Abstract

Arq Bras Cardiol

abc

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC

zmNbcMwFrp34WVmphz5tStP

S0066-782X2016004200223

S0066-782X2016005022101

10.5935/abc.20160118

Original Articles

Jabuticaba-Induced Endothelium-Independent Vasodilating Effect on Isolated Arteries

Andrade

Daniela Medeiros Lobo de

1 Borges

Leonardo Luis

2 Torres

Ieda Maria Sapateiro

1 Conceição

Edemilson Cardoso da

2 Rocha

Matheus Lavorenti

1 Universidade Federal de Goiás Faculdade de Farmácia Laboratório de Farmacologia Cardiovascular

Goiânia

Brazil Laboratório de Farmacologia Cardiovascular - Faculdade de Farmácia - Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia, GO - Brazil Universidade Federal de Goiás 2 Universidade Federal de Goiás Faculdade de Farmácia Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais

Goiânia

Brazil Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais - Faculdade de Farmácia - Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia, GO - Brazil Universidade Federal de Goiás

Mailing Address: Matheus Lavorenti Rocha, UFG - Faculdade de Farmácia. Rua 240, esquina com 5ª Avenida, s/n, Setor Leste Universitário. Postal Code 74605-170, Goiânia, Goiás - Brazil. E-mail: matheusroch@yahoo.com.br, rochaml@ufg.br

Author contributions

Conception and design of the research: Andrade DML, Borges LL, Torres IMS, Conceição EC, Rocha ML; Acquisition of data: Andrade DML, Borges LL, Conceição EC, Rocha ML; Analysis and interpretation of the data: Andrade DML, Torres IMS, Conceição EC, Rocha ML; Statistical analysis: Andrade DML, Rocha ML; Obtaining financing: Rocha ML; Writing of the manuscript: Andrade DML, Torres IMS, Rocha ML; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Andrade DML, Borges LL, Conceição EC, Rocha ML.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

11 08 2016

9 2016

107 3 223 229 25 11 2015 04 03 2016 07 03 2016

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract Background:

Despite the important biological effects of jabuticaba, its actions on the cardiovascular system have not been clarified.

Objectives:

To determine the effects of jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) on vascular smooth muscle (VSM) of isolated arteries.

Methods:

Endothelium-denuded aortic rings of rats were mounted in isolated organ bath to record isometric tension. The relaxant effect of JHE and the influence of K⁺ channels and Ca²⁺ intra- and extracellular sources on JHE-stimulated response were assessed.

Results:

Arteries pre-contracted with phenylephrine showed concentration-dependent relaxation (0.380 to 1.92 mg/mL). Treatment with K⁺ channel blockers (tetraethyl-ammonium, glibenclamide, 4-aminopyridine) hindered relaxation due to JHE. In addition, phenylephrine-stimulated contraction was hindered by previous treatment with JHE. Inhibition of sarcoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPase did not change relaxation due to JHE. In addition, JHE inhibited the contraction caused by Ca²⁺ influx stimulated by phenylephrine and KCl (75 mM).

Conclusion:

JHE induces endothelium-independent vasodilation. Activation of K⁺ channels and inhibition of Ca²⁺ influx through the membrane are involved in the JHE relaxant effect.

Keywords: Jabuticaba (Myrciaria Cauliflora) Trees Vasodilatation Calcium Channels Muscle, Smooth Vascular

Goiás State Research Support Foundation

201310267000013

Introduction

Cardiovascular diseases are a major cause of death worldwide, among which hypertension accounts for 9.4 million deaths per year.1 Around 1 billion adults in the world have hypertension, and that figure will have increased by 25% in 10 years.2

Vascular tonus regulation is fundamental to appropriate blood pressure control. Blood vessel contraction and dilation in response to physiological demands are controlled by changes in the intracellular concentration of Ca²⁺ in vascular smooth muscle (VSM) cells. The increase in intracellular concentration of Ca²⁺ occurs via both Ca²⁺ influx through the plasma membrane and Ca²⁺ release from inner sources, such as the sarcoplasmic reticulum.3^,4 Effective drugs to blood pressure control, such as nifedipine, verapamil and diltiazem, which act as Ca²⁺ channel blockers, induce vasodilation and reduce blood pressure.5

The use of natural products as an alternative treatment for hypertension has been extensively studied, being known to induce hypotension with minimum side effects.6^,7Jabuticaba (Myrciaria cauliflora), also known as Brazilian grape, is a hard-skinned berry of the Myrtaceae family, largely distributed in Brazil. It can be consumed fresh or in the form of liqueurs, wines, jams and sweets, and its consumption has increased in Brazil and worldwide.8^,9 In addition to the use of jabuticaba as food and beverage, in folk medicine, that fruit is used to treat some diseases, such as asthma, inflammations, and gastrointestinal and cardiovascular disorders.10 Recent findings have shown that jabuticaba can decrease oxidative process,11 hyperglycemia associated with insulin resistance12 and dyslipidemia.13 In addition, that species has a proven endothelium-dependent hypotensive and vasodilating effect, mediated by nitric oxide pathway.14

Considering that jabuticaba has important biological effects and that its action on the cardiovascular system has been little studied, this study was aimed at assessing the possible effect of the jabuticaba extract directly on the VSM, mainly its effect on Ca²⁺ influx through the plasma membrane and activation of K⁺ channels.

