Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC Rr8K9LbqhBrmk9wgpq83RKq S0066-782X2016004300339 10.5935/abc.20160137 Original Articles Ischemia/Myocardial Infarction Effects of Nitrate Intake on Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Diabetic Rats Jeddi Sajad 1 Khalifi Saeedeh 2 Ghanbari Mahboubeh 1 Bageripour Fatemeh 1 Ghasemi Asghar 1 Shahid Beheshti University of Medical Sciences Research Institute for Endocrine Sciences Endocrine Physiology Research Center and Endocrine Research Center Tehran Iran Endocrine Physiology Research Center and Endocrine Research Center, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran Shahid Beheshti University of Medical Sciences Shahid Beheshti University of Medical Sciences Faculty of Paramedical Sciences Department of Medical Laboratory Sciences Tehran Iran Department of Medical Laboratory Sciences, Faculty of Paramedical Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran Shahid Beheshti University of Medical Sciences Mailing Address: Asghar Ghasemi, Endocrine Physiology Research Center, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences. No. 24, Parvaneh Street, Yaman Street, Velenjak, Postal Code 1985717413. Teerã, I.R. Irã. E-mail: ghasemi@endocrine.ac.ir

Author contributions

Conception and design of the research: Jeddi S, Ghasemi A; Acquisition of data: Jeddi S, Khalifi S, Ghanbari M, Bageripour F; Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis: Jeddi S, Khalifi S, Ghanbari M, Bageripour F, Ghasemi A; Obtaining financing: Ghasemi A; Writing of the manuscript: Jeddi S, Ghanbari M, Bageripour F; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Khalifi S, Ghasemi A.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 10 2016 107 4 339 347 06 10 2015 21 03 2016 21 03 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Coronary artery disease is 2-3 times more common in diabetic individuals. Dietary nitrate/nitrite has beneficial effects in both diabetes and cardiovascular disease. It also has protective effects against myocardial ischemia-reperfusion (IR) injury in healthy animals. However, the effects of nitrate on myocardial IR injury in diabetic rats have not yet been investigated.

 Objective:

We examined the effects of dietary nitrate on myocardial IR injury in streptozotocin-nicotinamide-induced diabetic rats.

 Method:

Rats were divided into four groups (n=7 in each group): control, control+nitrate, diabetes, and diabetes+nitrate. Type 2 diabetes was induced by injection of streptozotocin and nicotinamide. Nitrate (sodium nitrate) was added to drinking water (100 mg/L) for 2 months. The hearts were perfused in a Langendorff apparatus at 2 months and assessed before (baseline) and after myocardial IR for the following parameters: left ventricular developed pressure (LVDP), minimum and maximum rates of pressure change in the left ventricle (±dP/dt), endothelial nitric oxide (NO) synthase (eNOS) and inducible NO synthase (iNOS) mRNA expression, and levels of malondialdehyde (MDA) and NO metabolites (NOx).

 Results:

Recovery of LVDP and ±dP/dt was lower in diabetic rats versus controls, but almost normalized after nitrate intake. Diabetic rats had lower eNOS and higher iNOS expression both at baseline and after IR, and dietary nitrate restored these parameters to normal values after IR. Compared with controls, heart NOx level was lower in diabetic rats at baseline but was higher after IR. Diabetic rats had higher MDA levels both at baseline and after IR, which along with heart NOx levels decreased following nitrate intake.

 Conclusion:

Dietary nitrate in diabetic rats provides cardioprotection against IR injury by regulating eNOS and iNOS expression and inhibiting lipid peroxidation in the heart.

 Keywords: Coronary Artery Disease Nitrates Nitrites Myocardial Reperfusion Diabetes Ischemia Introduction

The worldwide prevalence of diabetes has recently increased over twofold and is estimated to reach 592 million by 2035.1 Coronary artery disease is two to three times more common in diabetic patients and is the cause of mortality in over half of these individuals.2 Although various treatments are currently available for patients with diabetes, they lack sufficient efficacy; therefore, new strategies must be examined.3

Nitrate intake is considered a new potential strategy for managing type 2 diabetes.3 During the last half century, dietary nitrate has been considered unsafe due to its theoretical association with the development of diseases (including gastric cancer).4 This view is now being questioned after enzyme-independent production of nitric oxide (NO) from nitrate/nitrite has been found in tissues5 The nitrate/nitrite/NO pathway is a booster system for the L-arginine-NO synthase (NOs) pathway, mainly in conditions of NOs dysfunction6,7 Depending on the NOs isoform involved, NO could have protective or detrimental effects on the heart.8 Endothelial NOS (eNOS) is localized in caveolae where it controls heart rate, contraction, diastolic relaxation, and oxygen consumption. Inducible NOS (iNOS) is not present in healthy hearts but is expressed during pathological states, including ischemia and hyperglycemia, when it contributes to impair eNOS function and possibly worsen myocardial injury.9-11

Dietary nitrate reduces blood pressure, prevents endothelial dysfunction, and inhibits platelet aggregation.12 Recent investigations in animals indicate that dietary nitrate/nitrite has beneficial effects in diabetes and could increase pancreatic blood flow and insulin secretion,13 and improve both insulin resistance14 and glucose tolerance.15 Nitrate/nitrite has protective effects against myocardial ischemia-reperfusion (IR) injury in healthy animals.6,16 However, no studies have addressed to date the effects of nitrate on myocardial IR injury in diabetes. Therefore, the aim of this study was to determine the cardioprotective effects of nitrate on IR injury in streptozotocin (STZ)-nicotinamide (NA)-induced diabetic rats.

 Methods

The proposal of this study was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the Research Institute for Endocrine Sciences (RIES, permit number: 12 EC RIES 92/10/25) at Shahid Beheshti University of Medical Sciences (Tehran, Iran).

Animals

Male Wistar rats (2-month-old, 170-200 g) were obtained from the RIES laboratory animal house at Shahid Beheshti University of Medical Sciences. During the study, the animals were housed in an animal room with a temperature of 22 ± 2 °C and relative humidity of 50 ± 6%, with free access to standard rat chow (Pars Co., Tehran) and tap water. The animals were adapted to an inverse 12:12 h light-dark cycle for 2 weeks.

Diabetes was induced in the animals by intraperitoneal (IP) injection of NA (95 mg/kg) 15 min before an IP injection of STZ (65 mg/kg). Ten days after injection of STZ-NA, blood samples were obtained from a tail vein of the rats, and the animals with glucose levels > 126 mg/dL were considered diabetics.17 Rats were then allocated to four groups (n=7 each): control (C), control-nitrate (CN), diabetes (D), and diabetes-nitrate (DN). Each group was divided into two subgroups: pre-IR (baseline), and post-IR. Nitrate (sodium nitrate, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany) was added to the drinking water of the animals in the CN and DN groups at a concentration of 100 mg/L for 2 months.

 Measurements of hemodynamic parameters in Langendorff perfused hearts

At 2 months, all rats were anesthetized by IP injection of ketamine/xylazine (50 mg/kg and 10 mg/kg), and hearts from all groups were rapidly removed and immersed in ice-cold perfusion buffer. After cannulation of the aorta, the hearts were perfused in a Langendorff apparatus with a Krebs-Henseleit solution (containing [in mM] NaCl 118, NaHCO3 25, KCl 4.7, MgCl2 1.2, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, glucose 11, and pH=7.4) under constant pressure (75 mmHg) and temperature of 37 ºC. Krebs solution was oxygenated with 95% O2 and 5% CO2. After 20 minutes of stabilization, the hearts of the animals in all groups were exposed to 30 minutes of global ischemia, followed by 60 minutes of reperfusion. A latex balloon was inserted into the left ventricle for measurement of hemodynamic parameters including left ventricular end diastolic pressure (LVEDP), left ventricular developed pressure (LVDP), and the minimum and maximum rates of pressure change in the left ventricle (±dP/dt). LVEDP, LVDP, and ±dP/dt were digitalized by a data acquisition system (Power Lab, AD Instrument, Australia). Post-ischemic hemodynamic parameters were assessed by the recovery of LVEDP, LVDP, and ±dP/dt.

