity in isolated vesicles. Int Heart J. 2007; 48(6):755-66. Diedrichs H Frank K Schneider CA Burst V Hagemeister J Zobel C Increased functional importance of the Na, Ca-exchanger in contracting failing human myocardium but unchanged activity in isolated vesicles Int Heart J 2007 48 6 755 766 Artigos Originais Fisiologia Celular Efeitos Funcionais do Hipertireoidismo no Músculo Papilar Cardíaco de Ratos Vieira Fabricio Furtado 1 Olivoto Robson Ruiz 1 Silva Priscyla Oliveira da 1 Francisco Julio Cesar 2 Fogaça Rosalvo Tadeu Hochmuller 1 Laboratório de Fisiologia da Contração Muscular - Universidade Federal do Paraná - Brasil Instituto de Pesquisa Pelé Pequeno Príncipe, Curitiba, PR - Brasil Correspondência: Fabricio Furtado Vieira, Rua 15 de Setembro, 1491. CEP 84020-050, Ponta Grossa, PR - Brasil. E-mail: fabriciofurvi@yahoo.com.br

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Vieira FF, Olivoto RR, Fogaça RTH; Obtenção de dados: Vieira FF, Silva PO, Francisco JC, Fogaça RTH; Análise e interpretação dos dados: Vieira FF, Olivoto RR, Silva PO, Fogaça RTH; Análise estatística e Redação do manuscrito: Vieira FF, Fogaça RTH; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Vieira FF, Olivoto RR, Francisco JC, Fogaça RTH.

 Resumo Fundamento:

Sabe-se atualmente que o hipertireoidismo afeta o sistema cardiovascular, ocasionando uma série de alterações funcionais e moleculares. No entanto, pouco se sabe sobre a influência funcional do hipertireoidismo na regulação do cálcio citoplasmático e no trocador de sódio/cálcio (NCX) no músculo cardíaco.

 Objetivos:

Avaliar as alterações funcionais de músculos papilares isolados de animais com hipertireoidismo induzido.

 Métodos:

Ao todo, 36 ratos Wistar foram distribuídos em um grupo controle e outro grupo com hipertireoidismo induzido por injeção intraperitoneal de T3. Nos músculos papilares isolados dos animais foram medidos a força máxima de contração, a velocidade de contração (+df/dt) e relaxamento (-df/dt), o tempo de contração e relaxamento, a força de contração em diferentes concentrações de sódio extracelular, o potenciação pós-pausa (PPP) e a força de contração induzida por cafeína.

 Resultados:

Em animais com hipertireoidismo, observamos uma diminuição da PPP em todos os períodos de repouso (p < 0,05), aumento do +df/dt e -df/dt (p < 0,001), baixa resposta inotrópica positiva à concentração reduzida de sódio extracelular (p < 0,001), diminuição da força máxima de contração induzida por cafeína (p < 0,003) e diminuição do tempo total de contração (p < 0,001). A força máxima de contração não diferiu significativamente entre os grupos (p = 0,973).

 Conclusões:

Nossa hipótese é de que as alterações observadas são provavelmente resultantes de uma diminuição do conteúdo de cálcio do retículo sarcoplasmático causada por vazamento de cálcio, redução da expressão do NCX e aumento da expressão de a-MHC e SERCA2.

 Palavras-chave: Hipertireoidismo / metabolismo Ratos Miocárdio Contração Miocárdica Hormônios Tireóideos Introdução

Uma função endócrina normal é essencial para a saúde cardiovascular.1 O hipertireoidismo é um dos distúrbios endócrinos mais comuns, com uma prevalência de 1,3% nos Estados Unidos2 e 0,7% (intervalo de confiança [IC] de 95% 0,2-1,1%) no Brasil.3 Essa condição é definida por um aumento nos níveis de hormônios tireoidianos (T3 e/ou T4) e supressão ou diminuição dos níveis de TSH.2

