Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC Fg7ghQ4vzSgh9PXrdVKRG7j S0066-782X2016004200271 10.5935/abc.20160097 S0066-782X2016005018103 Review Article Cardiac Regeneration using Growth Factors: Advances and Challenges Rebouças Juliana de Souza 1 Santos-Magalhães Nereide Stela 1 Formiga Fabio Rocha 2 3 Universidade Federal de Pernambuco Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami Recife PE Brazil Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami - Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE - Brazil Universidade Federal de Pernambuco Universidade de Pernambuco Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Aplicada Recife PE Brazil Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Aplicada - Universidade de Pernambuco (UPE), Recife, PE - Brazil Universidade de Pernambuco Fundação Oswaldo Cruz Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz Curso de Pós-Graduação em Patologia Salvador BA Brazil Curso de Pós-Graduação em Patologia (UFBA/FIOCRUZ) - Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Salvador, BA - Brazil Fundação Oswaldo Cruz Mailing Address: Fabio Rocha Formiga. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Rua Waldemar Falcão, 121, Candeal. Postal Code 40296710, Salvador, BA – Brazil. E-mail: fabio.formiga@bahia.fiocruz.br

Author contributions

Conception and design of the research and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Rebouças JS, Santos-Magalhães NS, Formiga FR; Acquisition of data: Rebouças JS, Formiga FR; Analysis and interpretation of the data and Writing of the manuscript: Rebouças JS, Formiga FR; Obtaining financing: Santos-Magalhães NS, Formiga FR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 27 06 2016 9 2016 107 3 271 275 31 10 2015 18 03 2016 23 03 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract

Myocardial infarction is the most significant manifestation of ischemic heart disease and is associated with high morbidity and mortality. Novel strategies targeting at regenerating the injured myocardium have been investigated, including gene therapy, cell therapy, and the use of growth factors. Growth factor therapy has aroused interest in cardiovascular medicine because of the regeneration mechanisms induced by these biomolecules, including angiogenesis, extracellular matrix remodeling, cardiomyocyte proliferation, stem-cell recruitment, and others. Together, these mechanisms promote myocardial repair and improvement of the cardiac function. This review aims to address the strategic role of growth factor therapy in cardiac regeneration, considering its innovative and multifactorial character in myocardial repair after ischemic injury. Different issues will be discussed, with emphasis on the regeneration mechanisms as a potential therapeutic resource mediated by growth factors, and the challenges to make these proteins therapeutically viable in the field of cardiology and regenerative medicine.

 Keywords Myocardial Infarction Myocardial Ischemia Vascular Remodeling Intercellular Signaling Peptides and Proteins Cell-and Tissue Based Therapy Introduction

Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death among men and women worldwide, in all racial and ethnic groups.1 In the United States, these diseases account for approximately 57% of all deaths in the country.2 In Europe, CVD cause 4.3 million deaths every year, which represents almost half (48%) of all deaths in that continent.3 CVD are also the major death cause in Brazil, with a specific mortality rate for ischemic heart diseases of 53.8 deaths for every 100,000 inhabitants.4

In the CVD group, coronary artery disease (CAD) and peripheral artery disease (PAD) are significant causes of morbidity and mortality, requiring surgical bypass procedure or angioplasty for thousands of patients. On the other hand, myocardial infarction (MI) is the most important manifestation of ischemic heart disease and is also associated with high morbidity and mortality. Ischemia is responsible for cardiac muscle damage, including the loss of cardiomyocytes. This process leads to a negative cardiac remodeling causing the cardiac tissue with a normal contractile function to be replaced by a non-functional scar tissue. The myocardium then produces a compensatory hypertrophic mechanism against ischemia-induced wound healing. However, the hypertrophy may make the heart susceptible to the onset of arrhythmias, ventricular fibrillation and massive heart attack.5,6 Although advanced revascularization procedures (angioplasty, catheterization, bypass) have contributed to a marked reduction in mortality for CVD, a significant number of patients are not eligible to these procedures or achieve incomplete revascularization with these interventions. Consequently, many of these patients show persistent symptoms of cardiac ischemia despite intensive medical care. They probably suffer from severe diffuse atherosclerotic disease, which cannot be treated by surgery or angioplasty. Symptomatic obstructive vascular disease leads to claudication, peripheral ischemia, angina and congestive heart failure, significantly limiting the quality of life of these patients.

Treatment of MI includes the use of drugs (antiplatelet agents, oral anticoagulants, nitrates, β-adrenergic blockers, ACE inhibitors, and others), surgical reperfusion and revascularization procedures, and, in more complex cases, heart transplantation. In the past decade, there was growing investigation on new strategies for regeneration of the injured myocardium, including gene therapy,7,8 cell therapy,9,10 and the use of growth factors.11 The later has also been investigated for the induction of therapeutic angiogenesis for peripheral arterial disease.12

The use of growth factors has aroused interest in cardiovascular medicine because of the direct action of these factors on several cell functions such as adhesion, proliferation, migration, and others. When obstruction of the coronary artery flow occurs, induction of angiogenesis by growth factors represents an important mechanism of myocardial repair and protection under hypoxic conditions, resulting in the formation of new vessels.13 Consequently, tissue perfusion increases, ultimately leading to a better cardiac function.

