Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBCHHLrLMbrxPwgjyjT5YQH7DHS0066-782X2016004000033S0066-782X201600501510410.5935/abc.20160083Original ArticlesFractal Dimension in Quantifying Experimental-Pulmonary-Hypertension-Induced Cardiac Dysfunction in RatsPacagnelliFrancis Lopes12SabelaAna Karênina Dias de Almeida1MarianoThaoan Bruno1OzakiGuilherme Akio Tamura3CastoldiRobson Chacon4CarmoEdna Maria do3CarvalhoRobson Francisco5TomasiLoreta Casquel6OkoshiKatashi6VanderleiLuiz Carlos Marques3UNOESTECurso de FisioterapiaPresidente PrudenteSão PauloBrazilPós Graduação em Ciência Animal, Curso de Fisioterapia, UNOESTE, Presidente Prudente, São Paulo - BrazilUniversidade do Oeste PaulistaUNESPFCTPrograma de Pós DoutoradoPresidente PrudenteSão PauloBrazilPrograma de Pós Doutorado, FCT/UNESP, Presidente Prudente, São Paulo - BrazilUniversidade Estadual PaulistaUNESPFCTDepartamento de FisioterapiaPresidente PrudenteSão PauloBrazilDepartamento de Fisioterapia, FCT/UNESP, Presidente Prudente, São Paulo - BrazilUniversidade Estadual PaulistaUNOESTEDepartamento de Educação FísicaPresidente PrudenteSão PauloBrazilDepartamento de Educação Física UNOESTE, Presidente Prudente, São Paulo - BrazilUniversidade do Oeste PaulistaUNESPDepartamento de MorfologiaBotucatuSão PauloBrazilDepartamento de Morfologia, UNESP, Botucatu, São Paulo - BrazilUniversidade Estadual PaulistaUNESPFaculdade de MedicinaBotucatuSão PauloBrazilFaculdade de Medicina, UNESP, Botucatu, São Paulo - BrazilUniversidade Estadual PaulistaMailing Address: Francis Lopes Pacagnelli, Universidade do Oeste Paulista, Rodovia Raposo Tavares, km 572 - Bairro Limoeiro, Campus II. Postal Code 19067-175, Presidente Prudente, SP - Brazil. E-mail: francispacagnelli@unoeste.br, francispacagnelli@hotmail.com
Author contributions
Conception and design of the research: Pacagnelli FL, Carvalho RF, Okoshi K, Vanderlei LCM. Acquisition of data: Pacagnelli FL, Sabela AKDA, Mariano TB, Ozaki GAT, Castoldi RC, Carmo EM, Tomasi LC, Okoshi K. Analysis and interpretation of the data: Pacagnelli FL, Sabela AKDA, Mariano TB, Ozaki GAT, Castoldi RC, Carmo EM, Tomasi LC, Vanderlei LCM. Statistical analysis: Pacagnelli FL, Sabela AKDA, Vanderlei LCM. Writing of the manuscript: Pacagnelli FL, Carvalho RF, Vanderlei LCM. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Carvalho RF, Okoshi K, Vanderlei LCM.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
2405201607201610713339061020152810201523022016This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
Right-sided heart failure has high morbidity and mortality, and may be caused by pulmonary arterial hypertension. Fractal dimension is a differentiated and innovative method used in histological evaluations that allows the characterization of irregular and complex structures and the quantification of structural tissue changes.
Objective:
To assess the use of fractal dimension in cardiomyocytes of rats with monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension, in addition to providing histological and functional analysis.
Methods:
Male Wistar rats were divided into 2 groups: control (C; n = 8) and monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension (M; n = 8). Five weeks after pulmonary arterial hypertension induction with monocrotaline, echocardiography was performed and the animals were euthanized. The heart was dissected, the ventricles weighed to assess anatomical parameters, and histological slides were prepared and stained with hematoxylin/eosin for fractal dimension analysis, performed using box-counting method. Data normality was tested (Shapiro-Wilk test), and the groups were compared with non-paired Student t test or Mann Whitney test (p < 0.05).
Results:
Higher fractal dimension values were observed in group M as compared to group C (1.39 ± 0.05 vs. 1.37 ± 0.04; p < 0.05). Echocardiography showed lower pulmonary artery flow velocity, pulmonary acceleration time and ejection time values in group M, suggesting function worsening in those animals.
Conclusion:
The changes observed confirm pulmonary-arterial-hypertension-induced cardiac dysfunction, and point to fractal dimension as an effective method to evaluate cardiac morphological changes induced by ventricular dysfunction.