Methods Preparation of jabuticaba extract

For this study, the plant specimens were donated by the "Jabuticabal" wine house in the city of Hidrolândia, Goiás state, Brazil. A sample of the plant specimen was stored at the herbarium of the department of botany of the Federal University of Goiás (UFG), Goiânia, Goiás state, Brazil (n. 21140). Seedless fruits were dried in a greenhouse with air circulation, powdered in a pulverizer mill and passed through a 60-mesh sieve at the Laboratory of Research on Natural Products, Pharmacy School/UFG. The powder obtained was stored at -20°C. To prepare the extract, the dried material was exhaustively percolated into an ethanol:water solution (55:45 v/v), and the material obtained was filtered and submitted to rotary evaporation under reduced pressure at 40°C, resulting in the ethanol-free jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE). After that process, the JHE was maintained in a freezer (-20°C) protected from light. On the days of experiment, the JHE was solubilized in distilled water at the concentration of 120 mg/mL.

The phytochemical characterization and pattern of the JHE showed 17.89% of phenolic compounds, quantified by using the Hagerman and Butler method, adapted by Mole and Watermen.15 The JHE showed ellagic acid (phytochemical marker, determined by HPLC-PDA) at 0.222% concentration.14 According to Abe et at.,9 the total ellagic acid content in M. cauliflora fruits ranges from 0.021% to 0.311%. Thus, that phytochemical marker concentration in JHE is in accordance with the fruit content.

Animals and preparation of isolated arteries

Wistar male rats (200-230 g) from the central vivarium of the UFG were used in this study. All experimental protocols abided by the UFG Animal Research Ethics Committee (protocol: 015/2014). This study is in accordance with the European Union Guide to the Care and Use of Experimental Animals (2010/63/UE).

The rats were sacrificed by use of cervical dislocation under inhalation anesthesia. Thoracic aorta was isolated, cleared of connective and adipose tissues, and sliced into rings (± 4 mm), which were mounted between two metal hooks, one of which was connected to a power transducer to record isometric tension (DATAQ Instruments, Akron, OH, USA) and the other was fixed to a cube for the isolated organ. The rings were placed into chambers for isolated organs, containing modified Krebs solution [composition in mM: NaCl, 130.0; KCl, 4.7; KH₂PO₄, 1.2; CaCl₂,1.6; MgSO₄, 1.2; NaHCO₃, 14.9; glucose, 5.5], at pH of 7.4, under gasification with carbogen mixture (95% O₂ + 5% CO₂) at 37°C, and maintained at baseline tension of 1 g (ideal resting tension, previously standardized at our laboratory). To prevent the influence of vascular-endothelium-derived factors, endothelial cells were mechanically removed by rubbing the vessel lumen with a thin metal rod, the effectiveness of the removal being evidenced by lack of relaxation due to acetylcholine (1 µM) in aortic rings pre-contracted with EC₅₀ of phenylephrine (0.1 µM).

Experimental protocols

After 60 minutes of stabilization at baseline tension (1 g), the arteries were pre-contracted with phenylephrine (0.1 µM), and cumulative relaxation-concentration-effect curves were built for JHE (0 to 1.92 mg/mL) and for verapamil, used as inner control (10 nM to 100 µM).

To assess the cellular pathways responsible for the relaxant effect of JHE, aortic rings were pre-contracted with phenylephrine (0.1 µM) for 20 minutes after incubation with the following agents: 1) Ca²⁺ ATPase of the sarcoplasmic reticulum, cyclopiazonic acid (CPA, 10 µM); 2) non-selective K⁺ channel blocker, tetraethyl-ammonium (TEA, 1 mM); 3) selective voltage-gated K⁺ channel (K_v) blocker, 4-aminopyridine (4-AP, 1 mM); 4) selective ATP-sensitive K⁺ channel (K_ATP) blocker, glibenclamide (3 µM); 5) Ca²⁺-dependent K⁺ channel (K_Ca) blocker, clotrimazole (5 µM).

To assess the influence of JHE on the contraction induced by adrenergic contractile agonist, concentration-effect curves were built for phenylephrine (selective α1-adrenergic agonist, 0.1 nM to 10 µM) in the presence (20 minutes) or absence of JHE at inhibitory concentration 50% (IC₅₀, 0.5 mg/mL) or 100% (IC₁₀₀, 1.92 mg/mL). In addition, the inhibitory effect of the Ca²⁺ channel blocker verapamil (IC₅₀, 0.3 µM) was assessed as inner control.

In another series of experiments, JHE action on Ca²⁺ influx stimulated by two different agents was analyzed. The preparations were initially contracted with a KCl solution (75 mM) to cause maximum contraction of each preparation (100% contraction), being then rinsed with Ca²⁺-free Krebs solution until total relaxation. To exhaust the intracellular storage of Ca²⁺, the preparations were stimulated to contract with phenylephrine in Ca²⁺-free Krebs solution until any contractile response disappeared (approximately 5 or 6 times, for 30-50 minutes). Then the preparations were rinsed several times with Ca²⁺-free Krebs solution, and then incubated for 20 minutes with JHE at inhibitory concentration 50% (IC₅₀, 0.51 mg/mL) or 100% (IC₁₀₀, 1.92 mg/mL). In addition, the inhibitory effect of the Ca²⁺ channel blocker verapamil (IC₅₀, 0.3 µM) was assessed as inner control. After incubation, the contractile stimulus was applied (phenylephrine, 0.1 µM, or KCL, 75 mM), and concentration-effect curves were built for CaCl₂ (0 to 3.0 mM).

Statistical analysis

The results of isometric tension were expressed as mean ± standard error of the mean (SEM) of at least five experiments (n = 5-8) obtained from different animals. The graphs were built and analyzed by use of the GraphPad Prism software (GraphPad Software Corporation, 5.0 version) with ANOVA and Bonferroni post-test. The 5% significance level (p < 0.05) was adopted for the differences.

