Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC bPrW6CMmnd6jSpNHHsd9ZwR S0066-782X2016004500532 S0066-782X2016005026101 10.5935/abc.20160174 Original Article Exercising Testosterone and Voluntary Exercise, Alone or Together Increase Cardiac Activation of AKT and ERK1/2 in Diabetic Rats Chodari Leila 1 Mohammadi Mustafa 1 Mohaddes Gisou 2 Alipour Mohammad Reza 1 Ghorbanzade Vajiheh 1 Dariushnejad Hassan 1 Mohammadi Shima 1 Tabriz University of Medical Sciences Drug Applied Research Center Tabriz Iran Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences; Tabriz - Irã Tabriz University of Medical Sciences Tabriz University of Medical Sciences Neuroscience Research Center Tabriz Iran Neuroscience Research Center of Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz - Irã Tabriz University of Medical Sciences Mailing address: Dr. Mustafa Mohammadi, Department of Physiology, Faculty of Medicine, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran. Email: m.mohammadin@yahoo.com

Author contributions

Conception and design of the research and Writing of the manuscript: Chodari l, Mohammadi M, Mohaddes G; Acquisition of data: Chodari l, Mohammadi M, Mohaddes G, Ghorbanzade V, Dariushnejad H, Mohammadi S; Analysis and interpretation of the data: Chodari l, Mohammadi M, Alipour MR, Ghorbanzade V, Dariushnejad H, Mohammadi S; Statistical analysis: Chodari l, Mohammadi M, Alipour MR; Obtaining financing: Mohammadi M; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Chodari l, Mohammadi M, Mohaddes G, Alipour MR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 10 11 2016 12 2016 107 6 532 541 11 01 2016 08 07 2016 04 08 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Impaired angiogenesis in cardiac tissue is a major complication of diabetes. Protein kinase B (AKT) and extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathways play important role during capillary-like network formation in angiogenesis process.

 Objectives:

To determine the effects of testosterone and voluntary exercise on levels of vascularity, phosphorylated Akt (P- AKT) and phosphorylated ERK (P-ERK) in heart tissue of diabetic and castrated diabetic rats.

 Methods:

Type I diabetes was induced by i.p injection of 50 mg/kg of streptozotocin in animals. After 42 days of treatment with testosterone (2mg/kg/day) or voluntary exercise alone or in combination, heart tissue samples were collected and used for histological evaluation and determination of P-AKT and P-ERK levels by ELISA method.

 Results:

Our results showed that either testosterone or exercise increased capillarity, P-AKT, and P-ERK levels in the heart of diabetic rats. Treatment of diabetic rats with testosterone and exercise had a synergistic effect on capillarity, P-AKT, and P-ERK levels in heart. Furthermore, in the castrated diabetes group, capillarity, P-AKT, and P-ERK levels significantly decreased in the heart, whereas either testosterone treatment or exercise training reversed these effects. Also, simultaneous treatment of castrated diabetic rats with testosterone and exercise had an additive effect on P-AKT and P-ERK levels.

 Conclusion:

Our findings suggest that testosterone and exercise alone or together can increase angiogenesis in the heart of diabetic and castrated diabetic rats. The proangiogenesis effects of testosterone and exercise are associated with the enhanced activation of AKT and ERK1/2 in heart tissue.

 Keywords: Testosterone Rats Diabetes Mellitus: Angiogenesis Exercise Proto-Oncogenese Proteins C-akt Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Introduction

Diabetes mellitus is a metabolic disease with a high and increasing prevalence worldwide.1 Cardiovascular complications are the main causes of mortality and morbidity in diabetic subjects and suppression of angiogenesis in coronary heart and peripheral vascular system can possess influential effects in this case.2 AKT and ERK are two major signaling pathways that play central role in regulating cell proliferation, migration, and survival through their downstream targets.3,4 There are evidences that AKT-dependent signaling pathways have a critical role in the regulation of cardiac growth, contractile function, and coronary angiogenesis.5,6 It has been proved that AKT signaling pathway enhances angiogenesis in the heart tissue.7 MAPK-ERK signaling plays an important role during angiogenesis and is necessary for endothelial cell sprouting.8

Testosterone is the major gonadal androgen in men. Testosterone deficiency is common in men with diabetes and male STZ-induced diabetic rats.9 Also, it is shown that cardiovascular disease increase with testosterone deficiency.10 These observations may indicate that testosterone supplementation in diabetic men would be beneficial in attenuating cardiovascular disease.

Exercise has beneficial effects on functional properties of both healthy and diabetic heart muscle. Also, exercise training improves blood glucose metabolism, insulin action and cardiovascular risk factors in diabetic subjects.11 Voluntary exercise as a mild/moderate exercise12 have been shown to decrease cardiovascular disease.11 In the animal model of voluntary exercise, the animal has free access to a running wheel and uses the wheel according its physiological threshold for physical activity12.

Although the cardiovascular system is an important target of exercise and androgen action, the molecular mechanism of action of testosterone and voluntary exercise in heart of diabetics remains largely unexplored. So, the aim of this study was to investigate the effect of testosterone replacement therapy and exercise training, alone or in combination on P-Akt and P-ERK levels (as proangiogenic factors) in the heart tissue of diabetic and castrated diabetic rats.

 Methods Animals

Animals used in this study were provided by the colony of our university. The animals were housed in a temperature-controlled facility (21 -23°C), maintained on a 12:12-h light-dark cycle with food and water provided ad libitum. All animal experiments were performed under the guidelines on human use and care of laboratory animals for biomedical research published by National Institutes of Health (8th ed., revised 2011) and conformed to the Declaration of Helsinki. The Ethics Committee of Tabriz University approved the experimental protocol. Sixty-three male Wistar rats (250 - 270 g) were randomly assigned to testosterone or placebo treatment and sedentary or voluntary exercise groups. Then, the animals were divided into nine groups (n= 7): 1- Diabetic sham castration + placebo group (Dia-S- Cas), 2-Diabetic + placebo group (Dia), 3-Diabetic + Testosterone group (Dia -T), 4-Diabetic + Exercise + placebo group (Dia-E), 5-Diabetic + Exercise + Testosterone group (Dia-T-E), 6-Diabetic + castrated + placebo group (Dia-Cas), 7- Diabetic + castrated + Testosterone group (Dia-Cas-T), 8-Diabetic + castrated + Exercise + placebo group (Dia-Cas-E) ,9-Diabetic + castrated + Testosterone+ Exercise group (Dia-Cas-T-E) .

 Castration and hormone replacement therapy

Sexually adult male rats were anesthetized with ketamine hydrochloride (80 mg/kg) and xylazine hydrochloride (5 mg/kg). Then, animals were placed in a supine position and their testes were removed via a low-middle abdominal incision or remained intact. To avoid disruption of hormonal influence, testosterone replacement began immediately after surgery.13 Testosterone propionate (UNIGEN, Life Science) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and administered subcutaneously at a physiological dose (2 mg/kg /day) for 6 weeks.14 Rats in the Dia-S- Cas, Dia, Dia-E, Dia-Cas and Dia-Cas-E groups were injected with the same amount of DMSO vehicle.

 Induction of diabetes

All animals were injected with streptozotocin (50 mg/kg) (Sigma, St. Louis Mo, USA), to induce type I diabetes.15 Streptozotocin was dissolved in 10 mM sodium citrate, pH 4.5, with 0.9% NaCl. Diabetes was verified 72 h later by evaluating blood glucose levels by using glucometer (Elegance, Model: no: CT-X10 Germany). Rats with a blood glucose level ≥300 mg/dL were considered to be diabetic.16 Induction of diabetes in animals was performed seven days after castration surgery.