In experimental models, structural cardiac changes are usually identified by use of morphometric and/or histological analyses.1-3 Ventricular weight normalized to final body weight (FBW), obtained via morphometric analysis, has been used to characterize ventricular hypertrophy,4-7 while histological analysis has been used to characterize cardiac changes qualitatively, for example, inflammatory process, or quantitatively, by measuring cardiomyocyte area, blood vessels and interstitium.1,6
Another way to identify structural changes is fractal dimension, which allows the characterization of irregular structures in histological slides and the quantification of changes.8-12
To determine fractal dimension with histological analysis, box-counting is one of the most used techniques.13 It consists in sliding an r-sided square box over an image in an overlapping pattern, the square side r being progressively smaller; Nr is the number of r-sided squares necessary to overlap the image, at each side size chosen. Fractal dimension is the inclination of the regression line for the log-values of the box size ® and the number of squares (Nr).13
Fractal dimension has been used as a diagnostic tool for retinopathies, histopathological studies of neoplasms, morphometry of liver cells, liver fibrosis and cardiac studies.9,11,14 In addition, it has been used to assess the left ventricle of patients submitted to cardiac transplantation, contributing to quantify myocardial cellular rejection.13 However, to our knowledge, there is no study assessing fractal dimension in pulmonary arterial hypertension (PAH), a disease that can cause structural right ventricular (RV) modifications, inducing ventricular functional changes that affect the patients' functional capacity and quality of life.15,16 Of the experimental models to induce PAH, the one with monocrotaline, described by Lalich and Merkow in 1961, stands out; it is used to cause ventricular hypertrophy, RV dysfunction and heart failure.6,17-21 Monocrotaline is a pyrrolizidine alkaloid found in plants of the Crotalaria spectabilis species, which causes pulmonary endothelial injury, an increase in vasoconstrictors and thickening of vascular wall (mainly smooth muscle cells), leading to an increase in pulmonary resistance and RV overload.22,23
Method studies that, alone or along with cardiac histological assessment, can contribute to increase the accuracy in diagnosing ventricular dysfunction caused by PAH are fundamental.24 Right ventricular assessment in PAH by using fractal dimension can be useful to evaluate the physiopathology, as well as the influence of therapeutic interventions in that condition.
This study was aimed at assessing the use of fractal dimension in the cardiomyocytes of rats with monocrotaline-induced PAH, associated with histological and functional analysis. The hypothesis is that PAH induces ventricular dysfunction, which can be identified by use of fractal dimension.
MethodsAnimals
This study used 16 adult male Wistar rats, aged 4 months, weighing 358.5 g (±16.26 g), from the central vivarium of the Oeste Paulista University (UNOESTE), Presidente Prudente city, São Paulo. The animals were maintained in the Animal Experimentation Laboratory of the same institution, in plastic boxes measuring 41x34x16 cm (3 animals/box), at a temperature of 21°C to 23°C, and 50% to 60% relative humidity, with 12 hour light/dark cycles, light beginning at 7AM. The animals received water ad libitum and food preparation (Supralab, Alisul®, Brazil) proportionally to the amount consumed in the group treated with monocrotaline.
All experimental procedures used in this study abided by the principles of care for laboratory animals of the Brazilian College for Laboratory Animals (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal - COBEA), in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the National Research Council.25 This study was approved by the Ethics Committee of the UNOESTE (Protocol 1838).
Experimental design
Initially the animals were randomly distributed into two groups with eight animals each: control (C) group and monocrotaline (M) group. Group M animals received one single intraperitoneal dose of monocrotaline (60 mg/kg - Sigma Chemical, St Louis, MO, USA), while group C animals received an intraperitoneal saline solution injection (0.9% NaCl).
After 5 weeks, the rats underwent echocardiographic assessment, which identified PAH and RV dysfunction in group M. After that, the animals were weighed and euthanized with an overdose of sodium pentobarbital (50 mg/kg). The heart was removed, dissected and weighed. Then, histological slides were prepared for histological and fractal dimension assessment.
Induction of pulmonary hypertension
The protocol for PAH induction was performed in group M animals with injection of one single intraperitoneal dose of monocrotaline (Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) at the proportion of 60 mg/kg in 1 mol/L in HClph buffer 7.0 with 1 mol/l of NaOH.19
After receiving monocrotaline, the animals were separated into individual cages to measure their daily consumption of food preparation. Group M animals were fed ad libitum; however, their food preparation intake decreased because of RV dysfunction. Therefore, group C animals received the mean amount of food preparation consumed by group M animals.
Group C animals underwent an intraperitoneal saline solution injection (0.9% NaCl), to ensure all study animals would undergo the same degree of stress.
Echocardiographic functional assessment
The M mode echocardiography was performed with an echocardiographic device (Philips®, model HDI 5000, Netherlands) equipped with a 12 MHz electronic transducer,26 and the animals were anesthetized with intraperitoneal ketamine (60 mg/kg) and xylazine (1 mg/kg) hydrochloride.