Results Relaxant effect of JHE on isolated arteries

The JHE caused relaxation in preparations of endothelium-denuded arteries on a concentration-dependent way, relaxation initiating at the concentration of 0.38 mg/mL, and achieving the maximum effect (E_max) of 98.3% ± 0.4% (n = 6) at the concentration of 1.92 mg/mL (IC₁₀₀) (Figure 1A). The JHE concentration that induced 50% relaxation (IC₅₀) was 0.51 mg/mL. Similarly, verapamil (used as positive control) induced concentration-dependent relaxation with E_max of 99.8% ± 1.8% (n = 5) and IC₅₀ of 0.3 µM.

Figure 1 Cumulative concentration-response curves of jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) (A) and verapamil (B) in isolated endothelium-denuded arteries. The points represent mean ± SEM of the relaxant effect expressed as % relaxation.

Effect of JHE on the phenylephrine-induced contraction

The E_max value for phenylephrine (142.1% ± 7.1%, n = 6) was significantly (p < 0.001) reduced to 88.7% ± 6.2% (n = 5), 66.1% ± 5.1% (n = 6) and 79.9% ± 5.5% (n = 5) after incubation with IC₅₀ and IC₁₀₀ of JHE or verapamil, respectively. The addition of IC₅₀ and IC₁₀₀ of JHE or verapamil significantly increased phenylephrine pD₂ values (-log EC₅₀) from 6.24 ± 0.09 to 5.35 ± 0.04, 5.14 ± 0.09 and 5.68 ± 0.07, respectively (Figure 2).

Figure 2 Effect of jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) and verapamil on the phenylephrine-induced contraction in isolated endothelium-denuded arteries. Cumulative concentration-response curves were built in control conditions and after incubation (20 min) with JHE (IC50: 0.51 or IC100: 1.92 mg/mL) or verapamil (IC50: 0.3 µM). The points represent mean ± SEM of the contractile effect expressed as % contraction in relation to total KCl-induced contraction (75 mM). Significant difference: *** p<0.001 vs. Control

Effect of JHE on Ca2+-influx-induced contraction in preparations stimulated with phenylephrine or KCl

Regarding the Ca²⁺-influx-induced contraction stimulated by phenylephrine, pre-incubation with JHE (IC₅₀ or IC₁₀₀) significantly reduced (p < 0.001) the E_max values from 106.8% ± 7.5% (n = 5) to 58.8% ± 4.9% (n = 6) and 34.5% ± 3.2% (n = 6), respectively. In addition, treatment with verapamil significantly reduced (p < 0.001) the contraction to 7.1% ± 1.1% (n = 5) (Figure 3A).

Figure 3 Effect of jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) and verapamil on the contractile response in isolated endothelium-denuded arteries. Cumulative concentration-response curves for CaCl2 were stimulated with phenylephrine (0.1µM) (A) or KCl 75 mM (B) in control conditions and after incubation (20 min) with JHE (IC50: 0.51 or IC100: 1.92 mg/mL) or verapamil (IC50: 0.3 µM). The points represent mean ± SEM of the contractile effect expressed as % contraction in relation to total KCl-induced contraction (75 mM). Significant difference: *** p<0.001 vs. Control.

Regarding the Ca²⁺-influx-induced contraction stimulated by KCl (75 mM), pre-incubation with JHE (IC₅₀ or IC₁₀₀) significantly reduced (p < 0.001) the E_max values from 108.8% ± 4.3% (n = 5) to 63.8% ± 6.1% (n = 6) and 14.6% ± 1.9% (n=6), respectively. In addition, treatment with verapamil significantly reduced (p < 0.001) the contraction to 15.5% ± 1.1% (n=6) (Figure 3B).

Effect of reticular Ca2+ ATPase inhibitor, CPA, and K+-channel blockers on JHE- induced relaxation

Treatment with CPA did not change the JHE-induced relaxation (93.8% ± 4.6%, n = 6) in isolated arteries (Figure 4). Thus, JHE did not change the inner Ca²⁺ uptake by the sarcoplasmic reticulum to induce vascular relaxation.

Figure 4 Maximum relaxant effect induced by jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) in isolated arteries pre-contracted with phenylephrine (0.1 µM) in the absence or presence (20 min) of the reticular Ca2+ ATPase inhibitor, cyclopiazonic acid (CPA, 10 µM). The bars represent mean ± SEM of the maximum relaxant effect expressed as % relaxation.

As shown in figure 5, except for clotrimazole (94.1% ± 4.5%, n = 5), K⁺-channel blockers changed the JHE-stimulated relaxation. The JHE-induced relaxation (E_max: 98.3% ± 0.4%, n = 6) was significantly (p < 0.05) reduced by TEA (E_max: 87.6% ± 5.7%, n=5), glibenclamide (E_max: 61.6% ± 5.8%, n = 6) and 4-AP (E_max: 81.6% ± 5.9%, n = 5). The results showed that JHE-induced relaxation depends on K⁺ efflux through the membrane.