 Voluntary exercise

Voluntary exercise is considered as mild / moderate exercise. In this study, rats in exercise groups were housed individually in cages that were equipped with a stainless-steel vertical running wheel (Tajhiz Gostar, Tehran) and were allowed free access to the wheel 24 h per day for 6 weeks. The wheels were bound to a permanent sensor that activated a digital counter of wheel revolutions. Total wheel circulations were recorded daily, with total distance run per day determined by multiplying the number of wheel rotations by wheel circumference. Animals that had run less than 2000 m/day were replaced.15

Tissue processing and protein measurement

At the end of study, heart tissues were excised and frozen in liquid nitrogen immediately. Tissue samples from left ventricle were stored in -70 °C temperature until phospho-AKT (serine 473) and phospho-ERK 1/2 (threonine 202/tyrosine204) measurements. In order to measure protein levels in heart tissue, samples were homogenized in PBS (pH 7.2-7.4) and centrifuged for 20 min at the speed of 3000 rpm at 4°C. Resulting supernatants were removed and target proteins were extracted. Phosphorylated and activated forms of AKT (Eastbiopharm Co., Ltd., Hangzhou, China) and ERK1/2 (Abcam, Cambridge, U.K.) levels were measured by high-sensitivity ELISA and normalized to the total protein concentration for each sample as determined by the Bradfored assay.

 Histological evaluation

Tissue samples from left ventricle were immediately isolated and fixed in 10% buffered-formalin solution, dehydrated in ascending grades of alcohol and embedded in paraffin. Sections of 5 µm were taken, stained with hematoxylin-eosin (H-E), and examined under light microscope (Olympus BH-2, Tokyo, Japan) in a blinded manner. Heart tissues were evaluated in terms of interstitial edema, congestion, leukocytosis infiltration, and myonecrosis.

 Angiogenesis assay

Angiogenesis was measured by microvasculature density (MVD) in five sections at 50mm intervals from the intensely vascularized area under a light microscope by two independent observers who were blinded to the experimental conditions. The numbers of microvessels from each section were counted and calculated for the average number of microvessels per section.17

Statistical analysis

Data are expressed as means± SEM. After having evaluated the homogeneity of variance and normal distribution of data, one or two-way analysis of variance (ANOVA) and also Tukey's test was used to compare quantitative data. Mann-Whitney U test was used to test histological variables. Statistical significance was defined as p<0.05. Statistical analysis of data was carried out using SPSS statistical software (Version 17.0).

 Results Effects of testosterone and voluntary exercise on P- AKT levels in the heart tissue of type I diabetic and diabetic castrated rats

One-way ANOVA showed that castration significantly (p<0.01) decreased P- AKT protein levels in the heart tissue of diabetic rats. Treatment of diabetic (p<0.01) and diabetic castrated (p<0.05) groups with testosterone significantly raised P-AKT protein levels in the heart tissue compared to diabetes group (Figura 1A). Figure 1 B (analysis by one way ANOVA) shows that six weeks treatment of diabetic (p<0.01) and diabetic castrated (p<0.001) groups with exercise significantly raised P-AKT protein levels in heart compared to diabetic and diabetic castrated groups, respectively. Two way ANOVA in figure 1C shows that combination therapy with testosterone and exercise in diabetic rats significantly (p<0.001) enhanced P-AKT protein levels in the heart tissue in comparison with diabetes group. Also, combination therapy with testosterone and exercise in diabetic rats showed a significant increasing effect on P-AKT protein levels compared to testosterone (p<0.001) or exercise (p<0.01) groups.

A) Effect of 6 weeks testosterone treatment on P-AKT protein levels in the heart tissue of diabetic and diabetic castrated groups; B) Effect of 6 weeks exercise training on P-AKT protein levels in the heart tissue of diabetic and diabetic castrated groups; C) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on P-AKT protein levels in the heart tissue of the diabetic group; D) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on P-AKT protein levels in the heart tissue of the diabetic castrated group. Data are expressed as mean± SEM for 7 animals. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs the Dia group, &&& p<0.001 vs the Dia-T group, @@ p<0.01 vs the Dia-E group, +++ p<0.001 vs the Dia-Cas group, ▲ p<0.05 vs the Dia-Cas-E group, Δ p<0.05vs the Dia-Cas-T group.

Figure 1D shows that in diabetes-castration group, six weeks combination therapy with testosterone and exercise significantly (p<0.001) elevates P-AKT protein levels in the heart tissue in comparison with diabetes castrated group. Also, combination therapy with testosterone and exercise in castrated diabetic rats showed a significant (p<0.05) increasing effect on P-AKT protein levels compared to testosterone or exercise groups. Analysis of data for sham group showed no significant difference in comparison to diabetic group (data are not shown).

 Effects of testosterone and voluntary exercise on P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue of type I diabetic and diabetic castrated rats

One-way ANOVA showed that in the diabetes-castration group, P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue decreased significantly (p<0.05) in comparison to the diabetic group. Six weeks treatment of diabetic (p<0.05) and diabetic castrated (p<0.001) groups with testosterone significantly enhanced P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue in comparison to Dia and Dia-Cas groups, respectively (Figure 2A).

A) Effect of 6 weeks testosterone treatment on P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue of diabetic and diabetic castrated groups; B) Effect of 6 weeks exercise training on P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue of diabetic and diabetic castrated groups; C) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue of diabetic group; D) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue of the diabetic castrated group. Data are expressed as mean± SEM for 7 animals. *p<0.05, *** p<0.001 vs the Dia group. & p<0.05 vs the Dia-T group. @ p<0.05, @@ p<0.01 vs the Dia-E group. + p<0.05, ++ p<0.01 , +++ p<0.001 vs the Dia-Cas group. ▲ p<0.05 vs the Dia-Cas-E group. Δ p<0.05 vs the Dia-Cas-T group.

Figure 2B (analysis by one way ANOVA) shows that six weeks treatment of diabetic (p<0.05) and diabetic castrated (p<0.001) groups with exercise significantly raised P-ERK 1/2 protein levels in the heart compared to diabetic and diabetic castrated groups, respectively.

According to figure 2C (analysis by two way ANOVA), six weeks of combination therapy with testosterone and exercise in diabetic rats significantly (p<0.001) enhanced P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue in comparison with diabetes group. Also, combination therapy with testosterone and exercise in diabetic rats showed a significant increasing effect on P-ERK 1/2 protein levels compared to testosterone (p<0.05) or exercise (p<0.01) groups.

Figure 2D shows that in the diabetes-castration group, six weeks of combination therapy with testosterone and exercise significantly (p<0.001) increased P-ERK 1/2 protein levels in the heart tissue in comparison with the diabetes castrated group. Also, combination therapy with testosterone and exercise in castrated diabetic rats showed a significant (p<0.05) increasing effect on P-ERK 1/2 protein levels compared to testosterone or exercise groups. Analysis of data for the sham group showed no significant difference in comparison to diabetic group (data are not shown).

