Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC 9c3tGFbPs9xzWFbgKX8JRwM S0066-782X2016000600481 S0066-782X2016005011102 10.5935/abc.20160058 Original Articles The Labdane Ent-3-Acetoxy-Labda-8(17), 13-Dien-15-Oic Decreases Blood Pressure In Hypertensive Rats Simplicio Janaina A. 1 3 Simão Marilia R. 2 Ambrosio Sergio R. 2 Tirapelli Carlos R. 3 Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Programa de Pós-Graduação em Farmacologia Ribeirão Preto SP Brazil Programa de Pós-Graduação em Farmacologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, SP Universidade de São Paulo Universidade de Franca Núcleo de Pesquisa em Ciências e Tecnologia Franca SP Brazil Núcleo de Pesquisa em Ciências e Tecnologia - Universidade de Franca (UNIFRAN), Franca, SP Universidade de Franca USP Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto Laboratório de Farmacologia Ribeirão Preto SP Brazil Departamento de Enfermagem Psiquiátrica e Ciências Humanas - Laboratório de Farmacologia - Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto (USP), Ribeirão Preto, SP - Brazil Universidade de São Paulo Mailing Address: Carlos Renato Tirapelli, Universidade de São Paulo - Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto - Avenida Bandeirantes 3900, Postal Code 14040-902, Ribeirão Preto, SP - Brazil. E-mail: crtirapelli@eerp.usp.br, crtlilo@hotmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Simplicio JA, Tirapelli CR; Acquisition of data: Simplicio JA, Simão MR; Analysis and interpretation of the data: Simplicio JA, Simão MR, Ambrosio SR, Tirapelli CR; Statistical analysis: Simplicio JA; Obtaining financing: Tirapelli CR; Writing of the manuscript: Simplicio JA; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Ambrosio SR, Tirapelli CR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 19 4 2016 6 2016 106 6 481 490 21 10 2015 28 10 2015 23 02 2016 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Labdane-type diterpenes induce lower blood pressure via relaxation of vascular smooth muscle; however, there are no studies describing the effects of labdanes in hypertensive rats.

 Objective:

The present study was designed to investigate the cardiovascular actions of the labdane-type diterpene ent-3-acetoxy-labda-8(17), 13-dien-15-oic acid (labda-15-oic acid) in two-kidney 1 clip (2K-1C) renal hypertension.

 Methods:

Vascular reactivity experiments were performed in aortic rings isolated from 2K-1C and normotensive (2K) male Wistar rats. Nitrate/nitrite (NOx) measurement was performed in aortas by colorimetric assay. Blood pressure measurements were performed in conscious rats.

 Results:

Labda-15-oic acid (0.1-300 µmol/l) and forskolin (0.1 nmol/l - 1 µmol/l) relaxed endothelium-intact and endothelium-denuded aortas from both 2K-1C and 2K rats. Labda-15-oic acid was more effective at inducing relaxation in endothelium-intact aortas from 2K pre-contracted with phenylephrine when compared to the endothelium-denuded ones. Forskolin was more potent than labda-15-oic acid at inducing vascular relaxation in arteries from both 2K and 2K-1C rats. Labda-15-oic acid-induced increase in NOx levels was lower in arteries from 2K-1C rats when compared to 2K rats. Intravenous administration of labda-15-oic acid (0.3-3 mg/kg) or forskolin (0.1-1 mg/kg) induced hypotension in conscious 2K-1C and 2K rats.

 Conclusion:

The present findings show that labda-15-oic acid induces vascular relaxation and hypotension in hypertensive rats.