Table 1 shows the parameters assessed: pulmonary acceleration time (PAT), maximum pulmonary artery velocity (PAVm) and ejection time (EJT).27
Right ventricular echocardiographic parameters expressed as mean ± standard deviation, median, minimum and maximum values of the groups studied
Variables
Group C
Group M
p value
PAVm (cm/s)
88.50 ± 4.68 (87.50) [81.00– 97.00]
69.33 ± 18.17 (74.00) [36.00– 78.00]
0.0275
PAT (ms)
29.00 ± 3.16 (29.00) [26.00–33.00]
21.00 ± 3.80 (22.00) [15.00–26.00]
0.0005
EJT (ms)
86.33 ± 3.26 (87.00) [81.00–89.00]
75.44 ± 9.81 (78.00) [63.00 –89.00]
0.022
C: control; M: monocrotaline; PAVm: maximum pulmonary artery velocity; PAT: pulmonary acceleration time; EJT: right ventricular ejection time; cm/s: centimeters per second; ms: milliseconds. (PAVm: non-paired t test; PAT and EJT: Mann-Whitney test)
Assessment of anatomic parameters
To assess the anatomic parameters, the heart was removed and dissected, and the atria (ATs) and right and left ventricles were separated and weighed. Humid right and left atrial weights and right and left ventricular weights (RAW, LAW, RVW and LVW, respectively) were normalized to the animal's FBW (RAW/FBW, LAW/FBW, RVW/FBW and LVW/FBW, respectively) and used as ventricular hypertrophy indices.4
Histology and histomorphometric analysis
Samples of the right ventricle were fixed in a 10% buffered formalin solution for 48 hours. After fixation, the tissue was embedded in paraffin blocks, and later two 4-micrometer coronal histological sections were obtained for each animal. The histological sections were stained with Hematoxylin-Eosin (HE) solution and mounted on glass slides. The cross-sectional areas of cardiomyocytes were assessed by using a LEICA microscope (DM750 model, Germany) coupled to a video camera that sends digital images to a computer equipped with a program of image analysis (Image Pro-plus - Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA).28,29
All images were captured at 40x magnification. The images to be captured and digitalized were visually selected. In the two RV sections from each animal, different fields were captured, chosen where the highest number of cells could be visualized on cross section. For each ventricle analyzed, 50 cells were measured.
The cardiomyocytes selected were transversally sectioned. They were round with a central nucleus, located in the subendocardial layer of the RV muscle wall. This was to maximize the uniformity of the set of cardiomyocytes in the different groups. The mean sectional areas obtained for each group were used as an indicator of cell size.29
Fractal dimension
To analyze the fractal dimension of the right ventricle, the photographed slides were binarized for reading, and the fractal dimension was estimated by using box-counting and the ImageJ image processing program (National Institutes of Health, USA), available free of charge at http://rsbweb.nih.gov/ij/.11
That program considers box-counting in two dimensions, allowing quantification of the distribution of pixels in the space, but does not consider image texture. Therefore, two images with the same distribution of pixels, one binarized and the other in shades of gray, will have the same fractal dimension. Thus, the analysis of the fractal histological slides is based on the relation between the resolution and the scale assessed, and the result can be quantitatively expressed as the fractal dimension of the object [FD = (Log Nr / log r-1), where Nr is the number of equal elements necessary to cover the original object, and r is the scale applied to the object (Figure 1).30 Therefore, the fractal dimension calculated with ImageJ program will always be between 0 and 2, not distinguishing different textures.
A) Histological section of the right ventricle stained with Hematoxylin and Eosin (HE), 40x magnification. B) Binarization process. C) HE image after binarization. Cell nuclei are stained black, while cytoplasm, cell membrane and other cell elements are white. D) Linear regression: sliding an r-sided square box over an image in an overlapping pattern, the box side r being progressively smaller; Nr is the number of r-sided boxes necessary to overlap the image, at each side size chosen. Fractal dimension is the inclination of the regression line for the two log values. Mann-Whitney test was used.
Statistical analysis
Data were expressed as mean ± standard deviation and median (minimum - maximum). To analyze data normality, Shapiro Wilk test was used. The groups were compared by using non-paired Student t test (PAVm, RVW/FBW, LVW/FBW and cardiomyocyte area) or Mann-Whitney test (PAT, EJT, RAW/FBW and fractal analysis), depending on data normality. The null hypothesis was rejected at 0.05 significance level. The analyses were performed with the GraphPad Prism® statistical program, version 5.0.
ResultsEchocardiographic functional assessment
Table 1 shows the RV echocardiographic parameters of the groups assessed. Group M animals showed increased pulmonary arterial pressure and RV functional worsening.
Assessment of anatomical and histomorphometric parameters
Table 2 shows the anatomical and histomorphometric data of groups C and M. Group M had higher values of atrialW/FBW and RV/FBW indices than group C. A significant increase in the cross-sectional area of RV cardiomyocytes was also observed in group M animals (Table 2).
Anatomical and histomorphometric data expressed as mean ± standard deviation, median, minimum and maximum values of the groups studied
VARIABLES
Group C
Group M
P value
AW/FBW (g)
0.20 ± 0.03 (0.2) [0.18 - 0.28]
0.35 ± 0.16 (0.31) [0.20 - 0.70]
0.0030
RVW/FBW (g)
0.44 ± 0.05 (0.43) [0.37 - 0.53]
0.81 ± 0.30 (0.78) [0.47 - 1.18]
0.0040
LVW/FBW (g)
1.85 ± 0.07 (1.85) [1.73 - 1.95]
1.87 ± 0.11 (1.86) [1.72 - 2.00]
0.7072
Area (μm2)
61.49 ± 7.47 (58.62) [54.91–75.11]
103.90 ± 20.82 (106.4) [78.20 – 129.50]
0.0001
C: control; M: monocrotaline; AW: atrial weight; FBW: final body weight; RVW: right ventricular weight; LVW: left ventricular weight; g: grams. (AW/FBW: Mann-Whitney test; RVW/FBW, LVW/FBW and Area - non-paired t test)
On postmortem examination, group M animals showed no signs of heart failure, such as ascitis, pleural effusion, and liver congestion.