 Histopathological findings Effects of testosterone and voluntary exercise on myocardial tissues in type I diabetic and diabetic castrated rats

According to figure 3 and table 1A that analyzed by Mann-Whitney U test, castration increased interstitial edema (significantly p<0.05), leukocyte infiltration, and myonecrosis in the diabetes group. In the diabetic group, testosterone treatment resulted in a marked attenuation of interstitial edema, leukocyte infiltration and myonecrosis (significantly p<0.05) in comparison to the diabetic group. Also, six weeks exercise trained rats in the diabetes group had decreased interstitial edema, leukocyte infiltration (significantly p<0.05) and myonecrosis (significantly p<0.001) (Table 1B). Combination therapy with testosterone and exercise in diabetic rats showed a decreasing effect on myocardial tissues damage in comparison to Dia, Dia-E and Dia-T groups (Table 1C). Table 1A showed that in the Dia-Cas group testosterone treatment resulted in a marked attenuation of interstitial edema (significantly p<0.05), leukocyte infiltration (significantly p<0.01) and myonecrosis (significantly p<0.001) in comparison to the Dia-Cas group. Also, six weeks exercise trained rats in Dia-Cas group had decreased interstitial edema (significantly p<0.01), leukocyte infiltration (significantly p<0.05) and myonecrosis (significantly p<0.01) in comparison to the Dia-Cas group (Table 1B). Mann-Whitney U analysis showed that combination therapy with testosterone and exercise in castrated diabetic rats decreased interstitial edema (significantly p<0.01), leukocyte infiltration and myonecrosis (significantly p<0.001) in comparison to the Dia-Cas group (Table 1D).

A-H) The histological light microscopy images of the left ventricle tissues stained with hematoxylin and eosin (40 × HE). A) Dia group; B) Dia-T group; C) Dia-E group; D) Dia-T-E group; E) Dia- Cas group; F) Dia- Cas-T group; G) Dia- Cas-E group; H) Dia- Cas-T-E group.

A) Effect of 6 weeks testosterone treatment on histological changes of cardiomyocytes in the diabetic and diabetic castrated groups; B) Effect of 6 weeks exercise training on histological changes of cardiomyocytes in the diabetic and diabetic castrated groups; C) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on histological changes of cardiomyocytes in the diabetic group; D) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on histological changes of cardiomyocytes in the diabetic castrated group
A Interstitial edema Leukocyte infiltration Cardiomyocyte necrosis and congestion
Dia 1.57 ± 0.78 2.42 ± 0.78 2.57 ± 0.53
Dia-Cas 2.71 ± 0.48* 2.8571 ± 0.37 3.0 ± 0
Dia-T 1.71 ± 0.75++ 1 ± 1 ++ 0.85 ± 0.89* +++
Dia-Cas-T 1.85 ± 0.69+ 1.42 ± 0.78* ++ 1.42 ± 0.05** +++
B Interstitial edema Leukocyte infiltration Cardiomyocyte necrosis and congestion
Dia 1.57 ± 0.78 2.42 ± 0.78 2.57 ± 0.53
Dia-Cas 2.71 ± 0.48* 2.8571 ± 0.37 3.0 ± 0
Dia-E 1.42 ± 0.53 1.28 ± 1* 1.0 ± 0***
Dia-Cas-E 1.85 ± 0.37 ++ 2.14 ± 0.69007+ @ 2.14 ±0.69++ @@
C Interstitial edema Leukocyte infiltration Cardiomyocyte necrosis and congestion
Dia 1.57 ± 0.78 2.42 ± 0.78 2.57 ± 0.53
Dia-T 1.71 ± 0.75 1.85 ± 0.37 0.85 ± 0.89*
Dia-E 1.42 ± 0.53 1.28 ± 1. 00 * 1.0 ± 0***
Dia-T-E 1.85 ± 0.37 2.14 ± 0.69* 2.14 ±0.69**
D Interstitial edema Leukocyte infiltration Cardiomyocyte necrosis and congestion
Dia-Cas 2.71 ± 0.48 2.8571 ± 0.37 3.0 ± 0
Dia-Cas-T 1.85 ± 0.69+ 1.42 ± 0.78++ 1.42 ± 0.05+++
Dia-Cas-E 1.85 ± 0.37++ 2.14 ± 0.69007+ 2.14 ±0.69++
Dia-Cas-T-E 1.28 ± 0.48++ ▲ 1.28 ± 0.48+++ ▲ 1.28 ± 0.48+++ ▲

Data are expressed as mean± SEM for 7 animals.

p<0.05,

p<0.01,

p<0.001 vs the Dia group.

p<0. 05,

p<0. 01 vs the Dia-E group.

p<0.05,

p<0.01,

p<0.001 vs the Dia-Cas group.

p<0.05 vs the Dia-Cas-E group.

 Effects of testosterone and voluntary exercise on microvascular density (MVD) in type I diabetic and diabetic castrated rats

One-way ANOVA showed that castration significantly (p<0.01) decreased the number of MVD in the heart tissue of diabetic rats. Treatment of Dia and Dia-Cas groups with testosterone significantly (p<0.01) enhanced the number of MVD compared to Dia and Dia-Cas groups, respectively (Table 2A). Table 2B showed that in Dia and Dia-Cas groups six weeks exercise training (p<0.01) significantly increased the number of MVD in the heart tissue compared to Dia and Dia-Cas groups, respectively. According to table 2C (analysis by two way ANOVA), six weeks of combination therapy with testosterone and exercise in diabetic rats significantly (p<0.001) enhanced the number of MVD in the heart tissue in comparison with the diabetes group. Also, combination therapy with testosterone and exercise in diabetic rats showed a significant (p<0.01) increasing effect on the number of MVD compared to testosterone or exercise treated groups. Figure 2D (analysis by two way ANOVA), shows that in the diabetes-castration group, six weeks combination therapy with testosterone and exercise significantly (p<0.001) increased the number of MVD in the heart tissue in comparison with the diabetes castrated group. Also, combination therapy with testosterone and exercise in castrated diabetic rats showed a significant (p<0.05) increasing effect on the number of MVD compared to exercise treated groups. Analysis of data for the sham group showed no significant difference in comparison to diabetic group (data are not shown).

A) Effect of 6 weeks testosterone treatment on MVD cardiac tissue of the diabetic and diabetic castrated groups; B) Effect of 6 weeks exercise training on MVD cardiac tissue of the diabetic and diabetic castrated groups; C) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on MVD cardiac tissue of the diabetic group; D) Effects of 6 weeks testosterone and exercise on MVD cardiac tissue of the diabetic castrated
A Dia Dia-Cas Dia-T Dia-Cas-T
Microvascular density **
** ++ ++
239.57±11.76 196.00±14.70 281.00±9.50 245.42±9.66
B Dia Dia-Cas Dia-E Dia-Cas-E
Microvascular density **
** ++ ++
239.57±11.76 196.00±14.70 269.1429±12.42 226.57±28.17
C Dia Dia-T Dia-E Dia-T-E
Microvascular density ***
&&
@@
** **
239.57±11.76 281.00±9.50 269.1429±12.42 305.7143±9.4
D Dia-Cas Dia-Cas-T Dia-Cas-E Dia-Cas-T-E
Microvascular density +++
+++ + ▲
196.00±14.70 245.42±9.66 226.57±28.17 259.14±7.96

Group Data are expressed as mean± SEM for 7 animals.

p<0.01,

p<0.001 vs the Dia group.

p<0. 01vs the Dia-T group.

p<0. 01 vs the Dia-E group.

p<0.05,

p<0.01,

p<0.001 vs the Dia-Cas group.

p<0.05 vs the Dia-Cas-E group.

 Discussion

In this study, we provided novel information that testosterone and exercise increased P-AKT and P-ERK 1/2 levels in the heart tissue of type I diabetic rats. Our findings showed that castration impaired the activation of AKT and ERK 1/2 in the heart tissue of diabetic rats and testosterone-replacement therapy increased levels of these proteins. Specifically, we demonstrated that simultaneous treatment of diabetic and castrated diabetic rats with testosterone and exercise had additive effect on activation of these proteins. The present study revealed that levels of P-AKT and P-ERK 1/2 enhanced in exercise-trained groups compared with sedentary groups. Also, testosterone and exercise induced histological changes such as tissue organization and vascularization in the heart tissue. Briefly, the damage in the myocardium of diabetic and castrated diabetic rats decreased with testosterone treatment or exercise training. Moreover, simultaneous treatment with testosterone and exercise increased vascularization in the heart tissue of diabetic and castrated diabetic rats.