Figure 5 Effects of K<italic>+</italic> channel blockers on the relaxation induced by jabuticaba hydroalcoholic extract (JHE) in isolated arteries pre-contracted with phenylephrine (0.1 µM) in the absence or presence (20 min) of the blockers tetraethyl-ammonium (TEA, 1 mM), glibenclamide (Glib, 3 µM), clotrimazole (5 µM) and 4-aminopyridine (4-AP, 1 mM). The points represent mean ± SEM of the relaxant effect expressed as % relaxation. Significant difference: *p < 0.05; *** p < 0.001 vs. Control

Discussion

The major finding of this study is that JHE, in addition to having a hypotensive effect and inducing vascular relaxation through endothelial nitric oxide pathway, as shown by our team,14 acts directly on VSM and leads to endothelium-independent relaxation. Therefore, jabuticaba clearly has cardiovascular effects through multiple endothelium-dependent and independent pathways. It is worth noting that the JHE concentration capable of inducing 100% vascular relaxation through the endothelial pathway is approximately 16 times lower (0.12 mg/mL)14 than the JHE concentration necessary to induce 100% relaxation acting directly on VSM (1.92 mg/mL).

Blood vessel contraction and relaxation in response to physiological demands are controlled by changes in intracellular Ca²⁺ concentration of VSM. The Ca²⁺ used for contraction includes intracellular or extracellular sources, or both. Sarcoplasmic reticulum is the major source of intracellular Ca²⁺.16 Our experiments showed that JHE does not change Ca²⁺ uptake by the sarcoplasmic reticulum, because its selective inhibitor, CPA, did not change the relaxation profile.

Voltage-gated Ca²⁺ channels (VGCC), also known as L-type Ca²⁺ channels, and receptor-operated Ca²⁺ channels (ROCC) located on the plasma membrane of VSM cells play a fundamental role in controlling Ca²⁺ influx.17^,18 Phenylephrine-induced contraction is mediated by Ca²⁺ influx increase via VGCC and ROCC.19^,20 However, contraction induced by membrane depolarization, such as in high KCl concentrations, activates preferentially VGCC.21 The results of the present study show that treating arteries with JHE inhibits the vascular contraction induced by the adrenergic stimulus with phenylephrine, suggesting that JHE blocks Ca²⁺ influx by interfering with VGCC and/or ROCC.

In an attempt to clarify the cell mechanism through which JHE induces vascular relaxation, experiments were performed in a Ca²⁺-free solution. Two different stimuli, phenylephrine and KCl (75 mM), were used to induce Ca²⁺ influx. The JHE, as well as verapamil, used as a positive control, inhibited the Ca²⁺-influx-induced contraction mediated by both stimuli. Because membrane depolarization with high concentrations of K⁺ activates specifically VGCC, we suggest that JHE acts directly or indirectly by blocking Ca²⁺ influx through the plasma membrane, acting preferentially on VGCC.

Natural products have constantly shown the involvement of K⁺ channels in their vasodilating mechanism.22 Several types of K⁺ channels, such as ATP-sensitive K⁺ channels (K_ATP), Ca²⁺-dependent K⁺ channels (K_ca) and voltage-gated K⁺ channels (K_v), are present in VSM.23^,24 Those channels can be blocked by glibenclamide, clotrimazole and 4-AP, respectively.24^,25 Tetraethyl-ammonium is a non-selective blocker of those channels. When activated, those channels allow K⁺ efflux, hyperpolarizing the VSM plasma membrane. This reduces Ca²⁺ influx through the VGCC and induces vasodilation.26^,27 The present study shows that JHE-induced relaxation in endothelium-denuded arteries is hindered after K⁺ channel blockade. Except for clotrimazole, the other blockers hindered vascular relaxation, allowing relating its activation to the JHE effect.

Our results point to a new biological effect of jabuticaba, a Brazilian native specimen that has important biological effects on the cardiovascular system, such as glucose-lowering,12 lipid-lowering13 and hypotensive effects.14 Thus, the biological jabuticaba-induced effects demonstrated in this study will contribute to increase the knowledge about jabuticaba-derived compounds and their use as medicinal plant or functional food to prevent cardiovascular problems.

Conclusion

This study shows that JHE induces endothelium-independent vasodilation. The major cellular pathways used by JHE to cause vascular relaxation are inhibition of the Ca²⁺-influx through plasma membrane, in addition to K⁺ channel activation in VSM cells.

Sources of Funding

This study was partially funded by FAPEG/GO.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Daniela Medeiros Lobo Andrade, from Faculdade de Farmácia - Universidade Federal de Goiás.

Acknowledgements

This research was funded by the Goiás State Research Support Foundation (FAPEG), process 201310267000013. The Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) provided funding to support the Master's program of Daniela L. M. de Andrade.

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Efeito Vasodilatador Independente do Endotélio Induzido pela Jabuticaba (M. cauliflora) em Artérias Isoladas

Andrade

Daniela Medeiros Lobo de

1 Borges

Leonardo Luis

2 Torres

Ieda Maria Sapateiro

1 Conceição

Edemilson Cardoso da

2 Rocha

Matheus Lavorenti

1 Laboratório de Farmacologia Cardiovascular - Faculdade de Farmácia - Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia, GO - Brasil 2 Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais - Faculdade de Farmácia - Universidade Federal de Goiás (UFG), Goiânia, GO - Brasil

Correspondência: Matheus Lavorenti Rocha, UFG - Faculdade de Farmácia. Rua 240, esquina com 5ª Avenida, s/n, Setor Leste Universitário. CEP 74605-170, Goiânia, Goiás - Brasil. E-mail: matheusroch@yahoo.com.br, rochaml@ufg.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Andrade DML, Borges LL, Torres IMS, Conceição EC, Rocha ML; Obtenção de dados: Andrade DML, Borges LL, Conceição EC, Rocha ML; Análise e interpretação dos dados: Andrade DML, Torres IMS, Conceição EC, Rocha ML; Análise estatística: Andrade DML, Rocha ML; Obtenção de financiamento: Rocha ML; Redação do manuscrito: Andrade DML, Torres IMS, Rocha ML; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Andrade DML, Borges LL, Conceição EC, Rocha ML.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Resumo Fundamentos:

Embora a jabuticaba apresente importantes efeitos biológicos, suas ações sobre o sistema cardiovascular ainda não foram esclarecidas.

