Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC n8g7rmJwk8cMWVtChT4spMJ S0066-782X2016004200257 10.5935/abc.20160133 Original Articles Prevalence and Phenotypic Expression of Mutations in the MYH7, MYBPC3 and TNNT2 Genes in Families with Hypertrophic Cardiomyopathy in the South of Brazil: A Cross-Sectional Study Mattos Beatriz Piva e 1 Scolari Fernando Luís 2 Torres Marco Antonio Rodrigues 1 Simon Laura 3 Freitas Valéria Centeno de 2 Giugliani Roberto 4 Matte Úrsula 5 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Faculdade de Medicina Serviço de Cardiologia RS Brazil Faculdade de Medicina - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Serviço de Cardiologia - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brazil Universidade Federal do Rio Grande do Sul Hospital de Clínicas de Porto Alegre Serviço de Cardiologia RS Brazil Serviço de Cardiologia - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brazil Hospital de Clínicas de Porto Alegre Centro de Terapia Gênica RS Brazil Centro de Terapia Gênica - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brazil Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Biociências Serviço de Genética Médica RS Brazil Instituto de Biociências - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Serviço de Genética Médica - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brazil Universidade Federal do Rio Grande do Sul Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Biociências Unidade de Análise de Moléculas e Proteínas RS Brazil Instituto de Biociências - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Unidade de Análise de Moléculas e Proteínas - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brazil Universidade Federal do Rio Grande do Sul Mailing Address: Beatriz Piva e Mattos, HCPA - UFRGS - Serviço de Cardiologia. Rua Ramiro Barcelos, 2350, Sala 2060, Rio Branco, Postal Code 90035-903, Porto Alegre, RS - Brazil. E-mail: bpmattos@cardiol.br

Author contributions

Conception and design of the research: Piva e Mattos BP, Scolari FL, Torres MAR, Freitas VC, Giugliani R, Matte U; Acquisition of data: Mattos BP, Scolari FL, Torres MAR, Simon L, Freitas VC, Giugliani R, Matte U; Analysis and interpretation of the data: Mattos BP, Scolari FL, Simon L, Matte U; Statistical analysis and Writing of the manuscript: Mattos BP, Scolari FL; Obtaining financing: Mattos BP; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Mattos BP, Matte U.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 09 2016 107 3 257 265 21 12 2015 21 12 2015 24 05 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Mutations in sarcomeric genes are found in 60-70% of individuals with familial forms of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). However, this estimate refers to northern hemisphere populations. The molecular-genetic profile of HCM has been subject of few investigations in Brazil, particularly in the south of the country.

 Objective:

To investigate mutations in the sarcomeric genes MYH7, MYBPC3 and TNNT2 in a cohort of HCM patients living in the extreme south of Brazil, and to evaluate genotype-phenotype associations.

 Methods:

Direct DNA sequencing of all encoding regions of three sarcomeric genes was conducted in 43 consecutive individuals of ten unrelated families.

 Results:

Mutations for CMH have been found in 25 (58%) patients of seven (70%) of the ten study families. Fourteen (56%) individuals were phenotype-positive. All mutations were missense, four (66%) in MYH7 and two (33%) in MYBPC3. We have not found mutations in the TNNT2 gene. Mutations in MYH7 were identified in 20 (47%) patients of six (60%) families. Two of them had not been previously described. Mutations in MYBPC3 were found in seven (16%) members of two (20%) families. Two (5%) patients showed double heterozygosis for both genes. The mutations affected different domains of encoded proteins and led to variable phenotypic expression. A family history of HCM was identified in all genotype-positive individuals.

 Conclusions:

In this first genetic-molecular analysis carried out in the south of Brazil, we found mutations in the sarcomeric genes MYH7 and MYBPC3 in 58% of individuals. MYH7-related disease was identified in the majority of cases with mutation.

 Keywords: Mutation / genetics Cardiomyopathy, Hypertrophic Epidemiology Sarcomeres Ethnicity and Health Introduction

Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most prevalent genetic cardiovascular disease, affecting one in every 200 individuals.1-3 It is a global disease that occurs in many ethnic groups and in both sexes.3 HCM has an autosomal dominant pattern of inheritance, and incomplete, age- and gene-dependent penetrance.4,5 More than 1,500 causing mutations have been identified, mostly involving 11 genes that encode sarcomeric and Z-disc proteins.4-6 More recently, sarcomere mutations in other cell structures have been detected, although its pathogenicity has not been established.5,6 HCM-causing mutations are usually identified in 60-70% of patients with familial disease, and 30-40% of patients with the sporadic form.2,4,6-10 The involvement of cardiac β-myosin heavy chain (MYH7) and myosin-binding protein C (MYBPC3) encoding genes is observed, respectively, in 25% to 35% of cases seen in the northern hemisphere.4,6,10,11 Troponin T gene (TNNT2) mutations are detected in 5% of patients, and mutations in other genes in a lower frequency (<1%). 5,6

The heterogeneous molecular substrate and variable phenotypic expression, characteristics of HCM, may be influenced by ethnic and geographical factors. However, the genetic profile of HCM has been established based on studies conducted mostly on northern hemisphere populations,7-9,12-30 whereas few similar studies have been carried out in the southern hemisphere.31-34 Compared with other countries, the genetic structure of Brazilian population is defined by a high degree of admixture between European, African and Indian ancestors.35 Based on genetic aspects peculiar to the south of Brazil, characterized by a low degree of admixture among individuals with different ancestry, we have an interest in defining the genetic profile of HCM in this region.36

The aim of this study was to investigate mutations on the sarcomere genes MYH7, MYBPC3 and TNNT2 and genotype-phenotype associations in a cohort of HCM patients in the extreme south of Brazil.

 Methods Selection of patients and clinical evaluation

A cross-sectional study was conducted on a convenience sample of 43 consecutive individuals from 10 unrelated families, registered in the HCM outpatient care setting of a tertiary hospital in the south of Brazil. The first-degree relatives who first volunteered to participate during the recruitment period were enrolled in the study. All participants were from this region of the country.

The phenotype was defined by the identification of asymmetric left ventricular hypertrophy (LVH) in the echocardiogram, expressed by a maximum wall thickness ≥ 15 mm in any segment with a posterior septum/wall ratio ≥ 1.3, in the absence of chamber dilation or other conditions that may indicate similar changes. A maximum left ventricular (LV) wall thickness ≥ 13 mm in the anterior septal was the criterion used for the identification of HCM in the relatives. All subjects underwent cardiovascular assessment by resting electrocardiogram and echocardiogram. Ten patients underwent coronary angiography. The study protocol was approved by the local Ethics Committee, and signed informed consent was obtained from all participants.

 Molecular-Genetic analysis

DNA was extracted from the peripheral blood according to the technique described by Miller et al.37 Amplificatons of all the enconding regions of the sarcomeric genes MYH7 (38 exons), MYBPC3 (33 exons) and TNNT2 (15 exons) was performed by PCR,38 by using oligonucleotides available at htpp://www.cardiogenomics.org. The fragments were purified by Exo-SAP, according to the manufacturer's instructions (USB Corporation, USA), followed by direct sequencing of the fragments using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) and capillary electrophoresis using the ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). The resulting sequences were then compared with the reference sequences MYH7 - NM_000257, NP_000248; MYBPC3 - NM_000256, NP_000247; TNNT2 - NM_000364, NP_000355. The nomenclature for the description of sequence variants was established by following the Human Genome Variation Society recommendations.39 In some cases, analyses of cosegregation of the mutation and clinical data were conducted for pathogenicity definition.

