Abstract

Arq Bras Cardiol

abc

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC

RFhLbvGD7yN4byBgnkgZfCn

S0066-782X2016004400427

S0066-782X2016005025104

10.5935/abc.20160147

Original Articles

Acute Ethanol Intake Induces NAD(P)H Oxidase Activation and Rhoa Translocation in Resistance Arteries

Simplicio

Janaina A.

2 Hipólito

Ulisses Vilela

2 Vale

Gabriel Tavares do

2 Callera

Glaucia Elena

3 Pereira

Camila André

2 Touyz

Rhian M

3 Tostes

Rita de Cássia

2 Tirapelli

Carlos R.

1 Universidade de São Paulo Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto Laboratório de Farmacologia

Brazil Departamento de Enfermagem Psiquiátrica e Ciências Humanas - Laboratório de Farmacologia - Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (USP); SP, Brazil Universidade de São Paulo 2 Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Programa de Pós-Graduação em Farmacologia

Brazil Programa de Pós-Graduação em Farmacologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (USP), SP, Brazil Universidade de São Paulo 3 University of Ottawa Canada University of Ottawa, Canada University of Ottawa

Mailing Address: Carlos Renato Tirapelli, Avenida Bandeirantes 3900, Monte Alegre. Postal Code 14040 902, Ribeirão Preto, SP - Brazil. E-mail: crtirapelli@eerp.usp.br, crtlilo@hotmail.com

Author contributions

Conception and design of the research, Acquisition of data and Statistical analysis: Simplicio JA, Hipólito UV, Vale GT, Pereira CA; Analysis and interpretation of the data: Simplicio JA, Hipólito UV, Vale GT, Pereira CA, Tostes RC; Writing of the manuscript: Simplicio JA, Hipólito UV, Tirapelli CR; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Callera GE, Touyz RM, Tostes RC, Tirapelli CR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

27 10 2016

11 2016

107 05 427 436 29 03 2016 12 04 2016 24 05 2016

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract Background:

The mechanism underlying the vascular dysfunction induced by ethanol is not totally understood. Identification of biochemical/molecular mechanisms that could explain such effects is warranted.

Objective:

To investigate whether acute ethanol intake activates the vascular RhoA/Rho kinase pathway in resistance arteries and the role of NAD(P)H oxidase-derived reactive oxygen species (ROS) on such response. We also evaluated the requirement of p47phox translocation for ethanol-induced NAD(P)H oxidase activation.

Methods:

Male Wistar rats were orally treated with ethanol (1g/kg, p.o. gavage) or water (control). Some rats were treated with vitamin C (250 mg/kg, p.o. gavage, 5 days) before administration of water or ethanol. The mesenteric arterial bed (MAB) was collected 30 min after ethanol administration.

Results:

Vitamin C prevented ethanol-induced increase in superoxide anion (O₂^-) generation and lipoperoxidation in the MAB. Catalase and superoxide dismutase activities and the reduced glutathione, nitrate and hydrogen peroxide (H₂O₂) levels were not affected by ethanol. Vitamin C and 4-methylpyrazole prevented the increase on O₂^- generation induced by ethanol in cultured MAB vascular smooth muscle cells. Ethanol had no effect on phosphorylation levels of protein kinase B (Akt) and eNOS (Ser¹¹⁷⁷ or Thr⁴⁹⁵ residues) or MAB vascular reactivity. Vitamin C prevented ethanol-induced increase in the membrane: cytosol fraction ratio of p47phox and RhoA expression in the rat MAB.

Conclusion:

Acute ethanol intake induces activation of the RhoA/Rho kinase pathway by a mechanism that involves ROS generation. In resistance arteries, ethanol activates NAD(P)H oxidase by inducing p47phox translocation by a redox-sensitive mechanism.

Keywords: Ethanol NADPH Oxidase Rats Oxidative Stress Ascorbic Acid rhoAGTP-Binding Protein

Introduction

Excessive consumption of ethanol, often referred in the literature as "binge drinking", is considered a risk for the cardiovascular system. Binge drinking is associated with an increased risk of cardiovascular events, such as atherosclerosis, stroke and myocardial infarction.1^-3 The exact mechanism underlying the cardiovascular dysfunction induced by binge drinking is not totally understood; but changes on vascular function may play a key role.4^-6

One important mechanism by which ethanol leads to vascular damage is by increasing the generation of reactive oxygen species (ROS). Ethanol-mediated generation of superoxide anion (O₂^-) and hydrogen peroxide (H₂O₂) is associated with vascular dysfunction.7^,8 The enzyme nicotinamide adenine dinucleotide phosphate [NAD(P)H] oxidase is the main source of ROS in endothelial and vascular smooth muscle cells (VSMC),9 and a an essential factor in ethanol-induced vascular dysfunction.10 The activation of NAD(P)H oxidase is a complex process , but translocation of the cytosolic subunit p47phox to the membrane, with further association with the cytochrome b₅₅₈, is a decisive step for the activation of the enzyme .11 Recent findings from our laboratory have shown that acute ethanol intake increases the generation of NAD(P)H oxidase-derived ROS in resistance arteries.12

ROS activate downstream signaling targets, including mitogen-activated protein kinases (MAPK) and RhoA/Rho kinase, which are considered important mediators of vascular dysfunction. Activation of these redox-sensitive pathways regulates vascular cell growth, inflammation and contraction.13 Importantly, acute ethanol intake induces NAD(P)H oxidase activation and MAPK phosphorylation in resistance arteries.12 Additionally, the rapid inactivation of nitric oxide (NO)14 induced by O₂^-, and changes in NO synthesis and/or bioavailability have been implicated in the development of clinically significant vascular events.

In the present study, we sought to investigate whether acute ethanol intake activates the vascular RhoA/Rho kinase pathway in resistance arteries and the role of NAD(P)H oxidase-derived ROS on such response. Additionally, we evaluated the requirement of p47phox translocation for the activation of NAD(P)H oxidase induced by ethanol and the effect of ethanol-induced ROS on NO production. Ascorbic acid (vitamin C) was chosen as the antioxidant since it has been described to reduce oxidative stress in the vasculature.15^,16

Methods Acute ethanol administration

A dose of 1g/kg of ethanol (10 mL/kg of 13% ethanol diluted in water) was administered by gavage to 20 male Wistar rats (200-250 g) fasted for 12 h.12^,16 Blood ethanol levels using this model of ethanol administration are within the range of 20-24 mmol/L.12^,16^,17 Rats from the control group (n=20) received water (gavage). Some rats were treated with vitamin C at a dose of 250 mg/kg (gavage) for 5 days,16^,18^,19 before administration of water (n=18) or ethanol (n=19). The sample size was based on previous studies.12^,16^,17 The mesenteric arterial bed (MAB) was isolated from the rats 30 min after ethanol administration.17 All experiments were in accordance with the principles and guidelines of the animal ethics committee of the University of São Paulo (#10.1.235.53.0).

Detection of O2- in the rat MAB

Lucigenin-derived chemiluminescence assay was performed to measure O₂^- production in the rat MAB as previously described.12 Luminescence was measured in a luminometer (Orion II Luminometer, Berthold detection systems, Pforzheim, Germany) and the results are expressed as relative light units per mg of protein. Protein concentrations in the samples were measured using the method of Lowry (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Detection of H2O2 in the rat MAB

In order to measure H₂O₂ concentration in the rat MAB, Amplex red^® (#A22188, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used as previously described.20 Results are expressed as nmol H₂O₂/mg protein

Detection of basal nitrate in the rat MAB

Baseline nitrate concentrations of supernatants from MAB homogenates was evaluated using a Sievers Chemiluminescence Analyzer (Nitric Oxide Analyser, NOA™ 280, Sievers Instruments, CO, USA) as previously described.12 Results are expressed as µmol/L per mg of protein.