The diabetic condition changes neovascularization mechanisms and impairs vascular homeostasis. As, angiogenesis and capillary density decreases in heart of diabetic rats.18 Similarly, clinical studies have shown an abnormality in endothelium dependent vasodilation in patients with diabetes.19 Diabetes has been shown to cause structural and functional disturbances in the myocardium through myocardial fibrosis, collagen formation, myocyte hypertrophy, mitochondrial dysfunction, and ROS accumulation.20 It has been found that cardiac expression of VEGF-A and its receptors decreased in diabetic rats and in the human myocardium with diabetes.21

Several factors can affect angiogenesis in the heart of diabetic subjects; testosterone and exercise are the most notable of these factors.14,22 As, androgens, including testosterone, mediate biological effects on all aspects of cellular mechanisms, including proliferation, differentiation, and homeostasis. Moreover, it is shown that testosterone involves in endothelial cell proliferation and angiogenesis as testosterone supplementation increases angiogenesis in the heart of castrated rats.23 Also, previous studies have shown that testosterone deficiency is common in diabetic men and STZ-induced diabetic rats.24,25 Clinical trials have reported a higher prevalence of hypogonadism in diabetic men when compared with non-diabetics.24 It is shown that type I diabetic subjects have lower free testosterone compared with control subjects.26 These observations and other scientific evidence suggesting that testosterone deficiency contributes or at least is associated with cardiovascular risk factors in diabetic subjects.27,28 In our study, testosterone therapy increased vascularity in the myocardium of Dia and Dia-Cas groups.

Since regular moderate-intensity physical activity can reduce the risk of cardiovascular disease, it is recommended for patients with type I diabetes (T1DM).29 Multiple lines of evidence suggest that exercise increases angiogenesis.30 Our results showed that exercise increased MVD and decreased interstitial, leukocyte infiltration, and myonecrosis in the heart tissue of Dia and Dia-Cas groups.

To elucidate the mechanisms of testosterone and exercise for promotion of angiogenesis, we assessed AKT and ERK1/2 in the angiogenesis-related proteins. PI3K/Akt and MEK/ERK are two major cellular signaling pathways, which are activated 32 and play a principal role during angiogenesis.33 AKT is expressed in heart tissue at high levels.34 It has been shown that PI3K-AKT and MAPK-ERK signaling axis regulates multiple critical steps in angiogenesis.35,36 Dobrzynski et al37 showed that STZ-diabetic rats had a significant reductions in cardiac AKT activity and insulin treatment of streptozotocin (STZ)-diabetic rats enhanced retinal AKT phosphorylation. Also, it has been reported that insulin pretreatment of hepatoma cells specifically enhanced growth hormone induced ERK1/2 phosphorylation.33

It is clear that testosterone increased both AKT and ERK1/2 phosphorylation in neonatal rat cardiomyocytes.38 It seems that testosterone increases the HIF-1a and VEGF-A levels14 which act as chief regulators of neovascularization through phospho-AKT/AKT pathway. Also, testosterone can enhance SDF-1a levels which decreases apoptosis and increases angiogenesis.14

Multiple lines of evidence suggest that exercise can increase angiogenesis through increasing VEGF and eNOS phosphorylation by AKT in the post-ischemic failing heart in rats.39,40 Also, it is revealed that exercise can activate ERK in rodent skeletal muscle.41 In this regard, we showed that voluntary exercise increases cardiac P-AKT and P-ERK in diabetic and castrated diabetic rats, which can lead to angiogenesis. Other possible mechanisms are increasing of VEGF-A and decreasing of oxidative stress by voluntary exercise.16

Furthermore, for the first time, our study showed that testosterone treatment and exercise training have an additive effect on diminution of tissue injury, vascularity and activation of AKT and ERK in the hearts of diabetic rats. In agreement with our study, Fry and Lohnes showed that resistance exercise can elicit a heightening testosterone response that partially explains the muscle hypertrophy observed in athletes.42 It is also reported that, when exercise is added to testosterone supplementation, cardiac remodeling process, as structural or biochemical changes, becomes more efficient.43 Regarding the limitations of this study and results of previous studies, we did not measure circulating testosterone after castration.

 Conclusion

Based on our findings, we conclude that testosterone and exercise increase angiogenesis and diminish histological abnormalities in the hearts of type I diabetic rats by increasing of P-AKT and P-ERK. According to our findings, performing daily voluntary exercise as well as taking testosterone is recommended for diabetic men with testosterone deficiency to reduce their heart complications.

Sources of Funding

This study was funded by Tabriz University of Medical Sciences.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Mustafa Mohammadi, from Tabriz University of Medical Sciences.

 Acknowledgement

Support for this investigation by the Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences through grant, is gratefully acknowledged. Our data in this work were derived from the thesis of Ms Leila Chodari for a PhD degree in physiology (thesis serial number: 92/4-2/4).

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Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito: Chodari l, Mohammadi M, Mohaddes G; Obtenção de dados: Chodari l, Mohammadi M, Mohaddes G, Ghorbanzade V, Dariushnejad H, Mohammadi S; Análise e interpretação dos dados: Chodari l, Mohammadi M, Alipour MR, Ghorbanzade V, Dariushnejad H, Mohammadi S; Análise estatística: Chodari l, Mohammadi M, Alipour MR; Obtenção de financiamento: Mohammadi M; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Chodari l, Mohammadi M, Mohaddes G, Alipour MR.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Angiogênese prejudicada em tecido cardíaco é uma das principais complicações das diabetes. As vias de sinalização da proteína-quinase B (AKT) e a quinase regulada por sinal extracelular (ERK) exercem um importante papel durante a formação de uma rede similar à capilar no processo de angiogênese.

 Objetivos:

Determinar os efeitos da testosterona e exercícios voluntários sobre os níveis de vascularidade, AKT fosforilada (P- AKT) e ERK fosforilada (P-ERK) sobre o tecido cardíaco de ratos diabéticos e castrados diabéticos.

 Métodos:

A diabetes tipo 1 foi induzida através de injeção intraperitoneal de 50 mg/kg de estreptozotocina em animais. Após 42 dias de tratamento com testosterona (2mg/kg/dia) ou exercícios voluntários, individualmente ou em conjunto, as amostras de tecidos cardíacos foram coletadas e usadas para avaliação histológica e determinação de níveis de P-AKT e P-ERK através do método ELISA.

 Resultados:

Os nossos resultados mostraram que a testosterona ou os exercícios aumentaram a capilaridade, os níveis de P-AKT, e P-ERK nos corações de ratos diabéticos. O tratamento de ratos diabéticos com testosterona e exercícios obteve um efeito sinérgico sobre a capilaridade, níveis de P-AKT, e P-ERK no coração. Além disto, na capilaridade do grupo diabético castrado, os níveis de P-AKT e P-ERK diminuíram significativamente no coração, ao passo que o tratamento com testosterona ou o treinamento com exercícios reverteu tais efeitos. O tratamento simultâneo de ratos diabéticos castrados com testosterona e exercícios obteve um efeito aditivo sobre os níveis de P-AKT e P-ERK.