In silico analysis was used to evaluate the effect of an aminoacid substitution based on the conservation of the regions affected, using the PolyPhen2,40 SIFT,41 PROVEAN,42 MutationTaster,43 and MutPred44 bioinformatic tools. The MutPred system was used to formulate hypothesis on structural and functional properties of mutation. Synonymous mutations and substitutions in introns and coding exons, neither reported as polymorphisms (SNPs) nor found on the 1000 Exome Variant Server (EVS) database were also evaluated by in silico analysis to identify potential splice site changes. NetGene245 and Human Splicing Finder46 were used to calculate the consensus values of potential splice sites.

 Statistical analysis

Quantitative data were expressed as mean and standard deviation, and categorical variables as relative and absolute frequencies. The Shapiro-Wilk test was used to test normality of data, and differences between two groups, based on continuous and symmetrical variables were tested by Student's t-test for independent samples. The categorical variables were compared by the chi-square test. Analyses were performed using the SPSS software, version 18.0 (SPSS Inc., Chicago Illinois, USA). Significance level was set at p <0.05.

 Results Clinical and molecular-genetic profile

The study group was composed of 10 consecutive probands from unrelated families and 33 first-degree relatives. All participants were Caucasians. Clinical characteristics of the cohort are presented in Table 1.

Clinical characteristics of a cohort of patients with hypertrophic cardiomyopathy in the south of Brazil, composed of 10 unrelated probands and 33 relatives
Characteristics Probands (n = 10) Relatives (n = 33)
Phenotype-positive (n = 7) Phenotype-negative (n = 26)
Age (years) 53 ± 7 42 ± 20 32 ± 17
Racial group
Caucasians 10 (100%) 7 (100%) 26 (100%)
Female 5 (50%) 4 (57%) 17 (65%)
Family history
HCM 7 (70%) 7 (100%) 15 (58%)
Sudden cardiac death 2 (20%) 4 (57%) 8 (30%)
Age at the onset of disease (years) 44 ± 12 39 ± 20 -
NYHA functional class
I/II 5 (50%) 5 (71%) -
III/IV 5 (50%) 2 (29%) -
Echocardiogram
Left atrial diameter (mm) 46 ± 5 38 ± 8 32 ± 7
LV end-diastolic diameter (mm) 43 ± 5 47 ± 5 45 ± 4
LV end-systolic diameter (mm) 25 ± 3 26 ± 3 25 ± 3
LV maximal parietal thickness (mm) 20 ± 4 20 ± 5 9 ± 7
Ejection fraction % 72 ± 6 74 ± 5 71 ± 5
LV outflow tract obstruction 7 (70%) - -
LV mid-ventricular obstruction 1 (10%) 2 (29%) -
LV outflow gradient (mmHg) 45 ± 33 - -
Treatment
Alcohol septal ablation 3 (30%) - -
Myectomy 1 (10%) - -
Double-chamber pacemaker 4 (40%) - -
Implantable cardioverter defibrillator 2 (20%) 1 (14%) -

Data expressed in mean ± standard deviation; HCM: hypertrophic cardiomyopathy; NYHA: New York Heart Association; LV: left ventricular.

HCM-causing mutations were detected in 25 (58%) subjects, 7 (70%) probands and 18 (54%) relatives, from 7 (70%) out of 10 study families. In the families with known mutations, mutations were detected in 18 (82%) of 22 relatives, but only 7 of them (32%) were classified as phenotype-positive. All phenotype-negative relatives (n=15;45%) were normal at clinical examination. In all 11 mutation carriers, without evidence of LVH by echocardiogram, abnormal electrocardiogram, including pathological Q-waves ≥ 3 mm and/or > 40 ms in two or more leads, except for aVR (n = 10;90%), fascicular block (n = 6;54%), deep S-waves in V2 > 25 mm (n = 3;27%), and negative T-waves > 3 mm (n = 1;1%) were detected.

All mutations identified were missense mutations, four (66%) in the MYH7 gene and two (33%) in MYBPC3. No mutation was detected in TNNT2. Two of the four mutations in MYH7 had not been reported in the literature. Mutations in this gene were identified in 20 (47%) individuals from six (60%) families, including the probands and 14 relatives. Mutations in the MYBPC3 gene were found in seven (16%) individuals from two (20%) families, including the probands and five relatives. In a single family, two individuals (5%) - the proband and a relative - had double heterozygosis with mutations both in the MYH7 and MYBPC3 genes (Figure 1). In three (30%) genotype-negative families, all members were clinically normal, whereas in the seven families in whom mutations were detected, 32% of the individuals were phenotype-positive. Characteristics of the mutations are described in Table 2 and results of pathogenicity analysis in Table 3.

Distribution of mutations in the sarcomeric genes MYH7 and MYBPC3 in a population with hypertrophic cardiomyopathy. Individuals with double heterozygosity were included in this subgroup only.

Mutations in the sarcomeric genes <italic>MYH7</italic> and <italic>MYPC3</italic> in the study population
Gene/Exon Mutation/Domain Change of aminoacid Families Number of patients affected (phenotype +/ phenotype -) Cosegregation Phenotype
MYH7
9 Missense/Head p.lle263Thr IX 1/0 NT Mild, obstructive LVH
21 Missense/ Domain IQ p.Ala797Thr VI 1/1 NT Moderate, obstructive LVH
22 Missense/Neck p.Met877lle V 3/0 Yes Mild to severe LVH, non-obstructive or with outflow tract obstruction, or mid-ventricular obstruction
32 Missense/Rod p.Glu1468Lys IV, VIII, X 6/8* Yes Mild to severe LVH, non-obstructive or with outflow tract obstruction, or mid-ventricular obstruction, late sudden death
MYBPC3
18 Missense/C4 p.Arg495Gln III 3/2 Yes Moderate to massive LVH, non-obstructive form of early onset, premature sudden death
25 Missense/C6 p.Val896Met VIII 1/1** NT Moderate, obstructive LVH

Domain IQ: calmodulin binding domain; NT: not tested; LVH: left ventricular hypertrophy;

associated with p.Val896Met (MYBPC3), n = 2;

associated with p.Glu1468Lys (MYH7), n = 2.