On the other hand, the regenerative potential of growth factors has gained great importance in the context of cell therapy. Studies have demonstrated that the benefits derived from the administration of stem cells in the infarct area result, to a greater extent, from the paracrine effect of the growth factors secreted by the cells implanted than from the direct action of the cells in the infarct tissue.9,14-16 These factors show the potential of inducing different regeneration mechanisms: positive remodeling of the extracellular matrix, proliferation of adult cardiomyocytes, recruiting/homing of cardiac stem cells, antiapoptotic and/or angiogenic effect.11,17 Together, these mechanisms may reduce inflammation, fibrosis and inadequate perfusion of the ischemic myocardium, promoting tissue repair and improvement of the cardiac function.9

Despite the mechanisms of growth-factor-induced tissue regeneration, the therapeutic potential of these proteins is limited by their short biological half-life, low plasma stability and low specificity to target organs. In fact, Hwang and Kloner administered a cocktail of growth factors in rats intraperitoneally and did not observe benefits in the cardiac function, reduction of the infarct size or increase in vascularization.18

Thus, the clinical use of growth factors depends on new formulation technologies able to increase their half-lives, keep their bioactivity, and control their local delivery in target tissues. In this context, micro- and nanostructured systems have been used as delivery platforms,19,20 and are a promising formulation strategy for the therapeutic use of growth factors for cardiac regeneration.11

The objective of this review is to address the strategic role of growth factor therapy for cardiac regeneration, considering its innovative and multifactorial character on cardiac repair after an ischemic injury.

Mechanisms of cardiac regeneration

The innate capacity of the human heart for self-regeneration is not enough to compensate the loss of cardiac muscle after an ischemic injury.9 Unlike what is observed with skeletal muscles, in which satellite cells and myoblasts form new myocytes a few days after an injury, cardiomyocytes from the border zone of the infarct rarely divide after an ischemic event.21 In a lesion induced by infarct, the heart loses approximately 50 g of muscle, and this can result in the death of 2 billion cardiomyocytes.22,23 This myocardial aggression triggers and modulates tissue reparative changes, including dilatation, hypertrophy, and formation of a collagen scar.24 In relation to cell renewal, the mechanisms of endogenous repair are not enough to induce significant renewal of the muscle mass lost after the ischemic injury.

Cardiomyocyte proliferation plays a key role in cardiac regeneration in some vertebrates, but the proliferative capacity of these cells is limited in the adult hearts of mammals.21 Another potential cell renewal mechanism is the mobilization of progenitor cells from the bone marrow to the ischemic area and their differentiation into functional cardiomyocytes.9 However, mobilization and homing of these progenitors are also not enough to induce significant regeneration. The myocardium also shelters a population of resident cardiac stem cells (CSC) with potential to differentiate into cardiomyocytes.25,26 The CSC seem to account for the baseline turnover of cardiomyocytes. However, this renewal probably occurs at very low rates in the absence of lesion.27

The efficacy of these endogenous mechanisms of tissue repair is limited by the hostile microenvironment of the infarcted myocardium, which is characterized by ischemia, inflammation, fibrosis and inadequate angiogenesis. This microenvironment probably prevents, the CSC activation. On the other hand, excessive inflammation also prevents progenitors mobilization and homing. The formation of fibrotic tissue is necessary to prevent muscle rupture after infarction, but the high level of fibrosis represents an important physical barrier to myocardial cell regeneration.9 Therefore, mitigation of this hostile environment should contribute to cardiac repair, especially the reduction of local inflammation, apoptosis and fibrosis, as well as the increase in vascularization in the infarct and peri-infarct areas.

 Growth factors inducing regenerative mechanisms

Angiogenesis refers to the development of blood vessels from a pre-existing vascular bed. From the medical point of view, the objective is to stimulate vessel growth in patients with conditions characterized by insufficient blood flow, such as ischemic heart diseases and peripheral vascular diseases.28

As regards the latter aspect, the identification of growth factors that induce the angiogenic process stimulated the interest in the use of these proteins for the induction of therapeutic angiogenesis.11 In the case of myocardial infarction, angiogenic therapy with growth factors may salvage the ischemic tissue at early stages of infarction, by supplying the tissue with new vessels. This process is essential to prevent heart failure through the control of cardiomyocyte hypertrophy and contractility.29 In fact, angiogenesis is the main growth factor-induced reparative mechanism and has been the mechanism most often investigated in experimental studies and clinical trials on injured myocardium repair. Most of these studies have dedicated their efforts toward the angiogenic and regenerative potential of vascular endothelial growth factor (VEGF)30-33 and fibroblast growth factor (FGF).31,34-36

Mitigation of the ischemic injury in the cardiac tissue may be induced by antiapoptotic factors, which exert potentially cardioprotective effects. Hepatocyte growth factor (HGF) was first identified as a hepatocyte mitogen, with chemotactic and antiapoptotic actions in different cell types.37 In rats undergoing ischemia and reperfusion, intravenous administration of HGF reduced apoptosis in cardiomyocytes and the infarct size.38 Other antiapoptotic factors with therapeutic potential in cardiac regeneration include platelet-derived growth factor (PDGF-BB)39 and protein thymosin β440, IL-1141, IL-3342, and others.