 Conclusão:

Nossas descobertas sugerem que a testosterona e exercícios, em conjunto ou individualmente, podem aumentar a angiogênese nos corações de ratos diabéticos e castrados diabéticos. Os efeitos favoráveis à angiogênese da testosterona e dos exercícios estão associados à ativação reforçada de AKT e ERK1/2 no tecido cardíaco.

 Palavras-chave: Testosterona Ratos Diabetes Mellitus Exercício Angiogênese Proteínas c-akt MAP Quinases Reguladas por Sinal Extracelular Introdução

A diabetes mellitus é uma doença metabólica com uma alta e crescente prevalência ao redor do mundo.1 As complicações cardiovasculares são as principais causas da mortalidade e morbidade em indivíduos diabéticos, e a supressão da angiogênese nos sistemas cardíaco coronário e vascular periférico pode ter efeitos influenciadores sobre este caso.2 A AKT e a ERK são as duas principais vias de sinalização que exercem um papel central na regulação de proliferação, migração e sobrevivência celular através de seus alvos a jusante.3,4 Existem provas de que vias de sinalização dependentes da AKT exercem um papel crítico na regulação do crescimento cardíaco, função contrátil e angiogênese coronária.5,6 Foi provado que as vias de sinalização de AKT aumenta a angiogênese no tecido cardíaco.7 A sinalização de MAPK-ERK exerce um importante papel durante a angiogênese, e é necessária para o surgimento de células endoteliais.8

A testosterona é um importante androgênio gonadal nos homens. A deficiência de testosterona é comum em homem com diabetes e em ratos machos com diabetes induzidas através de estreptozotocina.9 Além disto, é observado que doenças cardiovasculares aumentam com a deficiência de testosterona.10 Estes achados podem indicar que a suplementação de testosterona em homens diabéticos pode ser benéfica para atenuar a doença cardiovascular.

Exercícios possuem efeitos benéficos sobre as propriedades funcionais dos músculos cardíacos saudáveis e diabéticos. Além disto, exercícios físicos melhoram o metabolismo de glucose no sangue, a ação da insulina e fatores de riscos cardiovasculares em indivíduos diabéticos.11 Foi demonstrado que exercícios voluntários, como exercícios leves/moderados12 diminuem as doenças cardiovasculares.11 No modelo animal de exercícios voluntários, o animal tem acesso livre a uma roda de corrida, e utiliza a roda de acordo com seu limite fisiológico para atividades físicas.12

Apesar de o sistema cardiovascular ser um importante objetivo dos exercícios e ações androgênicas, o sistema molecular da ação da testosterona e exercícios voluntários nos corações de diabéticos permanece amplamente inexplorada. Portanto, o propósito deste estudo era investigar o efeito da terapia de reposição de testosterona e treinamentos físicos, individualmente ou em conjunto, sobre os níveis de P-AKT e P-ERK (como fatores favoráveis à angiogênese) nos tecidos cardíacos de ratos diabéticos e castrados diabéticos.

 Métodos Animais

Os animais usados neste estudo foram fornecidos pela colônia da nossa universidade. Os animais foram abrigados em instalações com temperatura controlada (21 -23°C), mantidos em um ciclo de claro-escuro de 12-12h, com alimentos e água fornecidos ad libitum. Todos os experimentos com animais foram realizados seguindo as diretrizes de usos humanos e cuidados de animais de laboratório para pesquisas biomédicas publicadas pelos Institutos Nacionais de Saúde (8ª edição, revisada em 2011), e em conformidade com a Declaração de Helsinki. O Comitê de Ética da Universidade de Tabriz aprovou o protocolo experimental. Sessenta e três ratos machos Wistar (250 - 270 g) foram designados aleatoriamente para grupos com tratamento com testosterona ou placebo, e grupos de exercícios voluntários ou sedentários. Então, os animais foram divididos em nove grupos (n = 7): 1- Grupo diabético castrado sham + placebo (Dia-S- Cas), 2- Grupo diabético + placebo (Dia), 3- Grupo diabético + testosterona (Dia -T), 4- Grupo diabético + exercícios + placebo (Dia-E), 5- Grupo diabético + exercícios + testosterona (Dia-T-E), 6- Grupo diabético + castrado + placebo (Dia-Cas), 7- Grupo diabético + castrado + testosterona (Dia-Cas-T), 8-Grupo diabético + castrado + exercício (Dia-Cas-E), 9- Grupo diabético + castrado + testosterona + exercício (Dia-Cas-T-E) .

 Castração e terapia de reposição hormonal

Ratos machos sexualmente adultos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (80 mg/kg) e cloridrato de xilazina (5 mg/kg). Então, os animais foram colocados em uma posição supina e seus testículos foram removidos através de uma incisão abdominal média baixa ou permaneceram intactos. Para evitar a interrupção de influência hormonal, a reposição de testosterona foi iniciada imediatamente após a cirurgia.13 Propionato de testosterona (UNIGEN, Life Science) foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), administrado por via subcutânea numa dose fisiológica (2 mg/kg /dia) por 6 semanas.14 Os ratos nos grupos Dia-S- Cas, Dia, Dia-E, Dia-Cas e Dia-Cas-E foram injetados com a mesma quantidade de veículo de DMSO.

 Indução de diabetes

Todos os animais foram injetados com estreptozotocina (50 mg/kg) (Sigma, St. Louis Mo, EUA), para induzir diabetes tipo I.15 A estreptozotocina foi dissolvida em 10 mM de citrato de sódio, pH de 4,5, com 0,9% de NaCl. Diabetes foi constatada 72 h depois, através de avaliação dos níveis de glicose no sangue, utilizando um glicosímetro (Elegance, Modelo: no: CT-X10, Alemanha). Ratos com um nível de glicose no sangue ≥300 mg/dL foram considerados diabéticos.16 A indução de diabetes nos animais foi realizada sete dias após a cirurgia de castração.

 Exercícios voluntários

Os exercícios voluntários são considerados exercícios leves/moderados. Neste estudo, os ratos nos grupos de exercício foram abrigados individualmente em gaiolas equipadas com uma roda de corrida vertical de aço inoxidável (Tajhiz Gostar, Tehran), e tinham livre acesso à roda 24h por dia, por 6 semanas. As rodas estavam conectadas a um sensor permanente que ativava um contador digital das rotações das rodas. As circulações totais das rodas foram registradas diariamente, com a distância total corrida por dia determinada através da multiplicação do número de rotações das rodas pela circunferência das rodas. Os animais que tivessem corrido menos de 2.000 m/dia eram substituídos.15

Processamento de tecidos e medição de proteína

Ao final do estudo, os tecidos cardíacos foram excisados e congelados em nitrogênio líquido imediatamente. Amostras de tecidos do ventrículo esquerdo foram armazenadas em temperatura de -70 °C até a medição de fosfo-AKT (serina 473) e fosfo -ERK 1/2 (treonina 202/ tirosina204). De modo a mensurar os níveis de proteína no tecido cardíaco, as amostras foram homogeneizadas em PBS (pH 7,2-7,4), e centrifugadas por 20 minutos na velocidade de 3000 rpm a 4°C. Os sobrenadantes resultantes foram removidos, e as proteínas alvo foram extraídas. As formas fosforiladas e ativadas de AKT (Eastbiopharm Co., Ltd., Hangzhou, China) e os níveis de ERK1/2 (Abcam, Cambridge, U.K.) foram mensurados através de ELISA de alta sensibilidade, e normalizados à concentração total de proteínas para cada amostragem, conforme determinado pelo ensaio de Bradford.