 Assessment of lipid peroxidation

Levels of malondialdehyde (MDA), an indirect marker of cellular injury that reflects the extent of systemic lipid peroxidation in the heart, were measured by the method by Oshawa et al.18 In brief, heart samples were collected at baseline and during the post-IR period and then homogenized in phosphate buffered saline (PBS) (1:5, w/v) using a mini homogenizer (MICCRA-D1, Germany). Tissue homogenates were centrifuged (1,000 g, 4 ºC, 10 min) and supernatants were collected for measurement of MDA levels; 2.5 mL of trichloroacetic acid (20%) was added to 0.5 mL of supernatant followed by addition of 1 mL of thiobarbituric acid (0.67%). The mixture was placed in a water bath at 95 °C for 30 min and after cooling, 4 mL of n-butanol was added. The mixture was vortexed and after centrifugation at 1,100 g for 10 min, the absorbance of the upper layer was read at 532 nm using an ELISA reader (BioTek, Power wave XS2). The concentration of MDA was calculated using a standard curve of 1, 1, 3, 3-tetraethoxypropane and expressed as µmol/L.

 Measurement of NO metabolites (NOx)

The NOx levels in the hearts were measured by the Griess method. In brief, heart samples collected at baseline and at the post-IR period were rinsed and homogenized in PBS (1:5, w/v), and centrifuged at 15,000 g for 20 min. Supernatant was deproteinized by adding zinc sulfate (15 mg/mL); 100 µL of the supernatant were transferred to a microplate well and 100 µL of vanadium (III) chloride (8 mg/mL) were added to each well to reduce nitrate to nitrite; 50 µL of sulfanilamide (2%) and 50 µL of N-1-(naphthyl) ethylenediamine (0.1%) were then added, and samples were incubated for 30 min at 37 °C; absorbance was read at 540 nm using the ELISA reader. NOx concentration was determined from a linear standard curve established by 0-50 µmol/L sodium nitrate. Tissue NOx levels were expressed as µmol/L.

 Assessment of myocardial injury markers in coronary flow (CF)

At the start of reperfusion, CF was collected for a period of 5 minutes to measure myocardial enzyme leakage (myocardial injury markers), including creatine kinase MB (CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH). Levels of CK-MB and LDH in CF were measured using commercial kits (Pars Azmoon, Tehran, Iran).

Intra-assay coefficients of variation for NOx, CK-MB, and LDH measurements were 3.7%, 4.1%, and 4.7%, respectively.

 RNA extraction, cDNA synthesis, and real-time PCR

In all groups, samples from the left heart ventricle were obtained at baseline and during the post-IR period for RNA extraction using a standard, sterile surgical method. Total RNA was extracted from heart tissue using an RNX-Plus solution kit (Fermentase, Cinagen Co., Iran), according to the manufacturer's description and treated with RNase-free DNase to remove any residual genomic DNA. RNA quantity and purity were measured using the NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA); cDNAs were synthesized by incubating total RNA with RevertAid H Minus Reverse Transcriptase, DNase I, Random Hexamer Primer, dNTPs, and RiboLock RNase Inhibitor, for 10 min at 25 °C, followed by 60 min at 42 °C in a final volume of 20 µL. The reaction was terminated by heating at 70 °C for 5 min.

Quantitative real-time PCR was performed with Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Corbett Research, Sydney, Australia). Reactions were performed in 25 µL aliquots containing 12.5 µL SYBR Green PCR Master Mix (Jena Bioscience, Germany), 1 µL forward primer, 1 µL reverse primer, 8.5 µL RNase- free water, and 2 µL of the cDNA. The primer sequences used for real-time (RT)-PCR were forward 5′-TACAGCTTCACCACCACAGC-3′ and reverse 5′-CACACTGCTAGAGGTGCTGGAA-3′ for beta-actin; forward 5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′ and reverse 5′-TGTGCTGGCTTTGGTGAGGTTTGA-3′ for eNOS, and forward 5′-TGGCCTCCCTCTGGAAAGA-3′ and reverse 5′-TGCTGAGCTGACAGAGTAGTA-3′ for iNOS. PCR amplifications were performed by the three following cycle programs: (1) denaturation of cDNA (1 cycle: 10 min at 95 °C), (2) amplification (40 cycles: 15 sec at 95 °C, 30 sec at 60 °C, and 30 sec at 72 °C), (3) melting curve analysis (1 cycle: 72 to 95 °C with temperature transition rate 1 °C/sec for 5 sec). Real-time quantification was monitored by measuring the fluorescence activity. To compare the groups, the mRNA levels of eNOS and iNOS were measured as relative expression using 2−ΔΔCT values and normalized to beta-actin generated from the same sample; where ΔΔCT = [CT iNOS or eNOS (case) − CT beta-actin (case)] − [CT iNOS or eNOS (control) − CT beta-actin (control)].19 The specificity of the PCR reactions was verified by melting curve analysis.

 Statistical analysis

All values are expressed as mean ± standard error of the mean (SEM). The statistical analysis was performed using SPSS software, version 20 (SPSS, Chicago, IL, USA). The Kolmogorov-Smirnov and Shapiro-Wilk tests were used to check the normality of the study data, with p-values > 0.05 indicating normal distribution. Parametric and nonparametric tests were used for analysis of data with normal and non-normal distribution, respectively.20 Repeated measurement analysis of variance (ANOVA) was used to compare the hemodynamic parameters (LVDP, LVEDP, and ±dP/dt) at different time points. Student's sample t test was used to compare MDA and NOx levels at baseline and post-IR in each group. One-way ANOVA with Tukey post-hoc test was used for comparison among different groups of levels of MDA, NOx, CK-MB, and LDH. The Mann-Whitney U test was used to compare gene expression in different groups. Two-sided p-values < 0.05 were considered statistically significant.

 Results

The initial blood glucose levels, and body and heart weights of the animals were similar in all groups. After STZ-NA injection and compared with controls, diabetic rats had increased blood glucose levels (196.8 ± 26.4 versus 82.6 ± 4.5 mg/dL; p < 0.05), decreased body weight (239.7 ± 12.3 versus 331.7 ± 13.7 g; p < 0.05), and significantly increased heart weight to body weight ratio (0.48 ± 0.01 versus 0.37 ± 0.01%). At the end of the study (day 70), the area under the curve of the plasma glucose concentration in diabetic rats (20,264 ± 659 mg/dL/60 min) during an intravenous glucose tolerance test (GTT) was significantly (p < 0.05) higher when compared with that in control rats (7,825 ± 247 mg/dL/60 min, p < 0.05).

The effects of dietary nitrate on hemodynamic parameters in isolated hearts during the stabilization and IR period are shown in Table 1 and Figure 1. During the stabilization period, hearts from diabetic rats had significantly lower baseline LVDP and ±dP/dt values (p < 0.05) as compared with control rats. Nitrate intake had no effect on baseline LVDP and ±dP/dt values in heart samples from CN and DN rats compared with the values in control and diabetic rats, respectively (Table 1).