 Analysis of pathogenicity of the mutations in <italic>MYH7</italic> e <italic>MYBPC3</italic> genes
Mutation PolyPhen2 SIFT PROVEAN MutationTaster MutPred
p.lle263Thr Benign Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious
p.Ala797Thr Benign Benign Benign Benign Deleterious
p.Met877Ile Benign Benign Benign Deleterious Benign
p.Glu1468Lys Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious Deleterious
p.Arg495Gln Deleterious Benign Benign Deleterious Deleterious
p.Val896Met Benign Deleterious Benign Benign Deleterious
Mutations in the <italic>MYH7</italic> gene

In the six (60%) families with HCM caused by the MYH7 gene, only 11 (55%) were phenotype-positive, the proband and five relatives. In the phenotype-positive individuals, the maximal wall thickness varied from 13 to 26 mm (mean of 20 ± 4 mm). In MYH7, four mutations were mapped. The substitution p.Ile263Thr was identified in only one family, affecting the proband only. The only relative who underwent genotyping was clinically normal and did not harbor a mutation. The p.Ala797Thr mutation was detected in two members of the same family, the proband and one relative phenotype-negative. This substitution, considered pathogenic exclusively by the MutPred system, has been reported in the 1000 EVS, with an allele frequency of 0.0002 in African-American population. Both mutations were associated with mild to moderate HCM, and with the obstructive forms of the disease. The p.Met877Ile mutation, a mutation not previously described, was detected in three individuals of a four-member family. The mutation was considered a benign condition by four of the five in silico bioinformatic tools used in the study. However, it showed cosegregation with HCM phenotype in HCM patients, indicating a pathogenic effect. The proband had a phenotype of moderate HCM and left ventricular outflow tract obstruction. Severe mid-ventricular obstruction was identified in one family member and mild LVH was detected in another. None of these three mutations were related with a family history of sudden death. The p.Glu1468Lys mutation, identified in three families, had not been previously reported in the literature or in the EVS and SNP databases. Nevertheless, all bioinformatic tools favored its pathogenic potential. Analysis of cosegregation showed that all family members affected were also carriers of mutations, except for one, who was considered normal. In one of the families, although the mutation was identified in the proband and in six of seven members evaluated, only three of them were phenotype-positive. The proband and one of the family members had non-obstructive, moderate HCM. Mid-ventricular obstruction was identified in another family member, who died suddenly at the age of 66 during the study period. In another family with this mutation, the proband and four relatives had this genotype, although only two were phenotype-positive. Two individuals, one proband and one young, phenotype-negative relative, showed a double heterozygosis with mutations both in MYH7 and MYBPC3. The proband had moderate LVH and severe left ventricular outflow tract obstruction, whereas the relative with isolated mutation in MYH7 had mild, non-obstructive form of the disease. In the third family affected, the proband and one young, phenotype-negative relative were carriers of this mutation, which associated with moderate LVH and severe left ventricular outflow tract obstruction.

 Mutations in the <italic>MYBPC3</italic> gene

In the two (20%) families with mutations in the MYBPC3 gene, four (57%) of the carriers were phenotype-positive, the proband and two relatives. The mutations led to LVH with marked inter- and intrafamilial variability, expressed by a maximal wall thickness of LV varying from 17 to 34 mm, and mean of 23 ± 7 mm. The mutation p.Arg495Gln was identified in one family, in the proband and in four of the five members who underwent genotyping, two of them phenotype-positive. The analysis of cosegregation in this family and three in silico bioinformatic tools favored the pathogenic role of this mutation in HCM. The mutation was related to early onset and to non-obstructive forms with mild to massive LVH associated with a family history of premature sudden death. The mutation p.Val896Met was found in two subjects of a six-member family, who were also carriers of the mutation p.Glu1468Lys in the MYH7 gene. Two programs indicated the pathogenic effect of this variant, which was also reported in the EVS, with an allele frequency of 0.0015 and 0.0048 in African- and European-origin individuals respectively.

The comparison of clinical variables between genotype-positive and genotype-negative subjects revealed that a family history of HCM and/or sudden death was more frequent in those in whom a mutation was identified (Table 4). Clinical indicators were not significantly different between carriers of mutations of the two genes, except for a lower age and a family history of sudden death, which associated with HCM caused by MYBPC3 (Table 5).

Comparison of clinical characteristics between genotype-positive and genotype-negative subjects
Characteristics Genotype-positive (n = 25) Genotype-negative (n = 18) p
Age (years) 41 ± 19 35 ± 17 0.3
Gender
Male 13 (52%) 4 (22%) 0.08
Female 12 (48%) 14 (78%)
Family history
HCM 25 (100%) 4 (22%) 0.0001
Cardiac sudden death 12 (48%) 2 (11%) 0.019

Data expressed in mean ± standard deviation; HCM: hypertrophic cardiomyopathy.

 Comparison of clinical characteristics of carriers of mutations in the <italic>MYH7</italic> and <italic>MYBPC3</italic> gene
MYH7(n = 20) MYBPC3(n = 7) p
Age (years) 48 ± 19 32 ± 16 0.102
Age at the onset of disease (years) 47 ± 13 25 ± 13 0.0001
Gender
Male 13 (65%) 5 (71%) 0.127
Female 7 (35%) 2 (29%)
Family history
HCM 20 (100%) 7 (100%) -
Sudden death 7 (35%) 5 (71%) 0.016
NYHA functional class
I/II 15 (75%) 6 (86%) 0.246
III/IV 5 (25%) 1 (14%)
Left atrial diameter (mm) 40 ± 6 33 ± 7 0.082
LV diastolic diameter (mm) 45 ± 5 40 ± 4 0.06
LV systolic diameter (mm) 26 ± 4 24 ± 2 0.195
LV maximal parietal thickness (mm) 15 ± 6 19 ± 10 0.274
Ejection fraction (%) 67 ± 19 70 ± 3 0.497
LV outflow tract obstruction 6 (30%) 1 (14%) 0.133

Data expressed in mean ± standard deviation; HCM: hypertrophic cardiomyopathy; NYHA: New York Heart Association; LV: left ventricular.

 Discussion

The present study represents the first genetic-molecular analysis of HCM conducted on a population from the extreme south of Brazil, composed of members of unrelated families. A sample of consecutive index-patients and their respective relatives, considered representative of a cohort of non-referred HCM outpatients was studied. Causing mutations were detected in 58% of subjects and 70% of the families. Mutations in MYH7, identified in 47% of patients, were more frequent than mutations in MYBPC3, found in 16% of patients. Most mutations were private. Two mutations in the MYH7 gene were considered novel. A positive genetic test in the proband enabled the molecular identification of the disease in up to 82% of the respective relatives, 39% of them phenotype-positive. All mutation carriers without evidence of HCM in the echocardiogram had evidence of abnormal electrocardiogram findings, especially pathological Q-waves, which may suggest a pre-clinical stage of disease.47

HCM is considered a worldwide disease, affecting different populations exposed to a large variety of environmental and geographic factors. Although the phenotypic expression of HCM does not show evidence of differences between the northern and southern hemisphere populations, it is still not clear whether they share the same genetic substrate. Molecular analysis of HCM patients from multiple geographic regions and ethnic groups would certainly contribute to the understanding of the complex characteristics of this condition. The genetic profile of HCM was defined based on investigations on unrelated populations in Europe and North America.7-9,12-24 More recently, the genetic-molecular analysis has been extended to cohorts in Asia,25,26,28,30 North Africa and Australia.32 On the other hand, data from populations from the south hemisphere are still scarce.31-34 In our country, molecular characteristics of HCM have been determined in patients from the southeast, north and northeast regions.34 The incorporation of more resolutive genetic tests to clinical practice would certainly expand their use in all continents.