Endogenous mechanisms mediated by progenitors and stem cells include mobilization and homing of bone marrow progenitors as well as CSC activation. These cells may differentiate into new cardiomyocytes after the ischemic injury, but their number is reduced or they are insufficiently activated to produce significant muscular regeneration. Some proteins show the potential to mobilize bone marrow progenitors to the cardiac lesion area or activate CSC. These properties may be therapeutically explored as regenerative mechanisms activated by growth factors or recombinant proteins, such as the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF),43 HGF,44 stromal cell-derived factor (SDF-1),45 and others.

The paradigm of the heart as a completely differentiated organ was contested based on the identification of mitogens able to induce adult cardiomyocytes to enter into the cell cycle.46,47 This process opens the possibility to stimulate a new regeneration mechanism in the infarcted heart, leading to the formation of a population of new cardiomyocytes capable of replacing the cell mass lost due to the ischemic injury. Three extracellular factors have been identified for their ability to activate receptors involved in cardiomyocyte proliferation: acidic fibroblast growth factor (FGF-1),48 neuregulin (NRG-1),47 and periostin.49 Treatment of infarcted rats with FGF-1 in combination with a mitogen-activating protein kinase (MAPK) p38 resulted in increased cardiomyocyte mitosis and improved cardiac function.50 Studies have demonstrated improved cardiac function in infarcted mice treated with daily injections of NRG-1.47,51 A summary of growth factor-induced cardiac regeneration mechanisms is shown in Table 1.

Main growth factors inducing the mechanisms of cardiac regeneration
Factor Mechanisms Reference
VEGF Angiogenesis 30-33
FGF Angiogenesis 31,34-36
HGF Antiapoptosis 37,38, 44
CSCs chemotaxis
SDF-1 Hematopoietic stem cells mobilization and homing 45
IGF-1 Stem cells and progenitor cells viability and differentiation 52
PDGF Antiapoptosis 39
G-CSF Antiapoptosis 43
Hematopoietic stem cells mobilization and homing
Intermedin Angiogenesis 53
Angiopoietin Angiogenesis, remodeling and vascular stabilization 54
Periostin Cardiomyocyte proliferation 49
Neuregulin-1 Cardiomyocyte proliferation 47
Erythropoietin Antiapoptosis 55

VEGF: vascular endothelium growth factor isoforms; FGF: fibroblast growth factor; HGF: Hepatocyte growth factor; SDF-1: stromal cell-derived factor; IGF‑1: Insulin‑like growth factor 1; PDGF: platelet-derived growth factor; G-CSF: granulocyte colony stimulating factor.

 Challenges in growth factor formulation

In the past two decades, intensive research on the mechanisms of cardiac regeneration has resulted in considerable advances in the discovery of therapeutic targets related to several growth factors. These proteins have been evaluated in experimental studies and clinical trials, which have demonstrated the safety and potential efficacy of these factors in the treatment of ischemic heart diseases, particularly myocardial infarction.11,56 However, an important challenge for establishing protein therapy for these diseases is the development of formulation technologies capable of ensuring the reparative mechanisms of these biomolecules and making them clinically viable.

Aspects related to dosage, route of administration, protein stability and biocompatibility should be considered. The ability of these formulations to incorporate multiple factors also represents a critical issue, considering the multifactorial character of the mechanisms involved in myocardial repair following ischemia. Together, these aspects have been previously reviewed and should guide the rational development of growth factor formulations for protein and/or cell therapy focusing on cardiac generation.11

Micro- and nanostructured controlled delivery systems show several advantages over conventional formulations that deliver biopharmaceuticals in their free form, usually in an aqueous vehicle for intravenous administration. By permitting a more adequate pharmacokinetic profile to the effects of the active compound, micro- and nanoformulations facilitate patient's adherence to treatment; provide protection to the active ingredient against enzymatic degradation; permit specific targeting to an organ or target-structure; local and controlled delivery of the molecule of interest. Polymeric systems (hydrogels, scaffolds, micro- and nanoparticles)11,57,58 and lipid systems (liposomes, solid lipid nanoparticles)59,60 have been used as cardiac delivery platforms of growth factors, which can be obtained from natural biomaterials (collagen/gelatin, fibrin, hyaluronic acid, alginate, chitosan, etc.) and synthetic materials (polyesters, amino acid polymers, polyacrylamide derivatives, and others).11

Polyesters such as poly (lactic acid-co-glycolic acid, PLGA) and polycaprolactone (PCL) are polymers approved for the use in drug delivery systems because of their low immunogenic potential and adequate biodegradation profile. Previous studies have demonstrated the biocompatibility of PLGA microparticles with the cardiac tissue and the efficacy of these particles as delivery systems of VEGF in the experimental treatment of myocardial infarction.58,61 Recently, Formiga and colleagues have demonstrated the efficacy of these microparticles as cardiac delivery systems of FGF-1 and NRG-1, ensuring the regenerative effects of these factors in an rat myocardial infarction model.62

Perspectives

Future perspectives for the use of cardioregenerative factors are related to the development of new formulation technologies combined with smart, biocompatible, non-invasive materials. These advances should work as multifunctional structures that combine therapeutic and diagnostic functions in a single micro- or nanostructurated. Additionally, they will allow specific ligand-guided targeting on the material surface. The translational potential of these technologies is predictable, considering the diversity of growth factor-induced regeneration mechanisms. These processes should be explored with more clinical interest both as protein therapy and as adjuvant in stem-cell therapy for cardiac regeneration.