 Avaliação histológica

As amostras do tecido do ventrículo esquerdo foram isoladas imediatamente e afixadas em uma solução de solução de formalina a 10% tamponada, desidratadas em classes ascendentes de álcool e embebidas em parafina. Seções de 5 µm foram retiradas, coradas com hematoxilina-eosina (H-E), e examinadas em microscópio de luz (Olympus BH-2, Tóquio, Japão), de um modo cego. Os tecidos cardíacos foram avaliados em termos de edema intersticial, congestão, infiltração de leucocitose e mionecrose.

 Ensaio de angiogênese

A angiogênese foi medida através de densidade microvascular (DMV) em cinco sessões a intervalos de 50mm da área intensamente vascularizada, com microscópio de luz, por dois observadores independentes e cegos às condições experimentais. Os números de microvasos para cada sessão foram contados e calculados, para determinar o número médio de microvasos por sessão.17

Análise estatística

Os dados são expressos como média± EPM. Após avaliar a homogeneidade da variação e distribuição normal dos dados, foi usada uma análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, além do teste de Tukey para comparar dados quantitativos. O teste de Mann-Whitney U foi utilizado para testar variáveis histológicas. A significância estatística foi definida como p<0,05. A análise estatística de dados foi realizada utilizando o software estatístico SPSS (Versão 17,0).

 Resultados Efeitos da testosterona e exercícios voluntários sobre níveis de P- AKT no tecido cardíaco de ratos diabéticos tipo I e diabéticos castrados

A ANOVA de uma via mostrou que a castração fez os níveis de proteína P-AKT diminuir significativamente (p<0,01) no tecido cardíaco dos ratos diabéticos. O tratamento dos grupos diabéticos (p<0,01) e castrados diabéticos (p<0,05) com testosterona aumentou significativamente os níveis de proteína P-AKT no tecido cardíaco em comparação com o grupo diabético (Figura 1A). A Figura 1B (análise através de ANOVA de uma via) mostra que o tratamento de seis semanas de grupos diabéticos (p<0,01) e castrados diabéticos (p<0,001) com exercício aumentou significativamente os níveis de proteína P-AKT no coração, em comparação com os grupos diabéticos e castrados diabéticos, respectivamente. A ANOVA de duas vias na figura 1C mostra que a terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos melhorou os níveis de proteína P-AKT significativamente (p<0,001) no tecido cardíaco em comparação com o grupo diabético. Além disto, a terapia de combinação com testosterona e exercício em ratos diabéticos mostrou um efeito de aumento significativo sobre níveis de proteína P-AKT em comparação com os grupos de testosterona (p<0,001) ou exercício (p<0,01).

A) Efeito de tratamento de 6 semanas sobre níveis de proteína P-AKT no tecido cardíaco de grupos diabéticos e castrados diabéticos; B) Efeito de 6 semanas de exercício sobre níveis de proteína P-AKT no tecido cardíaco de grupos diabéticos e castrados diabéticos; C) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios em níveis de proteína P-AKT no tecido cardíaco de grupo diabético; D) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios sobre níveis de proteína P-AKT no tecido cardíaco do grupo de castrados diabéticos (d), Os dados são expressos como média± EPM para 7 animais. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 versus o grupo Dia, &&& p<0,001 versus o grupo Dia-T, @@ p<0,01 versus o grupo Dia-E, +++ p<0,001 versus o grupo Dia-Cas, ▲ p<0,05 versus o grupo Dia-Cas-E, Δ p<0,05versus o grupo Dia-Cas-T.

A Figura 1D mostra que no grupo diabético-castrado, uma terapia de combinação de seis semanas com testosterona e exercícios eleva significativamente (p<0,001) os níveis de proteína no tecido cardíaco em comparação com o grupo diabético-castrado. Além disto, a terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos castrados mostrou um efeito significativo de aumento (p<0,05) sobre os níveis de proteína P-AKT em comparação com grupos de testosterona ou exercício. A análise de dados para o grupo sham não aparentou diferença significativa em comparação com o grupo diabético (dados não-fornecidos).

 Efeitos da testosterona e exercícios voluntários sobre níveis de proteína P-ERK ½ no tecido cardíaco de ratos diabéticos tipo 9 e castrados diabéticos

A ANOVA de uma via demonstrou que, no grupo diabético castrado, os níveis de proteína P-ERK 1/2 diminuíram significativamente (p<0,05) em comparação com o grupo diabético. O tratamento de seis semanas de grupos diabéticos (p<0,05) e castrados diabéticos (p<0,001) com testosterona reforçou significativamente os níveis de proteína P-ERK 1/2 no tecido cardíaco em comparação com os grupos Dia e Dia-Cas, respectivamente (Figura 2A).

A) Efeito de 6 semanas de tratamento de testosterona sobre níveis de proteína P-ERK 1/2 no tecido cardíaco de grupos diabéticos e castrados diabéticos; B) Efeito de 6 semanas de exercícios físicos sobre os níveis de proteína P-ERK 1/2 no tecido cardíaco de grupos diabéticos e castrados diabéticos; C) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios sobre os níveis de proteína P-ERK 1/2 no tecido cardíaco do grupo diabético; D) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios sobre os níveis de proteína P-ERK 1/2 no tecido cardíaco do grupo de castrados diabéticos. Os dados são expressos como média± EPM para 7 animais. *p<0,05, *** p<0,001 versus o grupo Dia. & p<0,05 versus o grupo Dia-T. @ p<0,05, @@ p<0,01 versus o grupo Dia-E. + p<0,05, ++ p<0,01 , +++ p<0,001 versus o grupo Dia-Cas. ▲ p<0,05 versus o grupo Dia-Cas-E. Δ p<0,05 versus o grupo Dia-Cas-T.

A Figura 2B (análise através de ANOVA de uma via) mostra que o tratamento de seis semanas de grupos diabéticos (p<0,05) e castrados diabéticos (p<0,001) com exercício aumentou significativamente os níveis de proteína P-ERK 1/2 no coração em comparação com os grupos diabéticos e castrados diabéticos, respectivamente.

De acordo com a Figura 2C (análise através de ANOVA de duas vias), seis semanas de terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos reforçou significativamente (p<0,001) os níveis de proteína P-ERK 1/2 no tecido cardíaco em comparação com o grupo diabético. Também, a terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos demonstrou um efeito de aumento significativo sobre os níveis de proteína P-ERK 1/2 em comparação com os grupos de testosterona (p<0,05) ou exercício (p<0,01).

A Figura 2D mostra que, no grupo diabético-castrado, a terapia de combinação com testosterona e exercícios aumentou significativamente (p<0,001) os níveis de proteína-ERK 1/2 no tecido cardíaco em comparação com o grupo diabético-castrado. Além disto, a terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos castrados demonstrou um efeito de aumento significativo (p<0,05) sobre níveis de proteína P-ERK 1/2 em comparação com grupos de testosterona ou exercício. A análise de dados do grupo sham não demonstrou diferença significativa em comparação com o grupo diabético (dados não-fornecidos).