Parameters of cardiac function during the stabilization period
Control Control-Nitrate Diabetes Diabetes-Nitrate
LVEDP (mmHg) 8.5 ± 2.2 8.8 ± 2.8 8.2 ± 1.8 7.9 ± 2.3
LVDP (mmHg) 96.7 ± 7.6 93.4 ± 6.6 60 ± 3.9* 65 ± 6.3*
+dP/dt (mmHg/s) 3135 ± 211 3055 ± 247 2052 ± 434* 2152 ± 412*
–dP/dt (mmHg/s) 2215 ± 188 2163 ± 205 1387 ± 154* 1484 ± 123*

Data are represented as mean ± SEM. LVEDP: left ventricular end diastolic pressure; LVDP: left ventricular developed pressure, and minimum and maximum rates of pressure change in the left ventricle (± dP/dt)

p < 0.05 statistically significant deference between group D versus C group and group DN versus CN. Control (C), control-nitrate (CN), diabetes (D), and diabetes-nitrate (DN).

Recovery of cardiac function after IR injury. A) Left ventricular end diastolic pressure (LVEDP); B) Left ventricular developed pressure (LVDP); C) Maximum rates of pressure change in the left ventricle (+dP/dt); D. Minimum rates of pressure change in the left ventricle (-dP/dt). Values are mean ± SEM; (n = 7 in each group); *p < 0.05, as compared with the control and diabetic gr oups. Control (C), control-nitrate (CN), diabetes (D), and diabetes-nitrate (DN).

In all groups, LVEDP gradually increased during the 30 minutes of ischemia. However, diabetic rats compared with control ones displayed a significant increase in LVEDP (p < 0.05), while CN and DN rats showed a significant decrease (p < 0.01) in this parameter when compared with control and diabetic rats, respectively. Nitrate intake improved diastolic properties, as indicated by a lower LVEDP during reperfusion in heart samples of rats in the CN and DN groups and prevented a hypercontractile response during the early phase of reperfusion (Figure 1-A).

Compared with controls, STZ-NA-induced diabetic rats had significantly lower postischemic LVDP and ±dP/dt values. Nitrate intake restored the decreased LVDP and ±dP/dt values to near preischemic values in both the CN and DN groups, compared with the control and diabetic groups, respectively (p < 0.01) (Figure 1-B, C, D). Compared with baseline values, expression of eNOS decreased significantly and that of iNOS increased significantly in the control group after IR. Decreased eNOS expression and increased iNOS expression were observed in hearts from diabetic rats when compared with controls both before and after IR; dietary nitrate restored eNOS and iNOS expression to near normal values after IR in the CN and DN groups. Nitrate intake had no effect on baseline eNOS and iNOS expression in hearts of rats in the CN and DN groups compared with those in the control and diabetic groups, respectively (Figure 2).

Effect of nitrate intake on eNOS (A) and iNOS (B) mRNA expression. Values are expressed as mean ± SEM; *p < 0.05, comparing the pre-IR with the post-IR period in each group. **p < 0.05 comparing the pre-IR period in each group with controls. #p < 0.05 comparing the post-IR period in each group with controls. †p < 0.05 comparing the post-IR period between the DN and D groups. Control (C), control-nitrate (CN), diabetes (D), and diabetes-nitrate (DN).

In all groups, heart NOx levels increased significantly (p < 0.05) after IR when compared with baseline values. Dietary nitrate had no effect on baseline heart NOx levels in the CN group, which showed comparable levels to those in the control group. After ischemia, heart NOx levels increased in the control group but not in the CN group (p < 0.05), suggesting a protective effect of dietary nitrate. Compared with controls, heart NOx level was lower in diabetic rats before IR, but was higher after IR and decreased following nitrate intake in the DN group, both before and after IR when compared with diabetic rats (Figure 3-A).

Changes in NOx (A) and MDA (B) levels in the hearts of rats in different groups. Values are expressed as mean ± SEM; (n = 7 in each group); *p < 0.05 comparing the pre-IR with the post-IR period in each group. **p < 0.05 comparing the pre-IR period in each group with controls. #p < 0.05 comparing the post-IR period in each group with controls. ‡p < 0.05 comparing the pre-IR period in the DN and D groups. †p < 0.05 comparing the post-IR period between the DN and D groups. Control (C), control-nitrate (CN), diabetes (D), and diabetes-nitrate.

In all groups, heart MDA levels increased significantly (p < 0.05) after ischemia when compared with baseline values. Compared with controls, diabetic rats had significantly higher MDA levels, both before and after IR (p < 0.05); nitrate intake restored the elevated MDA levels to near normal values in the CN and DN groups as compared with levels in the control and diabetic group, respectively (Figure 3-B). Compared with the control group, CK-MB and LDH levels were significantly higher (p < 0.05) in the diabetic group (p < 0.05), and dietary nitrate significantly reduced the release of CK-MB and LDH in the CF of rats in the CN and DN groups versus the control and diabetic groups, respectively (Figure 4).

Effect of nitrate intake on levels of LDH (A) and CK-MB (B) in coronary flow 5 min after reperfusion. Values are expressed as mean ± SEM; (n = 7 in each group); *p < 0.05 compared with the control group. **p < 0.05 comparing the DN with the D group. Control (C), control-nitrate (CN), diabetes (D), and diabetes-nitrate (DN).

Discussion

Nitrate intake improved the recovery of the cardiac function after ischemia in both normal and diabetic rats. This cardioprotective effect was associated with prevention of increased iNOS and decreased eNOS mRNA expression in heart tissue. In addition, nitrate intake restored heart levels of both NOx and MDA to normal values.

In this study, we showed for the first time that chronic intake of a low dose of nitrate (100 mg/L for 2 months) protected the heart of rats in the control group from IR injury. In humans, a similar dose can be achieved with a vegetable-rich diet. Most studies assessing the effects of nitrate on IR injury have been performed in vitro.21-23 Webb et al.21 have reported that nitrite infusion in rats (0.7-7 mg/L) during ischemia in the Langendorff apparatus reduced infarct size and improved left ventricular function.21 An additional investigation by Gonzalez et al.23 has documented a similar protection in an in vivo canine model.23 Duraunski et al.22 have also shown that administration of nitrite (48 nmoL) during ischemia in mice reduced the infarct size and protected the heart from IR injury.22 Bryan et al.,24 in an in vivo study, assessed the effects of short-term nitrate intake (1,000 mg/L in drinking water for 7 days) on IR injury and showed that nitrate reduced the infarct size in response to a myocardial IR injury.24 However, it remains disputable whether conclusions from a short-term study could be extended to a long-term situation.25 Therefore, we assessed the effects of chronic low-dose nitrate intake on IR injury in STZ-NA-induced diabetic rats. This is a suitable model for assessment of the effectiveness of new potential antidiabetic agents and has been reported to be close to human type 2 diabetes. However, STZ-NA-induced diabetic rats, as a model for nonobese type 2 diabetes, do not display insulin resistance, which is the main characteristic of type 2 diabetes.15,17 In this study, we defined diabetes using a blood glucose cutoff level of 126 mg/dL because the STZ-NA model of type 2 diabetes is associated with moderate hyperglycemia.17 This value, when determined during fasting, is adopted in human studies to define diabetes.26 In addition, the occurrence of an abnormal GTT indicates that diabetes was successfully induced.