In the present analysis, causing mutations were more frequent as compared with previous studies that included familial and sporadic HCM.8,9,18,19,22-27 This may be explained by the fact that our study group was composed of a well-characterized sample of individuals with HCM, even though it is known that the identification of mutations varies according with the study populations.10 All mutations detected in MYH7 and MYBPC3 were missense mutations. No mutation was found in the TNNT2 gene, which may be explained by the lower prevalence of the gene in general population and the relatively older age of our sample, since the TNNT2 gene is associated with an early onset and premature sudden death.4,6,13 In contrast to previous studies conducted on northern hemisphere populations,7,8,11,22,23,27,48 mutations in MYH7 were more frequent than in MYBPC3. This characteristic was described in HCM patients from other regions in Brazil, and may represent a particularity of the disease in our country.34

Mutations in MYH7 were found in 47% of patients that underwent genotyping and in 60% of the families. The screening of all coding regions of this gene identified the presence of four missense mutations in different protein domains. The mutation p.Ile263Thr has been previously reported in France,7,22 Portugal,23 and more recently, in other regions in Brazil.34 The mutation p.Ala797Thr has been previously reported in South Africa, with a possible founder effect, and in other cohorts in North America,8 North Africa,27 Europe9,23,24 Europe, as well as in Brazil.34 The mutation p.Met877Ile, novel, was mapped in one family with high degree of penetrance, affecting three of the four genotyped members of two generations. The mutation was associated with low to severe LVH, mid-ventricular and left ventricular outflow tract obstruction, and non-obstructive condition. The p.Glu1468Lys mutation, also considered novel, was identified in three unrelated families. Inter- and intrafamilial phenotypic variability was observed in obstructive and non-obstructive HCM, with mild to moderate LVH. This mutation was also related to mid-ventricular obstruction associated with late sudden death in one family member.

Missense mutations in the MYBPC3 gene were found in 16% of patients and 20% of the families. The p.Arg495Gln mutation has been previously described in North America,20 Portugal,23 and reported as a frequent mutation in a cohort of HCM patients in Brazil.34 In this study, the mutation was identified in a family with history of premature sudden death and mild to massive LVH. The mutation p.Val896Met has been previously detected in European7,23 and South African31 cohorts. Two carriers of this mutation, a proband with moderate LVH and severe left ventricular outflow tract obstruction and a phenotype-negative young relative, also had the p.Glu1468Lys mutation in MYH7. This phenotype-negative individual showed pathological Q-waves in resting electrocardiogram. Double or compound heterozygosity have been usually identified in families with mutations in MYBPC3, representing 3-5% of HCM patients.7,20 Multiple mutations are commonly related to severe phenotypes and early onset disease, although varied degrees of LVH have been reported in these individuals.34

All mutations in the MYH7 e MYBPC3 genes showed marked intra- and interfamilial phenotypic variability, related to the degree of LVH. Phenotypic variability in carriers of the same mutation is considered a characteristic of HCM.10 The patterns of LVH and the age of disease onset may differ even between related subjects, since the phenotype is determined not only by the mutation per se, but also by the interaction of polymorphisms, modifying genes, and epigenetic and environmental factors.6,10 The meta-analysis of the genotype-phenotype associations in HCM showed that, due to the fact that many mutations are exclusive of a unique family, the studies conducted so far have not exhibited sufficient statistical power to reach definite conclusions.48 Nevertheless, some clinical variables may be related to the genotype, such as age, maximal wall thickness of LV and family history of HCM or sudden death. In our study group, there was a predominance of a family history of sudden death and the onset of the disease at an early age in carriers of mutation in the MYBPC3 gene. These characteristics are different from those previously reported, but may represent a particularity of our group.

In 30% of the families, no causing mutation was identified and, in all these cases, there was no clinical history of HCM. The presence of a negative genetic test may result from the presence of mutations in unknown or unsequenced genes. LVH does not constitute a specific phenotype and may be identified in other heart conditions, seen as phenocopies of HCM. The detection of mutations in HCM-related sarcomeric genes has been associated with a family history or early onset of the disease, unfavorable prognosis and higher degree of LVH compared with patients with negative genetic tests.9,25,27 Recent data have indicated that this association occurs independently of the gene involved, although further studies to confirm this observation are still needed.2 In our study, a family history of HCM or sudden death was more frequent in genotype-positive individuals than in genotype-negative ones.

In this study, HCM causing mutations were identified in a considerable number of patients. However, the genetic profile of our population was not essentially different from that reported in cohorts of different ethnicities from other geographic regions, except for the fact that mutations in the MYH7 gene were more frequent than in MYBPC3.

Limitations of the study

The study consisted of the screening of the three most prevalent genes in HCM, but it did not include other genes of lower prevalence. Nevertheless, the analysis was restricted to a sample of unrelated families, registered in a unique tertiary care center located in the south of Brazil.

 Conclusions

In this first molecular-genetic analysis of a HCM cohort in the extreme south of Brazil, mutations were identified in 58% of consecutive individuals of unrelated families. The mutations affected predominantly the MYH7 gene; this finding is different from that reported in northern hemisphere countries. Our study supports that mutations in MYH7 and MYBPC3 should be the first focus of molecular-genetic analysis in HCM, and that mutations in TNNT2 have a low prevalence in Brazilian population. All mutations detected were missense mutations, whereas two mutations in MYH7 had not been described before. The mutations affected different domains of the encoded proteins and determined variable phenotypic expressions. There was a relationship between a positive genetic test and a family history of HCM or sudden death. The predominance of mutations in the MYH7 gene may be a characteristic of the local population.

Sources of Funding

This study was funded by Fundo de Incentivo à Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

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Lopes LR Rahman MS Elliott PM A systematic review and meta-analysis of genotype-phenotype associations in patients with hypertrophic cardiomyopathy caused by sarcomeric protein mutations Heart 2013 99 24 1800 1811 Artigos Originais Prevalência e Expressão Fenotípica das Mutações nos Genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2 em Famílias com Cardiomiopatia Hipertrófica no Sul do Brasil: Um Estudo Transversal Mattos Beatriz Piva e 1 Scolari Fernando Luís 2 Torres Marco Antonio Rodrigues 1 Simon Laura 3 Freitas Valéria Centeno de 2 Giugliani Roberto 4 Matte Úrsula 5 Faculdade de Medicina - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Serviço de Cardiologia - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brasil Serviço de Cardiologia - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brasil Centro de Terapia Gênica - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brasil Instituto de Biociências - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Serviço de Genética Médica - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brasil Instituto de Biociências - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Unidade de Análise de Moléculas e Proteínas - Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS - Brasil Correspondência: Beatriz Piva e Mattos, HCPA - UFRGS - Serviço de Cardiologia. Rua Ramiro Barcelos, 2350, Sala 2060, Rio Branco. CEP 90035-903, Porto Alegre, RS - Brasil. E-mail: bpmattos@cardiol.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Mattos BP, Scolari FL, Torres MAR, Freitas VC, Giugliani R, Matte U; Obtenção de dados: Mattos BP, Scolari FL, Torres MAR, Simon L, Freitas VC, Giugliani R, Matte U; Análise e interpretação dos dados: Mattos BP, Scolari FL, Simon L, Matte U; Análise estatística e Redação do manuscrito: Mattos BP, Scolari FL; Obtenção de financiamento: Mattos BP; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Mattos BP, Matte U.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Mutações em genes do sarcômero são encontradas em 60-70% dos indivíduos com formas familiares de cardiomiopatia hipertrófica. (CMH). Entretanto, essa estimativa refere-se a populações de países do hemisfério norte. O perfil genético-molecular da CMH foi tema de poucos estudos no Brasil, particularmente na região sul do país.

 Objetivo:

Realizar a pesquisa de mutações dos genes sarcoméricos MYH7, MYBPC3 e TNNT2 numa coorte de CMH estabelecida no extremo sul do Brasil, assim como avaliar as associações genótipo-fenótipo.