Evaluation of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities in the rat MAB

The activity of SOD in the rat MAB was evaluated using a commercially available kit (#19160, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). SOD activity is expressed as inhibition rate % per mg of protein. The activity of CAT was determined as previously described.12 One CAT unit (U) was defined as the amount of enzyme required to decompose 1 µmol of H₂O₂/min.

Evaluation of reduced glutathione (GSH) concentration in the rat MAB

The concentration of GSH in the rat MAB was determined as previously described.12 Results are expressed as µg GSH per mg of protein.

Evaluation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in the rat MAB

The concentration of TBARS in the rat MAB was determined using a commercially available kit (#10009055, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Results are expressed as nmol per mg of protein.

Immunoblotting

The rat MAB was homogenized in a lysis buffer composed of 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4), NP-40 (1%), sodium deoxycholate (0.5%) and SDS (0.1%). Samples were centrifuged at 5,000 × g for 10 min (4ºC). Forty micrograms of protein were separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel, and transferred onto a nitrocellulose membrane. Skimmed milk 5% diluted in Tris-buffered saline solution with Tween 20 was used to block nonspecific binding sites (1 h at 24ºC). Membranes were then incubated overnight at 4ºC with the following primary antibodies: p-eNOS (Ser¹¹⁷⁷) (diluted 1:1000, 9571, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p-eNOS (Thr⁴⁹⁵) (diluted 1:1000, 9574, Cell Signaling), total eNOS (diluted 1:1000, 9572, Cell Signaling), P-protein kinase B (P-Akt) (Ser⁴⁷³) (diluted 1:1000, 4058, Cell Signaling) and total Akt (diluted 1:1000, 9272, Cell Signaling). Membranes were then incubated with secondary antibodies for 90 min at room temperature. Signals were revealed with chemiluminescence and quantified densitometrically. The results are expressed as the non-phospho/total proteins ratio.

Cytosol/membrane fractionation

The rat MAB was homogenized in lysis buffer containing 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4), 2.5 mmol/L EDTA, 5 mmol/L EGTA, and protease inhibitor. Homogenates were centrifuged at 100,000 × g for 1 h, at 4ºC. The supernatant (cytosolic fraction) was collected. The pellet, containing the particulate fraction, was resuspended in lysis buffer containing 1% Triton X-100 and centrifuged at 10,000 × g for 10 min at 4 °C. Membranes were then incubated with specific antibodies for RhoA (diluted 1:1000, sc-418, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) or p47phox (diluted 1:500, Santa Cruz Biotechnology) as previously published.21

Vascular reactivity experiments

Male Wistar rats were anesthetized with urethane (1.25 g/kg, i.p., Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and killed by aortic exsanguination. Segments of third-branch mesenteric arteries, measuring about 2 mm in length, were mounted in a small vessel myograph (Danish Myo Tech, Model 620M, A/S, Århus, Denmark) as previously described.22 Arteries were maintained in Krebs Henseleit solution [(in mmol/L) 130 NaCl, 4.7 KCl, 1.18 KH₂PO₄, 1.17 MgSO₄, 14.9 NaHCO₃, 5.5 glucose, 0.03 EDTA, 1.6 CaCl₂ )], at a constant temperature of 37°C, pH 7.4 and gassed with a mixture of 95% O₂ and 5% CO₂. Concentration-response curves to phenylephrine (0.1 nmol/L-100 µmol/L) were performed in endothelium-intact and endothelium-denuded arteries. The curves for acetylcholine (0.1 nmol/L-10 µmol/L) were performed in endothelium-intact arteries, pre-contracted with phenylephrine (1 µmol/L). Concentration-response curves were fitted using a nonlinear curve fitting program (Graph Pad Prism 3.0; GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Two pharmacological parameters were analyzed: pD₂ (negative logarithm of the molar concentration of the drug producing 50% of the maximum response) and E_max (maximum effect elicited by the agonist).

Cell culture and stimulation

VSMC derived from the MAB of male Wistar-Kyoto rats were isolated and characterized as previously described.23 Cells at passages 4 to 8 isolated from at least 5 different primary cell cultures were used. VSMC were stimulated with ethanol (50 mmol/L, 5 min) in the absence or in the presence of apocynin, a NAD(P)H oxidase inhibitor (10 µmol/L, 30 min), tiron (O₂^- scavenger, 10 µmol/L, 30 min), 4-methylpyrazole (4-MP,10 µmol/L, 30 min), a selective alcohol dehydrogenase (ADH) inhibitor, or vitamin C (100 µmol/L, 24 h). The concentration and period of exposition to ethanol and antioxidants were based on previous studies.12^,24 Superoxide anion production was measured by lucigenin-enhanced chemiluminescence as described above, and is expressed as percentage increase from baseline values.

Statistical analysis

Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). Groups were compared using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni's multiple comparison test. Data followed a normal distribution. Results of statistical tests with p<0.05 were considered as significant. Statistical analysis was carried out using the program Graph Pad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Results Blood ethanol levels

As we had previously reported,12^,16^,17 in this model of ethanol administration, blood ethanol levels vary from 20-24 mmol/L, which are within the range found in the bloodstream of humans after a binge drinking episode.25

Effect of acute ethanol intake on O2-, H2O2, TBARS, nitrate and GSH levels and SOD and CAT activities in the rat MAB

The effect of acute ethanol intake on ROS generation and lipid peroxidation in the rat MAB was evaluated by assessing the generation of O₂ ^- and H₂O₂ and the concentration of TBARS. Lucigenin-derived luminescence was significantly higher in the MAB from ethanol-treated rats, and such response was prevented by treatment with vitamin C (Figure 1A). No changes in H₂O₂ levels were observed after treatment with ethanol (Figure 1B). Vitamin C prevented the increase on TBARS concentration induced by acute ethanol intake (Figure 1C). Since increased oxidative stress is associated with reduced NO bioavailability, we evaluated the effect of acute ethanol intake on nitrate concentration in the rat MAB. Ethanol treatment did not alter the baseline levels of nitrate in the rat MAB (Figure 1D). In order to evaluate the effect of ethanol on the vascular antioxidant status, SOD and CAT activities as well as GSH concentrations were determined in the rat MAB. Our results showed that treatment with ethanol had no effect on these parameters (Figure 2).

Figure 1 Effects of acute ethanol intake on O2-, H2O2 and nitrate levels in the rat mesenteric arterial bed . Vascular levels of O2- (A) and nitrate (D) were determined by chemiluminescence. Vascular H2 O 2 levels were measured fluorometrically (B). thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) concentration was determined colorimetrically (C). Results are presented as means ± SEM of 6-9 experiments. *Compared to control, control plus vitamin C and ethanol plus vitamin C (p<0.05, ANOVA).

Figure 2 Effects of acute ethanol intake on superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities and reduced glutathione (GSH) levels in the rat mesenteric arterial bed. SOD and CAT activities (A and B) and GSH levels (C) were determinate colorimetrically. Results are presented as means ± SEM of 6-8 experiments.

Effect of ethanol on O2- generation in cultured MAB VSMC

The antioxidant effect of vitamin C was tested in cultured MAB VSMC. Vitamin C prevented the increase on O₂^- generation induced by ethanol (50 mmol/L, 5 min) in cultured VSMC. To test the role of an ethanol metabolite on ethanol-induced O₂^- generation, the cells were incubated with 4-MP, an ADH inhibitor. 4-MP prevented ethanol-induced O₂^- generation in cultured VSMC. Apocynin and tiron also prevented the generation of O₂^- induced by ethanol (Figure 3).

Figure 3 Effect of tiron, apocynin, 4-MP and vitamin C on ethanol-induced O2- generation in cultured VSMC of the rat mesenteric arterial bed . Cells were stimulated with ethanol (50 mmol/L, 5 min) in the absence or after incubation with tiron (10 µmol/L, 30 min), apocynin (10 µmol/L, 30 min), 4-methylpyrazole (4-MP) (10 µmol/L, 30 min) or vitamin C (100 µmol/L, 24 h). The bars represent the mean ± SEM of 7-11 experiments. * Compared to vehicle (p<0.05, ANOVA).