 Observações histopatológicas Efeitos da testosterona e exercícios voluntários em tecidos do miocárdio em ratos diabéticos tipo I e castrados diabéticos

De acordo com a Figura 3 e a tabela 1A, analisada através do teste de Mann-Whitney U, a castração aumentou o edema intersticial (significativamente, p<0,05), infiltração de leucócitos, e a mionecrose no grupo diabético. No grupo diabético, o tratamento com testosterona resultou em uma acentuada atenuação do edema intersticial, infiltração de leucócitos e mionecrose (significativamente, p<0,05) em comparação com o grupo diabético. Além disto, os ratos no grupo diabético, após treinamento físico de seis semanas, tinham diminuídos edema intersticial, infiltração de leucócitos (significativamente, p<0,05) e mionecrose (significativamente, p<0,001) (Tabela 1B). A terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos demonstrou um efeito de diminuição sobre os danos dos tecidos do miocárdio em comparação com os grupos Dia, Dia-E e Dia-T (Tabela 1C). A Tabela 1A demonstrou que no grupo Dia-Cas, o tratamento de testosterona resultou em uma acentuada atenuação do edema intersticial (significativamente, p<0,05), infiltração de leucócitos (significativamente, p<0,01) e mionecrose (significativamente, p<0,001) em comparação com o grupo Dia-Cas. Além disto, os ratos que se exercitaram por seis semanas no grupo Dia-Cas tinham diminuídos edema intersticial (significativamente, p<0,01), infiltração de leucócitos (significativamente, p<0,05) e mionecrose (significativamente, p<0,01) em comparação com o grupo Dia-Cas (Tabela 1B). A análise de Mann-Whitney U demonstrou que a terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos castrados diminuiu o edema intersticial (significativamente, p<0,01), a infiltração de leucócitos e mionecrose (significativamente, p<0,001) em comparação com o grupo Dia-Cas (Tabela 1D).

A-H) As imagens histológicas de microscopia de luz dos tecidos do ventrículo esquerdo coradas com hematoxilina e eosina (40 × HE). A) Grupo Dia; B) Grupo Dia-T; C) Grupo Dia-E; D) Grupo Dia-T-E; E) Grupo Dia- Cas; F) Grupo Dia- Cas-T; G) Grupo Dia- Cas-E; H) Grupo Dia- Cas-T-E.

A) Efeito de 6 semanas de tratamento de testosterona sobre as alterações histológicas de cardiomiócitos em grupos diabéticos e castrados diabéticos; B) Efeito de 6 semanas de exercícios físicos sobre as alterações histológicas de cardiomiócitos em grupos diabéticos e castrados diabéticos; C) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios alterações histológicas de cardiomiócitos em grupo diabético; D) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios alterações histológicas de cardiomiócitos em grupo de castrados diabéticos
A Edema intersticial Infiltração de leucócitos Necrose e congestão de cardiomiócitos
Dia 1,57 ± 0,78 2,42 ± 0,78 2,57 ± 0,53
Dia-Cas 2,71 ± 0,48* 2,8571 ± 0,37 3,0 ± 0
Dia-T 1,71 ± 0,75++ 1 ± 1 ++ 0,85 ± 0,89* +++
Dia-Cas-T 1,85 ± 0,69+ 1,42 ± 0,78* ++ 1,42 ± 0,05** +++
B Edema intersticial Infiltração de leucócitos Necrose e congestão de cardiomiócitos
Dia 1,57 ± 0,78 2,42 ± 0,78 2,57 ± 0,53
Dia-Cas 2,71 ± 0,48* 2,8571 ± 0,37 3,0 ± 0
Dia-E 1,42 ± 0,53 1,28 ± 1* 1,0 ± 0***
Dia-Cas-E 1,85 ± 0,37 ++ 2,14 ± 0,69007+ @ 2,14 ±0,69++ @@
C Edema intersticial Infiltração de leucócitos Necrose e congestão de cardiomiócitos
Dia 1,57 ± 0,78 2,42 ± 0,78 2,57 ± 0,53
Dia-T 1,71 ± 0,75 1,85 ± 0,37 0,85 ± 0,89*
Dia-E 1,42 ± 0,53 1,28 ± 1. 00 * 1,0 ± 0***
Dia-T-E 1,85 ± 0,37 2,14 ± 0,69* 2,14 ±0,69**
D Edema intersticial Infiltração de leucócitos Necrose e congestão de cardiomiócitos
Dia-Cas 2,71 ± 0,48 2,8571 ± 0,37 3,0 ± 0
Dia-Cas-T 1,85 ± 0,69+ 1,42 ± 0,78++ 1,42 ± 0,05+++
Dia-Cas-E 1,85 ± 0,37++ 2,14 ± 0,69007+ 2,14 ±0,69++
Dia-Cas-T-E 1,28 ± 0,48++ ▲ 1,28 ± 0,48+++ ▲ 1,28 ± 0,48+++ ▲

Os dados são expressos como média± EPM para 7 animais.

p<0,05,

p<0,01,

p<0,001 versus o grupo Dia.

p<0. 05,

p<0. 01 versus o grupo Dia-E.

p<0,05,

p<0,01,

p<0,001 versus o grupo Dia-Cas.

p<0,05 versus o grupo Dia-Cas-E.

 Efeitos da testosterona e exercícios voluntários sobre a densidade microvascular (DMV) em ratos diabéticos tipo I e castrados diabéticos

A ANOVA de uma via mostrou que a castração diminuiu significativamente (p<0,01) o número de DMV no tecido cardíaco de ratos diabéticos. O tratamento dos grupos Dia e Grupo Dia-Cass com testosterona reforçou significativamente (p<0,01) o número de DMV em comparação com os Grupos Dia e Dia-Cass, respectivamente (Tabela 2A). A Tabela 2B mostrou que nos Grupos Dia e Dia-Cass, treinamento físico de seis semanas aumentou significativamente (p<0,01) significativamente o número de DMV no tecido cardíaco em comparação com os Grupos Dia e Dia-Cass, respectivamente. De acordo com a tabela 2C (análise através de ANOVA de duas vias), seis semanas de terapia de comparação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos reforçou significativamente (p<0,001) o número de DMV no tecido cardíaco em comparação com o grupo diabético. Além disto, a terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos mostrou um efeito de aumento significativo (p<0,01) sobre o número de DMV em comparação com os grupos tratados com testosterona ou exercício. A Figura 2D (análise de ANOVA de duas vias), mostra que, no grupo diabético-castrado, seis semanas de terapia de combinação com testosterona e exercícios aumentou significativamente (p<0,001) o número de DMV no tecido cardíaco em comparação com o grupo diabético-castrado. Além disto, a terapia de combinação com testosterona e exercícios em ratos diabéticos-castrados apresentou um efeito de aumento significativo (p<0,05) sobre o número de DMV em comparação com grupos tratados com exercícios. A análise de dados para o grupo sham não demonstrou diferenças significativas em comparação com o grupo diabético (dados não-fornecidos).

A) Efeito de 6 semanas de tratamento de testosterona sobre as DMV de tecidos cardíacos de grupos diabéticos e castrados diabéticos; B) Efeito de 6 semanas de exercícios físicos sobre as DMV de tecidos cardíacos de grupos diabéticos e castrados diabéticos; C) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios sobre as DMV de tecidos cardíacos do grupo diabético; D) Efeitos de 6 semanas de testosterona e exercícios sobre as DMV de tecidos cardíacos de grupo de castrados diabéticos
A Dia Dia-Cas Dia-T Dia-Cas-T
Densidade microvascular **
** ++ ++
239,57±11,76 196,00±14,70 281,00±9,50 245,42±9,66
B Dia Dia-Cas Dia-E Dia-Cas-E
Densidade microvascular **
** ++ ++
239,57±11,76 196,00±14,70 269,1429±12,42 226,57±28,17
C Dia Dia-T Dia-E Dia-T-E
Densidade microvascular ***
&&
@@
** **
239,57±11,76 281,00±9,50 269,1429±12,42 305,7143±9,4
D Dia-Cas Dia-Cas-T Dia-Cas-E Dia-Cas-T-E
Densidade microvascular +++
+++ + ▲
196,00±14,70 245,42±9,66 226,57±28,17 259,14±7,96

Os dados são expressos como média± EPM para 7 animais.

p<0,01,

p<0,001 versus o grupo Dia.

p<0. 01versus o grupo Dia-T.

p<0. 01 versus o grupo Dia-E.

p<0,05,

p<0,01,

p<0,001 versus o grupo Dia-Cas.

p<0,05 versus o grupo Dia-Cas-E.