 Keywords: Labdane Vascular Relaxation Diterpene Forskolin Renovascular Hypertension Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2010/01009-3 2011/13630-7 Introduction

The treatment of arterial hypertension with plant-derived products is well described in the literature.1-4 A great number of medicinal plants with antihypertensive activity have been chemically investigated and diterpenoids are pointed out as their major constituents. For this reason, many studies have focused on the cardiovascular properties of these compounds. For example, the labdane-type diterpene forskolin (7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alpha,6 beta,9 alpha-trihydroxy-labd-14-ene-11-one) lowers blood pressure by a mechanism that involves relaxation of vascular smooth muscle.5-8 In the vasculature, forskolin activates the enzyme adenylyl cyclase, which in turn increases the production of cAMP and cAMP-dependent protein kinase (PKA) activation.9 Calcium extrusion across the plasma membrane and vascular smooth muscle hyperpolarization are mechanisms also related to the vascular actions of forskolin10. In humans, intravenous administration of forskolin decreased vascular resistance and reduced diastolic blood pressure (DBP).7,8

Other labdane-type diterpenes, such as labdane 8(17), 12E, 14-labdatrien-18-oic acid and labd-8 (17)-en-15-oic acid were also described to induce vascular relaxation and hypotension in normotensive rats.11,12 We have recently described that the labdane ent-3-acetoxy-labda-8(17),13-dien-15-oic acid (labda-15-oic acid) induced vascular relaxation via blockade of Ca2+ influx, activation of the endothelial nitric oxide (NO)-cGMP pathway and the opening of K+ channels.13 Intravenous injection of labda-15-oic acid induced a decrease in blood pressure in normotensive rats and this response was partially attenuated by L-NAME, suggesting a role for NO in such response.13 It is important to note that lower doses of labda-15-oic acid (0.3 - 3 mg/kg) were needed to induce hypotension when compared to other labdanes previously tested, such as 8 (17), 12E, 14-labdatrien-18-oic acid (5-30 mg/kg)11 and labd-8 (17)-en-15-oic acid (1-10 mg/kg).12 On the basis of these initial results with labda-15-oic acid, we hypothesized that this compound would induce vascular relaxation and hypotension in hypertensive rats. In the present study we sought to evaluate the cardiovascular actions of labda-15-oic acid in hypertensive animals.

 Methods Isolation of labda-15-oic acid

The isolation of labda-15-oic acid was performed as previously described.14 One hundred grams of oleoresin was chromatographed over silica gel 60 H (Merck, art. 7736) using vacuum liquid chromatography (VLC) with increasing amounts of ethyl acetate (EtOAc) in n-hexane as eluent. This procedure furnished six fractions (2000 ml each) that were named F1 (34.7 g; n-hexane), F2 (13.5 g; 20% EtOAc), F3 (11.4 g; 40% EtOAc), F4 (9.7 g; 60% EtOAc), F5 (7.6 g; 80% EtOAc), and F6 (17.8 g; EtOAc) after solvent evaporation. Fraction F4 was initially chromatographed by VLC over silica gel 60 H (Merck, art. 7736) as described above, to give additional fractions (F4.1 to F4.5). Labda-15-oic acid (1132.0 mg) was obtained from F4.3 through medium pressure chromatography (flash chromatography) using silica gel 60 (Merck, art. 9385), isocratic n-hexane: EtOAc:CHCl3 (5:2:3) as mobile phase, and a flow rate of 5 ml/min.15 The purity of (-)-acetoxycopalic acid (98%) was estimated by HPLC, mass spectrometric analysis and 1H and 13C NMR spectral data.

 Renovascular hypertension

Renovascular hypertension was induced in rats as previously described. Briefly, male Wistar rats weighting between 180 and 200 g (35 days old) were anaesthetised with tribromoethanol (250 mg/kg, i.p.) and after a midline laparotomy, a silver clip with an internal diameter of 0.2 mm was placed around the left renal artery. Normotensive two kidney (2K) rats were submitted to laparotomy only. Systolic blood pressure (SBP) was measured before and after 6 weeks of midline laparotomy in non anaesthetized animals by pletysmography (tail-cuff) and rats were considered to be hypertensive when SBP was higher than 160 mmHg. At 6 weeks after surgery, rats were killed and the thoracic aortas were isolated.16 A total of 26 2K rats and 28 2K-1C rats were used in the present study. All protocols were approved by the Ethical Animal Committee of the Campus of Ribeirão Preto - University of São Paulo (#09.1.1007.53.0).