Evaluation of Akt and eNOS phosphorylation in the rat MAB

Our findings showed no alteration in the phosphorylation of Akt at Ser⁴⁷³ residue or eNOS at Ser¹¹⁷⁷ and Thr⁴⁹⁵ residues after acute ethanol intake or treatment with vitamin C (Figure 4).

Figure 4 Effects of acute ethanol intake on protein kinase B (Akt) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) phosphorylation in the rat mesenteric arterial bed . Top panels: representative immunoblots for Akt and eNOS protein phosphorylation and expression. Bottom panels: corresponding bar graphs showing densitometric data for phosphorylation of Akt at Ser473 residue (A), eNOS at Ser1177 residue (B) and eNOS at Thr495 residue (C). Results are presented as mean ± SEM of 4-6 experiments.

Evaluation of p47phox and RhoA translocation in the rat MAB

Since NAD(P)H oxidase is the major source of ROS in the vasculature, and NAD(P)H-derived ROS induce activation of the RhoA/Rho kinase signaling pathway, we evaluated the effect of ethanol on p47phox and RhoA translocation. MAB from ethanol-treated rats displayed a significant increase in the membrane/cytosol fraction ratio of p47phox (Figure 5A) and RhoA expression (Figure 5B), indicating the translocation of the proteins. Treatment with vitamin C prevented the increase in p47phox and RhoA translocation induced by ethanol.

Figure 5 Effects of acute ethanol intake on p47phox and RhoA translocation in the rat mesenteric arterial bed (MAB). Bar graph represents translocation of p47phox and RhoA as a ratio of membrane/cytosol expression (A and B) in the rat MAB. Top panels: representative immunoblots. Results are presented as mean ± SEM of 5-7 experiments. *Compared with control, control plus vitamin C and ethanol plus vitamin C (p<0.05, ANOVA).

Experiments on vascular reactivity of mesenteric artery

Ethanol treatment did not affect acetylcholine-induced relaxation (E_max: 98.3 ± 1.5%; pD₂: 8.2 ± 0.2, n=6), when compared to control (E_max: 100.3 ± 2.3%; pD₂: 8.1 ± 0.4, n=6), control plus vitamin C (E_max: 98.6 ± 1.8%; pD₂: 8.1 ± 0.2, n=4) and ethanol plus vitamin C (E_max: 99.8 ± 0.4%; pD₂: 7.8 ± 0.3, n=5) groups (Figure 6) . In endothelium-intact arteries, acute ethanol intake had no effect on contraction (% KCl 120 mmol/L) induced by phenylephrine (E_max: 138.8 ± 10.4%; pD₂: 5.9 ± 0.3, n=5), when compared to control (E_max: 136.3 ± 10.3%; pD₂: 6.3 ± 0.2, n=4), control plus vitamin C (E_max: 112.9 ± 2.4%; pD₂: 6.3 ± 0.1, n=4) and ethanol plus vitamin C (E_max: 122.3 ± 7.7%; pD₂: 6.1 ± 0.1, n=6) groups. Similarly, ethanol treatment did not alter the contraction induced by phenylephrine in endothelium-denuded arteries (E_max: 135.1 ± 7.2%; pD₂: 6.1 ± 0.1, n=6), when compared to control (E_max: 120.7 ± 5.5%; pD₂: 6.1 ± 0.3, n=5), control plus vitamin C (E_max: 116.3 ± 3.5%; pD₂: 5.7 ± 0.1, n=4) and ethanol plus vitamin C (E_max: 144.3 ± 10.4%; pD₂: 6.1 ± 0.3, n=5) groups.

Figure 6 Effects of acute ethanol intake on vascular reactivity to acetylcholine and phenylephrine. Concentration-response curves for acetylcholine were performed in endothelium-intact third branch mesenteric arteries (A). Concentration-response curves for phenylephrine were obtained in endothelium-intact (Endo+, B) or endothelium-denuded (Endo-, C) arteries. Results are presented as means ± SEM of 4 to 6 experiments.

Discussion

The present findings show that acute ethanol intake induces RhoA translocation and NAD(P)H oxidase activation by promoting p47phox translocation in resistance arteries. Despite increasing ROS generation, acute ethanol intake does not affect NO synthesis or bioavailability in resistance arteries. The relevance of our findings is strengthened by previous studies of our group that showed that using this same model of ethanol administration, plasma ethanol levels are within the range of 20-24 mmol/L12^,16^,17 which corresponds to that found in humans after a "binge drinking" session ,25 and in rats 30 min after oral administration of ethanol.26

Our findings demonstrated that ethanol increased O₂^- generation in the rat MAB, which is in accordance with previous results from our laboratory.12 Additionally, increased lipid peroxidation was observed in the rat MAB after ethanol intake. The lucigenin-derived chemiluminescence assay is based on the enzymatic action of the enzyme NAD(P)H oxidase.27 In this sense, the increase in chemiluminescence here described suggests that the enzyme NAD(P)H oxidase is an important source of acute ethanol-induced O₂^- generation in resistance arteries. This idea is supported by the fact that apocynin inhibited ethanol-induced O₂^- generation in cultured VSMC. Vitamin C is an effective scavenger of O₂^-28 and in our model it decreased ethanol-induced O₂^- generation and lipid peroxidation in resistance arteries. The antioxidant property of vitamin C is also associated with decreased activation of NAD(P)H oxidase.15 In cultured VSMC, vitamin C prevented ethanol-induced O₂^- generation, suggesting that the inhibition of NAD(P)H oxidase by vitamin C may also be implicated in diminishing ethanol-induced vascular O₂^- generation.

ADH is an ethanol-metabolizing enzyme that is functionally active in the vasculature.29 We have previously described that ethanol metabolites are involved in the vascular effects elicited by ethanol.30 In order to determine a possible role for ethanol metabolites on O₂^- generation induced by ethanol in resistance arteries, we evaluated the effect of 4-MP on this process. Inhibition of ethanol metabolism mediated by ADH led to a decrease in ethanol-induced O₂^- generation in cultured VSMC. Thus, we present evidence that an ethanol metabolite, possibly acetaldehyde, is responsible for ROS generation in resistance arteries.

NAD(P)H oxidase is the major source of ROS in the vasculature. The prototypical phagocytic Nox comprises five subunits: three cytosolic regulatory subunits, p40phox, p47phox and p67phox and two membrane-associated components named gp91phox (Nox2) and p22phox. The enzymatic complex is dissociated in resting cells but it is rapidly activated upon cellular stimulation. Phosphorylation of p47phox at a serine residue initiates the activation of the enzyme, triggering the formation of a complex composed by the cytosolic subunits. This response is followed by translocation of the cytosolic complex to the membrane and association with gp91phox and p22phox subunits (cytochrome b₅₅₈). NAD(P)H oxidase components are expressed in endothelial and VSMC, and translocation of the p47phox subunit has been shown to be essential for ROS production in these cells.31 In our study, the translocation of p47phox was increased in MAB from ethanol-treated rats, and this effect was inhibited by vitamin C, suggesting that oxidative stress is involved in ethanol-induced p47phox translocation and NAD(P)H oxidase activation. Moreover, this observation strengthens our initial idea that NAD(P)H oxidase is implicated in ethanol-induced O₂^- generation in the rat MAB. The inhibitory action of vitamin C on p47phox translocation has been previously described.32 Mechanisms whereby vitamin C inhibits the translocation of p47phox are ill defined, but may involve the inhibition of NAD(P)H oxidase activators. A large number of proteins are involved in NAD(P)H oxidase assembly. These include Rac GTPases, protein kinase C (PKC) and c-Src.11 Papparella et al.32 showed that vitamin C inhibited PKC activation with subsequent reduction in p47phox translocation and ROS generation. The current study did not address the exact mechanism whereby ethanol modulates NAD(P)H oxidase activity. Different stimuli, such as endothelin-1, angiotensin II, catecholamines, thrombin and growth factors (eg.: epidermal and growth factor and platelet-derived growth factors ) acutely activate NAD(P)H oxidase in the vasculature.33 We have previously shown that losartan, an antagonist of AT₁ receptors, did not prevent ethanol-induced ROS generation in the rat MAB,12 ruling out a role for angiotensin II in ethanol-induced NAD(P)H activation here described. Future studies designed to address how acute ethanol intake induces p47phox translocation and ROS generation in resistance arteries are of interest.