Sources of Funding

This study was partially funded by CNPq (461865/2014-9).

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

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Thymosin beta4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration, survival and cardiac repair. Nature. 2004;432(7016):466-72. Bock-Marquette I Saxena A White MD Dimaio JM Srivastava D Thymosin beta4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration, survival and cardiac repair Nature 2004 432 7016 466 472 41 Obana M, Maeda M, Takeda K, Hayama A, Mohri T, Yamashita T, et al. Therapeutic activation of signal transducer and activator of transcription 3 by interleukin-11 ameliorates cardiac fibrosis after myocardial infarction. Circulation. 2010;121(5):684-91. Obana M Maeda M Takeda K Hayama A Mohri T Yamashita T Therapeutic activation of signal transducer and activator of transcription 3 by interleukin-11 ameliorates cardiac fibrosis after myocardial infarction Circulation 2010 121 5 684 691 42 Seki K, Sanada S, Kudinova AY, Steinhauser ML, Handa V, Gannon J, et al. 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Madonna R Cevik C Nasser M De Caterina R Hepatocyte growth factor molecular biomarker and player in cardioprotection and cardiovascular regeneration Thromb Haemost 2012 107 4 656 661 45 Shao S, Cai W, Sheng J, Yin L. Role of SDF-1 and Wnt signaling pathway in the myocardial fibrosis of hypertensive rats. Am J Transl Res. 2015;7(8):1345-56. Shao S Cai W Sheng J Yin L Role of SDF-1 and Wnt signaling pathway in the myocardial fibrosis of hypertensive rats Am J Transl Res 2015 7 8 1345 1356 46 Bergmann O, Bhardwaj RD, Bernard S, Zdunek S, Barnabe-Heider F, Walsh S, et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 2009;324(5923):98-102. Bergmann O Bhardwaj RD Bernard S Zdunek S Barnabe-Heider F Walsh S Evidence for cardiomyocyte renewal in humans Science 2009 324 5923 98 102 47 Bersell K, Arab S, Haring B, Kuhn B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 2009;138(2):257-70. Bersell K Arab S Haring B Kuhn B Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury Cell 2009 138 2 257 270 48 Engel FB, Schebesta M, Duong MT, Lu G, Ren S, Madwed JB, et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Genes Dev. 2005;19(10):1175-87. Engel FB Schebesta M Duong MT Lu G Ren S Madwed JB p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes Genes Dev 2005 19 10 1175 1187 49 Kuhn B, Del Monte F, Hajjar RJ, Chang YS, Lebeche D, Arab S, et al. Periostin induces proliferation of differentiated cardiomyocytes and promotes cardiac repair. Nat Med. 2007;13(8):962-9. Kuhn B Del Monte F Hajjar RJ Chang YS Lebeche D Arab S Periostin induces proliferation of differentiated cardiomyocytes and promotes cardiac repair Nat Med 2007 13 8 962 969 50 Engel FB, Hsieh PC, Lee RT, Keating MT. 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Chong AY Caine GJ Lip GY Angiopoietin/tie 2 as mediators of angiogenesis a role in congestive heart failure Eur J Clin Investig 2004 34 1 9 13 55 Calvillo L, Latini R, Kajstura J, Leri A, Anversa P, Ghezzi P, Et al. Recombinant human erythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury and promotes beneficial remodeling. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(8):4802-6. Calvillo L Latini R Kajstura J Leri A Anversa P Ghezzi P Recombinant human erythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury and promotes beneficial remodeling Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 8 4802 4806 56 Simón-Yarza T, Formiga F, Tamayo E, Pelacho B, Prosper F, Blanco-Prieto M. Vascular endothelial growth factor-delivery systems for cardiac repair: an overview. Theranostics. 2012;2(6):541-52. Simón-Yarza T Formiga F Tamayo E Pelacho B Prosper F Blanco-Prieto M Vascular endothelial growth factor-delivery systems for cardiac repair an overview Theranostics 2012 2 6 541 552 57 Rocha Formiga F, Ansorena E, Estella-Hermoso de Mendoza A, Imbuluzqueta E, González D, Blanco-Prieto MJ. Nanosistemas a base de poliésteres. In: Vila Jato JL. (ed). Nanotecnología farmacéutica. Madrid: Real Academia Nacional de Farmacia; 2009. p. 41-101. Rocha Formiga F Ansorena E Estella-Hermoso de Mendoza A Imbuluzqueta E González D Blanco-Prieto MJ Nanosistemas a base de poliésteres Vila Jato JL Nanotecnología farmacéutica Madrid Real Academia Nacional de Farmacia 2009 41 101 58 Formiga FR, Pelacho B, Garbayo E, Abizanda G, Gavira JJ, Simon-Yarza T, et al. Sustained release of VEGF through PLGA microparticles improves vasculogenesis and tissue remodeling in an acute myocardial ischemia-reperfusion model. J Control Release. 2010;147(1):30-7. Formiga FR Pelacho B Garbayo E Abizanda G Gavira JJ Simon-Yarza T Sustained release of VEGF through PLGA microparticles improves vasculogenesis and tissue remodeling in an acute myocardial ischemia-reperfusion model J Control Release 2010 147 1 30 37 59 Scott RC, Rosano JM, Ivanov Z, Wang B, Chong PL, Issekutz AC, et al. Targeting VEGF-encapsulated immunoliposomes to MI heart improves vascularity and cardiac function. FASEB J. 2009;23(10):3361-7. Scott RC Rosano JM Ivanov Z Wang B Chong PL Issekutz AC Targeting VEGF-encapsulated immunoliposomes to MI heart improves vascularity and cardiac function FASEB J 2009 23 10 3361 3367 60 Zhang S, Uludag H. Nanoparticulate systems for growth factor delivery. Pharm Res. 2009;26(7):1561-80. Zhang S Uludag H Nanoparticulate systems for growth factor delivery Pharm Res 2009 26 7 1561 1580 61 Formiga F, Garbayo E, Diaz-Herraez P, Abizanda G, Simón-Yarza T, Tamayo E, et al. Biodegradation and heart retention of polymeric microparticles in a rat model of myocardial ischemia. Eur J Pharm Biopharm. 2013;85(3):665-72. Formiga F Garbayo E Diaz-Herraez P Abizanda G Simón-Yarza T Tamayo E Biodegradation and heart retention of polymeric microparticles in a rat model of myocardial ischemia Eur J Pharm Biopharm 2013 85 3 665 672 62 Formiga FR, Pelacho B, Garbayo E, Imbuluzqueta I, Diaz-Herraez P, Abizanda G, et al. Controlled delivery of fibloblast growth factor-1 and neuregulin-1 from biodegradable microparticles promotes cardiac repair in a rat myocardial infarction model through activation of endogenous regeneration. J Control Release. 2014;173:132-9. Formiga FR Pelacho B Garbayo E Imbuluzqueta I Diaz-Herraez P Abizanda G Controlled delivery of fibloblast growth factor-1 and neuregulin-1 from biodegradable microparticles promotes cardiac repair in a rat myocardial infarction model through activation of endogenous regeneration J Control Release 2014 173 132 139 Regeneração Cardíaca com Fatores de Crescimento: Avanços e Desafios Rebouças Juliana de Souza 1 Santos-Magalhães Nereide Stela 1 Formiga Fabio Rocha 2 3 Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami - Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, PE - Brasil Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Aplicada - Universidade de Pernambuco (UPE), Recife, PE - Brasil Curso de Pós-Graduação em Patologia (UFBA/FIOCRUZ) - Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Salvador, BA - Brasil Correspondência: Fabio Rocha Formiga. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Rua Waldemar Falcão, 121, Candeal. CEP 40296710, Salvador, BA – Brasil. E-mail: fabio.formiga@bahia.fiocruz.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Rebouças JS, Santos-Magalhães NS, Formiga FR; Obtenção de dados: Rebouças JS; Análise e interpretação dos dados e Redação do manuscrito: Rebouças JS, Formiga FR; Obtenção de financiamento: Santos-Magalhães NS, Formiga FR.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo

O infarto do miocárdio representa a manifestação mais significativa da cardiopatia isquêmica e está associado a elevada morbimortalidade. Novas estratégias vêm sendo investigadas com o intuito de regenerar o miocárdio lesionado, incluindo a terapia gênica, a terapia celular e a utilização de fatores de crescimento. A terapia com fatores de crescimento despertou interesse em medicina cardiovascular, devido aos mecanismos de regeneração induzidos por essas biomoléculas, incluindo angiogênese, remodelamento da matriz extracelular, proliferação de cardiomiócitos e recrutamento de células-tronco, dentre outros. Em conjunto, tais mecanismos promovem a reparação do miocárdio e a melhora da função cardíaca. Esta revisão pretende abordar o papel estratégico da terapia, com fatores de crescimento, para a regeneração cardíaca, considerando seu caráter inovador e multifatorial sobre o reparo do miocárdio após dano isquêmico. Diferentes questões serão discutidas, destacando-se os mecanismos de regeneração como recurso terapêutico potencial mediado por fatores de crescimento e os desafios para tornar essas proteínas terapeuticamente viáveis no âmbito da cardiologia e da medicina regenerativa.

 Palavras-chave Infarto do Miocárdio Isquemia Miocárdica Remodelação Vascular Peptídeos e Proteínas de Sinalização Intercelular Terapia Baseada em Transplante de Células e Tecidos Introdução

As doenças cardiovasculares (DCV) são a primeira causa de morte entre homens e mulheres no mundo, entre todos os grupos raciais e étnicos.1 Nos Estados Unidos, essas enfermidades são responsáveis por aproximadamente 57% de todas as mortes no país.2 Na Europa, as DCV causam 4.3 milhões de mortes a cada ano, o que representa quase metade (48%) de todas as mortes nesse continente.3 As DCV também são as principais causas de morte no Brasil, com uma taxa de mortalidade específica para doenças isquêmicas do coração de 53,8 óbitos para cada 100.000 habitantes.4