In this study, hearts from STZ-NA-induced diabetic rats had lower baseline cardiac functions, a controversial finding in different animal models of diabetes.27-29 Lower recovery of cardiac function has been observed in diabetic rats following IR when compared with controls. The effects of type 2 diabetes on myocardial IR injury in animal studies are a controversial issue, and both higher30 and lower30 sensitivity to injury or even no effect31 have been reported. These inconsistent results can be partially explained by the severity and duration of type 2 diabetes and also the change in metabolic profiles following induction of diabetes.28,32 Moreover, the differences between models of type 2 diabetes, the degree of IR injury, and the species of the rat with type 2 diabetes can modify the baseline cardiac functions and susceptibility to myocardial IR injury.28

Our results show that diabetic rats had lower eNOS and higher iNOS expression both at baseline and after IR. Heart NOx level was also lower before IR, but was higher after IR, and heart MDA level was higher both before and after IR. Previous studies have shown that although iNOS-induced NO formation increases NO levels in diabetes, elevation in reactive oxygen species (ROS), while simultaneously interacting with NO, lead to decreased NO bioavailability in baseline serum and heart. In addition, NO may rapidly be scavenged by free radicals and produce peroxynitrite, leading to baseline myocardial injury.9,11 Also, a marked increase in production of ROS and decrease in antioxidant capacity in hyperglycemic conditions lead to the development of oxidative stress, lipid peroxidation, and cell membrane injury, which may cause leakage of LDH and CK-MB, suggesting an increased oxidative stress and cell necrosis in STZ-NA-induced diabetes.11

To the best of our knowledge, no study so far has documented the effect of nitrate intake on IR injury in STZ-NA-induced diabetic rats. We have previously shown that dietary nitrate prevents an increase in systolic blood pressure and serum glucose, improves glucose tolerance, and restores dyslipidemia in STZ-NA-induced diabetic rats.15 Jiang et al.33 have reported that dietary nitrite (50 mg/L for 4 weeks) in db/db diabetic mice improves insulin signaling through GLUT4 translocation to the membrane.33 Ohtake et al. have also shown that dietary nitrite (150 mg/L for 10 weeks) improves insulin resistance in type 2 diabetic mice.14

Nitrate intake in this study also offered cardioprotection by decreasing the levels of myocardial injury markers in CF and lipid peroxidation levels in the hearts of diabetic rats after IR, an effect that may be related to the antioxidative properties of nitrate intake that protect the membrane of heart cells by inhibiting lipid peroxidation and decreasing the leakage of cytosolic enzymes.11 We have also previously reported that chronic treatment with a low nitrate dose attenuates oxidative stress in STZ-NA-induced diabetic rats by increasing serum total antioxidant capacity and catalase activity.15

In the present study, we found that nitrate intake protected the heart from IR injury by restoring iNOS and eNOS expression to normal values and subsequently reducing the accumulation of NO after IR. Previous studies have reported that nitrite intake improves insulin signaling34 and increases insulin secretion in rats.13 Insulin activates Akt and increases eNOS activity through the PI3K-Akt-eNOS pathway,34,35 which activates eNOS through phosphorylation of serine 117735 and increased NO production. In addition, insulin decreases iNOS-induced NO production and reduces IR-induced peroxynitrite formation.36 Increased eNOS expression and decreased iNOS expression by insulin are both cardioprotective. This gives us a basis to hypothesize that nitrate intake protects the heart by increasing eNOS expression and decreasing iNOS expression via a decrease in oxidative stress and an increase in insulin secretion.

Our results show that nitrate intake was insufficient to restore basal hemodynamic function to near normal values in diabetic rats, because in the diabetic state, before NO acts it is inactivated by ROS. Evidence shows that eNOS may be uncoupled in diabetic conditions due to a decrease in tetrahydrobiopterin, a NOS cofactor that increases superoxide anion formation and impairs eNOS function in the heart. Moreover, iNOS may have important chronic deleterious effects, i.e., irreversible impairment of basal contractile function mediated via peroxynitrite that is not readily reversible by nitrate intake; hence, other treatments such as radical scavengers seem essential.37

Some limitations of our study should be considered when the results are interpreted. First, we did not measure the levels of eNOS and iNOS proteins. Although mRNA changes do not necessarily reflect protein changes, the mRNA expression is still informative.38 Second, we did not use a pharmacological approach to confirm our results regarding decreased iNOS expression and increased eNOS expression after nitrate intake, since it has been shown that both deletion of iNOS gene and inhibition of iNOS could provide cardioprotection in diabetic animals.39

Conclusion

Nitrate intake restored cardiac function to near preischemic values after IR in diabetic rats by blocking the pathological increases in iNOS expression, as well as the pathological decrease in eNOS expression. It also restored NOx and MDA levels in the heart to normal values both before and after ischemia.

Sources of Funding

This study was funded by Endocrine Research Centre, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran Iran.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 Acknowledgements

This study was supported by a grant (N0.711) from the Endocrine Physiology Research Center, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences. The authors wish to thank Ms. N. Shiva for critically editing the manuscript for English grammar and syntax.

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Nagareddy PR McNeill JH MacLeod KM Chronic inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates cardiovascular abnormalities in streptozotocin diabetic rats Eur J Pharmacol 2009 611 1-3 53 59 Artigos Originais Isquemia / Infarto do miocárdio Efeitos do Consumo de Nitrato na Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Ratos Diabéticos Jeddi Sajad 1 Khalifi Saeedeh 2 Ghanbari Mahboubeh 1 Bageripour Fatemeh 1 Ghasemi Asghar 1 Endocrine Physiology Research Center and Endocrine Research Center, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Teerã, Irã Department of Medical Laboratory Sciences, Faculty of Paramedical Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Teerã, Irã Correspondência: Asghar Ghasemi, Endocrine Physiology Research Center, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences. No. 24, Parvaneh Street, Yaman Street, Velenjak, Postal Code 1985717413. Teerã, I.R. Irã. E-mail: ghasemi@endocrine.ac.ir

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Jeddi S, Ghasemi A; Obtenção de dados: Jeddi S, Khalifi S, Ghanbari M, Bageripour F; Análise e interpretação dos dados e Análise estatística: Jeddi S, Khalifi S, Ghanbari M, Bageripour F, Ghasemi A; Obtenção de financiamento: Ghasemi A; Redação do manuscrito: Jeddi S, Ghanbari M, Bageripour F; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Khalifi S, Ghasemi A.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamentos:

A doença arterial coronariana é duas a três vezes mais comum em indivíduos diabéticos. O nitrato/nitrito dietético tem efeitos benéficos tanto para o diabetes quanto para a doença cardiovascular, assim como efeitos protetores contra a lesão de isquemia-reperfusão (IR) miocárdica em animais saudáveis. Porém, os efeitos do nitrato na lesão de IR miocárdica em ratos diabéticos ainda não foram investigados.

 Objetivos:

Foram examinados os efeitos sobre a lesão de IR miocárdica da adição de nitrato à dieta de ratos com diabetes mellitus tipo 2 induzido por estreptozotocina-nicotinamida.

 Métodos:

Os ratos foram divididos em quatro grupos (n = 7 em cada grupo): controle, controle+nitrato, diabetes e diabetes+nitrato. O diabetes foi induzido nos animais por injeção de estreptozotocina e nicotinamida. Nitrato (nitrato de sódio) foi adicionado à água de beber (100 mg/L) por 2 meses. Os corações foram perfundidos em sistema de Langendorff aos 2 meses e avaliados antes (basal) e após IR miocárdica em relação aos seguintes parâmetros: pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE), taxas máximas de variação positiva e negativa da pressão ventricular esquerda (±dP/dt), expressão do RNAm da óxido nítrico (NO) sintase (NOS) endotelial (eNOS) e da NOS induzível (iNOS), além de níveis de malondialdeído (MDA) e metabólitos do óxido nítrico (NOx).