Fractal dimension
Group M had higher fractal dimension values than group C (1.43 ± 0.06 vs. 1.37 ± 0.045; p = 0.0012; Figure 2).
The results of the present study show that monocrotaline-induced PAH in rats caused an increase in RV fractal dimension, in addition to RV hypertrophy and contractile function worsening.
Experimental models of PAH are often used to assess and understand the pathophysiological mechanisms of that disease.5,6,19,31 The use of monocrotaline to induce PAH is a well-established model.32 Monocrotaline induces injury to the pulmonary capillaries, with an increase in pulmonary vascular resistance and ventricular afterload, causing progressive pathological RV remodeling with hypertrophy induction, increased interstitial fibrosis, cardiac dysfunction and heart failure.33
Group M animals had RV hypertrophy and developed cardiac dysfunction with RV systolic function worsening, suggesting the development of PAH and confirming the role of monocrotaline in triggering that disease. In addition, other studies using the same experimental model in rats have reported RV hypertrophy and myocardial contractile function worsening.5,6,19,31
The fractal dimension of the animals with PAH increased as compared to that of controls, suggesting that animals with RV hypertrophy and cardiac dysfunction have higher fractal dimension. To our knowledge, this is the first study assessing fractal dimension in RV dysfunction caused by monocrotaline-induced PAH in rats.
Fractal dimension is a useful method to characterize irregular structures.34 It counts the effective number of degrees of freedom in the dynamic system, quantifying, therefore, its complexity.8,13 One can infer that images evidencing higher fractal dimension are, thus, more complex.8,10,13
Histological changes caused by RV overload alter the amount and distribution of the information contained in the histological slide. The most commonly used histological methods to analyze cardiac remodeling assess either the structures qualitatively or depend on the proper visualization of particular aspects, such as cross-sectional cardiomyocyte location.3,19,29 In that context, fractal dimension would prevent that difficulty by adding a numerical value to the analysis, thus, allowing quantification of tissue structural changes. In addition, that method prevents possible errors of interobserver variations.11
Fractal dimension has been used in several medical areas, such as oncology, neurology, ophthalmology, radiology and cardiology,9,10 to characterize and identify irregular and complex structures.11 In addition, fractal concepts have been incorporated into models of biological processes, such as epithelial cell growth, detection of DNA encoding regions, blood vessel growth, periodontal disease and viral infections.8,34
The results of this study indicate that fractal dimension analysis can be used to characterize cardiac ventricular changes in such a prevalent and disabling disease as PAH is.
It is worth noting that, at an initial phase of cardiac remodeling without heart failure, which is the progression of PAH, fractal dimension analysis was sensitive to detect ventricular changes, showing its importance to the early identification of those changes.
One limitation of this study is that fractal dimension quantifies the degree of complexity of the image, and, thus, that technique compares to neither Western-Blot nor RT-qPCR, which can quantify the total level of proteins and myocardial gene expression, but neither its distribution nor degree of complexity in the tissue.
Further studies are necessary in human beings with PAH in the phase of ventricular dysfunction to validate and corroborate the results of this study, and, thus to widen the knowledge on that disease and on new clinical perspectives for its early treatment.
Conclusion
The results confirm the PAH-induced cardiac dysfunction and point to the fractal dimension increase in cardiomyocytes of rats with monocrotaline-induced PAH, fractal dimension being an effective method to assess cardiac morphological changes induced by ventricular dysfunction.
Sources of Funding
There were no external funding sources for this study.
Study Association
This article is part of the stage of Post Doctoral submitted by Francis Lopes Pacagnelli, from Faculty of Science and Technology / Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - FCT / Unesp - Presidente Prudente, Brazil.
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CEP 19067-175, Presidente Prudente, SP - Brasil. E-mail: francispacagnelli@unoeste.br, francispacagnelli@hotmail.com
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: Pacagnelli FL, Carvalho RF, Okoshi K, Vanderlei LCM. Obtenção de dados: Pacagnelli FL, Sabela AKDA, Mariano TB, Ozaki GAT, Castoldi RC, Carmo EM, Tomasi LC, Okoshi K. Análise e interpretação dos dados: Pacagnelli FL, Sabela AKDA, Mariano TB, Ozaki GAT, Castoldi RC, Carmo EM, Tomasi LC, Vanderlei LCM. Análise estatística: Pacagnelli FL, Sabela AKDA, Vanderlei LCM. Redação do manuscrito: Pacagnelli FL, Carvalho RF, Vanderlei LCM. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Carvalho RF, Okoshi K, Vanderlei LCM.