Superoxide anion is a highly unstable molecule that is reduced by SOD to H₂O_2.34 In our study, the antioxidant action of vitamin C was not related to an increase in SOD activation, since no difference on SOD activity was observed in the MAB after treatment with the vitamin . In addition , since ethanol treatment did not alter SOD activity , the ethanol-induced increase in O₂^- levels seems not to be related to decreased dismutation of O₂^- by SOD. Although both O₂^- and H₂O₂ act as signaling molecules, H₂O₂ is considered the main signaling compound because of its relative stability and sub-cellular localization.34 For example, H₂O₂ activates redox-signaling sensitive pathways such as MAPK and Rho kinase.35 H₂O₂ is tightly regulated by intracellular and extracellular enzymes, including CAT, which converts H₂O₂ into water and O₂. Our findings showed that acute ethanol intake did not alter either H₂O₂ levels or CAT activity in the rat MAB.

Endothelial dysfunction is caused by an increase in ROS generation and a reduction of endothelial NO bioavailability, by increasing the oxidative inactivation of NO and/or by decreasing its synthesis. In the vascular endothelium NO is synthesized by eNOS. Akt, a serine/threonine kinase, phosphorylates eNOS thereby activating the enzyme.36 Phosphorylation of eNOS at Ser¹¹⁷⁷ residue is a critical requirement for eNOS activation, whereas phosphorylation at Thr⁴⁹⁵ residue leads to inactivation of the enzyme.36 Here we demonstrated that ethanol had no effect on the Akt/eNOS phosphorylation, which corroborated the observation that ethanol intake did not alter the concentration of nitrate in the rat MAB. Ethanol induces a transient increase in the activity of both SOD and CAT and this response can shift the balance ROS/NO towards NO levels.37 In this regard , ethanol-induced increase in antioxidant defenses could explain the lack of effect of ethanol on nitrate levels in the rat MAB. However, acute ethanol intake did not alter GSH levels or SOD and CAT activities in the rat MAB, indicating that the treatment did not affect the cellular antioxidant capacity.

NAD(P)H oxidase-derived ROS in the vasculature activate redox-sensitive targets such as RhoA/Rho kinase. Superoxide anion and H₂O₂ activate the RhoA/Rho kinase pathway, which represents an important class of redox-regulated signaling molecules in the cardiovascular system.13 The RhoA/Rho kinase pathway regulates many intracellular signaling pathways in the vasculature. Rho cycles between the GDP-bound inactive form located in the cytoplasm and the GTP-bound active form in the cell membrane,38 and RhoA translocation to the membrane is associated with its activation. The present findings showed that ethanol intake increased RhoA translocation, further suggesting an activation of the RhoA/Rho kinase pathway. Also , the fact that vitamin C prevented ethanol-induced RhoA translocation suggests that this response is mediated by ROS. This result is in agreement with previous findings showing that ROS, most notably O₂ ^- and H₂O₂, are linked to the activation of the RhoA/Rho kinase pathway.39 To the best of our knowledge, this is the first study demonstrating a direct interaction among ethanol intake, NAD(P)H oxidase-derived ROS and the activation of the RhoA/Rho kinase signaling pathway. RhoA is abundantly expressed in VSMC and participates in vasoconstriction via phosphorylation of myosin light chain and sensitization of contractile proteins to calcium. Additionally, increased RhoA activation has been linked to endothelial dysfunction, increased peripheral vascular resistance and hypertension.40 Despite the activation of the RhoA/Rho kinase signaling pathway, acute ethanol intake did not affect the contractile response induced by phenylephrine or the endothelium-dependent relaxation induced by acetylcholine in the mesenteric artery. These results suggest that RhoA activation here described probably occurs before the onset of severe functional abnormalities.

Some limitations for the present study should be considered. In our study, all parameters were evaluated when ethanol reached its maximal plasma concentration. The period of action of ethanol in the vasculature after a single dose was not evaluated. Thus, studies on the time-course effect of a single dose administration of ethanol are of interest. Another point that should be considered is that while "binge drinking" in humans is broadly defined as the consumption of a large amount of ethanol (4-5 standard drinks) in a two-hour period, in our study the total amount of ethanol (1g/kg) was administered in a single dose.

Activation of NAD(P)H oxidase with subsequent increase in ROS generation and activation of redox-sensitive signalling pathways, such as the RhoA/Rho kinase pathway, are important events linked to vascular dysfunction and are described to play a role in the pathophysiology of several cardiovascular diseases.9^,11^,13 Binge drinking is associated with a heightened risk of cardiovascular events, such as stroke, sudden death, myocardial infarction, increased mortality after myocardial infarction,2^-4 and with progression of carotid atherosclerosis.1 Importantly, changes in vascular biology are key mechanisms underlying the increased risk of adverse cardiovascular events induced by binge drinking.6 Thus, our findings raise the possibility that not only chronic ethanol intake is a risk factor for cardiovascular events, but also acute ethanol intake may increase the risk for vascular injury by increasing ROS generation and activation of redox-sensitive pathways. Altogether, these responses trigged by ethanol could predispose to the development of cardiovascular diseases.

Conclusions

In summary, the major new finding of the present study is that acute ethanol intake induces activation of the RhoA/Rho kinase pathway by a mechanism that involves ROS generation. Additionally, we first demonstrated that ethanol activates NAD(P)H oxidase by induction of p47phox translocation and by redox-sensitive mechanisms in resistance arteries.

Sources of Funding

This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

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O consumo agudo de etanol induz a ativação da NAD(P)H oxidase e translocação da RhoA em artérias de resistência

Simplicio

Janaina A.

2 Hipólito

Ulisses Vilela

2 Vale

Gabriel Tavares do

2 Callera

Glaucia Elena

3 Pereira

Camila André

2 Touyz

Rhian M

3 Tostes

Rita de Cássia

2 Tirapelli

Carlos R.

1 Departamento de Enfermagem Psiquiátrica e Ciências Humanas - Laboratório de Farmacologia - Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (USP); SP, Brasil 2 Programa de Pós-Graduação em Farmacologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (USP), SP, Brasil 3 University of Ottawa, Canada

Correspondência: Carlos Renato Tirapelli, Avenida Bandeirantes 3900, Monte Alegre. CEP 14040 902, Ribeirão Preto, SP - Brasil. E-mail: crtirapelli@eerp.usp.br, crtlilo@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Obtenção de dados e Análise estatística: Simplicio JA, Hipólito UV, Vale GT, Pereira CA; Análise e interpretação dos dados: Simplicio JA, Hipólito UV, Vale GT, Pereira CA, Tostes RC; Redação do manuscrito: Simplicio JA, Hipólito UV, Tirapelli CR; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Callera GE, Touyz RM, Tostes RC, Tirapelli CR.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Resumo Fundamento:

O mecanismo da disfunção vascular induzido pelo consumo de etanol não é totalmente compreendido. Justifica-se, assim a identificação de mecanismos bioquímicos e moleculares que poderiam explicar tais efeitos.

Objetivos:

Investigar se a ingestão aguda de etanol ativa a via vascular RhoA/Rho quinase em artérias de resistência e o papel das espécies reativas de oxigênio (ERO) derivadas da NAD(P)H oxidase nessa resposta. Nós também avaliamos se ocorreu translocação da p47phox e ativação da NAD(P)H oxidase após o consumo agudo de etanol.