Sabe-se atualmente que os hormônios tireoidianos afetam o sistema cardiovascular. Mudanças nos níveis circulantes desses hormônios influenciam a contratilidade cardíaca e a função eletrofisiológica.4 Aumentos nos níveis de hormônios tireoidianos (hipertireoidismo) resultam em um aumento na contratilidade cardíaca, velocidade de contração e relaxamento, débito cardíaco e frequência cardíaca.1,5

Os hormônios tireoidianos regulam uma variedade de proteínas nos miócitos cardíacos (incluindo cadeias pesadas de miosina [MHC] a e b, receptores beta-adrenérgicos, SERCA2 e fosfolambam [PLB]) e podem levar à hipertrofia cardíaca.6-8 Essas alterações moleculares acabam por afetar o ciclo do cálcio na célula.9

Devido à grande importância do cálcio como uma via de sinalização na geração da despolarização de membrana, na indução da liberação de cálcio pelo retículo sarcoplasmático (RS) e na ativação do aparato contrátil, condições fisiopatológicas que alteram o controle do cálcio no miócito são as principais causas de disfunção contrátil do músculo cardíaco e arritmias.10

No entanto, pouco se sabe sobre a influência dos hormônios tireoidianos nos eventos celulares associados com aumento e diminuição do cálcio citoplasmático no processo do acoplamento excitação-contração do músculo cardíaco.11 A maioria das informações disponíveis compreende alterações na expressão gênica de proteínas envolvidas no acoplamento excitação-contração. Ainda assim, as consequências funcionais dessas proteínas no hipertireoidismo permanecem amplamente desconhecidas. Menos ainda se sabe sobre as consequências das alterações do trocador de sódio/cálcio (NCX) na função do músculo cardíaco no hipertireoidismo.

O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do hipertireoidismo na função cardíaca, incluindo a força cardíaca e a velocidade e o tempo de contração em músculos papilares isolados de ratos.

 Métodos

O estudo incluiu 36 ratos machos Wistar com peso de 250-300 g, fornecidos pelo Biotério do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná (UFPR). Todos os animais foram mantidos em gaiolas sob temperatura controlada e ciclos claro-escuro de 12 horas, com livre acesso à ração e água. Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Uso Animal (CEUA) do Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná (UFPR); Certificado No. 23075.098041/2011-11.

Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: um grupo controle (n = 18) e outro com hipertireoidismo (n = 18). O hipertireoidismo foi induzido por injeções diárias intraperitoneais de T3 (15 µg/100 g) durante 10 dias. O grupo controle recebeu injeções diárias de solução salina durante o mesmo período.12,13

Após 10 dias de tratamento, os animais foram anestesiados com quetamina (50 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg) e submetidos à toracotomia. Os corações foram removidos e colocados em solução de Ringer (pH = 7,4; 110 mM de NaCl, 4 mM KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2, 10 mM Tris, 11 mM glicose). Em seguida, os corações foram pesados e fixados em uma placa de petri contendo solução de Ringer oxigenada antes da dissecção dos músculos papilares do ventrículo esquerdo.

Após a dissecção e remoção do músculo papilar, uma das extremidades do músculo foi fixada a um micromanipulador e a outra a um transdutor de força (Fort 10 WPI, Transduction Laboratories Co.), que por sua vez foi conectado a um sistema de aquisição de dados (LabChart - ADinstruments). O músculo era então estirado até o comprimento de tensão ativa máxima (Lmáx) e mantido em uma câmara com solução salina continuamente oxigenada a 32ºC.

Antes de cada experimento, uma curva de calibração foi obtida para o transdutor de força utilizando massas conhecidas. O comprimento do músculo papilar foi medido com a utilização de uma retícula ocular. Os músculos papilares eram pesados ao final de cada experimento. A área da secção transversal foi calculada com a fórmula: área = massa / (comprimento x densidade), assumindo uma densidade de 1,0. Desta maneira, a força produzida pelos músculos papilares foi normalizada pela área transversal do próprio músculo. Após essas etapas, o protocolo experimental foi iniciado.