Potencial Conflito de Interesse
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamento:
Insuficiência cardíaca direita apresenta grande morbimortalidade e pode ser causada por hipertensão arterial pulmonar. Um método diferenciado e inovador utilizado em avaliações histológicas é a dimensão fractal, que permite a caracterização de estruturas irregulares e complexas e pode quantificar alterações estruturais dos tecidos.
Objetivo:
Avaliar a utilização do método da dimensão fractal nos cardiomiócitos de ratos com hipertensão arterial pulmonar induzida por monocrotalina, associada com análise histológica e funcional.
Métodos:
Ratos Wistar machos foram divididos em 2 grupos: controle (C; n = 8) e hipertensão arterial pulmonar induzida por monocrotalina (M; n = 8). Após 5 semanas da indução da hipertensão arterial pulmonar pela monocrotalina, foi realizado ecocardiograma. Os animais foram eutanasiados, o coração dissecado e os ventrículos pesados para avaliação dos parâmetros anatômicos. Lâminas histológicas foram confeccionadas, coradas com hematoxilina/eosina para análise da dimensão fractal, realizada pelo método box-counting . Inicialmente foi testada a normalidade dos dados (teste Shapiro Wilk) e a comparação entre os grupos foi por meio do teste t de Student não pareado ou teste de Mann Whitney (p < 0,05).
Resultados:
Maiores valores da dimensão fractal foram observados no grupo M em comparação ao C (1,43 ± 0,06 vs. 1,37 ± 0,04; p < 0,05). O ecocardiograma apontou menores valores no grupo M para velocidade máxima pulmonar, tempo de aceleração pulmonar e tempo de ejeção, sugerindo piora funcional nesses animais, que também apresentaram hipertrofia cardíaca.
Conclusão:
As alterações observadas comprovam a disfunção cardíaca induzida pela hipertensão arterial pulmonar e apontam que a dimensão fractal é um método eficaz para avaliar alterações morfológicas cardíacas induzidas pela disfunção ventricular.
Em modelos experimentais, as alterações estruturais cardíacas são, em geral, identificadas por meio de análises morfométricas e/ou histológicas.1-3 O peso do ventrículo normalizado pelo peso corporal final (PCF), obtidos pela análise morfométrica, tem sido utilizado para caracterizar hipertrofia ventricular,4-7 enquanto que, a análise histológica é utilizada para caracterizar alterações cardíacas de forma qualitativa, como por exemplo, processo inflamatório, ou quantitativa, por meio de mensurações da área do cardiomiócito, vasos sanguíneos e interstício.1,6
Outra forma de avaliação utilizada para identificar alterações estruturais é a dimensão fractal, que permite caracterizar estruturas irregulares em lâminas histológicas e quantificar as alterações existentes.8-12
Para análise em lâminas histológicas, a técnica do box-counting é uma das mais utilizadas para determinação da dimensão fractal.13 Nessa técnica, utiliza-se a sobreposição da imagem com quadrados de lados r progressivamente menores e, nesse caso, Nr é a quantidade de quadrados de lado r necessários para cobrir a imagem, a cada tamanho escolhido. A dimensão fractal será a inclinação da linha de regressão dos log-valores do tamanho do lado r e da quantidade de quadrados Nr.13
A dimensão fractal tem sido utilizada como ferramenta diagnóstica de retinopatias, estudos histopatológicos de neoplasias, morfometria de hepatócitos, fibrose hepática e estudos cardíacos.9,11,14 Além disso, ela já foi utilizada para avaliar o ventrículo esquerdo (VE) de humanos submetidos a transplante cardíaco e mostrou sua contribuição na quantificação da rejeição celular miocárdica.13 No entanto, não é de nosso conhecimento estudos que avaliem a dimensão fractal na hipertensão arterial pulmonar (HAP), doença que pode promover modificações estruturais do ventrículo direito (VD) induzindo alterações na função ventricular, que comprometem a capacidade funcional e a qualidade de vida desses indivíduos.15,16 Entre os modelos experimentais para induzir HAP, destaca-se a monocrotalina, descrita inicialmente por Lalich e Merkow em 1961,17 sendo bastante utilizada para promover hipertrofia ventricular, disfunção do VD e insuficiência cardíaca.6,17-21 A monocrotalina é um alcaloide pirrolizidínico encontrado em plantas da espécie Crotalaria spectabilis, que ocasiona lesão endotelial vascular pulmonar, com aumento de vasoconstritores, espessamento da parede do vaso (principalmente células musculares lisas) e conduz a aumento da resistência pulmonar e sobrecarga ao VD.22,23
Estudos de método que, isoladamente ou em conjunto com a avaliação histológica cardíaca, possam contribuir para uma maior precisão no diagnóstico de disfunção ventricular ocasionadas pela HAP são fundamentais.24 A avaliação do VD na HAP por meio da dimensão fractal pode ser um método diagnóstico útil para avaliação fisiopatológica, bem como da influência de intervenções terapêuticas nessa condição.
Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a utilização do método da dimensão fractal nos cardiomiócitos de ratos com HAP induzida pela monocrotalina, associada com análise histológica e funcional. Hipotetiza-se que a HAP induza disfunção ventricular que possa ser identificada pela dimensão fractal.