 Resultados:

A recuperação da PDVE e ±dP/dt foi inferior nos ratos diabéticos versus controles, mas quase normalizou após ingestão de nitrato. Ratos diabéticos apresentaram expressão diminuída de eNOS e aumentada de iNOS tanto no estado basal quanto após IR, e o consumo dietético de nitrato restaurou estes valores para o estado normal após a IR. O nível de NOx cardíaco foi menor nos ratos diabéticos em comparação aos controles no momento basal, mas foi superior após a IR. Ratos diabéticos apresentaram níveis mais elevados de MDA tanto no estado basal quanto após IR que, juntamente com os níveis cardíacos de NOx, reduziram após consumo dietético do nitrato.

 Conclusões:

O consumo dietético de nitrato por ratos diabéticos ofereceu cardioproteção contra a lesão de IR através da regulação da expressão de eNOS e iNOS e inibição da peroxidação lipídica no coração.

 Palavras-chave: Doença Arterial Coronariana Nitratos Nitritos Reperfusão Miocárdica Diabetes Isquemia Introdução

A prevalência mundial de diabetes aumentou mais do que o dobro recentemente e é estimada a alcançar 592 milhões até 2035.1 A doença arterial coronariana é duas a três vezes mais comum em pacientes diabéticos e é a causa da mortalidade de mais da metade destes indivíduos.2 Embora vários tratamentos sejam atualmente disponíveis para pacientes com diabetes, eles não possuem eficácia suficiente. Portanto, novas estratégias devem ser examinadas.3

O consumo de nitrato é considerado uma nova estratégia potencial no manejo do diabetes tipo 2.3 Durante os últimos 50 anos, o consumo de nitrato na dieta não tem sido considerado seguro devido a uma teórica associação com o desenvolvimento de doenças (incluindo o câncer gástrico).4 Esta visão vem sendo questionada após demonstração da produção tecidual não-enzimática de óxido nítrico (NO) a partir de nitrato/nitrito.5 A via nitrato/nitrito/NO é um sistema auxiliar na via da L-arginina-NO sintase (NOs), principalmente em condições com disfunção da Nos.6,7 Dependendo da isoforma envolvida da NOs, o NO pode ter efeitos protetores ou prejudiciais sobre o coração.8 A NOs endotelial (eNOS) está localizada nas caveólas, a partir das quais controla a frequência, contração, relaxamento diastólico e consumo de oxigênio do coração. A NOS induzível (iNOS) não está presente em corações saudáveis, mas é expressa durante estados patológicos, incluindo isquemia e hiperglicemia, e contribui para prejudicar a função da eNOS, possivelmente piorando a lesão miocárdica.9-11

O consumo dietético de nitrato reduz a pressão arterial, previne a disfunção endotelial e inibe a agregação plaquetária.12 Investigações recentes em animais indicam que o nitrato/nitrito dietético tem efeitos benéficos no diabetes e pode aumentar o fluxo sanguíneo pancreático e secreção de insulina,13 além de melhorar a resistência à insulina14 e a tolerância à glicose.15 O nitrato/nitrito tem efeitos protetores contra a lesão de isquemia-reperfusão (IR) miocárdica em animais saudáveis.6,16 No entanto, não há estudos que tenham abordado até o momento os efeitos do nitrato na lesão de IR miocárdica no diabetes. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar os efeitos cardioprotetores do nitrato na lesão de IR em ratos com diabetes induzido por nicotinamida (NA) e estreptozotocina (STZ).

 Métodos

A proposta deste estudo foi aprovada pelo Comitê Institucional para o Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Research Institute for Endocrine Sciences (RIES, protocolo no. 12 EC RIES 92/10/25) da Shahid Beheshti University of Medical Sciences (Teerã, Irã).

Animais

Ratos Wistar machos (2 meses de idade, 170-200 g) foram obtidos do centro de animais de laboratório do RIES na Shahid Beheshti University of Medical Sciences. Durante o estudo, os animais permaneceram no biotério a uma temperatura de 22 ± 2 °C e umidade relativa de 50 ± 6%, com livre acesso à ração padrão para ratos (Pars Co., Teerã) e água de torneira. Os animais foram adaptados a um ciclo alternado de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão por 2 semanas.

O diabetes foi induzido nos animais por injeção intraperitoneal (IP) de NA (95 mg/kg) 15 minutos antes de uma injeção IP de STZ (65 mg/kg). Dez dias após a injeção de STZ-NA, amostras de sangue foram coletadas da veia caudal dos ratos, e os animais com níveis de glicose > 126 mg/dL foram considerados diabéticos.17 Em seguida, os ratos foram distribuídos em quatro grupos com sete animais em cada grupo: controle (C), controle-nitrato (CN), diabetes (D) e diabetes-nitrato (DN). Cada grupo foi dividido em dois subgrupos: pré-IR (basal) e pós-IR. Nitrato (nitrato de sódio, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Alemanha) foi adicionado à água de beber dos ratos nos grupos CN e DN a uma concentração de 100 mg/L por 2 meses.

 Medidas dos parâmetros hemodinâmicos nos corações perfundidos pela técnica de Langendorff

Após 2 meses, todos os ratos foram anestesiados por injeção IP de cetamina/xilazina (50 mg/kg e 10 mg/kg) e os corações dos ratos em todos os grupos foram rapidamente removidos e imersos em uma solução tampão de perfusão gelada. Após canulação da aorta, os corações foram perfundidos pela técnica de Langendorff com solução de Krebs-Henseleit (contendo [em mM] NaCl 118, NaHCO3 25, KCl 4,7, MgCl2 1,2, CaCl2 2,5, KH2PO4 1,2, glicose 11 e pH=7,4) sob pressão constante (75 mmHg) e temperatura de 37 ºC. A solução de Krebs foi oxigenada com O2 a 95% e CO2 a 5%. Após 20 minutos de estabilização, os corações dos ratos em todos os grupos foram expostos a 30 minutos de isquemia global seguidos de 60 minutos de reperfusão. Um balão de látex foi inserido no ventrículo esquerdo para permitir a medição de parâmetros hemodinâmicos, incluindo a pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE), a pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE), e as taxas máximas de variação positiva e negativa da pressão ventricular esquerda (±dP/dt). A PDFVE, PDVE e ±dP/dt foram digitalizadas através de um sistema de aquisição de dados (Power Lab, AD Instrument, Austrália). Os parâmetros hemodinâmicos pós-isquêmicos foram avaliados pela recuperação da PDFVE, PDVE e ±dP/dt.

 Avaliação da peroxidação lipídica

Os níveis de malondialdeído (MDA), um marcador indireto de lesão celular que reflete a extensão da peroxidação lipídica sistêmica no coração, foram medidos pelo método de Oshawa et al.18 Resumidamente, amostras foram coletadas dos corações no momento basal e durante o período pós-IR e homogeneizadas em tampão fosfato salino (PBS; 1:5, w/v) com uso de um mini-homogeneizador (MICCRA mini-D1, Alemanha). Os tecidos homogeneizados foram centrifugados (1.000 g, 4 ºC, 10 min) e os sobrenadantes foram coletados para medida dos níveis de MDA; 2,5 mL de solução de ácido tricloroacético (20%) foram adicionados a 0,5 mL de sobrenadante seguido pela adição de 1 mL de ácido tiobarbitúrico (0,67%). A mistura foi colocada em um banho de água a 95 °C por 30 min e, após refrigerada, recebeu adição de 4 mL de n-butanol. A mistura foi agitada em vortex e após centrifugação a 1.100 g por 10 min, a absorbância da camada superior foi medida a 532 nm com uso de um leitor ELISA (BioTek, Power wave XS2). A concentração de MDA foi calculada com uso de uma curva padrão de 1, 1, 3, 3-tetraetoxipropano e expressa em µmol/L.