 Discussão

Neste estudo, fornecemos novas informações de que a testosterona e os exercícios aumentaram os níveis de P-AKT e P-ERK 1/2 no tecido cardíaco de ratos diabéticos tipo I. Nossas descobertas mostraram que a castração prejudicou a ativação de AKT e ERK 1/2 no tecido cardíaco de ratos diabéticos, e a terapia de reposição de testosterona aumentou os níveis destas proteínas. Especificamente, demonstramos que o tratamento simultâneo de ratos diabéticos e castrados-diabéticos com testosterona e exercícios teve um efeito sobre a ativação destas proteínas. O presente estudo revelou que os níveis de P-AKT e P-ERK 1/2 foram reforçados em grupos treinados com exercícios em comparação com os grupos sedentários. Além disto, a testosterona e os exercícios induziram alterações histológicas, como a organização do tecido e a vascularização no tecido cardíaco. Brevemente, os danos aos miocárdios dos ratos diabéticos e diabéticos-castrados diminuiu com o tratamento com testosterona ou treinamento físico. Adicionalmente, o tratamento simultâneo com testosterona e exercícios aumentou a vascularização no tecido cardíaco de ratos diabéticos e diabéticos-castrados.

A condição diabética altera mecanismos de neovascularização e prejudica a homeostase vascular. Assim, a angiogênese e a densidade capilar diminuíram nos corações de ratos diabéticos.18 Similarmente, estudos clínicos mostraram uma anormalidade na vasodilatação dependente do endotélio em pacientes com diabetes.19 Foi observado que as diabetes causam perturbações estruturais e funcionais no miocárdio através de fibrose do miocárdio, formação de colágeno, a formação de colágeno, hipertrofia dos miócitos, disfunção mitocondrial, e acumulação de ERRO.20 Foi constatado que a expressão cardíaca de FCEV-A e seus receptores foi reduzida em ratos diabéticos e no miocárdio de humanos com diabetes.21

Diversos fatores podem afetar a angiogênese no coração de indivíduos diabéticos; a testosterona e exercícios são os mais notáveis entre tais fatores.14,22 Assim, androgênios, incluindo a testosterona, mediam efeitos biológicos sobre todos os aspectos de mecanismos celulares, incluindo a proliferação, diferenciação e homeostase. Adicionalmente, foi notado que a testosterona está envolvida na proliferação de células endoteliais e na angiogênese, uma vez que a suplementação de testosterona aumenta a angiogênese nos corações de ratos castrados.23 Além disto, estudos anteriores mostraram que deficiência de testosterona é comum em homens diabéticos e em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.24,25 Testes clínicos relataram uma maior prevalência de hipogonadismo em homens diabéticos em comparação com não-diabéticos.24 É visto que indivíduos diabéticos tipo I possuem menor testosterona livre em comparação com indivíduos controle.26 Estas observações e outras evidências científicas sugerem que a deficiência de testosterona contribui, ou pelo menos está associada à fatores de riscos cardiovasculares em indivíduos diabéticos.27,28 Em nosso estudo, a terapia com testosterona aumentou a vascularidade no miocárdio dos Grupos Dia e Dia-Cass.

Uma vez que atividade física regular de intensidade moderada pode reduzir o risco de doença cardiovascular, ela é recomendada para pacientes com diabetes tipo I (T1DM).29 Diversas linhas de evidência sugerem que exercícios aumentam a angiogênese.30 Nossos resultados mostraram DMV aumentada e intersticial, infiltração de leucócitos, e mionecrose diminuídas no tecido cardíaco dos Grupos Dia e Dia-Cass.

Para elucidar os mecanismos da testosterona e exercícios para promover a angiogênese, avaliamos AKT e ERK1/2 nas proteínas relacionadas à angiogênese. PI3K/Akt e MEK/ERK são duas principais vias de sinalização celular, ativadas pela insulina,31,32 e exercem um papel grandioso durante a angiogênese.33 A AKT é expressada no tecido cardíaco em altos níveis.34 Foi demonstrado que os eixos de sinalização PI3K-AKT e MAPK-ERK regulam diversos passos críticos na angiogênese.35,36 Dobrzynski et al.37 seus colegas demonstraram que ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina tiveram reduções significativas em atividade cardíaca de AKT e o tratamento com insulina de ratos diabéticos por estreptozotocina melhorou a fosforilação retiniana de AK. Além disto, foi relatado que o pré-tratamento com insulina de células de hepatoma aumentou especificamente a fosforilação de ERK1/2 induzida pelo hormônio de crescimento.33

É visível que a testosterona aumentou a fosforilação de AKT e ERK1/2 em cardiomiócitos de ratos neonatais.38 Parece que a testosterona aumenta os níveis de HIF-1a e FCEV-A14 que atuam como os principais reguladores de neovascularização através de sinalização fosfo-AKT/AKT. Além disto, a testosterona pode realçar os níveis de FDS-1ª, o que diminui a apoptose e aumenta a angiogênese.14

Diversas linhas de evidência sugerem que exercícios podem aumentar a angiogênese através do aumento de fosforilação de FCEV e NO Endotelial pela AKT no coração pós-isquêmico a falhar em ratos.39,40 Além disto, foi revelado que exercícios podem ativar ERK no músculo esquelético de roedores.41 Em relação a isto, mostramos que exercícios voluntários aumentam P-AKT e P-ERK cardíacos em ratos diabéticos e castrados diabéticos, o que pode causar a angiogênese. Outros mecanismos possíveis são o aumento de FCEV-A e a diminuição de estresse oxidativo através de exercícios voluntários.16

Adicionalmente, pela primeira vez, nosso estudo mostrou que o tratamento com testosterona e exercícios físicos teve um efeito aditivo sobre a diminuição de lesão tecidual, vascularidade e ativação de AKT e ERK nos corações de ratos diabéticos. Em concordância com o nosso estudo, Fry e Lohnes42 mostraram que exercícios de resistência podem provocar uma resposta de elevação de testosterona, que explica parcialmente a hipertrofia muscular observada em atletas. Também foi relatado que quando exercícios são adicionados à suplementação de testosterona, processo de remodelação cardíaca, como alterações estruturais ou bioquímicas, se torna mais eficaz.43 Acerca das limitações deste estudo e resultados dos estudos anteriores, não medimos, a testosterona circulante após a castração.

 Conclusão

Com base em nossas descobertas, concluímos que a testosterona e os exercícios aumentam a angiogênese e diminuem as anormalidades histológicas nos corações de ratos diabéticos tipo I, aumentando a P-AKT e P-ERK. De acordo com nossos achados, recomenda-se a realização de exercícios voluntários diários, além de doses de testosterona, para homens diabéticos com deficiência de testosterona para reduzir suas complicações cardíacas.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por Tabriz University of Medical Sciences.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Mustafa Mohammadi pela Tabriz University of Medical Sciences.

 Agradecimentos

Reconhecemos com gratidão o apoio para esta investigação por parte do Centro de Pesquisa Aplicada em Medicamentos, e da Universidade de Ciências Médicas de Tabriz. Nossos dados neste trabalho foram retirados da tese da Sra. Leila Chodari para PhD em fisiologia (número de série da tese: 92/4-2/4).