Objetivos:

Determinar os efeitos do extrato de jabuticaba (EHJ) sobre o músculo liso vascular (MLV) em artérias isoladas.

Métodos:

Aortas (sem endotélio) de ratos foram montadas em banho de órgãos isolados para registro de tensão isométrica. Foram verificados o efeito relaxante, a influência dos canais de K⁺ e das fontes de Ca²⁺ intra- e extracelular sob a resposta estimulada pelo EHJ.

Resultados:

Artérias pré-contraídas com fenilefrina apresentaram relaxamento concentração-dependente (0,380 a 1,92 mg/mL). O tratamento com bloqueadores de canais de K⁺ (tetraetilamônio, glibenclamida, 4-aminopiridina) prejudicaram o relaxamento pelo EHJ. A contração estimulada com fenilefrina também foi prejudicada pelo tratamento prévio com EHJ. A inibição da Ca²⁺ATPase do reticulo sarcoplasmático não alterou o relaxamento pelo EHJ. Além disso, o EHJ inibiu a contração causada pelo influxo de Ca²⁺ estimulado por fenilefrina e KCl (75 mM).

Conclusão:

O EHJ induz vasodilatação independente do endotélio. Ativação dos canais de K⁺ e inibição do influxo de Ca²⁺ através da membrana estão envolvidas no efeito relaxante do EHJ.

Palavras-chave: Jabuticaba-Myrciaria Cauliflora Árvores Vasodilatação Canais de Cálcio Músculo Liso Vascular

Introdução

Doenças cardiovasculares são as maiores causas de morte no mundo e, dentre elas, a hipertensão é responsável por 9,4 milhões de mortes por ano.1 Perto de 1 bilhão de adultos no mundo sofrem de hipertensão e este número aumentará 25% em 10 anos.2

A regulação do tônus vascular é fundamental para o apropriado controle da pressão arterial. A contração e a dilatação dos vasos sanguíneos em resposta às demandas fisiológicas são controladas por mudanças na concentração intracelular de Ca²⁺ nas células do músculo liso vascular (MLV). O aumento da concentração intracelular de Ca²⁺ ocorre através do influxo desse íon pela membrana plasmática e por liberação de fontes internas de Ca²⁺, como o retículo sarcoplasmático.3^,4 Fármacos efetivos para controle da pressão arterial como nifedipina, verapamil e diltiazem, os quais atuam como bloqueadores de canais de Ca²⁺ induzem vasodilatação e reduzem a pressão arterial.5

O uso de produtos naturais como possível alternativa para o tratamento da hipertensão tem sido extensivamente estudado, sendo conhecidos por induzir hipotensão com mínimos efeitos colaterais.6^,7 A jabuticaba é um fruto da família Myrtaceae, amplamente distribuído no Brasil. Ela é consumida in natura, na forma de licores, vinhos, geleias e doces, cujo consumo tem aumentado no Brasil e no exterior.8^,9 Em adição ao uso da fruta como alimentos e bebidas, a medicina popular usa a jabuticaba para tratar algumas doenças como asma, inflamações, problemas gastrintestinais e distúrbios cardiovasculares.10 Recentes achados mostram a capacidade da jabuticaba em reduzir o processo oxidativo,11 a hiperglicemia associada à resistência a insulina12 e a dislipidemia.13 Além disso, a espécie tem comprovado efeito hipotensor e vasodilatador dependentes do endotélio vascular, efeitos estes mediados pela via do óxido nítrico.14

Considerando que a espécie apresenta importantes efeitos biológicos e suas ações sobre o sistema cardiovascular têm sido muito pouco estudadas, o objetivo deste trabalho foi avaliar a possível ação do extrato de jabuticaba diretamente sobre o MLV, examinando principalmente o efeito da espécie sobre o influxo de Ca²⁺ através da membrana e ativação de canais de K⁺.

Métodos Preparação do extrato de jabuticaba (Myrciaria cauliflora)

As frutas foram doadas pela adega "Jabuticabal" na cidade de Hidrolândia, GO, Brasil. Uma amostra da espécie foi depositada no herbário do departamento de botânica da Universidade Federal de Goiás (UFG) (n. 21140). As frutas sem as sementes foram secas em estufa de ar circulante, pulverizadas em moinho de facas e passadas por um tamis de malha 60 no Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais, Faculdade de Farmácia/UFG. O pó obtido foi estocado em -20°C. Para preparação do extrato, o material seco foi extraído exaustivamente por percolação em solução etanol:água (55:45 v/v) e o extrato obtido foi filtrado e rota-evaporado sob pressão reduzida a 40°C, resultando no extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) isento de etanol. Após este processo, o EHJ foi mantido em freezer (-20°C) protegido da luz. No dia dos experimentos, o EHJ foi solubilizado em água destilada numa concentração de 120 mg/mL.

A caracterização e padronização fitoquímica do EHJ mostrou 17,89% de compostos fenólicos, quantificados por método de Hagerman & Butler, adaptado por Mole e Watermen.15 O EHJ apresentou ácido elágico (marcador fitoquímico, determinado por HPLC-PDA) numa concentração de 0,222%.14 De acordo com Abe et al.,9 o conteúdo total de ácido elágico em frutos de M. cauliflora varia de 0,021% a 0,311%. Portanto, a concentração deste marcador fitoquímico no EHJ está de acordo com o conteúdo das frutas.