MétodosAnimais
Para realização deste estudo, foram utilizados 16 ratos Wistar machos adultos, com 4 meses de idade, pesando 358,5 g (±16,26 g) provenientes do Biotério Central da Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE de Presidente Prudente - São Paulo. Os animais foram mantidos no Laboratório de Experimentação Animal da mesma instituição, em caixas plásticas com dimensão 41x34x16 cm (3 animais/caixa), à temperatura de 21°C a 23°C e umidade relativa de 50% a 60%, com ciclos de luminosidade de 12h (claro/escuro) com início do ciclo claro às 7h. Os animais receberam ração (Supralab, Alisul®, Brasil) de forma proporcional ao que o grupo monocrotalina consumia e água ad libitum.
Todos os procedimentos experimentais utilizados neste estudo estão em conformidade com os princípios de cuidados com animais de laboratório formulados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), conforme o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicado pelo National Research Council25 e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE (Protocolo 1838).
Desenho experimental
Para realização do estudo, inicialmente os animais foram distribuídos de forma aleatória em 2 grupos com 8 animais cada, denominados de grupo controle (C) e grupo monocrotalina (M). Após a distribuição, os animais do grupo M receberam uma dose única de monocrotalina (Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA) intraperitoneal (60 mg/kg), enquanto os animais C receberam uma injeção intraperitoneal de solução salina (NaCl 0,9%).
Após 5 semanas, os ratos foram submetidos a uma avaliação ecocardiográfica, que constatou a presença da HAP e disfunção ventricular direita no grupo M. Após a avaliação ecocardiográfica, os animais foram pesados e eutanasiados com overdose de pentobarbital sódico (50 mg/kg). O coração foi então removido, dissecado e pesado. Posteriormente, lâminas histológicas foram preparadas para avaliação histológica e da dimensão fractal.
Indução da hipertensão pulmonar
O protocolo para indução da HAP foi realizado nos animais do grupo M com injeção de uma única dose intraperitoneal da monocrotalina (Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA) na proporção 60 mg/kg em 1 mol/l em tampão HClph 7.0 com 1 mol/l de NaOH.19
Após a administração da monocrotalina, os animais foram separados em gaiolas individuais para dosar o consumo de ração diário. O grupo M recebeu comida a vontade. Como os animais desse grupo vão diminuindo o consumo de ração devido à disfunção ventricular direita, os animais do grupo C receberam a média de consumo de ração dos animais do grupo M.
Nos animais do grupo C, foi realizada administração intraperitoneal de solução salina (NaCl 0,9%), para que todos os animais fossem avaliados com o mesmo grau de estresse.
Avaliação funcional ecocardiográfica
Para o exame ecocardiográfico em Modo M, foi utilizado um ecocardiógrafo (Philips®, modelo HDI 5000, Holanda) equipado com um transdutor eletrônico de 12 MHz.26 Para sua realização, os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina (60 mg/kg) e cloridrato de xilidina (1 mg/kg) via intraperitoneal.
Os parâmetros avaliados foram o tempo de aceleração pulmonar (TAcPulm), velocidade máxima da artéria pulmonar (VMáxPulm) e tempo de ejeção (TEJ)27 (Tabela 1).
Parâmetros ecocardiográficos do ventrículo direito expressos em média ± desvio padrão, mediana, mínimo e máximo, dos grupos estudados.
Variáveis
Grupo C
Grupo M
p valor
VMáxPul (cm/s)
88,50 ± 4,68 (87,50) [81,00– 97,00]
69,33 ± 18,17 (74,00) [36,00– 78,00]
0,0275
TAcPul (ms)
29,00 ± 3,16 (29,00) [26,00–33,00]
21,00 ± 3,80 (22,00) [15,00–26,00]
0,0005
TEJ (ms)
86,33 ± 3,26 (87,00) [81,00–89,00]
75,44 ± 9,81 (78,00) [63,00 –89,00]
0,022
C: controle; M: monocrotalina; VMáxPul: velocidade máxima da artéria pulmonar; TAcPul: tempo de aceleração pulmonar; TEJ: tempo de ejeção do ventrículo direito; cm/s: centímetros por segundo; ms: milissegundos. (VMáxPul: teste t não pareado; TAcPul e TEJ: teste de Mann-Whitney).
Avaliação dos parâmetros anatômicos
Para avaliação dos parâmetros anatômicos, após a eutanásia, o coração foi retirado, dissecado, separado em átrios (ATs), VD e VE e pesados. Os pesos úmidos dos ATs, VD e VE foram normalizados pelo PCF do animal, que foi utilizado como índice de hipertrofia ventricular.4
Histologia e análise histomorfométrica
Amostras do VD foram fixadas em solução de formol tamponado a 10% por um período de 48 horas. Após fixação, o tecido foi incluso em blocos de parafina, obtendo-se a seguir dois cortes histológicos coronais de 4 micrômetros de cada animal. Os cortes histológicos foram corados em lâmina com solução de Hematoxilina-Eosina (HE) para aferição de áreas da secção transversa dos cardiomiócitos, empregando-se microscópio LEICA (modelo DM750, Alemanha) acoplado a câmera de vídeo, que envia imagens digitais a um computador dotado de programa de análise de imagens Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, EUA).28,29
Todas as imagens foram capturadas no aumento de 40x. A seleção das imagens para captura e digitalização foi feita visualmente. De cada um dos dois cortes obtidos do VD de cada animal foram realizadas capturas de campos diferentes, escolhidos de acordo com o local onde se pudessem visualizar mais células em corte transversal. Foram mensuradas 50 células por ventrículo analisado.