 Métodos:

Sequenciamento direto do DNA de todas as regiões codificantes dos três genes sarcoméricos foi realizada em 43 indivíduos consecutivos de dez famílias não-relacionadas.

 Resultados:

Mutações para CMH foram encontradas em 25 (58%) indivíduos de sete (70%) das dez famílias estudadas, sendo 14 (56%) deles fenótipo-positivos. Todas as mutações eram missense, quatro (66%) no gene MYH7 e duas (33%) no gene MYBPC3. Não foram encontradas mutações no gene TNNT2. Mutações em MYH7 foram identificadas em 20 (47%) indivíduos de seis (60%) famílias. Duas delas não haviam sido previamente relatadas. Mutações de MYBPC3 foram detectadas em sete (16%) membros de duas (20%) famílias. Dois (5%) indivíduos apresentaram dupla heterozigose com mutações em ambos os genes. As mutações acometeram distintos domínios das proteínas codificadas e produziram expressão fenotípica variável. História familiar de CMH foi identificada em todos os indivíduos genótipo-positivos.

 Conclusões:

Nessa primeira análise genético-molecular da CMH realizada no sul do Brasil, foram encontradas mutações nos genes sarcoméricos MYH7 e MYBPC3 em 58% dos indivíduos. Doença relacionada ao gene MYH7 foi identificada na maioria dos casos com mutação.

 Palavras-chave: Mutação / genética Cardiomiopatia Hipertrófica Epidemiologia Sarcômeros Etnia e Saúde Introdução

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é a doença cardiovascular de origem genética mais prevalente, acometendo um em cada 200 indivíduos.1-3 Apresenta distribuição geográfica universal, incidindo em diversos grupos étnicos, sem distinção de gênero.3 É transmitida predominantemente por herança autossômica dominante com penetrância incompleta, idade e gene-dependentes.4,5 Na atualidade, já foram descritas mais de 1500 mutações causadoras que, em sua maioria, envolvem 11 genes codificantes de proteínas do sarcômero e de discos Z.4-6 Mais recentemente, foram identificadas mutações em proteínas de outras estruturas celulares relacionadas ao sarcômero, cuja patogenicidade ainda não foi comprovada.5,6 Mutações causadoras costumam ser identificadas em 60-70% dos pacientes com formas familiares e em 30-40% dos casos esporádicos.2,4,6-10 O acometimento dos genes codificantes da cadeia pesada da β-miosina cardíaca (MYH7) e da proteína C de ligação à miosina (MYBPC3) é evidenciado em, respectivamente, 25% a 35% dos casos avaliados no hemisfério norte.4,6,10,11 O gene da troponina T (TNNT2) seria responsável por 5% dos pacientes, sendo que aos demais, atribui-se reduzida frequência individual, < 1%.5,6

O substrato molecular heterogêneo e a expressão fenotípica variável, características da CMH, podem ser influenciados por fatores étnicos e geográficos. Todavia, o perfil genético da doença foi definido com base em estudos desenvolvidos predominantemente em populações do hemisfério norte,7-9,12-30 enquanto que, no hemisfério sul, análises semelhantes são em número ainda restrito.31-34 A população urbana brasileira, em relação à de outros países, apresenta estrutura genética definida por alto grau de miscigenação entre ancestrais europeus, africanos e indígenas.35 Características étnicas próprias do sul do Brasil, expressas por reduzido grau de miscigenação entre indivíduos de ancestralidade diversa, justificam nosso interesse em definir o perfil genético da CMH nessa região.36

O objetivo deste estudo é realizar a pesquisa de mutações nos genes sarcoméricos MYH7, MYBPC3 e TNNT2 e avaliar as associações genótipo-fenótipo numa coorte de CMH estabelecida no extremo sul do Brasil.

 Métodos Seleção de pacientes e avaliação clínica

Foi realizado um estudo transversal em uma amostra de conveniência de 43 indivíduos consecutivos, pertencentes a 10 famílias não-relacionadas, registrados no Ambulatório de CHM de um hospital terciário no sul do Brasil. Os familiares em primeiro grau incluídos no estudo correspondem àqueles que primeiro se apresentaram para avaliação no período de recrutamento. Todos os indivíduos integrantes desta análise eram originários desta região do país.

O fenótipo foi definido pela identificação ao ecocardiograma de hipertrofia ventricular esquerda (HVE) assimétrica, expressa por espessura parietal máxima ≥ 15 mm em qualquer segmento com razão septo/parede posterior ≥ 1,3 na ausência de dilatação da câmara e outras condições capazes de determinar alterações semelhantes. Na avaliação dos familiares, o critério adotado para identificação da doença foi de espessura parietal máxima do ventrículo esquerdo (VE) ≥ 13 mm no septo anterior ou parede posterior. Todos os indivíduos foram submetidos à avaliação cardiovascular incluindo eletrocardiograma convencional em repouso e ecocardiograma. Dez pacientes foram submetidos à cineangiocoronariografia. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Instituição, e todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

 Análise genético-molecular

A extração de DNA do sangue periférico foi realizada de acordo com a técnica descrita por Miller et al.37 A amplificação de todas as regiões codificantes dos genes sarcoméricos MYH7 (38 exons), MYBPC3 (33 exons) e TNNT2 (15 exons) foi realizada por PCR.38 Os fragmentos foram purificados por meio de Exo-SAP, de acordo com instruções do fabricante (USB Corporation, USA), seguido de sequenciamento direto com BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) e eletroforese capilar analisada por meio de ABI3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). As sequências obtidas foram comparadas às consideradas de referência: MYH7 - NM_000257, NP_000248; MYBPC3 - NM_000256, NP_000247; TNNT2 - NM_000364, NP_000355. A nomenclatura para a descrição das variações de sequências seguiu a recomendação do Human Genome Variation Society.39 Em alguns casos, a análise de cosegregação da mutação e dos dados clínicos foi efetuada para definição da patogenicidade.

A análise in silico foi aplicada para avaliar o efeito da substituição de um aminoácido da proteína com base na conservação das regiões afetadas por meio dos seguintes sistemas computacionais: PolyPhen2,40 SIFT,41 PROVEAN,42 MutationTaster43 e MutPred.44 O sistema MutPred foi utilizado como gerador de hipótese sobre as propriedades estruturais e funcionais da mutação. Mutações sinônimas e substituições intrônicas em exons codificantes, não relatados como polimorfismos (SNPs) ou encontrados no 1000 Exome Variant Server (EVS) database, foram também submetidas à análise in silico para identificação de possível alteração do tipo splice site. NetGene245e Human Splicing Finder46 foram adotados para cálculo dos valores de consenso de potenciais sítios de splice.

 Análise estatística

Os dados quantitativos foram expressos por média e desvio-padrão, e as variáveis categóricas por frequências relativas e absolutas. A normalidade dos dados foi analisada pelo teste de Shapiro-Wilk, e a diferença entre dois grupos baseada em variáveis contínuas e simétricas pelo teste t de Student para amostras independentes. Variáveis categóricas foram comparadas por meio do teste qui-quadrado. Os dados foram processados utilizando o software SPSS, versão 18.0 (SPSS Inc., Chicago Illinois, USA). O nível de significância estatística adotado foi de p <0,05.

 Resultados Perfil clínico e genético-molecular

A população estudada foi constituída por 10 probandos consecutivos de famílias não-relacionadas e 33 familiares em primeiro grau. Todos eram caucasianos. As características clínicas da coorte estão apresentadas na tabela 1.