 Medida dos metabólitos do NO (NOx)

Os níveis de NOx nos corações foram medidos pelo método Griess. Resumidamente, amostras de corações coletadas nos períodos basal e pós-IR foram lavadas e homogeneizadas em PBS (1:5, w/v) e, em seguida, centrifugadas a 15.000 g por 20 min. O sobrenadante foi desproteinizado com adição de sulfato de zinco (15 mg/mL). A seguir, 100 µL do sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação e 100 µL de cloreto de vanádio (III) a 8 mg/mL) foram adicionados em cada poço para reduzir o nitrato a nitrito; 50 µL de sulfanilamida (2%) e 50 µL de N-1-(naftil) etilenodiamina (0,1%) foram adicionados e as amostras foram incubadas por 30 min a 37 °C. A absorbância foi lida a 540 nm no leitor ELISA. A concentração de NOx foi determinada a partir de uma curva padrão linear estabelecida com 0-50 µmol/L de nitrato de sódio. Os níveis teciduais de NOx foram expressos em µmol/L.

 Avaliação dos marcadores de lesão miocárdica no fluxo coronariano (FC)

No início da reperfusão, o FC foi coletado por um período de 5 minutos para medida do extravasamento de enzimas miocárdicas (marcadores de lesão miocárdica), incluindo a creatina quinase fração MB (CK-MB) e a lactato desidrogenase (LDH). Níveis de CK-MB e LDH no FC foram medidos através de kits comerciais (Pars Azmoon, Teerã, Irã).

Os coeficientes de variação intraensaio para as medidas de NOx, CK-MB e LDH foram de 3,7%, 4,1% e 4,7%, respectivamente.

 Extração de RNA, síntese de DNA e PCR em tempo real

Em todos os grupos, amostras do ventrículo esquerdo do coração nos períodos basal e pós-IR foram obtidas para extração de RNA através de um método cirúrgico padrão e estéril. O RNA total foi extraído do tecido cardíaco com uso do kit de solução RNX-Plus (Fermentase, Cinagen Co., Irã) de acordo com descrição do fabricante e tratado com RNase-free DNase para remoção de qualquer resíduo de DNA genômico. A quantidade e a pureza do RNA foram medidas com NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA); DNAs complementares (DNAc) foram sintetizados a partir da incubação do RNA total com RevertAid H Minus Reverse Transcriptase, DNase I, Random Hexamer Primer, dNTPs, and RiboLock RNase Inhibitor por 10 min a 25 °C e em seguida, por 60 min a 42 °C em um volume final de 20 µL. A reação foi encerrada por aquecimento a 70 °C durante 5 min.

Foi realizada PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR) com analisador Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Corbett Research, Sydney, Austrália). As reações foram rea lizadas em alíquotas de 25 µL contendo 12,5 µL de SYBR Green PCR Master Mix (Jena Bioscience, Alemanha), 1 µL de primer direto, 1 µL de primer reverso, 8,5 µL de água RNase-free e 2 µL de DNAc. As sequências de primers utilizadas para a RT-PCR foram: direta 5′-TACAGCTTCACCACCACAGC-3′ e reversa 5′-CACACTGCTAGAGGTGCTGGAA-3′ para a beta-actina; direta 5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′ e reversa 5′-TGTGCTGGCTTTGGTGAGGTTTGA-3′ para a eNOS; e direta 5′-TGGCCTCCCTCTGGAAAGA-3′ e reversa 5′-TGCTGAGCTGACAGAGTAGTA-3' para a iNOS. As amplificações por PCR foram realizadas através dos três seguintes programas de ciclos: (1) Desnaturação do DNAc (1 ciclo: 10 min a 95 °C), (2) amplificação (40 ciclos: 15 seg a 95 °C, 30 seg a 60 °C e 30 seg a 72 °C), (3) análise da curva de dissociação (1 ciclo: 72 a 95 °C com taxa de transição de temperatura de 1 °C/seg durante 5 seg.). A quantificação em tempo real foi monitorada pela medida da atividade de fluorescência. Para comparar os grupos, níveis de RNAm da eNOS e iNOS foram medidos como expressão relativa com uso de valores 2-∆∆CT e normalizados para beta-actina gerada na mesma amostra; onde ΔΔCT = [CT iNOS ou eNOS (caso) - CT beta-actina (caso)] - [CT iNOS ou eNOS (controle) - CT beta-actina (controle)].19 A especificidade das reações de PCR foi verificada pela análise de curva de dissociação.

 Análise estatística

Todos os valores são expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A análise estatística foi realizada com o programa SPSS, versão 20 (SPSS, Chicago, IL, EUA). Os testes de Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk foram utilizados para verificação da normalidade dos dados, com valores de p > 0,05 indicando distribuição normal. Testes paramétricos e não paramétricos foram utilizados para a análise de dados com distribuição normal e não normal, respectivamente.20 A análise de variância por medidas repetidas (ANOVA) foi utilizada para comparação dos parâmetros hemodinâmicos (PDVE, PDFVE e ± dP/dt) em diferentes momentos. O teste t de Student foi utilizado para comparar os níveis de MDA e NOx nos momentos basal e pós-IR em cada grupo. ANOVA unifatorial com teste post hoc de Tukey foi utilizado para comparação dos níveis de MDA, NOx, CK-MB e LDH entre os diferentes grupos. O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para comparação da expressão gênica nos diferentes grupos. Valores de p (bicaudal) < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

 Resultados

A glicemia inicial e os pesos do corpo e do coração dos animais foram semelhantes em todos os grupos. Em comparação aos animais controles, os ratos diabéticos apresentaram após injeção de STZ-NA níveis sanguíneos aumentados de glicose (196,8 ± 26,4 versus 82,6 ± 4,5 mg/dL; p < 0,05), diminuição do peso corporal (239,7 ± 12,3 versus 331,7 ± 13,7 g; p < 0,05) e aumento significativo da razão do peso do coração sobre o peso corporal (0,48 ± 0,01 versus 0,37 ± 0,01%). Ao final do estudo (dia 70), a área sob a curva da concentração plasmática de glicose durante um teste intravenoso de tolerância à glicose (TOTG) foi significativamente (p < 0,05) maior em ratos diabéticos (20.264 ± 659 mg/dL/60 min) quando comparada à de ratos do grupo controle (7.825 ± 247 mg/dL/60 min, p < 0,05).

Os efeitos do nitrato dietético nos parâmetros hemodinâmicos em corações isolados durante o período de estabilização e IR estão mostrados na Tabela 1 e na Figura 1. Durante o período de estabilização, os corações de ratos diabéticos tinham PDVE e ±dP/dt significativamente inferiores (p < 0,05) em comparação aos dos ratos do grupo controle. O consumo de nitrato não teve efeito sobre a PDVE e ±dP/dt no momento basal em amostras de corações de ratos CN e DN quando comparados aos de ratos controle e diabéticos, respectivamente (Tabela 1).

Parâmetros da função cardíaca durante o período de estabilização
Controle Controle-Nitrato Diabetes Diabetes-Nitrato
PDFVE (mmHg) 8,5 ± 2,2 8,8 ± 2,8 8,2 ± 1,8 7,9 ± 2,3
PDVE (mmHg) 96,7 ± 7,6 93,4 ± 6,6 60 ± 3,9* 65 ± 6,3*
+dP/dt (mmHg/s) 3.135 ± 211 3.055 ± 247 2.052 ± 434* 2.152 ± 412*
-dP/dt (mmHg/s) 2.215 ± 188 2.163 ± 205 1.387 ± 154* 1.484 ± 123*

Os dados estão expressos em média ± EPM. Pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE); pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE) e taxas máximas de variação positiva e negativa da pressão ventricular esquerda (± dP/dt)

p < 0,05 diferença estatisticamente significativa entre os grupos D versus C e grupos DN versus CN. Controle (C), controle-nitrato (CN), diabetes (D) e diabetes-nitrato (DN).