Para avaliar os efeitos da administração do hormônio tireoidiano, os animais em ambos os grupos foram expostos a dois protocolos experimentais. O primeiro protocolo envolveu várias medições da contratilidade e estimulação elétrica do músculo papilar isolado. O segundo protocolo avaliou a força de contração induzida por cafeína em músculos papilares quiescentes (não estimulados eletricamente).

Experimentos com músculo papilar estimulado eletricamente

Após os músculos papilares terem sido isolados e conectados a um transdutor de força, como descrito acima, foram estimulados eletricamente com pulsos de tensão supraliminares (10 a 15 V), com uma duração máxima de 5 milissegundos e utilização de um par de eletrodos de platina posicionados ao longo de todo o comprimento muscular. Com uso de um micromanipulador, o músculo foi estendida até o Lmáx. A frequência de estimulação padrão foi de 0,5 Hz (condição estabilizada). As preparações foram mantidas nessas condições durante um período de estabilização de 20-30 minutos e os protocolos experimentais foram então realizados. A força resultante foi registrada por um sistema de aquisição de dados (LabChart - ADinstruments) conectado a um computador.

Os seguintes parâmetros contráteis foram analisados: força máxima isométrica desenvolvida; potenciação pós-pausa (PPP), que corresponde ao aumento na força de contração isométrica obtida após pausas na estimulação elétrica de 1, 3, 5, 10 e 20 segundos; velocidade máxima de contração (+df/dt) e relaxamento (-df/dt); tempo de contração total; tempo até o pico de contração; tempo até o relaxamento máximo; e força máxima de contração em diferentes concentrações de sódio extracelular.

Para o protocolo PPP, a estimulação elétrica do músculo papilar foi interrompida após períodos de estabilização de 1, 3, 5, 10 e 20 segundos. A amplitude da primeira contração após o repouso foi comparada com a amplitude da força obtida antes do período de repouso. Esses dados foram analisados e expressos como valores de porcentagem de força obtidos no estado estável antes do período de repouso.

Após a estabilização em solução de Ringer contendo 110 mm de NaCl, a preparação foi colocada em câmaras com solução de Ringer contendo 90, 70 e 50 mM de NaCl. Para manter a osmolaridade e a força iônica, as soluções foram suplementadas com cloreto de lítio (LiCl) em concentrações de até 110 mM. A amplitude da contração foi analisada e expressa como porcentagem em relação aos valores de força obtidos na solução com 110 mM de NaCl.

A +df/dt e a -df/dt foram calculadas em tempo real com utilização do programa LabChart. Os dados estão expressos como força produzida por área transversal do músculo por segundo (mN/mm(2)/seg). O tempo para 100% da força máxima e o tempo de força de contração máxima até 100% de relaxamento estão expressos em segundos.

 Avaliação da contração em músculos papilares quiescentes

A dissecção e a montagem dos músculos papilares neste experimento seguiram os mesmos protocolos descritos acima, com exceção da estimulação elétrica.

Este protocolo foi realizado em três câmaras contendo soluções diferentes. A primeira câmara continha solução de Ringer. A segunda continha solução de Ringer sem sódio ou cálcio (Ringer 0Na+ - 0Ca2+), na qual os íons sódio e cálcio foram substituídos por cloreto de lítio para manter a osmolaridade e a força iônica iguais às da solução de Ringer. A terceira câmara foi preenchida com solução de Ringer 0Na+ - 0Ca2+ e 30 mM de cafeína. De acordo com a literatura, a cafeína é um conhecido agonista dos receptores de rianodina e induz liberação de cálcio do RS em concentrações de 30 mM.14

A preparação foi inicialmente imersa em solução de Ringer durante pelo menos 30 minutos. Em seguida, foi transferida para a solução de Ringer 0Na+ 0Ca2+ e mantida por tempo suficiente para que a força atingisse o estado estacionário (normalmente entre 5 a 10 minutos). Os músculos papilares foram então transferidos para a câmara com Ringer 0Na+ - 0Ca2+ e 30 mM de cafeína. A força de contração induzida pela cafeína foi comparada entre os grupos.