Características clínicas de uma coorte de cardiomiopatia hipertrófica no sul do Brasil constituída por 10 probandos não-relacionados e 33 familiares
Características Probandos (n = 10) Familiares (n = 33)
Fenótipo-positivo(n = 7) Fenótipo-negativo(n = 26)
Idade (anos) 53 ± 7 42 ± 20 32 ± 17
Grupo racial
Caucasianos 10 (100%) 7 (100%) 26 (100%)
Gênero feminino 5 (50%) 4 (57%) 17 (65%)
História familiar
CMH 7 (70%) 7 (100%) 15 (58%)
Morte súbita cardíaca 2 (20%) 4 (57%) 8 (30%)
Idade de início da doença (anos) 44 ± 12 39 ± 20 -
Classe funcional NYHA
I/II 5 (50%) 5 (71%) -
III/IV 5 (50%) 2 (29%) -
Ecocardiograma
Diâmetro do átrio esquerdo (mm) 46 ± 5 38 ± 8 32 ± 7
Diâmetro diastólico final do VE (mm) 43 ± 5 47 ± 5 45 ± 4
Diâmetro sistólico final do VE (mm) 25 ± 3 26 ± 3 25 ± 3
Espessura parietal máxima do VE (mm) 20 ± 4 20 ± 5 9 ± 7
Fração de ejeção % 72 ± 6 74 ± 5 71 ± 5
Obstrução da via-de-saída do VE 7 (70%) - -
Obstrução médio-ventricular esquerda 1 (10%) 2 (29%) -
Gradiente na via-de-saída do VE (mmHg) 45 ± 33 - -
Tratamento
Ablação alcoólica do septo 3 (30%) - -
Miectomia 1 (10%) - -
Marca-passo de dupla-câmara 4 (40%) - -
Cardiodesfibrilador automático implantável 2 (20%) 1 (14%) -

Dados apresentados como média ± desvio padrão. CMH: cardiomiopatia hipertrófica; NYHA: New York Heart Association; VE: ventrículo esquerdo.

Mutações causadoras foram encontradas em 25 indivíduos (58%), compreendendo sete (70%) probandos e 18 (54%) familiares, pertencentes a sete (70%) das dez famílias avaliadas. Nas famílias com mutação conhecida, 18 (82%) dos 22 familiares examinados apresentavam mutação, mas somente sete (32%) eram fenótipo-positivos. Todos os familiares genótipo-negativos (n = 15;45%) apresentavam-se normais à avaliação clínica. Em todos os 11 (33%) carreadores de mutação sem evidências de HVE ao ecocardiograma, foram identificadas anomalias eletrocardiográficas incluindo ondas Q patológicas ≥ 3 mm e/ou > 40 ms em duas ou mais derivações, com exceção de aVR (n = 10;90%), bloqueios fasciculares (n = 6; 54%), ondas S profundas em V2 > 25 mm (n = 3;27%) e ondas T negativas > 3 mm (n = 1;1%).

Todas as mutações encontradas eram missense, quatro (66%) no gene MYH7 e duas (33%) em MYBPC3. Não foram identificadas mutações em TNNT2. Duas das mutações do gene MYH7 não haviam sido previamente relatadas na literatura. Mutações desse gene foram identificadas em 20 (47%) indivíduos de seis (60%) famílias, afetando os probandos e 14 familiares. As mutações do gene MYBPC3 foram detectadas em sete (16%) indivíduos de duas (20%) famílias, acometendo os probandos e cinco familiares. Em uma única família, dois (5%) membros, o probando e um familiar, apresentaram dupla heterozigose com mutações simultaneamente nos genes MYH7 e MYBPC3 (Figura 1). Nas três (30%) famílias genótipo-negativas, todos familiares eram clinicamente normais, enquanto que, nas sete famílias com mutação, 32% dos familiares avaliados eram fenótipo-positivos. As características das mutações encontram-se descritas na tabela 2 e a análise de patogenicidade na tabela 3.

Distribuição das mutações dos genes sarcoméricos MYH7 e MYBPC3 numa população com cardiomiopatia hipertrófica. Indivíduos com dupla heterozigose foram incluídos exclusivamente neste subgrupo.

Mutações dos genes sarcoméricos <italic>MYH7</italic> e <italic>MYPC3</italic> na população em estudo
Gene/Exon Mutação/Domínio Alteração do aminoácido Famílias No. de indivíduos afetados fenótipo + / fenótipo – Cosegregação Fenótipo
MYH7
9 Missense/Cabeça p.lle263Thr IX 1/0 NT HVE leve, forma obstrutiva
21 Missense/Domínio IQ p.Ala797Thr VI 1/1 NT HVE moderada, forma obstrutiva
22 Missense/Pescoço p.Met877lle V 3/0 Sim HVE leve à grave, formas não-obstrutivas ou com obstrução de via-de-saída ou médio- ventricular
32 Missense/Haste p.Glu1468Lys IV, VIII, X 6/8* Sim HVE leve à moderada, formas não-obstrutivas ou com obstrução de via-de-saída ou médio-ventricular, morte súbita tardia
MYBPC3
18 Missense/C4 p.Arg495Gln III 3/2 Sim HVE moderada à maciça, formas não-obstrutivas de início precoce, morte súbita prematura
25 Missense/C6 p.Val896Met VIII 1/1** NT HVE moderada, formas obstrutivas

Domínio IQ: domínio de ligação à calmodulina; NT: não testado; HVE: hipertrofia ventricular esquerda;

associada à p.Val896Met (MYBPC3), n = 2;

associada à p.Glu1468Lys (MYH7), n = 2.

 Análise da patogenicidade das mutações em <italic>MYH7</italic> e <italic>MYBPC3</italic>
Mutação PolyPhen2 SIFT PROVEAN MutationTaster MutPred
p.lle263Thr Benigno Deletério Deletério Deletério Deletério
p.Ala797Thr Benigno Benigno Benigno Benigno Deletério
p.Met877lle Benigno Benigno Benigno Deletério Benigno
p.Glu1468Lys Deletério Deletério Deletério Deletério Deletério
p.Arg495Gln Deletério Benigno Benigno Deletério Deletério
p.Val896Met Benigno Deletério Benigno Benigno Deletério
Mutações do gene <italic>MYH7</italic>