No grupo das DCV, a doença arterial coronariana (DAC) e a doença arterial obstrutiva periférica (DAOP) são importantes causas de morbidade e mortalidade, exigindo procedimento de bypass cirúrgico ou angioplastia em milhares de pacientes. Por outro lado, o infarto do miocárdio (IM) representa a manifestação mais significativa da cardiopatia isquêmica e também está associado a elevada morbimortalidade. A isquemia é responsável pelo dano ao músculo cardíaco, incluindo a perda de cardiomiócitos. Esse processo produz um remodelamento negativo do coração causando a substituição do tecido cardíaco com função contrátil normal por um tecido cicatrizado não funcional. O miocárdio, então, produz um mecanismo compensatório hipertrófico contra a cicatrização induzida pela isquemia. Entretanto, a hipertrofia pode tornar o coração susceptível ao aparecimento de arritmias, fibrilação ventricular e ataque cardíaco fulminante.5,6 Apesar de os procedimentos avançados de revascularização (angioplastia, cateterismo, bypass) terem contribuído para uma redução marcante na mortalidade por DCV, um número significativo de pacientes não são candidatos a esses procedimentos ou alcançam revascularização incompleta com tais intervenções. Consequentemente, muitos desses pacientes apresentam sintomas persistentes de isquemia cardíaca, apesar dos cuidados médicos intensivos. Eles devem sofrer de doença aterosclerótica severa difusa, a qual não pode ser tratada com cirurgia ou angioplastia. A doença vascular obstrutiva sintomática resulta em claudicação, isquemia periférica, angina e insuficiência cardíaca congestiva, limitando de maneira significativa a qualidade de vida de tais pacientes.

O tratamento do IM inclui o uso de fármacos (antiplaquetários, anticoagulantes orais, nitratos, bloqueadores β-adrenérgicos e inibidores da ECA entre outros), procedimentos de reperfusão e de revascularização cirúrgica e, nos casos mais complexos, o transplante de coração. Na última década, houve uma crescente investigação sobre novas estratégias para regenerar o miocárdio lesionado, incluindo a terapia gênica,7,8 a terapia celular9,10 e a utilização de fatores de crescimento.11 Essa última estratégia também tem sido investigada para a indução de angiogênese terapêutica na doença arterial periférica.12

O uso de fatores de crescimento despertou interesse em medicina cardiovascular devido às ações diretas dos fatores sobre diversas funções celulares como adesão, proliferação e migração, entre outras. Diante da oclusão do fluxo arterial coronariano, a indução de angiogênese por fatores de crescimento representa um importante mecanismo de reparo e proteção do miocárdio sob condições de hipoxia, resultando na formação de novos vasos.13 Consequentemente, produz-se um aumento da perfusão tecidual gerando, em última instância, uma melhora na função cardíaca.

Por outro lado, o potencial regenerativo dos fatores de crescimento ganhou notória importância no âmbito da terapia celular. Estudos comprovaram que os benefícios observados após a aplicação de células tronco na área infartada se devem mais ao efeito parácrino dos fatores de crescimento secretados pelas células implantadas do que pela a ação direta das células no tecido infartado.9,14-16 Esses fatores apresentam o potencial de induzir distintos mecanismos de regeneração: remodelamento positivo da matriz extracelular, proliferação de cardiomiócitos adultos, recrutamento/homing de células tronco cardíacas, efeito antiapoptótico e/ou angiogênico.11,17 Em conjunto, esses mecanismos podem reduzir a inflamação, a fibrose e a perfusão inadequada do miocárdio isquêmico, promovendo reparação tecidual e melhora na função cardíaca.9

Apesar dos mecanismos de regeneração tecidual induzidos por fatores de crescimento, o potencial terapêutico dessas proteínas é limitado pela sua curta meia-vida biológica, baixa estabilidade em plasma e pouca especificidade aos órgãos-alvo. De fato, Hwang e Kloner administraram um coquetel de fatores de crescimento em ratos por via intraperitonial e não observaram benefícios na função cardíaca, redução do tamanho do infarto ou aumento da vascularização.18

Dessa forma, a utilização clínica dos fatores de crescimento depende de novas tecnologias de formulação capazes de aumentar sua meia-vida, manter sua bioatividade e controlar sua liberação local nos tecidos-alvo. Nesse contexto, sistemas micro e nanoestruturados têm sido utilizados como plataformas de liberação de moléculas bioativas,19,20 sendo uma estratégia de formulação promissora para o uso terapêutico de fatores de crescimento no âmbito na regeneração cardíaca.11

Esta revisão pretende abordar o papel estratégico da terapia com fatores de crescimento para a regeneração cardíaca, considerando seu caráter inovador e multifatorial sobre o reparo cardíaco após um dano isquêmico.

Mecanismos de regeneração cardíaca

A capacidade inata de autorregeneração do coração humano é insuficiente para compensar a perda de músculo cardíaco após um dano isquêmico.9 Diferentemente do que acontece com o músculo esquelético, no qual as células satélites e mioblastos formam novos miócitos em poucos dias após a lesão, cardiomiócitos da zona limítrofe do infarto raramente se dividem após o evento isquêmico.21 Em uma lesão provocada por infarto, o coração perde aproximadamente 50 g de músculo, o que pode resultar na morte de 2 bilhões de cardiomiócitos.22,23 Essa agressão ao miocárdio dispara e modula alterações reparadoras no tecido, incluindo dilatação, hipertrofia e formação de cicatriz de colágeno.24 Com relação à renovação celular, os mecanismos de reparo endógeno são insuficientes para induzir renovação significativa da massa muscular perdida após o dano isquêmico.