 Análise estatística

Os resultados foram coletados de pelo menos seis observações em cada experimento e estão expressos como média ± erro padrão. A normalidade dos dados foi analisada com o teste de Shapiro-Wilk e os dados foram comparados com o teste t de Student para amostras independentes. Diferenças estatísticas entre os grupos foram consideradas quando p < 0,05. O programa SigmaPlot (versão 11.0) foi utilizado para a análise dos dados.

 Resultados

A Tabela 1 mostra os valores de peso corporal nos dias 1 e 10 de tratamento e os valores do peso cardíaco em ambos os grupos. Após 10 dias de tratamento com o hormônio tireoidiano, os animais do grupo com hipertireoidismo mostraram uma diminuição estatisticamente significativa no peso corporal (p = 0,034) e aumento no peso do coração (p < 0,001) quando comparados aos animais do grupo controle.

Peso dos animais no primeiro e décimo dia após o tratamento
n Peso dos animais (g) no 1º. dia Peso dos animais (g) no 10º. dia Peso do coração (g)
Controle 18 311 ± 10,94 336,2 ± 7,32 1,528 ± 0,036
Hipertireoidismo 18 310 ± 9,57 309,7 ± 9,51* 2,153 ± 0,074 #

p = 0,034;

p < 0,001.

Os resultados da força máxima de contração isométrica dos músculos papilares estimulados eletricamente, +df/dt, -df/dt e tempo de contração total estão mostrados na Tabela 2 e na Figura 1.

Parâmetros de força, velocidade e tempo de contração (n = 36)
Controle Hipertireoidismo Valor de p
Força máxima de contração isométrica (mN/mm2) 4,903 ± 0,13 4,917 ± 0,35 0,973
+df/dt (mN/mm2/s) 69,88 ± 2,77 105,90 ± 7,31 <0,001
-df/dt (mN/mm2/s) 51,92 ± 2,04 67,32 ± 3,59 <0,001
Tempo total de contração (s) 0,441 ± 0,00 0,350 ± 0,00 <0,001
Tempo até contração máxima (s) 0,138 ± 0,01 0,108 ± 0,01 <0,001
Tempo até relaxamento máximo (s) 0,303 ± 0,01 0,241 ± 0,01 <0,001

Velocidade máxima de contração (+df/dt) e relaxamento (-df/dt). O grupo com hipertireoidismo (n =18) mostrou um aumento no +df/dt e -df/dt quando comparado com o grupo controle (n = 18).

Em relação ao PPP, o grupo com hipertireoidismo teve uma redução significativa no percentual de ganho de força em todos os momentos de pausa quando comparados com o grupo controle (Figuras 2 e 3).

Porcentagem de força após repouso. O ganho de força em todos os momentos de repouso foi significativamente menor no grupo com hipertireoidismo (n = 18) em comparação ao grupo controle (n = 18) (*p < 0,001, # p < 0,05). Potenciação pós-pausa (PPP). O aumento da força de contração isométrica após pausas de 1, 3, 5, 10 e 20 segundos na estimulação elétrica foi menor no grupo com hipertireoidismo (n = 18) em comparação ao grupo controle (n = 18).

Variações nas porcentagens da força gerada em diferentes concentrações de sódio extracelular estão expressas com referência à força produzida em uma solução com 110 mM de sódio extracelular. Uma diferença significativa entre os grupos foi detectada apenas em concentrações de sódio extracelular de 70 mM (p < 0,001) e 50 mM (p < 0,001). Em ambos os momentos, o percentual de ganho de força no grupo com hipertireoidismo foi menor do que o observado no grupo controle (Figura 4).