Métodos:

Ratos Wistar machos foram tratados com etanol via oral (1g/kg, p.o. gavagem) ou água (controle). Alguns ratos foram tratados com vitamina C (250 mg/kg, p.o. gavagem, 5 dias) antes de água ou etanol. O leito arterial mesentérico (LAM) foi coleado 30 min após a administração de etanol.

Resultados:

A vitamina C preveniu o aumento da geração de ânion superóxido (O₂ ^-) e lipoperoxidação no LAM induzidos pelo etanol. A atividade da catalase (CAT), da superóxido dismutase (SOD) e os níveis de glutationa reduzida(GSH), nitrato e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) não foram afetados após a ingestão aguda de etanol. A vitamina C e o 4-metilpirazol preveniram o aumento na geração de O₂ ^- induzido pelo etanol em cultura de células do músculo liso vascular (CMLV). O etanol não afetou a fosforilação da proteína quinase B (Akt) e nem da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (nos resíduos de Ser¹¹⁷⁷ ou Thr⁴⁹⁵) ou a reatividade vascular do LAM. A vitamina C preveniu o aumento da razão membrana:citosol da p47phox e a expressão da RhoA no LAM de rato induzido pelo etanol.

Conclusão:

A ingestão aguda de etanol induz a ativação da via RhoA/Rho quinase por um mecanismo que envolve a geração de ERO. Nas artérias de resistência, o etanol ativa NAD(P)H oxidase induzindo a translocação da p47phox por um mecanismo redox-sensível.

Palavras-chave: Etanol NADPH Oxidase Ratos Estresse Oxidativo Ácido Ascórbico Proteína rhoA de Ligação do GTP

Introdução

O consumo excessivo de etanol, frequentemente referido na literatura como "binge drinking", é considerado um fator de risco para o sistema cardiovascular. Binge drinking está associado a um risco aumentado para eventos cardiovasculares, tais como aterosclerose, acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio1^-3. O mecanismo exato que envolve a disfunção cardiovascular associada com o consumo excessivo de álcool não foi totalmente elucidado, mas alterações da função vascular parecem exercer um papel fundamental4^-6.

Um mecanismo importante pelo qual o etanol causa danos vasculares é pelo aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). A formação de ânion superóxido (O₂^-) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) está associada à disfunção vascular.7^,8 A enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, [NAD(P)H] oxidase, é a principal fonte de ERO nas células endoteliais e nas células do músculo liso vascular (CMLV)9, sendo um fator essencial na disfunção vascular induzida por etanol10. A ativação da [NAD(P)H] oxidase é um processo complexo, mas a translocação da subunidade p47phox para a membrana, com posterior associação com o citocromo b₅₅₈, é uma etapa decisiva para a ativação da enzima.11 Achados recentes do nosso laboratório mostraram que a ingestão aguda de etanol aumenta a geração de ERO derivados da NADPH oxidase em artérias de resistência.12

ERO influenciam na ativação de diversas vias de sinalização, incluindo as proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e a RhoA/Rho quinase, consideradas importantes mediadores de disfunção vascular. A ativação de vias redox-sensíveis regula o crescimento de células vasculares, a inflamação e a contração13. Um dado importante é que a ingestão aguda de etanol induz a ativação da [NAD(P)H] oxidase e a fosforilação de MAPK em artérias de resistência12. Além disso, o O₂^- é responsável pela rápida inativação do óxido nítrico (NO)14 e, alterações na síntese e/ou biodisponibilidade do NO estão envolvidas no desenvolvimento de eventos vasculares clinicamente significantes.

No presente estudo, buscamos investigar se a ingestão aguda de etanol ativa a via da RhoA/Rho quinase em células vasculares de artérias de resistência, e o papel das ERO derivadas da [NAD(P)H] oxidase nessa resposta. Além disso, avaliamos a translocação da p47phox para a ativação da [NAD(P)H] oxidase induzida por etanol, e o efeito das ERO induzidas pelo etanol sobre a produção de NO. O ácido ascórbico (vitamina C) foi o antioxidante escolhido, uma vez que, segundo estudos anteriores15^,16, reduz o estresse oxidativo na vasculatura.

Métodos Administração aguda de etanol

Dose de 1g/kg de etanol (10mL/kg de etanol a 13% diluído em água) foi administrado por gavagem a 20 ratos Wistar machos (200-250g) mantidos em jejum por 12 h.12^,16 Aplicando esse modelo de administração, os níveis sanguíneos de etanol mantêm-se no intervalo entre 20 e 24 mmoL/L12^,16^,17. Ratos do grupo controle (n=20) receberam água (gavagem). Alguns animais foram tratados com vitamina C na dose de 250 mg/kg (gavagem) por 5 dias,16^,18^,19 antes da administração de água (n=18) ou etanol (n=19). O tamanho da amostra foi baseado em estudos prévios.12^,16^,17 O leito arterial mesentérico (LAM) foi isolado 30 min após a administração de etanol.17 Todos os experimentos estavam de acordo com os princípios e diretrizes do comitê de ética em uso de animais da Universidade de São Paulo (#10.1.235.53.0).

Detecção de O2- no LAM de rato

A produção de O₂^- no LAM de ratos foi medida pelo método da quimioluminescência da lucigenina, conforme descrito anteriormente.12 A luminescência foi medida em um luminômetro (Orion II Luminometer, Berthold detection systems, Pforzheim, Germany), e os resultados expressos em unidades relativas de luz (URL) por mg de proteína. As concentrações de proteína nas amostras foram medidas pelo método de Lowry (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Detecção de H2O2 no LAM de rato

Para medir a concentração de H₂O₂ no LAM de rato, foi utilizado o Amplex red^® (#A22188, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), conforme descrito previamente.20 Os resultados foram expressos em nmol por mg de proteína.

Detecção de nitrato basal no LAM de rato

A concentração basal de nitrato no sobrenadante do homogeneizado de LAM foi avaliado usando um analisador de óxido nítrico Sievers (NOA™ 280, Sievers Instruments, CO, USA), conforme descrito previamente.12 Os resultados foram expressos em µmol/L por mg de proteína.

Avaliação das atividades da superóxido dismutase (SOD) e da catalase (CAT) em LAM de rato

A atividade da SOD no LAM de rato foi avaliada usando um kit disponível comercialmente (#19160, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A atividade da SOD foi expressa como taxa de inibição (%) / mg de proteína. A atividade da CAT foi determinada conforme descrito anteriormente.12 Uma unidade de CAT foi definida como a quantidade de enzima necessária para decompor 1 µmol de H₂O₂/min.

Avaliação da concentração de glutationa reduzida (GSH) em LAM de rato

A concentração de GSH no LAM foi determinada conforme descrito anteriormente .12 Os resultados foram expressos em µg GSH por mg de proteína.

Avaliação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em LAM de rato

A concentração de TBARS no LAM foi determinada utilizando-se um kit disponível comercialmente (#10009055, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Os resultados foram expressos em nmol por mg de proteína.

Immunoblotting

O LAM de rato foi homogeneizado em um tampão de lise composto por 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7,4), NP-40 (1%), desoxicolato de sódio (0,5%) e SDS (0,1%). As amostras foram centrifugadas a 5000 × g por 10 min (4ºC). Quarenta microgramas de proteína foram separadas por eletroforese em um gel de poliacrilamida a 10%, e transferida para uma membrana de nitrocelulose. Leite desnatado (5%) diluído em solução salina tamponada (Tris) com Tween 20 foi usado para bloquear sítios de ligação não específicos (1 h a 24ºC). As membranas foram incubadas por uma noite a 4ºC com os seguintes anticorpos primários: p-eNOS (Ser¹¹⁷⁷) (diluído 1:1000, 9571, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p-eNOS (Thr⁴⁹⁵) (diluído 1:1000, 9574, Cell Signaling), eNOS total (diluído 1:1000, 9572, Cell Signaling), P- proteína quinase B (P-Akt) (Ser⁴⁷³) (diluído 1:1000, 4058, Cell Signaling) e Akt total (diluído 1:1000, 9272, Cell Signaling). Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários por 90 min à temperatura ambiente e os sinais foram revelados pela exposição das membranas à uma solução de quimioluminescência e quantificados densitometricamente. Os resultados foram expressos pela razão entre proteínas não fosforiladas / proteínas totais.