Recuperação da função cardíaca após lesão de IR. A) Pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE); B) Pressão desenvolvida no ventrículo esquerdo (PDVE); C) Taxas máximas de variação positiva da pressão ventricular esquerda (+dP/dt); D. Taxas máximas de variação negativa da pressão ventricular esquerda (-dP/dt). Os valores estão expressos em média ± EPM; (n = 7 em cada grupo); *p < 0,05, em comparação aos grupos controle e diabético. Controle (C), controle-nitrato (CN), diabetes (D) e diabetes-nitrato (DN).

Em todos os grupos, a PDFVE aumentou gradualmente durante os 30 minutos de isquemia. No entanto, ratos diabéticos, quando comparados aos controles, exibiram um aumento significativo na PDFVE (p < 0,05), enquanto que ratos CN e DN mostraram redução significativa (p < 0,01) neste parâmetro quando comparados com ratos controles e diabéticos, respectivamente. O consumo de nitrato melhorou as propriedades diastólicas, como indicado por uma menor PDFVE durante a fase de reperfusão em amostras de coração de ratos nos grupos CN e DN e preveniu uma resposta hipercontrátil durante a fase precoce de reperfusão (Figura 1-A).

Comparados com os animais controles, os ratos com diabetes induzido por STZ-NA apresentaram PDVE e ±dP/dt significativamente inferiores. A ingestão de nitrato restaurou a PDVE e ±dP/dt reduzidas para níveis próximos aos pré-isquêmicos tanto no grupo CN quanto no DN, comparados com os grupos controle e diabético, respectivamente (p < 0,01) (Figura 1-B, C, D). Em comparação com os valores basais, a expressão da eNOS diminuiu significativamente e a da iNOS aumentou significativamente no grupo controle após IR. Houve diminuição da expressão de eNOS e aumento da expressão de iNOS em corações de ratos diabéticos quando comparados com os dos animais controles tanto antes como depois da IR. O nitrato dietético restaurou a expressão de eNOS e iNOS para níveis próximos aos normais após IR nos grupos CN e DN. O consumo de nitrato não teve efeito sobre a expressão basal de eNOS e iNOS em corações de ratos nos grupos CN e DN em comparação aos encontrados em animais nos grupos controle e diabético, respectivamente (Figura 2).

Efeito do consumo de nitrato na expressão do RNAm da eNOS (A) e (B) iNOS. Os valores estão expressos como média ± EPM; *p < 0,05, comparando o períodos pré-IR com o período pós-IR em cada grupo. **p < 0,05 comparando o período pré-IR em cada grupo com controles. #p < 0,05 comparando o período pós-IR em cada grupo com controles. †p < 0,05 comparando o período pós-IR entre os grupos DN e D. Controle (C), controle-nitrato (CN), diabetes (D) e diabetes-nitrato (DN).

Em todos os grupos, os níveis cardíacos de NOx aumentaram significativamente (p < 0,05) após IR em comparação aos valores basais. O nitrato dietético não teve efeito sobre os níveis cardíacos de NOx no período basal no grupo CN, que apresentou níveis comparáveis aos do grupo controle. Após a isquemia, os níveis cardíacos de NOx aumentaram no grupo controle, mas não no grupo CN (p < 0,05), sugerindo um efeito protetor do nitrato. Em comparação aos animais controles, o nível cardíaco de NOx foi inferior nos ratos diabéticos antes da IR, mas foi superior após IR e diminuiu após ingestão de nitrato no grupo DN, tanto antes quanto depois da IR em comparação aos ratos diabéticos (Figure 3-A).

Alterações dos níveis de NOx (A) e MDA (B) em corações de ratos nos diferentes grupos. Os valores estão expressos como média ± EPM; (n = 7 em cada grupo); *p < 0,05 comparando o período pré-IR com o período pós-IR em cada grupo. **p < 0,05 comparando o período pré-IR em cada grupo com controles. #p < 0,05 comparando o período pós-IR em cada grupo com controles. ‡p < 0,05 comparando o período pré-IR nos grupos DN e D. †p < 0,05 comparando o período pós-IR entre os grupos DN e D. Controle (C), controle-nitrato (CN), diabetes (D) e diabetes-nitrato (DN).

Em todos os grupos, os níveis cardíacos de MDA aumentaram significativamente (p < 0,05) após a isquemia em comparação aos valores no momento basal. Comparados com controles, os ratos diabéticos apresentaram níveis significativamente mais elevados de MDA, tanto antes quanto após IR (p < 0,05). O consumo de nitrato restaurou os níveis elevados de MDA para próximo dos valores normais nos grupos CN e DN em comparação com os níveis nos grupos controle e diabético, respectivamente (Figura 3-B). Em comparação com o grupo controle, os níveis de CK-MB e LDH foram significativamente mais elevados (p < 0,05) no grupo diabético (p < 0,05). O nitrato dietético reduziu significativamente a liberação de CK-MB e LDH em ratos no FC dos ratos nos grupos CN e DN em relação aos dos grupos controle e diabético, respectivamente (Figura 4).

Efeito da ingestão de nitrato nos níveis de LDH (A) e CK-MB (B) no fluxo coronariano 5 min após a reperfusão. Os valores estão expressos como média ± EPM; (n = 7 em cada grupo); *p < 0,05 comparado com o grupo controle. **p < 0,05 comparando o grupo DN com o grupo D. Controle (C), controle-nitrato (CN), diabetes (D) e diabetes-nitrato (DN).

Discussão

A ingestão de nitrato melhorou a recuperação da função cardíaca após isquemia tanto em ratos normais quanto diabéticos. Este efeito cardioprotetor foi associado com a prevenção do aumento e diminuição da expressão do RNAm da iNOS e da eNOS, respectivamente, no tecido cardíaco. Além disso, a ingestão de nitrato restaurou os níveis cardíacos tanto de NOx quanto de MDA para os valores normais.

Neste estudo, nós mostramos pela primeira vez que a ingestão crônica de uma baixa dose de nitrato (100 mg/L por 2 meses) protegeu o coração dos ratos no grupo controle de lesões de IR. Em seres humanos, uma dose semelhante pode ser alcançada através de uma dieta rica em vegetais. A maioria dos estudos que avaliaram os efeitos do nitrato na lesão de IR foi realizada in vitro.21-23 Webb et al.21 relataram que a infusão de nitrito em ratos (0,7 a 7 mg/L) durante isquemia no sistema de Langendorff reduziu o tamanho do infarto e melhorou a função ventricular esquerda.21 Uma investigação adicional por Gonzalez et al.23 documentou uma proteção semelhante em um modelo canino in vivo.23 Duraunski et al.22 também demonstraram que a administração de nitrito (48 nmoL) durante isquemia em camundongos reduziu o tamanho do infarto e protegeu o coração da lesão de IR.22 Bryan et al.,24 em um estudo in vivo, avaliaram os efeitos da ingestão a curto prazo de nitrato (1.000 mg/L na água de beber por 7 dias) na lesão de IR e demonstraram uma redução no tamanho do infarto em resposta à lesão de IR miocárdica.24 No entanto, é ainda questionável se as conclusões de um estudo realizado a curto prazo possam ser estendidas a uma situação de longo prazo.25 Portanto, nós avaliamos os efeitos do consumo crônico de uma dose baixa de nitrato na lesão de IR em ratos com diabetes induzido por STZ-NA. Este é um modelo adequado para avaliar a eficácia de novos agentes antidiabéticos em potencial e que tem sido relatado como o mais próximo do diabetes tipo 2 em humanos. No entanto, ratos com diabetes induzido por STZ-NA, como modelo para diabetes tipo 2 não ligado à obesidade, não apresentam resistência à insulina, que é a principal característica do diabetes tipo 2.15,17 No presente estudo, nós utilizamos o ponto de corte de 126 mg/dL para a glicemia na definição do diabetes, pois o modelo de diabetes tipo 2 induzido por STZ-NA está associado com hiperglicemia moderada.17 Este valor, quando determinado durante jejum, é adotado em estudos em humanos para definir diabetes.26 Além disso, a ocorrência de um TOTG anormal indica que o diabetes foi induzido com êxito.