Os cardiomiócitos selecionados estavam seccionados transversalmente e apresentavam forma redonda, núcleo visível no centro da célula e localizavam-se na camada subendocárdica da parede muscular do VD. Esse cuidado visou uniformizar ao máximo o conjunto de cardiomiócitos dos diferentes grupos. As áreas seccionais médias obtidas para cada grupo foram utilizadas como indicador do tamanho celular.29
Dimensão fractal
Para análise da dimensão fractal do VD, as lâminas fotografadas foram binarizadas para leitura e a dimensão fractal estimada pelo método box-counting, por meio do software Image J (Instituto Nacional de Saúde, Estados Unidos - NIH), disponível gratuitamente na Internet (http://rsbweb.nih.gov/ij/).11
O software considera o box-counting em duas dimensões, permitindo a quantificação da distribuição de pixels nesse espaço, não considerando, portanto, a textura da imagem. A influência disso é que duas imagens com a mesma distribuição dos pixels, uma binarizada e outra em níveis de cinza, possuirão a mesma dimensão fractal. Dessa forma, a análise das lâminas histológicas fractais baseia-se na relação entre a resolução e a escala avaliada, e o resultado pode ser quantitativamente expresso como a dimensão fractal do objeto que é DF= (Log Nr / log r-1), sendo Nr a quantidade de elementos iguais necessários para preencher o objeto original e r a escala aplicada ao objeto (Figura 1).30 Com isso, a dimensão fractal calculada com o software Image J ficará sempre entre 0 e 2, não distinguindo texturas diferentes.
A) Corte histológico do ventrículo direito corados em Hematoxilina e Eosina (HE), aumento 40x. B) Processo de binarização. C) Imagem de HE após o processo de binarização. Observam-se os núcleos celulares em preto e todo o restante da célula (citoplasma, membrana plasmática e outros elementos), em branco. D) Regressão linear pela sobreposição de quadrados (N) de lados (r) progressivamente menores, sendo Nr a quantidade de quadrados de lado r necessários para cobrir a imagem, a cada tamanho escolhido. A dimensão fractal é a inclinação da linha de regressão dos valores dos dois log. Foi utilizado o teste de Mann Whitney.
Análise estatística
Os dados foram expressos em média ± desvio padrão e mediana (mínimo - máximo). Para análise da normalidade dos dados, foi utilizado o teste de Shapiro Wilk. As comparações entre os grupos foram feitas por meio do teste t de Student não pareado (VMáxPulm, VD/PCF, VE/PCF e área dos cardiomiócitos) ou teste de Mann-Whitney (TAcPulm, TEJ, AD/PCF e análise fractal), dependendo da normalidade dos dados. A hipótese zero foi rejeitada ao nível de 5%. As análises foram realizadas no programa estatístico GraphPad Prism® versão 5.0.
ResultadosAvaliação funcional ecocardiográfica
Na Tabela 1 estão descritos os parâmetros ecocardiográficos do VD dos grupos analisados. Houve aumento da pressão arterial pulmonar e piora funcional do VD nos animais que receberam monocrotalina.
Avaliação dos parâmetros anatômicos e histomorfometria
A Tabela 2 mostra os dados anatômicos e histomorfométricos dos grupos C e M. Maiores valores para os índices átrio/PCF e VD/PCF foram observados no grupo M em comparação ao grupo C. Aumento significativo da área seccional dos cardiomiócitos do VD foi também observado nos animais do grupo M (Tabela 2).
Dados anatômicos e histomorfométricos expressos em média ± desvio padrão, mediana, mínimo e máximo dos grupos estudados.
Variáveis
Grupo C
Grupo M
p valor
ÁTRIO/PCF (g)
0,20 ± 0,03 (0,2) [0,18 - 0,28]
0,35 ± 0,16 (0,31) [0,20 - 0,70]
0,0030
VD/PCF (g)
0,44 ± 0,05 (0,43) [0,37 - 0,53]
0,81 ± 0,30 (0,78) [0,47 - 1,18]
0,0040
VE/PCF (g)
1,85 ± 0,07 (1,85) [1,73 - 1,95]
1,87 ± 0,11 (1,86) [1,72 - 2,00]
0,7072
Área (μm2)
61,49 ± 7,47 (58,62) [54,91–75,11]
103,90 ± 20,82 (106,4) [78,20 – 129,50]
0,0001
C: controle; M: monocrotalina; PCF: peso corporal final; VD: ventrículo direito; VE: ventrículo esquerdo; g: gramas. (ÁTRIO/PCF: teste de Mann-Whitney; VD/PCF, VE/PCF e área - teste t não pareado)
Os animais que receberam a monocrotalina não apresentaram sinais de insuficiência cardíaca, como ascite, derrame pleural e congestão hepática, no exame pós-morte.