Animais e preparação das artérias isoladas

Ratos Wistar machos (200-230 g) cedidos pelo biotério central da UFG foram usados neste estudo. Todos os protocolos experimentais foram realizados em conformidade com o Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFG, Goiânia, GO, Brasil (protocolo: 015/2014). Esta investigação está em conformidade com a diretiva da União Europeia para o Cuidado e Uso de Animais de Experimentação (2010/63/UE).

Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical sob anestesia inalatória. A aorta torácica foi isolada, limpa dos tecidos conjuntivos e gordurosos e cortada em anéis (± 4 mm), que foram montados entre dois ganchos de metal, sendo um deles conectado a um transdutor de força para registro da tensão isométrica (DATAQ Instruments, Akron, OH, EUA) e o outro fixo à cuba para órgão isolado. Os anéis foram colocados em câmaras para órgãos isolados contendo solução de Krebs modificada com a seguinte composição (em mM): NaCl 130,0; KCl 4,7; KH₂PO₄ 1,2; CaCl₂ 1,6; MgSO₄ 1,2; NaHCO₃ 14,9; glicose 5,5; em pH 7,4 sob gaseificação com mistura carbogênica (95% O₂ e 5% CO₂), a 37°C, e mantidas a uma tensão basal de 1 g (tensão de repouso ideal, previamente padronizada em nosso laboratório). Para evitar influência dos fatores derivados do endotélio vascular, as células endoteliais foram removidas mecanicamente pelo atrito da luz do vaso com uma haste fina de metal e a efetividade da remoção foi demonstrada pela ausência de relaxamento à acetilcolina (ACh, 1 µM) em anéis de aorta pré-contraídas com a EC₅₀ da fenilefrina (0,1 µM).

Protocolos experimentais

Após 60 min de estabilização em tensão basal (1 g), as artérias foram pré-contraídas com fenilefrina (0,1 µM) e curvas de efeito de relaxamento-concentração cumulativas foram realizadas para o EHJ (0 a 1,92 mg/mL) e para o verapamil, usado como controle interno (10 nM a 100 µM).

Para verificar as vias celulares responsáveis pelo efeito relaxante do EHJ, anéis de aortas foram pré-contraídos com fenilefrina (0,1 µM) 20 min após a incubação com os seguintes agentes: 1) inibidor da Ca²⁺ ATPase do retículo sarcoplasmático, ácido ciclopiazônico (CPA, 10 µM); 2) bloqueador não seletivo dos canais de K⁺, tetraetilamônio (TEA, 1 mM); 3) bloqueador seletivo dos canais de K⁺ ativados por voltagem (K_v), 4-aminopiridina (4-AP, 1 mM); 4) bloqueador seletivo dos canais de K⁺ dependentes de ATP (K_ATP), glibenclamida (3 µM); 5) bloqueador dos canais de K⁺ ativados pelo Ca²⁺ (K_Ca), clotrimazol (5 µM).

Para avaliar a influência do EHJ na contração induzida por agonista adrenérgico contrátil, foram realizadas curvas concentração-efeito para fenilefrina (agonista α1-adrenérgico seletivo, 0,1 nM até 10 µM) na presença (20 min) ou ausência do EHJ na concentração inibitória 50% (CI₅₀, 0,5 mg/mL) ou 100% (CI₁₀₀, 1,92 mg/mL). O efeito inibitório do bloqueador de canal de Ca²⁺, verapamil (CI₅₀, 0,3 µM), também foi analisado como controle interno.

Em outra série de experimentos, a ação do EHJ sobre o influxo de Ca²⁺ estimulado por dois diferentes estímulos foi analisada. Para isto, as preparações foram inicialmente contraídas com solução de KCl (75 mM) para produção da contração máxima de cada preparação (100% de contração) e então enxaguadas com solução de Krebs sem Ca²⁺ até o relaxamento total. Para esgotamento dos estoques intracelulares de Ca²⁺, as preparações foram estimuladas para contrair com fenilefrina em solução de Krebs sem Ca²⁺ até o desaparecimento de qualquer resposta contrátil (aproximadamente 5 ou 6 vezes, por 30-50 min). Após isto, as preparações foram enxaguadas varias vezes com Krebs sem Ca²⁺ e então incubadas 20 min com EHJ nas concentrações inibitória 50% (CI₅₀, 0,51 mg/mL) ou 100% (CI₁₀₀, 1,92 mg/mL). O efeito inibitório do bloqueador de canal de Ca²⁺ verapamil (CI₅₀, 0,3 µM) também foi analisado como controle interno. Após incubação, o estímulo contrátil foi aplicado (fenilefrina 0,1 µM ou KCL 75 mM) e então realizadas curvas concentração-efeito para CaCl₂ (0 a 3,0 mM).

Análise estatística

Os resultados de tensão isométrica foram expressos como a média ± erro padrão da média (EPM) de pelo menos cinco experimentos (n = 5-8), obtidos de diferentes animais. Os gráficos foram feitos e analisados pelo programa GraphPad Prism (GraphPad Software Corporation, versão 5.0) por ANOVA mais pós-teste de Bonferroni. Foi adotado nível de significância de 5% (p < 0,05) para que as diferenças sejam consideradas estatisticamente significativas.