Neste estudo, corações de ratos com diabetes induzido por STZ-NA tiveram funções cardíacas inferiores no momento basal, um dado controverso em diferentes modelos animais de diabetes.27-29 Em comparação aos animais controles, foi observada uma menor recuperação da função cardíaca em ratos diabéticos após a IR. Os efeitos do diabetes tipo 2 na lesão de IR miocárdica em estudos com animais são uma questão controversa, e tanto uma sensibilidade maior30 quanto menor30 à lesão ou mesmo nenhum efeito31 têm sido relatados. Estes resultados inconsistentes podem ser parcialmente explicados pela gravidade e duração do diabetes tipo 2 e também a mudança nos perfis metabólicos após indução do diabetes.28,32 Além disso, as diferenças entre os modelos de diabetes tipo 2, o grau de lesão de IR e a espécie do animal podem modificar as funções cardíacas no momento basal em ratos com diabetes tipo 2 e a suscetibilidade à lesão de IR miocárdica.28

Nossos resultados demonstram que ratos diabéticos tiveram expressão reduzida de eNOS e aumentada de iNOS tanto no momento basal quanto após IR. O nível cardíaco de NOx foi também inferior antes da IR, mas foi superior após IR, e o nível cardíaco de MDA foi maior tanto antes quanto depois da IR. Estudos prévios demostraram que embora a formação de NO induzida por iNOS aumente os níveis de NO no diabetes, o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), enquanto interagindo simultaneamente com o NO, leva à diminuição da biodisponibilidade do NO no soro e no coração no momento basal. Além disso, o NO pode ser rapidamente removido por radicais livres e produzir peroxinitrito, levando à lesão miocárdica no momento basal.9,11 Além disso, um aumento importante na produção de ROS e diminuição da capacidade antioxidante em condições hiperglicêmicas levam ao desenvolvimento de estresse oxidativo, peroxidação lipídica e lesão da membrana celular, o que pode causar extravasamento de LDH e CK-MB, sugerindo um aumento do estresse oxidativo e necrose celular no diabetes induzido por STZ-NA.11

Até onde sabemos, nenhum estudo até o momento documentou o efeito do consumo de nitrato na lesão de IR em ratos com diabetes induzido por STZ-NA. Embora tenhamos demonstrado anteriormente que o nitrato dietético impede o aumento da pressão arterial sistólica e da glicose sérica, ele melhora a tolerância à glicose e restaura a dislipidemia em ratos com diabetes induzido por STZ-NA.15 Jiang et al.33 relataram que o consumo de nitrito dietético (50 mg/L por 4 semanas) por camundongos diabéticos db/db melhora a sinalização da insulina através da translocação de GLUT4 para a membrana.33 Ohtake et al.14 também demonstraram que o consumo dietético de nitrito (150 mg/L por 10 semanas) melhora a resistência à insulina em camundongos com diabetes tipo 2.14

A ingestão de nitrato no presente estudo também ofereceu cardioproteção através da diminuição dos níveis de marcadores de lesão miocárdica no FC e níveis de peroxidação lipídica em corações de ratos diabéticos após IR, um efeito que pode estar relacionado às propriedades antioxidantes da ingestão de nitrato que protege a membrana das células cardíacas através da inibição da peroxidação lipídica, resultando em diminuição do extravasamento de enzimas citossólicas.11 Nós também mostramos anteriormente que o tratamento crônico com uma baixa dose de nitrato atenua o estresse oxidativo em ratos com diabetes induzido por STZ-NA através de um aumento na capacidade antioxidante total sérica e catalase.15

No presente estudo, observamos que o consumo de nitrato protegeu o coração da lesão de IR através da restauração da expressão de iNOS e eNOS para valores normais e, posteriormente, diminuição do acúmulo de NO após IR. Estudos anteriores relataram que a ingestão de nitrito melhora a sinalização de insulina34 e aumenta a sua secreção em ratos.13 A insulina ativa a Akt e aumenta a atividade da eNOS através da via PI3K-Akt-eNOS,34,35 que por sua vez ativa a eNOS através da fosforilação da serina 117735 e aumenta a produção de NO. Além disso, a insulina diminui a produção de NO induzida por iNOS e reduz a formação de peroxinitrito induzida por IR.36 O aumento na expressão de eNOS e redução da expressão de iNOS pela insulina são ambos cardioprotetores. Isso nos oferece um embasamento para levantar a hipótese de que o consumo de nitrato protege o coração por aumentar a expressão de eNOS e diminuir a expressão de iNOS através de uma redução do estresse oxidativo e aumento na secreção de insulina.

Nossos resultados mostram que o consumo de nitrato foi insuficiente para restaurar a função hemodinâmica basal para valores próximos dos normais em ratos diabéticos, pois no estado diabético, o NO é inativado pelos ROS antes da sua ação. Evidências mostram que a eNOS pode ser desacoplada no diabetes devido a uma diminuição na tetrahidrobiopterina, um cofator da NOS que aumenta a formação de ânion superóxido e prejudica a função da eNOS no coração. Além disso, a iNOS pode ter efeitos crônicos deletérios importantes, i.e., comprometimento irreversível da função contrátil basal mediada pelo peroxinitrito que não pode ser prontamente revertida pela ingestão de nitrato; portanto, outros tratamentos, tais como removedores de radicais, parecem ser essenciais.37

Algumas limitações deste estudo devem ser consideradas na interpretação de seus resultados. Primeiro, nós não medimos os níveis das proteínas eNOS e iNOS. Embora mudanças no RNAm não reflitam necessariamente mudanças proteicas, a expressão do RNAm ainda é informativa.38 Segundo, nós não utilizamos uma abordagem farmacológica para confirmar os nossos resultados em relação à diminuição da expressão da iNOS e aumento da expressão da eNOS após ingestão de nitrato, já que tem sido demonstrado que tanto a deleção do gene iNOS quanto a inibição da iNOS pode fornecer cardioproteção em animais diabéticos.39

Conclusão

O consumo de nitrato restaurou a função cardíaca após IR para níveis próximos aos pré-isquêmicos em ratos diabéticos através de um bloqueio do aumento e da diminuição patológica da expressão de iNOS e eNOS, respectivamente. O nitrato também restaurou os níveis cardíacos de NOx e MDA a valores normais tanto antes quanto depois da isquemia.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por Endocrine Research Centre, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran Iran.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

 Agradecimentos

Este estudo recebeu financiamento (N0.711) do Endocrine Physiology Research Center, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences. Os autores gostariam de agradecer a sra. N. Shiva pela edição crítica do manuscrito em inglês em relação à gramática e sintaxe.