Percentagem de variação na força para concentrações diferentes de sódio extracelular. O ganho de força em diferentes concentrações extracelulares de sódio foi significativamente menor no grupo com hipertireoidismo em duas condições, em concentrações extracelulares de sódio de 70 e 50 mM (n = 36, *p < 0,001).

Em relação à força máxima de contração (mN/mm2) induzida pela cafeína em músculos papilares quiescentes, encontramos diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (p < 0,001). A força de contração no grupo com hipertireoidismo foi menor do que a no grupo controle (3,26 ± 0,88 mN/mm2 versus 8,13 ± 1,07 mN/mm2, respectivamente).

 Discussão

Neste estudo, observamos que músculos papilares isolados de ratos com hipertireoidismo mostraram diminuição da PPP, aumento na +df/dt e -df/dt, redução dos tempos de contração e relaxamento total, redução da força máxima induzida pela cafeína e baixa resposta inotrópica positiva a uma baixa concentração de sódio extracelular. No entanto, nenhuma diferença foi observada na força de contração isométrica.

O aumento na +df/dt e a redução no tempo de contração podem ser explicados por um aumento na expressão de a-MHC.6-7,15,16) Embora as evidências sejam limitadas, uma expressão e função aumentadas dos receptores de rianodina, SERCA2 e canais de cálcio tipo L podem ter contribuído para esses resultados.11,17,18 Essas alterações levam a um aumento no influxo de cálcio, na taxa de liberação de cálcio pelos receptores de rianodina, na velocidade da recaptação do cálcio pela SERCA2 e na atividade da α-MHC ATPase, o que pode explicar o aumento na +df/dt, levando em última análise a uma diminuição do tempo para atingir o pico da contração.15,19,20

A razão SERCA2/PLB é um determinante importante na cinética da captação de cálcio nos miócitos cardíacos, influenciando tanto a taxa de relaxamento quanto a produção de força.21 Animais com hipertireoidismo mostraram um aumento da razão SERCA2/PLB devido a uma diminuição na quantidade de PLB e aumento da SERCA2.7,21-24 Aumentos na quantidade de PLB fosforilada em comparação com a não fosforilada também têm sido relatados.(7) Essas mudanças, em conjunto, promovem um aumento na taxa de captação de cálcio pelo RS, causando um aumento na velocidade de relaxamento do músculo cardíaco (-df/dt) e, consequentemente, diminuição no tempo de relaxamento.21,24

No miocárdio da maioria dos mamíferos, acredita-se que o PPP seja produzido pela liberação de uma quantidade maior de cálcio armazenada no RS durante o período de pausa.25,26 No entanto, a perda de cálcio celular durante o repouso é bem descrita nos ventrículos de coelhos, gatos e cobaias. Estes animais, portanto, não apresentam PPP, especialmente durante longos períodos de repouso. No entanto, a PPP ocorre em camundongos e é acompanhada pelo aumento do cálcio armazenado no RS.26

No presente estudo, músculos papilares isolados de animais com hipertireoidismo mostraram uma redução na PPP e na força máxima induzida por cafeína, uma agonista do receptor de rianodina. A concentração de cafeína utilizada neste estudo (30 mM) é suficiente para esgotar o cálcio do RS. Esses dados sugerem que o hipertireoidismo reduz a quantidade de cálcio armazenado no RS.

Esta diminuição no conteúdo de cálcio no RS pode ser devida a três possibilidades não mutuamente excludentes: a) um aumento na expressão e/ou atividade do NCX, que no período de repouso da estimulação aumentaria a extrusão de cálcio das células, diminuindo a quantidade de cálcio disponível para captação pelo RS; b) diminuição da expressão e/ou atividade da SERCA2 e c) aumento no vazamento de cálcio do RS através dos receptores de rianodina.27

Nossos resultados sobre contratilidade, juntamente com dados da literatura, nos levam a supor que a função da SERCA2 está aumentada e a do NCX está diminuída. No entanto, essas duas alterações não poderiam causar uma redução no PPP; assim, acreditamos que isso se deva ao cálcio liberado pelos receptores de rianodina do RS.