Resultados Efeito relaxante do EHJ em artérias isoladas

O EHJ causou relaxamento em preparações de artérias sem endotélio de modo dependente da concentração, iniciando o relaxamento na concentração de 0,38 mg/mL e alcançando um efeito máximo (E_max) de 98,3% ± 0,4% (n = 6) numa concentração de 1,92 mg/mL (CI₁₀₀) (Figura 1A). A concentração de EHJ que induziu 50% do relaxamento (CI₅₀) foi de 0,51 mg/mL. Da mesma forma, o verapamil (usado como controle positivo) induziu relaxamento concentração-dependente, com E_max de 99,8% ± 1,8% (n = 5) e CI₅₀ de 0,3 µM.

Figura 1 Curvas concentração-resposta cumulativas do extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) (A) e do verapamil (B) em artérias isoladas sem endotélio. Os pontos representam a média ± EPM do efeito relaxante expressos em % de relaxamento.

Efeito do EHJ sobre a contração induzida por fenilefrina

O valor de E_max para fenilefrina (142,1% ± 7,1%, n = 6) foi significantemente (p < 0,001) reduzido para 88,7% ± 6,2% (n = 5), 66,1% ± 5,1% (n = 6) e 79,9% ± 5,5% (n = 5) após incubação com a CI₅₀ e a CI₁₀₀ do EHJ ou verapamil, respectivamente. A adição do EHJ com a CI₅₀ e a CI₁₀₀ do EHJ ou verapamil significantemente aumentou os valores de pD₂ (-log da EC₅₀) da fenilefrina de 6,24 ± 0,09 para 5,35 ± 0,04, 5,14 ± 0,09 e 5,68 ± 0,07, respectivamente (Figura 2).

Figura 2 Efeito do extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) e do verapamil sobre a contração induzida por fenilefrina em artérias isoladas sem endotélio. As curvas concentração-resposta cumulativas foram realizadas em condições controle ou após incubação (20 min) com EHJ (CI50: 0,51 ou CI100: 1,92 mg/mL) ou verapamil (CI50: 0,3 µM). Os pontos representam a média ± EPM do efeito contrátil expresso em % de contração em relação à contração total induzida por KCl (75 mM). Diferença significativa: *** p<0,001 vs. Controle.

Efeito do EHJ sobre a contração induzida por influxo de Ca2+ em preparações estimuladas com fenilefrina ou KCl

A contração induzida por influxo de Ca²⁺ estimulada por fenilefrina, a pré-incubação com EHJ (CI₅₀ ou CI₁₀₀) reduziu significativamente (p < 0,001) os valores de E_max de 106,8% ± 7,5% (n = 5) para 58,8% ± 4,9% (n = 6) e 34,5% ± 3,2% (n = 6), respectivamente. O tratamento com verapamil também reduziu significantemente (p < 0,001) a contração para 7,1% ± 1,1% (n = 5) (Figura 3A).

Como mostrado na Figura 3B, a contração induzida por influxo de Ca²⁺ estimulada por KCl 75 mM, a pré-incubação com EHJ (CI₅₀ ou CI₁₀₀) reduziu significativamente (p < 0,001) os valores de E_max de 108,8% ± 4,3% (n = 5) para 63,8% ± 6,1% (n = 6) e 14,6% ± 1,9% (n = 6), respectivamente. O tratamento com verapamil também reduziu significativamente (p < 0,001) a contração para 15,5% ± 1,1% (n = 6).

Figura 3 Efeito do extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) e do verapamil sobre a resposta contrátil em artérias isoladas sem endotélio. As curvas concentração-resposta cumulativas para CaCl2 foram estimuladas por fenilefrina (0,1 µM) (A) ou KCl 75 mM (B) em condições controle ou após incubação (20 min) com EHJ (CI50: 0,51 ou CI100: 1,92 mg/mL) ou verapamil (CI50: 0,3 µM). Os pontos representam a média ± EPM do efeito contrátil expresso em % de contração em relação à contração total induzida por KCl (75 mM). Diferença significativa: *** p < 0,001 vs. Controle.

Efeito do inibidor da Ca2+ATPase reticular, CPA, e dos bloqueadores de canais de K+ sobre o relaxamento induzido pelo EHJ

O tratamento com CPA não alterou o relaxamento estimulado pelo EHJ (93,8% ± 4,6%, n = 6) em artérias isoladas (Figura 4). Dessa forma, o EHJ não altera a captação interna de Ca²⁺ pelo retículo sarcoplasmático para induzir o relaxamento vascular.

Figura 4 Efeito relaxante máximo induzido pelo extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) em artérias isoladas pré-contraídas com fenilefrina (0,1 µM) na ausência ou presença (20 min) do inibidor da Ca2+ ATPase reticular, ácido ciclopiazônico (CPA - 10 µM). As barras representam a média ± EPM do efeito relaxante máximo expresso em % de relaxamento.

Como mostrado na Figura 5, com exceção do clotrimazol (94,1% ± 4,5%, n = 5), os bloqueadores de canais de K⁺ alteraram o relaxamento induzido pelo EHJ. O relaxamento induzido pelo EHJ (E_max: 98,3% ± 0,4%, n = 6) foi significativamente (p < 0,05) reduzido por TEA (E_max: 87,6% ± 5,7%, n=5), glibenclamida (E_max: 61,6% ± 5,8%, n=6) e 4-AP (E_max: 81,6% ± 5,9%, n=5). Os resultados mostram que o relaxamento induzido pelo EHJ depende do efluxo de íons K⁺ através da membrana.