Dimensão fractal
Maiores valores da dimensão fractal foram observados no grupo M em comparação ao grupo C (1,43 ± 0,06 vs. 1,37 ± 0,045; P= 0,0012; Figura 2).
Análise da dimensão fractal. C: controle; M: monocrotalina; * p < 0,05. (teste de Mann Whitney)
Discussão
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que a HAP induzida por monocrotalina em ratos promoveu aumento da dimensão fractal no VD, juntamente com a hipertrofia e piora da função contrátil do VD.
Modelos experimentais de HAP são muito utilizados para o estudo e compreensão dos mecanismos fisiopatológicos dessa doença,5,6,19,31 e o uso da monocrotalina para sua indução é um modelo bem estabelecido e utilizado na literatura.32 A monocrotalina induz lesão dos capilares pulmonares com aumento da resistência vascular pulmonar e da pós-carga ventricular, ocasionando, progressivamente, a remodelação patológica do VD com indução de hipertrofia, aumento da fibrose intersticial, disfunção e insuficiência cardíaca.33
Os animais desse estudo que receberam monocrotalina apresentaram hipertrofia do VD e desenvolveram disfunção cardíaca com piora da função sistólica do VD, o que sugere o desenvolvimento de HAP e confirmam a ação da monocrotalina em desenvolver essa doença. Outros estudos utilizando o mesmo modelo experimental em ratos também observaram hipertrofia do VD e piora da função contrátil miocárdica.5,6,19,31
A análise da dimensão fractal demonstrou que os animais com HAP apresentaram aumento da dimensão fractal em comparação aos animais controle, sugerindo que animais que apresentam hipertrofia do VD e disfunção cardíaca possuem maior dimensão fractal. Pelo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que avaliou a dimensão fractal na disfunção ventricular direita ocasionada por HAP induzida por monocrotalina em ratos.
A dimensão fractal é um método útil para a caracterização de estruturas irregulares,34 que conta o número efetivo de graus de liberdade no sistema dinâmico e, portanto, quantifica a sua complexidade.8,13 Assim, infere-se que imagens evidenciando maior dimensão fractal sejam, consequentemente, mais complexas.8,10,13
Alterações histológicas provocadas por sobrecarga do VD alteram a quantidade e distribuição de informação contida na lâmina histológica. Os métodos histológicos mais comumente utilizados para análise da remodelação cardíaca avaliam as estruturas qualitativamente ou dependem da adequada visualização de aspectos particulares, como a localização transversal do cardiomiócito.3,19,29 Nesse contexto, a dimensão fractal evitaria essa dificuldade ao adicionar um valor numérico à análise e, portanto, permitiria a quantificação das alterações estruturais teciduais. Além disso, a utilização desse método permite evitar possíveis erros de variações entre observadores.11
A dimensão fractal já foi utilizada em várias áreas da medicina, como oncologia, neurologia, oftalmologia, radiologia e cardiologia,9,10 sendo útil na caracterização e identificação de estruturas irregulares e complexas.11 Conceitos fractais também têm sido incorporados em modelos de processos biológicos, incluindo o crescimento de células epiteliais, detecção de regiões de codificação de DNA, crescimento de vasos sanguíneos, doença periodontal e infecções virais.8,34
Os resultados deste estudo apontam que a análise da dimensão fractal também pode ser utilizada para caracterização de alterações ventriculares cardíacas em uma doença tão prevalente e incapacitante como a HAP.
É importante salientar que mesmo em uma fase inicial da remodelação cardíaca sem a presença de insuficiência cardíaca, que é a progressão da HAP, a análise da dimensão fractal foi sensível para detectar as alterações ventriculares, o que demonstra também a sua importância na identificação precoce de alterações ventriculares.
Como limitação do estudo pode-se apontar que a dimensão fractal quantifica o grau de complexidade da imagem, assim, essa técnica não é comparável com o Western-Blot ou RT-qPCR, já que essas podem quantificar o valor total das proteínas e expressão gênica miocárdica e não sua distribuição ou seu grau de complexidade no tecido.
Outros estudos são necessários em humanos com HAP na fase de disfunção ventricular para validar e reforçar os resultados encontrados nesta pesquisa e assim ampliar o conhecimento nesta doença e novas perspectivas clínicas para seu tratamento precoce.
Conclusão
Os resultados comprovam a disfunção cardíaca induzida pela HAP e apontam aumento da dimensão fractal nos cardiomiócitos de ratos com HAP induzida pela monocrotalina, sendo a dimensão fractal um método eficaz para avaliar alterações morfológicas cardíacas induzidas pela disfunção ventricular.
Fontes de Financiamento
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Vinculação Acadêmica
Este artigo é parte do estágio de Pós Doutorado de Francis Lopes Pacagnelli pela Faculdade de Ciências e Tecnologia/Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - FCT/Unesp - Presidente Prudente.