Fracionamento celular (membrana plasmática / citosol)

O LAM de rato foi homogeneizado em tampão de lise contendo Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7,4), EDTA 2,5 mmol/L, EGTA 5 mmol/L, e inibidor de protease. Em seguida, centrifugado a 100 000 × g por 1 h, a 4ºC. O sobrenadante (fração citosólica) foi coletado. O pellet, contendo a fração com partículas, foi ressuspenso em tampão de lise contendo Triton X-100 1%, e centrifugado a 10 000 × g por 10 min a 4 ºC. As membranas foram então incubadas com anticorpos específicos para RhoA (diluído 1:1000, sc-418, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) ou p47phox (diluído 1:500, Santa Cruz Biotechnology), como publicado anteriormente.21

Experimentos de reatividade vascular

Ratos machos Wistar foram anestesiados com uretana (1,25 g/kg, i.p., Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), e sacrificados por exsanguinação da aorta. Segmentos do terceiro ramo das artérias mesentéricas, medindo aproximadamente 2 mm de comprimento, foram colocados em um miógrafo para pequenos vasos (Danish Myo Tech, Model 620M, A/S, Århus, Denmark), conforme descrito previamente.22 As artérias foram mantidas em solução Krebs Henseleit [(em mmol/L) NaCl 130, KCl 4,7, KH₂PO₄ 1,18, MgSO₄ 1,17, NaHCO₃ 14,9, glicose 5,5, EDTA 0,03, CaCl₂ 1,6)], temperatura constante de 37°C, pH 7,4, e gaseificadas com uma mistura de O₂ 95% e CO₂ 5%. Curvas dose-resposta à fenilefrina (0,1 nmol/L-100 µmol/L) foram obtidas em artérias com endotélio intacto e na ausência de endotélio. As curvas para acetilcolina (0,1 nmol/L-10 µmol/L) foram obtidas nas artérias com endotélio intacto, pré-contraídas com fenilefrina (1 µmol/L). Curvas dose-resposta foram ajustadas com um programa não linear de ajuste de curvas (Graph Pad Prism 3.0; GraphPad Software Inc., San Diego, CA) e dois parâmetros farmacológicos foram analisados: pD₂ (logaritmo negativo da concentração molar da droga produzindo 50% da resposta máxima) e E_max (efeito máximo induzido pelo agonista).

Cultura de células e estimulação

CMLV derivadas do LAM de ratos machos foram isoladas e caracterizadas como descrito anteriormente.23 Foram utilizadas células nas séries 4 a 8 isoladas de pelo menos 5 culturas diferentes de células primárias. As CMLV foram estimuladas com etanol (50 mmol/L, 5 min) na ausência e na presença de apocinina, um inibidor da NAD(P)H oxidase (10 µmol/L, 30 min), tiron (sequestrador de O₂^-, 10 µmol/L, 30 min), 4-metilpirazol (4-MP) (10 µmol/L, 30 min), um inibidor seletivo de álcool desidrogenase (ADH,) ou vitamina C (100 µmol/L, 24 h). A concentração e o período de exposição ao etanol e aos antioxidantes foram baseados em estudos prévios.12^,24 A produção de ânion superóxido foi medida por quimioluminescência dependente de lucigenina como descrito acima, e expressa em porcentagem de aumento dos valores basais.

Análise estatística

Os dados foram representados pela média ± erro padrão da média. A comparação entre os grupos foi realizada por análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. Os dados apresentavam distribuição normal. Os resultados dos testes estatísticos com p<0,05 foram considerados significativos. As análises foram realizadas pelo programa Graph Pad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Resultados Níveis de etanol sanguíneo

Conforme descrito previamente,12^,16^,17 neste modelo de administração de etanol, os níveis sanguíneos de etanol variam de 20 a 24 mmol/L, os quais encontram-se dentro dos valores encontrados na corrente sanguínea humana após um episódio de binge drinking.25

Efeito da ingestão aguda de etanol sobre os níveis de O2-, H2O2, TBARS, nitrato, GSH e atividades da SOD e CAT no LAM de ratos

Para verificar o efeito da ingestão aguda de etanol sobre a geração de ERO e peroxidação lipídica no LAM de rato, foi avaliada a geração de O₂ ^- e H₂O₂, bem como a concentração de TBARS. A quimioluminescência dependente de lucigenina foi significativamente maior no LAM de ratos tratados com etanol, e o tratamento com vitamina C preveniu essa resposta (Figura 1A). Não foram observadas mudanças nos níveis de H₂O₂ após tratamento com etanol (Figura 1B). A vitamina C preveniu o aumento na concentração de TBARS induzido por ingestão aguda de etanol (Figura 1C). Uma vez que o estresse oxidativo está associado com menor biodisponibilidade de NO, nós avaliamos o efeito da ingestão aguda de etanol sobre a concentração de nitrato no LAM de rato. O tratamento com etanol não alterou os níveis basais de nitrato no LAM de rato (Figura 1D). Para avaliar o efeito do etanol sobre o estado antioxidante vascular, foram determinadas as atividades da SOD e CAT, bem como as concentrações de GSH no LAM de rato. Nossos resultados mostraram que a ingestão aguda de etanol não alterou as atividades da SOD e CAT (Figuras 2A e B), ou os níveis de GSH (Figura 2C).

Figura 1 Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre os níveis de O2-, H2O2 e nitrato no leito arterial mesentérico de rato. Os níveis vasculares de O2- (A) e nitrato (D) foram determinados por quimioluminescência. Os níveis vasculares de H2O2 foram determinados por fluorimetria (B). Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram medidas por colorimetria (C). Os resultados foram apresentados em média ± erro padrão da média de 6-9 experimentos. *Em comparação aos grupos controle, controle + vitamina C e etanol + vitamina C (p<0,05, ANOVA).

Figura 2 Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre as atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CTA) e os níveis de glutationa reduzida (GSH) no leito arterial mesentérico de rato. As atividades da SOD e CAT (A e B) e os níveis de GSH (C) foram determinados colorimetricamente. Os resultados foram apresentados em média ± erro padrão da média de 6-8 experimentos.

Efeito de etanol sobre a geração de O2- na cultura de CMLV de LAM

O efeito antioxidante da vitamina C foi testado na cultura de CMLV derivadas do LAM. A vitamina C preveniu o aumento da geração de O₂^- induzida por etanol (50 mmol/L, 5 min) em cultura de CMLV. A fim de avaliar o papel de um metabólito de etanol sobre a geração de O₂- induzida por etanol, as células foram incubadas com 4-MP, um inibidor de ADH. 4-MP preveniu a geração de O₂^- induzida por etanol na cultura de CMLV (Figura 3).

Figura 3 Efeito do tiron, da apocinina, do 4-metilpirazol (4-MP) e da vitamina C sobre a geração de O2- induzida por etanol na cultura de células vasculares do músculo liso de células do leito arterial mesentérico de rato. As células foram estimuladas com etanol (50 mmol/L, 5 min) na ausência de inibidor ou após incubação com tiron (10 µmol/L, 30 min), apocinina (10 µmol/L, 30 min), 4-MP (10 µmol/L, 30 min) ou vitamina C (100 µmol/L, 24 h). As barras representam média ± erro padrão da média de 7-11 experimentos. *Comparado ao veículo (p<0.05, ANOVA).