A proliferação de cardiomiócitos exerce um papel fundamental na regeneração cardíaca de alguns vertebrados, mas a capacidade proliferativa dessas células é limitada no coração adulto de mamíferos.21 Outro potencial mecanismo de renovação celular é a mobilização de progenitores da medula óssea para a área isquêmica e sua diferenciação em cardiomiócitos funcionais.9 Contudo, a mobilização e o homing desses progenitores também são insuficientes para induzir regeneração significativa. O miocárdio também alberga uma população de células-tronco cardíacas residentes (CSCs) com o potencial para diferenciar-se em cardiomiócitos.25,26 As CSCs parecem ser responsáveis pelo turnover basal dos cardiomiócitos, mas tal renovação ocorre, provavelmente, em taxas muito reduzidas na ausência de lesão.27

A eficácia desses mecanismos endógenos de reparo tecidual é limitada pelo microambiente hostil do miocárdio infartado, caracterizado por isquemia, inflamação, fibrose e angiogênese inadequada. Esse microambiente deve evitar, por exemplo, a ativação de CSCs. Por outro lado, a inflamação excessiva também evita a mobilização e o homing de progenitores. A formação de tecido fibrótico é necessária para evitar a ruptura muscular após o infarto, mas o alto nível de fibrose representa uma importante barreira física para a regeneração celular do miocárdio.9 Portanto, a mitigação desse ambiente hostil deve contribuir para o reparo cardíaco, principalmente a redução da inflamação, apoptose e fibrose locais bem como o aumento da vascularização nas áreas infartadas e peri-infartadas.

 Fatores de crescimento indutores de mecanismos regenerativos

Angiogênese se refere ao crescimento de vasos sanguíneos a partir de um leito vascular pré-existente. Do ponto de vista clínico, o objetivo é estimular o crescimento de novos vasos em pacientes sob condições caracterizadas por baixa perfusão sanguínea, como as doenças isquêmicas do coração e doenças vasculares periféricas.28

Nesse último aspecto, a identificação de fatores de crescimento indutores do processo angiogênico estimulou o interesse pela utilização dessas proteínas para induzir angiogênese terapêutica.11 No caso do infarto do miocárdio, a terapia angiogênica com fatores de crescimento pode salvar o tecido isquêmico nos estágios iniciais do infarto, suprindo o tecido com novos vasos. Esse processo é essencial para prevenir a insuficiência cardíaca, mantendo o controle da hipertrofia e contratilidade dos cardiomiócitos.29 De fato, a angiogênese é o principal mecanismo reparador induzido por fatores de crescimento e tem sido o mecanismo mais investigado em estudos experimentais e ensaios clínicos para reparar o miocárdio lesionado. A maioria desses estudos dedicou seus esforços ao potencial angiogênico e regenerativo das isoformas do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF)30-33 e do fator de crescimento de fibroblastos (FGFs).31,34-36

A mitigação do dano isquêmico no tecido cardíaco pode ser induzida por fatores antiapoptóticos, os quais exercem efeitos potencialmente cardioprotetores. O fator de crescimento de hepatócito (HGF) foi inicialmente identificado como um mitógeno de hepatócitos, mas com ações quimiotática e antiapoptótica em diferentes tipos celulares.37 Em ratos submetidos à isquemia e reperfusão, a administração intravenosa de HGF reduziu a apoptose em cardiomiócitos e o tamanho do infarto.38 Outros fatores antiapoptóticos com potencial terapêutico na regeneração cardíaca incluem o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB)39 e a proteína timosina β4,40 IL-11,41 IL-33,42 dentre outros.

Mecanismos endógenos mediados por progenitores e células-tronco incluem a mobilização e o homing de progenitores da medula óssea bem como a ativação das CSCs. Essas células podem diferenciar-se em novos cardiomiócitos após o dano isquêmico, mas são numericamente reduzidas ou insuficientemente ativadas para produzir regeneração muscular significativa. Algumas proteínas apresentam o potencial de mobilizar os progenitores da medula óssea para a área da lesão cardíaca ou de ativar as CSCs. Essas propriedades podem ser exploradas terapeuticamente como mecanismos de regeneração ativados por fatores de crescimento ou proteínas recombinantes, como o fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF),43 HGF,44 o fator derivado de células estromais-1 (SDF-1),45 dentre outros.

O paradigma do coração como um órgão completamente diferenciado foi contestado a partir da identificação de mitógenos capazes de induzir cardiomiócitos adultos a entrar em ciclo celular.46,47 Tal processo abre a possibilidade para estimular um novo mecanismo de regeneração no coração infartado, levando à formação de uma população de novos cardiomiócitos capazes de substituir a massa celular perdida em função do dano isquêmico. Três fatores extracelulares foram identificados por sua capacidade de ativar receptores envolvidos na proliferação de cardiomiócitos: o fator de crescimento de fibroblastos ácido (FGF-1),48 neuroregulina-1 (NRG-1)47 e periostina.49 O tratamento de ratos infartados com FGF-1 associado a um inibidor da proteína quinase ativadora mitogênica (MAPK) p38 resultou em aumento da mitose de cardiomiócitos e melhora na função cardíaca dos animais.50 Estudos demonstraram a melhora da função cardíaca em camundongos infartados tratados com injeções diárias de NRG-1.47,51 A Tabela 1 resume os mecanismos de regeneração cardíaca induzidos por fatores de crescimento.