Outro fator que pode ter contribuído para a diminuição no conteúdo de cálcio no RS é a fosforilação dos receptores de rianodina pela proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina (CaMKII). Estudos têm mostrado que condições hipertróficas e insuficiência cardíaca, ambas comuns no hipertireoidismo, aumentam a expressão da CaMKII, favorecendo a abertura dos receptores de rianodina que levam ao vazamento de cálcio do RS.28

Ai et al.27 encontraram níveis aumentados de CaMKII e fosforilação dos receptores de rianodina em animais com insuficiência cardíaca, fortalecendo a hipótese de abertura dos receptores e favorecendo o vazamento de cálcio do RS durante a diástole.29,30

Song et al.31 induziram hipertrofia cardíaca com hormônio tireoidiano em ratos e observaram uma diminuição no conteúdo de cálcio do RS devido a um aumento no vazamento de cálcio dos receptores de rianodina. Nos animais que desenvolveram hipertrofia, esses autores observaram que a redução na liberação de cálcio durante a contração poderia ser devida a um aumento da liberação espontânea de cálcio em repouso.

Portanto, a fosforilação dos receptores de rianodina pela CaMKII aumentando a liberação espontânea de cálcio do RS na diástole poderia contribuir para a diminuição no cálcio do RS.27,28 No entanto, nosso modelo de hipertrofia foi induzido por hormônio tireoidiano e não fomos capazes de encontrar estudos avaliando a expressão de CaMKII neste modelo de hipertrofia.

A redução na concentração de sódio extracelular induz uma resposta inotrópica positiva. Diminuição no gradiente eletroquímico de sódio reduz ou mesmo reverte a função do NCX, levando a um aumento da concentração intracelular de cálcio e da força.28,32,33

Diedrichs et al.33 demonstraram que o músculo cardíaco em pacientes com insuficiência cardíaca é mais sensível à redução do sódio extracelular, exibindo um aumento maior na força contrátil quando comparado com o músculo de indivíduos normais. Segundo os autores, isso ocorre devido ao acúmulo intracelular de cálcio através do NCX, cuja expressão e função estão aumentadas na insuficiência cardíaca.

Nossos resultados mostram que a força de contração em animais com hipertireoidismo está ligeiramente aumentada quando comparada com a de controles. Isto pode ser explicado por uma função reduzida do NCX no hipertireoidismo. A expressão reduzida de NCX em animais com hipertireoidismo é bem reconhecida.8,9

O ponto forte do presente estudo é a avaliação das alterações funcionais no músculo papilar isolado no hipertireoidismo. A principal limitação, que é também uma sugestão para ser explorada em outros estudos, é a falta de experimentos envolvendo biologia molecular para avaliar a expressão de proteínas de membrana que controlam o cálcio intracelular e o conteúdo de cálcio no RS.

 Conclusões

Nós demonstramos neste estudo que músculos papilares isolados de animais com hipertireoidismo apresentaram uma diminuição do PPP, aumento da +df/dt e -df/dt, baixa resposta inotrópica positiva a baixas concentrações de sódio extracelular, diminuição da produção de força máxima induzida por cafeína e diminuição do tempo para atingir o pico da contração e relaxamento máximo. A nossa hipótese é que essas alterações observadas possam ser devidas a uma diminuição no conteúdo de cálcio no RS, provavelmente causado por um vazamento de cálcio, expressão e/ou atividade reduzida de NCX e expressão aumentada de a-MHC e SERCA2.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela CAPES.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Fabricio Furtado Vieira pela Universidade Federal do Paraná.