Nas seis (60%) famílias com doença causada pelo gene MYH7, somente 11 (55%) eram fenótipo-positivos, o probando e cinco familiares. Nos indivíduos fenótipo-positivos, a espessura parietal máxima do VE apresentou variação de 13 a 26 mm, média de 20 ± 4 mm. Nesse gene, foram mapeadas quatro mutações. A substituição p.Ile263Thr foi identificada em apenas uma família, afetando exclusivamente o probando. O único familiar submetido à genotipagem era clinicamente normal e não exibia mutação. A mutação p.Ala797Thr foi detectada somente em dois indivíduos de uma família, no probando e em um familiar, fenótipo-negativo. Essa substituição, considerada patogênica apenas pelo sistema MutPred, foi relatada no 1000 EVS com a frequência alélica de 0,0002 na população afro-americana. Ambas as mutações associaram-se à HVE de grau leve ou moderado e às formas obstrutivas. A mutação p.Met877Ile, não descrita previamente, foi identificada em três indivíduos de uma família de quatro membros. A mutação foi considerada como uma alteração benigna por quatro dos cinco sistemas computacionais consultados. Entretanto, mostrou cosegregação com o fenótipo da CMH nos indivíduos com a doença, o que sugere seu efeito patogênico. O probando apresentava fenótipo moderado com obstrução de via-de-saída do VE. Obstrução médio-ventricular grave foi evidenciada em um dos membros da família e HVE leve em outro. Nenhuma dessas três mutações relacionou-se à história familiar de morte súbita. A mutação p.Glu1468Lys, identificada em três famílias, não apresentava registro prévio na literatura ou nas bases de dados EVS e SNP. No entanto, todos os programas consultados favoreceram seu potencial patogênico. A análise de cosegregação demonstrou que todos os membros das famílias afetadas com exceção de um, considerado normal, eram carreadores da mutação. Em uma das famílias, a mutação foi encontrada no probando e em seis dos sete familiares avaliados, mas somente três eram fenótipo-positivos. O probando e um dos familiares apresentavam formas não-obstrutivas com HVE moderada. Obstrução médio-ventricular foi identificada em outro membro desta família, posteriormente acometido por morte súbita aos 66 anos durante o período de seguimento. Em outra família com essa mutação, o probando e os quatro familiares examinados apresentavam o genótipo, mas apenas dois eram fenótipo-positivos. Dois membros, o probando e um familiar jovem fenótipo-negativo, exibiam dupla heterozigose com mutação nos genes MYH7 e MYBPC3. O probando evidenciava HVE moderada e obstrução grave da via-de-saída, enquanto que o familiar com mutação isolada de MYH7, demonstrava forma leve não-obstrutiva. Na terceira família acometida, o probando e um familiar jovem fenótipo-negativo eram carreadores dessa mutação, a qual se associou à HVE moderada e obstrução grave da via-de-saída do VE.

 Mutações do gene <italic>MYBPC3</italic>

Nas duas (20%) famílias com mutações do gene MYBPC3, quatro (57%) dos carreadores eram fenótipo-positivos, os probandos e dois familiares. As mutações determinaram HVE com marcada variação inter- e intrafamiliar, expressa por espessura parietal máxima do VE de 17 a 34 mm, média 23 ± 7 mm. A mutação p.Arg495Gln foi identificada em uma família, no probando e em quatro dos cinco membros submetidos à genotipagem, dois dos quais eram fenótipo-positivos. A análise de cosegregação nessa família e três sistemas computacionais favoreceram o seu papel patogênico na CMH. A mutação relacionou-se à HVE de moderada à maciça, em formas não-obstrutivas de início precoce, associadas à história familiar de morte súbita prematura. A mutação p.Val896Met foi encontrada em dois indivíduos de uma família de seis membros, os quais eram também carreadores da mutação p.Glu1468Lys no gene MYH7. Dois programas distinguem o caráter patogênico desta variante, relatada no EVS com uma frequência alélica de 0,0015 e 0,0048 em indivíduos de origem africana e europeia, respectivamente.

A comparação de variáveis clínicas entre os indivíduos genótipo-positivos e genótipo-negativos demonstrou que história familiar de CMH e/ou morte súbita foi mais frequente naqueles com mutação identificada (Tabela 4). Indicadores clínicos não diferiram significativamente entre os carreadores de mutações dos dois genes, exceção feita à menor idade de apresentação e história familiar de morte súbita, que se associaram à doença causada por MYBPC3 (Tabela 5).

Comparação de características clínicas entre indivíduos genótipo-positivos e genótipo-negativos
Características Genótipo-positivo (n = 25) Genótipo-negativo (n = 18) p
Idade (anos) 41 ± 19 35 ± 17 0,3
Gênero
Masculino 13 (52%) 4 (22%) 0,08
Feminino 12 (48%) 14 (78%)
História familiar
CMH 25 (100%) 4 (22%) 0,0001
Morte súbita cardíaca 12 (48%) 2 (11%) 0,019

Dados apresentados por média ± desvio padrão. CMH: cardiomiopatia hipertrófica.

 Comparação de características clínicas entre carreadores de mutações nos genes <italic>MYH7</italic> e <italic>MYBPC3</italic>
MYH7(n = 20) MYBPC3 (n = 7) p
Idade (anos) 48 ± 19 32 ± 16 0,102
Idade de apresentação (anos) 47 ± 13 25 ± 13 0,0001
Gênero
Masculino 13 (65%) 5 (71%) 0,127
Feminino 7 (35%) 2 (29%)
História familiar
CMH 20 (100%) 7 (100%) -
Morte súbita 7 (35%) 5 (71%) 0,016
Classe funcional NYHA
I/II 15 (75%) 6 (86%) 0,246
III/IV 5 (25%) 1 (14%)
Diâmetro do átrio esquerdo (mm) 40 ± 6 33 ± 7 0,082
Diâmetro diastólico do VE (mm) 45 ± 5 40 ± 4 0,06
Diâmetro sistólico do VE (mm) 26 ± 4 24 ± 2 0,195
Espessura parietal máxima do VE (mm) 15 ± 6 19 ± 10 0,274
Fração de ejeção (%) 67 ± 19 70 ± 3 0,497
Obstrução na via-de-saída do VE 6 (30%) 1 (14%) 0,133

Dados apresentados por média ± desvio padrão; CMH: cardiomiopatia hipertrófica; VE: ventrículo esquerdo; NYHA: New York Heart Association.

 Discussão

O presente estudo representa a primeira análise genético-molecular da CMH realizada em população do extremo sul do Brasil, a qual compreendeu a avaliação de membros de famílias não-relacionadas. Foi estudada uma amostra de pacientes-índices consecutivos e seus respectivos familiares, considerados como representativos de uma coorte ambulatorial não-referenciada de CMH. Mutações causadoras foram detectadas em 58% dos indivíduos e em 70% das famílias. As mutações do gene MYH7, identificadas em 47% dos indivíduos, foram predominantes em relação àquelas do gene MYBPC3, presentes em apenas 16% dos casos. A maioria dessas mutações demonstrou serem privativas de uma única família. Duas mutações do gene MYH7 foram consideradas como novas. A presença de teste genético positivo no probando possibilitou a identificação molecular da doença em até 82% dos respectivos familiares, dos quais 39% eram fenótipo-positivos. Todos os carreadores de mutação sem evidências de HVE ao ecocardiograma apresentaram anomalias eletrocardiográficas, expressas majoritariamente por ondas Q patológicas, as quais podem ser indicativas da doença em fase pré-clínica.47

A CMH é considerada uma doença universal, que acomete diferentes populações expostas a uma ampla variedade de fatores ambientais e geográficos. Embora a expressão fenotípica da CMH não evidencie aspectos distintos em populações do hemisfério norte e sul, ainda não está claramente definido se ambas compartilham o mesmo substrato genético. A análise molecular de indivíduos com a doença, originários de múltiplas regiões geográficas e de etnia diversa, certamente contribuirá para o entendimento das complexas características desta entidade. O perfil genético da CMH foi definido com base no estudo de populações não-relacionadas da Europa e América do Norte.7-9,12-24 Mais recentemente, a análise genético-molecular foi estendida a coortes da Ásia,25,26,28,30 África Setentrional27 e Austrália.32 Todavia, dados gerados a partir da avaliação de populações do hemisfério sul, são comparativamente escassos.31-34 Em nosso país, as características moleculares da CMH foram determinadas em indivíduos oriundos das regiões sudeste, norte e nordeste.34 A assimilação de testes genéticos mais resolutivos à prática clínica deverá certamente favorecer a sua aplicação em maior escala em coortes de todos os continentes.