Principais fatores de crescimento indutores de mecanismos de regeneração cardíaca
Fator Mecanismos Referência
VEGF Angiogênese 30-33
FGF Angiogênese 31,34-36
HGF Antiapoptose 37,38,44
Quimiotaxia sobre CSCs
SDF-1 Mobilização e homing de células-tronco hematopoiéticas 45
IGF-1 Viabilidade e diferenciação de células-tronco e progenitores 52
PDGF Antiapoptose 39
G-CSF Antiapoptose 43
Mobilização e homing de células-tronco hematopoiéticas
Intermedina Angiogênese 53
Angiopoietina Angiogênese, remodelamento e estabilização vascular 54
Periostina Proliferação de cardiomiócitos 49
Neuroregulina-1 Proliferação de cardiomiócitos 47
Eritropoietina Antiapoptose 55

VEGF: Fator de Crescimento do Endotélio Vascular; FGF: fator de crescimento de fibroblasto; HGF: fator de crescimento de hepatócito; SDF-1: fator derivado de células estromais-1; IGF-1: Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1; PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas; G-CSF: fator estimulante de colônias de granulócitos.

 Desafios na formulação de fatores de crescimento

Nas últimas duas décadas, a intensa pesquisa sobre os mecanismos de regeneração cardíaca tem resultado em consideráveis avanços na descoberta de alvos terapêuticos relacionados a diversos fatores de crescimento. Essas proteínas têm sido avaliadas em estudos experimentais e ensaios clínicos, os quais demonstraram a segurança e a eficácia potencial desses fatores frente a doenças isquêmicas do coração, particularmente o infarto do miocárdio.11,56 Contudo, um importante desafio para o estabelecimento da terapia proteica em tais enfermidades é o desenvolvimento de tecnologias de formulação capazes de garantir os mecanismos reparadores dessas biomoléculas e torná-las clinicamente viáveis.

Aspectos relacionados à dose, via de administração, estabilidade proteica e biocompatibilidade devem ser considerados. A capacidade das formulações de incorporar múltiplos fatores também representa um aspecto crítico, considerando o caráter multifatorial dos mecanismos envolvidos no reparo do miocárdio após isquemia. Em conjunto, esses aspectos foram previamente revisados e devem guiar o desenvolvimento racional das formulações de fatores de crescimento direcionadas à terapia proteica e/ou celular visando à regeneração cardíaca.11

Sistemas de liberação controlada micro/nanoestruturados apresentam diversas vantagens sobre formulações convencionais que disponibilizam fármacos ou biomoléculas na sua forma livre, geralmente em um veículo aquoso para administração intravenosa. Ao permitir um perfil farmacocinético mais adequado aos efeitos do composto ativo, as micro/nanoformulações facilitam a adesão do paciente ao tratamento, fornecem proteção ao ativo contra degradação enzimática, permitem o direcionamento (targeting) especifico a um órgão ou estrutura alvo e a liberação local e controlada da molécula de interesse. Sistemas poliméricos (hidrogéis, scaffolds, micro/nanopartículas)11,57,58 e lipídicos (lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas)59,60 têm sido utilizados como plataformas de liberação cardíaca de fatores de crescimento, os quais podem ser obtidos a partir de biomateriais naturais (colágeno/gelatina, fibrina, ácido hialurônico, alginato, quitosana, etc.) e sintéticos (poliésteres, polímeros de aminoácidos, derivados de poliacrilamida e outros).11

Poliésteres como o poli ([ácido lático-co-ácido glicílico, PLGA) e a policaprolactona (PCL) são polímeros aprovados para uso em sistemas de liberação de fármacos devido ao seu baixo potencial imunogênico e adequado perfil de biodegradação. Estudos prévios demonstraram a biocompatibilidade de micropartículas de PLGA com o tecido cardíaco e a eficácia dessas partículas como sistemas de liberação do Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF) no tratamento experimental do infarto do miocárdio.58,61 Recentemente, foi demonstrada a eficácia dessas micropartículas como sistemas de liberação cardíaca de FGF-1 e NRG-1, garantindo os efeitos regenerativos desses fatores em um modelo experimental de infarto em ratos.62

Perspectivas

As perspectivas futuras para a utilização de fatores cardioregenerativos estão relacionadas ao advento de novas tecnologias de formulação associadas a materiais inteligentes, biocompatíveis e não-invasivos. Tais avanços devem funcionar como estruturas multifuncionais que combinem funções terapêuticas e de diagnóstico em um único complexo micro/nanoestruturado. Além disso, permitirão o targeting a um alvo específico guiado por ligante na superfície da micro/nanoestrutura. O potencial translacional dessas tecnologias é previsível, considerando a diversidade de mecanismos potenciais de regeneração induzidos por fatores de crescimento, os quais deverão ser explorados com maior interesse clínico tanto como terapia proteica quanto como adjuvante na terapia com células-tronco para a regeneração cardíaca.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pelo CNPq (461865/2014-9).

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.