Avaliação de fosforilação de Akt e eNOS no LAM de rato

Nossos resultados mostraram que não houve alteração na fosforilação da Akt no resíduo de Ser⁴⁷³ ou da eNOS nos resíduos de Ser¹¹⁷⁷ e Thr⁴⁹⁵ após ingestão aguda de etanol ou tratamento com vitamina C (Figura 4).

Figura 4 Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre a fosforilação da proteína quinase B (Akt) e óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) no leito arterial mesentérico de rato. Parte superior: resultados de western blotting para expressão e fosforilação de Akt e proteína eNOS. Parte inferior: gráficos de coluna correspondentes mostrando dados densitométricos para fosforilação da Akt no resíduo de Ser473 (A), eNOS no resíduo de Ser1177 (B), eNOS no resíduo de Tre495 (C). Os resultados foram apresentados em média ± erro padrão da média de 4-6 experimentos.

Avaliação da translocação da p47phox e RhoA em LAM de rato

Uma vez que a NAD(P)H oxidase é a principal fonte de ERO na vasculatura, e as ERO proveniente da NAD(P)H induzem a ativação da via de sinalização RhoA/Rho quinase, foi avaliado o efeito do etanol sobre a translocação da p47phox e RhoA. LAM de ratos tratados com etanol apresentaram um aumento significativo na expressão proteica da razão fração membrana/citosol da p47phox (Figura 5A) e na expressão proteica de RhoA (Figura 5B), indicando a translocação das proteínas. O tratamento com vitamina C preveniu o aumento da translocação da p47phox e da RhoA induzida pelo etanol.

Figura 5 Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre a translocação da p47phox e RhoA no leito arterial mesentérico (LAM) de rato. O gráfico de barra representa a translocação da p47phox e RhoA como razão da expressão membrana/citosol (A e B) no LAM de rato. Parte superior: resultados de western blotting. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-7 experimentos. *em comparação aos grupos controle, controle + vitamina C e etanol + vitamina C (p<0,05, ANOVA).

Experimentos sobre a reatividade vascular da artéria mesentérica

O tratamento com etanol não afetou o relaxamento induzido por acetilcolina (E_max: 98,3 ± 1,5%; pD₂: 8,2 ± 0,2, n=6), quando comparado aos grupos controle (E_max: 100,3 ± 2,3%; pD₂: 8,1 ± 0,4, n=6), controle + vitamina C (E_max: 98,6 ± 1,8%; pD₂: 8,1 ± 0,2, n=4) e etanol + vitamina C (E_max: 99,8 ± 0,4%; pD₂: 7,8 ± 0,3, n=5). Nas artérias com endotélio intacto, a ingestão aguda de etanol não afetou a contração (% KCl 120 mmol/L) induzida por fenilefrina (E_max: 138,8 ± 10,4%; pD₂: 5,9 ± 0,3, n=5), em comparação aos grupos controle (E_max: 136,3 ± 10,3%; pD₂: 6,3 ± 0,2, n=4), controle + vitamina C (E_max: 112,9 ± 2,4%; pD₂: 6,3 ± 0,1, n=4) e etanol + vitamina C (E_max: 122,3 ± 7,7%; pD₂: 6,1 ± 0,1, n=6). O mesmo foi observado nas artérias sem endotélio, em que o tratamento com etanol não afetou a contração induzida por fenilefrina (E_max: 135,1 ± 7,2%; pD₂: 6,1 ± 0,1, n=6), em comparação aos grupos controle (E_max: 120,7 ± 5,5%; pD₂: 6,1 ± 0,3, n=5), controle + vitamina C (E_max: 116,3 ± 3,5%; pD₂: 5,7 ± 0,1, n=4) e etanol+ vitamina ((Emax: 144.3 ± 10.4%; pD2: 6.1 ± 0.3, n=5).

Discussão

Os resultados presentes mostram que a ingestão aguda de etanol induz a translocação da RhoA e a ativação da NAD(P)H oxidase, pela translocação da p47phox em artérias de resistência. Apesar de aumentar a geração de ERO, a ingestão aguda de etanol não afeta a síntese ou a biodisponibilidade de NO nas artérias de resistência. A relevância de nossos achados ganha força ao considerarmos estudos prévios de nosso grupo de pesquisa12^,16^,17 em que se demonstrou que, utilizando este mesmo modelo de administração de etanol, a concentração plasmática de etanol atingida é de 20-24 mmol/L, a qual corresponde à encontrada em humanos após consumo excessivo de álcool,25 ou em ratos após 30 min de administração oral de etanol.26

Nossos resultados demonstraram que o etanol aumentou a geração de O₂^- no LAM de rato, o que está de acordo com resultados prévios de nosso laboratório.12

Além disso, observou-se um aumento da peroxidação lipídica no LAM de rato após ingestão de álcool. O teste de quimioluminescência dependente de lucigenina baseia-se na ação enzimática da enzima NAD(P)H oxidase.27 Nesse sentido, o aumento na quimioluminescência descrito neste estudo sugere que a enzima NAD(P)H oxidase seja uma importante fonte de geração de O₂^- induzida pelo etanol nas artérias de resistência. Esta ideia é corroborada pelo fato de que a apocinina inibiu a geração de O₂^- na cultura de CMLV. A vitamina C é um eficaz agente sequestrador de O₂,28 e, em nosso modelo, ela diminuiu a geração de O₂^- e a peroxidação lipídica em artérias de resistência. A propriedade antioxidante da vitamina C também está associada à menor ativação de NAD(P)H oxidase.15

Em culturas de células CMLV, a vitamina C preveniu a geração de O₂^- induzida pelo etanol, sugerindo que a inibição da NAD(P)H oxidase pela vitamina C também pode estar envolvida na diminuição da geração vascular de O_2- induzida pelo etanol.

ADH é uma enzima que atua na metabolização do etanol, e é funcionalmente ativa na vasculatura.29 Foi descrito anteriormente que metabólitos do etanol estão envolvidos nos efeitos vasculares estimulados pelo etanol.30 Para determinar um possível papel dos metabólitos do etanol sobre a geração de O₂^- induzido por etanol em artérias de resistência, foi avaliado o efeito do 4-MP nesse processo. A inibição do metabolismo do etanol mediado pela ADH levou à diminuição da geração de O_2- induzida pelo etanol na cultura de CMLV. Assim, apresentamos uma evidência de que um metabólito de etanol, possivelmente o acetaldeído, é responsável pela geração de ERO em artérias de resistência.

A NAD(P)H oxidase é a principal fonte de ERO na vasculatura. A prototípica, Nox fagocítica é composta por cinco subunidades - três subunidades citosólicas, p40phox, p47phox e p67phox, e dois componentes associados à membrana, denominados gp91phox (Nox2) e p22phox. O complexo enzimático encontra-se dissociado nas células de repouso, mas é rapidamente ativado à estimulação celular. A fosforilação da p47phox em um resíduo de serina inicia a ativação da enzima, desencadeando a formação de um complexo composto por subunidades citosólicas. Essa resposta é seguida pela translocação do complexo citosólico à membrana, e associação com as subunidades gp91phox e p22phox (citocromo b₅₅₈). Os componentes da NAD(P)H oxidase são expressos em células endoteliais e CMLV, e a translocação da subunidade p47phox mostrou-se essencial para a produção de ERO nessa células.31 Em nosso estudo, foi observado o aumento da translocação da p47phox em LAM de ratos tratados com etanol, e tal efeito foi inibido pela vitamina C, sugerindo que o estresse oxidativo esteja envolvido na translocação da p47phox induzida pelo etanol e na ativação da NAD(P)H oxidase. Além disso, essa resposta reforça nossa ideia inicial de que a NAD(P)H oxidase esteja envolvida na geração de O₂- induzida pelo etanol no LAM de rato. A ação inibitória da vitamina C sobre a translocação da p47phox foi previamente descrita.32 Os mecanismos pelos quais a vitamina C inibe a translocação da p47phox não foram totalmente elucidados, mas parecem envolver a inibição dos ativadores da enzima NAD(P)H oxidase. Um grande número de proteínas está envolvido no complexo NAD(P)H oxidase, que inclui Rac GTPases, proteína quinase C (PKC) e c-Src.11 Papparella et al.32 demonstraram que a vitamina C inibiu a ativação da PKC com subsequente redução na translocação da p47phox e geração de ERO. O presente estudo não abordou o mecanismo exato pelo qual o etanol modula a atividade da NAD(P)H oxidase. Diferentes estímulos, tais como endotelina-1, angiotensina II, catecolaminas, trombina e fatores de crescimento (p.ex.: fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento derivado de plaquetas) promovem ativação aguda da NAD(P)H oxidase na vasculatura.33 Nós demonstramos anteriormente que o losartan, um antagonista de receptores AT₁, não impediu a geração de ERO induzida por etanol em LAM de rato,12 descartando um possível papel da angiotensina II na ativação da NAD(P)H aqui descrita. Seria interessante outros estudos que avaliem a maneira exata que ingestão aguda de etanol induz a translocação de p47phox e a geração de ERO nas artérias de resistência.