Figura 5 Efeitos dos bloqueadores de canais de K<italic>+</italic> sobre o relaxamento induzido pelo extrato hidroalcoólico de jabuticaba (EHJ) em artérias isoladas pré-contraídas com fenilefrina (0,1 µM) na ausência ou presença (20 min) dos bloqueadores tetraetilamônio (TEA, 1 mM), glibenclamida (Glib, 3 µM), clotrimazol (5 µM) e 4-aminopiridina (4-AP, 1 mM). Os pontos representam a média ± EPM do efeito relaxante expresso em % de relaxamento. Diferença significativa: *p < 0,05; *** p < 0,001 vs. Controle.

Discussão

O maior achado deste trabalho é que o EHJ, além de apresentar efeito hipotensor e induzir relaxamento vascular por via do óxido nítrico endotelial, como já mostrado por nós anteriormente,14 age diretamente sobre o MLV e leva ao relaxamento independente do endotélio. Dessa forma, fica claro que a jabuticaba exerce efeitos cardiovasculares através de múltiplas vias dependentes e independentes do endotélio vascular. Cabe notar que a concentração do EHJ capaz de induzir 100% de relaxamento vascular por via endotelial é aproximadamente 16 vezes menor (0,12 mg/mL)14 que a concentração necessária para induzir 100% de relaxamento agindo diretamente sobre o MLV (1,92 mg/mL).

A contração e o relaxamento dos vasos sanguíneos em resposta às demandas fisiológicas são controlados por mudanças na concentração de Ca²⁺ intracelular do MLV. O Ca²⁺ usado para contração inclui fontes intracelulares, extracelulares ou ambas. O retículo sarcoplasmático é a principal fonte de Ca²⁺ intracelular.16 Nossos experimentos demonstram que o EHJ não altera a captação de Ca²⁺ pelo retículo sarcoplasmático, uma vez que seu inibidor seletivo CPA não alterou o perfil do relaxamento.

Canais de Ca²⁺ voltagem-dependente (CCVD), também conhecidos como canais de Ca²⁺ do tipo L, e os canais de Ca²⁺ operados por receptor (CCOR) localizados na membrana plasmática das células do MLV desempenham um papel fundamental no controle do influxo de Ca²⁺.17^,18 A contração induzida pela fenilefrina é mediada por aumento no influxo de Ca²⁺ via CCDV e CCOR.19^,20 Porém, a contração induzida pela despolarização de membrana, como ocorre em altas concentrações de KCl, ativa preferencialmente CCVD.21 Os presentes resultados mostram que o tratamento das artérias com EHJ inibe a contração vascular induzida pelo estimulo adrenérgico com fenilefrina, o que sugere que o EHJ bloqueia o influxo de Ca²⁺ por interferir com CCVD e/ou CCOR.

Na tentativa de esclarecer o mecanismo celular pelo qual EHJ induz o relaxamento vascular, experimentos foram feitos em solução sem Ca²⁺. Foram usados dois estímulos diferentes para induzir o influxo de Ca²⁺, fenilefrina e KCl (75 mM). O EHJ, assim como o verapamil, usado como controle positivo, inibiu a contração induzida pelo influxo de Ca²⁺ mediado por ambos os estímulos. Como a despolarização de membrana com altas concentrações de K⁺ ativa especificamente CCDV, sugerimos que o EHJ direta ou indiretamente atue bloqueando o influxo de Ca²⁺ através da membrana plasmática, agindo preferencialmente no CCVD.

Produtos naturais têm constantemente demonstrado o envolvimento de canais de K⁺ no seu mecanismo de vasodilatação.22 Vários tipos de canais de K⁺ estão presentes no MLV, incluindo canais de K⁺ sensíveis ao ATP (K_ATP), canais de K⁺ ativados por Ca²⁺ (K_ca) e dependentes da voltagem (K_v).23^,24 Esses canais podem ser bloqueados por glibenclamida, clotrimazol e 4-AP, respectivamente.24^,25 O TEA é um bloqueador não seletivo desses canais. Quando são ativados, esses canais permitem o efluxo de K⁺, hiperpolarizando a membrana plasmática do MLV. Isso reduz o influxo de Ca²⁺ atravéz dos CCVD e induz vasodilatação.26^,27 O presente estudo mostra que o relaxamento induzido pelo EHJ em artérias sem endotélio é prejudicado após o bloqueio dos canais de K⁺. Exceto o clotrimazol, os outros bloqueadores prejudicaram o relaxamento vascular, o que permite relacionar sua ativação ao efeito do EHJ.

Nossos resultados apontam um novo efeito biológico da jabuticaba, espécie nativa do Brasil e que apresenta importantes efeitos biológicos já relatados sobre o sistema cardiovascular como hipoglicemiante,12 antilipidêmico13 e hipotensor.14 Portanto, os efeitos biológicos induzidos pela jabuticaba mostrados em nosso trabalho contribuirão para o conhecimento sobre compostos derivados dessa espécie e seu uso como planta medicinal ou alimento funcional aliado à prevenção de problemas cardiovasculares.

Conclusão

O presente estudo demonstra que o EHJ induz vasodilatação de forma independente do endotélio vascular. As principais vias celulares utilizadas pelo EHJ para causar o relaxamento vascular são a inibição do influxo de Ca²⁺ através da membrana plasmática além da ativação de canais de K⁺ das células do MLV.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pela FAPEG/GO.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Daniela Medeiros Lobo Andrade pela Faculdade de Farmácia - Universidade Federal de Goiás.

Agradecimentos

A Pesquisa foi financiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG), processo 201310267000013. O CNPq concedeu a bolsa de mestrado para Daniela L. M. de Andrade.