Na presente análise, mutações causadoras foram identificadas com maior frequência do que em estudos prévios, que incluíram formas familiares e esporádicas de CMH.18,9,18,19,22-27 A maior positividade de nossos resultados pode ser atribuída ao fato de termos avaliado uma amostra bem caracterizada da doença, ainda que a identificação de mutações apresente variação de acordo com a população estudada.10 Todas as mutações dos genes MYH7 e MYBPC3 detectadas eram missense. A ausência de acometimento no gene TNNT2 pode ser atribuída à sua menor prevalência na população em geral e a idade mais avançada dos indivíduos integrantes dessa amostra, considerando que esse gene apresenta relação com início precoce e morte súbita prematura.4,6,13 As mutações de MYH7 foram predominantes em relação àquelas que envolveram MYBPC3, ao contrário do referido em estudos prévios baseados em populações independentes do hemisfério norte.7,8,11,22,23,27,48 Essa característica foi descrita em pacientes com CMH originários de outras regiões do Brasil e pode representar uma particularidade da doença em nosso país.34

As mutações de MYH7 foram encontradas em 47% dos indivíduos submetidos à genotipagem e em 60% das famílias. O rastreamento de todas as regiões codificantes deste gene identificou a presença de quatro mutações missense em diferentes domínios da proteína. A mutação p.Ile263Thr foi previamente relatada na França,7,22 em Portugal,23 e mais recentemente em outras regiões do Brasil.34 A mutação p.Ala797Thr, previamente descrita na África do Sul31 com provável efeito fundador, também foi referida em coortes da América do Norte,8 África Setentrional27 e Europa9,23,24 assim como no Brasil.34 A mutação p.Met877Ile, nova, foi mapeada em uma família com alto grau de penetrância, acometendo três dos quatro membros genotipados em duas gerações. A mutação associou-se à HVE de leve à grave e à obstrução médio-ventricular e de via-de-saída, assim como também a formas não-obstrutivas. A mutação p.Glu1468Lys, também considerada nova, foi identificada em três famílias não-relacionadas. Variação fenotípica inter e intrafamiliar foi observada em formas obstrutivas e não-obstrutivas com HVE de grau leve a moderado. Essa mutação relacionou-se, igualmente, à obstrução médio-ventricular associada à morte súbita tardia em um familiar.

Mutações missense do gene MYBPC3 foram encontradas em 16% dos indivíduos e em 20% das famílias avaliadas. A mutação p.Arg495Gln, descrita na América do Norte20 e na população portuguesa,23 foi referida como frequente em uma coorte brasileira de CMH.34 A mutação foi identificada em uma família com história de morte súbita prematura associada à HVE de moderada à maciça. A mutação p.Val896Met foi previamente detectada em coortes europeias,7,23 assim como na África do Sul.31 Dois carreadores dessa mutação de uma família, o probando com HVE moderada e obstrução de via-de-saída grave, assim como um familiar jovem fenótipo-negativo, também exibiam a mutação p.Glu1468Lys no gene MYH7. O familiar fenótipo-negativo demonstrava ondas Q patológicas no eletrocardiograma em repouso. Heterozigose dupla ou composta costuma ser identificada em famílias com mutações de MYBPC3, correspondendo de 3 a 5% dos pacientes com CMH.7,20 Múltiplas mutações estão usualmente relacionadas à fenótipos graves e doença de início precoce,4,6,7 entretanto, graus variáveis de HVE já foram relatados em alguns desses indivíduos.34

Todas as mutações dos genes MYH7 e MYBPC3 demonstraram marcada variação fenotípica intra e interfamiliar relacionada ao grau de HVE. Variação fenotípica em pacientes carreadores de uma mesma mutação é considerada característica da CMH.10 Os padrões de HVE e a idade de início da doença podem diferir mesmo entre indivíduos relacionados, considerando que o fenótipo é determinado não só pela mutação, mas também pela interação de polimorfismos, genes modificantes, fatores epigenéticos e ambientais.6,10 A metanálise das associações genótipo-fenótipo na CMH demonstra que, devido ao fato de muitas mutações serem privativas de uma só família, os estudos já realizados ainda não possuem poder estatístico suficiente para obtenção de conclusões definitivas.48 Entretanto, algumas variáveis clínicas podem estar relacionadas ao genótipo, tais como idade de apresentação, espessura parietal máxima do VE e história familiar da doença ou de morte súbita. Na amostra avaliada, houve predomínio de história familiar de morte súbita e idade de apresentação mais precoce nos carreadores de mutação do gene MYBPC3, características que diferem daquelas relatadas na literatura, mas que podem representar uma particularidade da população em estudo.

Em 30% das famílias, não foram identificadas mutações causadoras. Em todos esses casos, foi evidenciada ausência de história clínica prévia de CMH. A presença de um teste genético negativo pode resultar da existência de mutações em genes não conhecidos ou não sequenciados. A HVE, por não constituir fenótipo específico, é identificada em outras formas de cardiopatia como nas doenças metabólicas consideradas fenocópias da CMH. A detecção de mutações em genes sarcoméricos relacionados à doença associa-se à história familiar, início precoce da doença, prognóstico desfavorável e maior grau de HVE em relação aos casos com teste genético negativo.9,25,27 Dados recentes indicam que essa associação manifesta-se independentemente do gene acometido, mas estudos adicionais são necessários para comprovar esses achados.2 No presente estudo, história familiar de CMH ou morte súbita foi mais frequente em indivíduos genótipo-positivos em relação àqueles genótipo-negativos.

Neste estudo, mutações causadoras de CMH foram identificadas em expressivo número de indivíduos. Entretanto, o perfil genético da população aqui analisada não diferiu essencialmente daquele descrito em coortes de etnia diversa, originárias de outras regiões geográficas, exceto pelo fato de que o acometimento de MYH7 foi mais frequente em relação à MYBPC3.

Limitações do estudo

O estudo compreendeu o rastreamento dos três genes mais prevalentes na CMH, mas não se estendeu aos demais, considerados como de reduzida frequência. Não obstante, a análise restringiu-se a uma amostra de famílias não-relacionadas registradas em um único centro terciário situado no sul do Brasil.

 Conclusões

Nesta primeira análise genético-molecular de uma coorte de pacientes com CMH do extremo sul do Brasil, mutações foram identificadas em 58% dos indivíduos consecutivos de famílias não relacionadas. As mutações afetaram de forma predominante o gene MYH7, característica que diverge do relatado em países do hemisfério norte. O estudo corrobora que as mutações em MYH7 e MYBPC3 devem constituir o enfoque inicial da análise genético-molecular na CMH, mutações no gene TNNT2 seguem um padrão de baixa prevalência na população brasileira. Todas as mutações detectadas eram do tipo missense, enquanto que duas do gene MYH7 não haviam sido previamente descritas. As mutações caracterizaram-se por acometer distintos domínios das proteínas codificadas e determinar expressão fenotípica variável. Foi identificada relação entre teste genético positivo e história familiar de CMH ou morte súbita. Predomínio de mutações do gene MYH7 pode representar uma característica da população local.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo Fundo de Incentivo à Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.