Figura 6 Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre a reatividade vascular à acetilcolina e fenilefrina. Curvas dose-resposta para acetilcolina foram obtidas no terceiro ramo das artérias mesentéricas com endotélio intacto (A). Curvas dose-resposta para fenilefrina foram obtidas nas artérias com endotélio (Endo+, B) e sem endotélio (Endo-,C). Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 4-6 experimentos.

O ânion superóxido é uma molécula altamente instável, reduzida à H₂O₂ pela SOD34. Em nosso estudo, a ação antioxidante da vitamina C não estava relacionada com aumento da ativação da SOD, uma vez que não foi observada diferença na atividade da SOD no LAM após o tratamento com a vitamina. Além disso, uma vez que o tratamento com etanol não alterou a atividade da SOD, o aumento nos níveis de O₂^- induzido pelo etanol parece não estar relacionado com a redução da dismutação do O₂^- pela SOD. Tanto o O₂^- como o H₂O₂ atuam como moléculas de sinalização, sendo o H₂O₂ considerado o principal composto de sinalização, dado sua relativa estabilidade e localização subcelular 34. Por exemplo, o H₂O₂ ativa vias sensíveis à sinalização redox, tais como MAPK e Rho kinase35. H₂O₂ é intimamente regulado por enzimas intracelulares e extracelulares, incluindo CAT, que converte H₂O₂ em água e O₂. Nossos resultados mostraram que a ingestão aguda de etanol não alterou os níveis de H₂O₂ ou a atividade da CAT no LAM de rato.

A disfunção endotelial é causada por um aumento na geração de ERO e redução na biodisponibilidade de NO, aumentando a inativação oxidativa do NO e/ou diminuindo sua síntese. No endotélio vascular, o NO é sintetizado pela eNOS. A Akt, uma proteína quinase serina/treonina, fosforila a eNOS, promovendo a ativação da enzima.36 A fosforilação da eNOS no resíduo de Ser¹⁷⁷ é um requisito crucial para a ativação da eNOS, enquanto que a fosforilação no resíduo Tre⁴⁹⁵ leva à inativação da enzima.36 Neste trabalho, demonstramos que o etanol não teve efeito sobre a fosforilação Akt/NOS, o que corroborou a observação de que a concentração de nitrato no LAM de rato não foi afetada pelo etanol. O etanol induz um aumento transitório na atividade da SOD e CAT, e tal resposta pode mudar o equilíbrio entre EROs e NO em direção aos níveis de NO.37 Nesse sentido, o aumento induzido por etanol nas defesas antioxidantes poderia explicar a ausência de efeito do etanol sobre os níveis de NO no LAM de rato.

As ERO derivadas da NAD(P)H oxidase na vasculatura ativam alvos redox-sensíveis tais como RhoA/Rho quinase. O ânion superóxido e H₂O₂ ativam a via RhoA/Rho quinase, que representa uma importante classe de moléculas sinalizadoras reguladas pelo estado redox no sistema cardiovascular.13 A via RhoA/Rho quinase regula muitas vias de sinalização intracelulares na vasculatura. A proteína Rho permanece em um ciclo entre sua forma inativa ligada ao GDP no citoplasma, e sua forma ativa ligada ao GTP na membrana celular,38 e a translocação de RhoA para a membrana está associada com sua ativação. Os presentes achados mostraram que a ingestão de etanol aumentou a translocação de RhoA, o que sugere uma ativação da via RhoA/Rho quinase. Além do fato de a vitamina C ter prevenido a translocação de RhoA induzida pelo etanol sugerimos que essa resposta seja mediada por ERO. Esse resultado vai ao encontro de resultados anteriores mostrando que as ERO, principalmente O₂ ^- e H₂O₂, estão ligados à ativação da via RhoA/Rho quinase.39 Até nosso conhecimento, este é o primeiro estudo demonstrando uma interação direta entre ingestão de etanol, ERO derivadas de NAD(P)H oxidase, e a ativação da via de sinalização da RhoA/Rho quinase. A RhoA é abundantemente expressa nas CMLV e participa da vasoconstrição via fosforilação da cadeia leve de miosina e sensibilização das proteínas contráteis ao cálcio. Além disso, a ativação aumentada de RhoA foi associada à disfunção endotelial, resistência periférica aumentada e hipertensão.40 Apesar da ativação da via de sinalização da RhoA/Rho quinase, a ingestão aguda de etanol não afetou a resposta contrátil induzida pela fenilefrina ou o relaxamento dependente do endotélio induzido por acetilcolina na artéria mesentérica. Esses resultados sugerem que a ativação da RhoA aqui descrita provavelmente ocorre antes do início das disfunções graves.

Algumas limitações do presente estudo devem ser consideradas. Em nosso estudo, todos os parâmetros foram avaliados quando o etanol atingiu sua concentração plasmática máxima. Não foi avaliado o período de ação do etanol na vasculatura após a administração de uma única dose. Portanto, seria interessante a realização de estudos sobre o efeito de uma única dose de etanol ao longo do tempo. Outro ponto a ser considerado é que enquanto binge drinking em humanos é amplamente definido como o consumo de uma grande quantidade de etanol (4-5 doses) em um período de duas horas, em nosso estudo, a quantidade total de etanol (1g/kg) foi administrada em uma única dose.

A ativação da NAD(P)H oxidase, com aumento subsequente na geração de ERO, e a ativação das vias de sinalização redox-sensíveis, tais como a via RhoA/Rho quinase, são eventos importantes ligados à disfunção vascular e, segundo estudos anteriores,9^,11^,13 exercem um papel na fisiopatologia de várias doenças cardiovasculares. Binge drinking está associado a um risco aumentado de eventos cardiovasculares, tais como acidente vascular cerebral, morte súbita, infarto do miocárdio, maior mortalidade após infarto do miocárdio,2^-4 e a progressão de aterosclerose carotídea.1 Importante mencionar que mudanças na biologia vascular são mecanismos chaves para o risco aumentado de eventos cardiovasculares induzidos pelo consumo de álcool excessivo.6 Assim, nossos resultados levantam a possibilidade de que não somente a ingestão crônica de etanol seja um fator de risco para eventos cardiovasculares, como a ingestão aguda de etanol também pode aumentar o risco de causar danos vasculares pelo aumento da geração de ERO e ativação de vias redox-sensíveis. Em geral, essas respostas desencadeadas pelo etanol poderiam predispor ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares.

Conclusões

Em resumo, o principal achado inédito deste estudo é que a ingestão aguda de etanol induz a ativação da via RhoA/Rho quinase por um mecanismo que envolve a geração de ERO. Além disso, nós demonstramos, pela primeira vez, que o etanol ativa a NAD(P)H oxidase por estímulo da translocação da p47phox e por mecanismos redox-sensíveis em artérias de resistência.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.