 Vessel ring preparation

The thoracic aorta was quickly removed, cleaned of adherent connective tissues and cut into rings (5-6 mm in length). Two stainless-steel stirrups were passed through the lumen of each ring. One stirrup was connected to an isometric force transducer (TRI201; Panlab, Spain) to measure tension in the vessels. The rings were placed in a 5 ml organ chamber that contained Krebs solution, gassed with 95% O2 / 5% CO2 maintained at 37°C. The composition of Krebs solution was as follows (mmol/l): NaCl, 118.0; KCl, 4.7; KH2PO4, 1.2; MgSO4, 1.2; NaHCO3, 15.0; Glucose, 5.5; CaCl2, 2.5. The rings were stretched until they reached a basal tension of 1.5 g, which was determined by length-tension relationship experiments and were then allowed to equilibrate for 60 min; during this time, the bath fluid was changed every 15-20 min. For some rings, the endothelium was removed mechanically by gently rolling the lumen vessel on a thin wire. Endothelial integrity was assessed qualitatively by the degree of relaxation caused by acetylcholine (1 µmol/l) in the presence of contractile tone induced by phenylephrine (0.1 µmol/l). For studies of endothelium-intact vessels, a ring was discarded if relaxation with acetylcholine was not 50% or greater. For studies of endothelium-denuded vessels, a ring was discarded if there was any degree of relaxation. Agonist concentration-response curves were fitted using a nonlinear interactive fitting program (Graph Pad Prism 3.0; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Agonist potencies and maximal responses were expressed as pD2 (-logEC50) and Emax (maximum effect elicited by the agonist), respectively.

 Effect of labda-15-oic acid on aortic rings contracted with phenylephrine or KCl

Steady tension was evoked by phenylephrine (concentrations of 0.1 µmol/l for endothelium-intact rings and 0.03 µmol/l for endothelium-denuded rings were used to induce contractions of similar magnitude), and labda-15-oic acid was then added in a stepwise fashion (0.1-300 µmol/l). The effect of labda-15-oic acid on KCl-induced sustained contraction (30 mmol/l) in intact or denuded rings was also examined. For comparison, the effect of forskolin (0.1 nmol/l - 1 µmol/l) on the contractions induced by phenylephrine and KCl in endothelium-intact and endothelium-denuded rings was evaluated.

 Blood pressure experiments

Blood pressure experiments were performed as previously described.17 One day before the experiments, the rats were anesthetised with tribromoethanol (250 mg/kg, i.p.), and a catheter (a 4 cm segment of PE-10 heat-bound to a 13 cm segment of PE-50 (Clay Adams, Parsippany, NJ, USA) was inserted into the abdominal aorta through the femoral artery for blood pressure and heart rate recording. A second catheter was implanted into the jugular vein for intravenous administration of drugs. Both catheters were implanted under the skin and exited at the animal's back. During the experiment, freely moving rats were kept in individual cages, and mean arterial pressure (MAP) was recorded using an HP-7754A amplifier (Hewlett Packard, USA) connected to a signal acquisition board (MP-100, BIOPAC, USA) and processed by a computer. Labda-15-oic acid (0.3 - 3 mg/kg) or forskolin (0.1 - 1 mg/kg) were administered by intravenous bolus injection. Both labda-15-oic acid (0.3-3 mg/kg) and forskolin (0.1 - 1 mg/kg) were administered in different animals. Blood pressure responses were calculated with base on the average mean blood pressure calculated at the response's plateau.

 Nitrate/Nitrite (NOx) measurements

NOx levels were measured in supernatants from endothelium-intact aorta homogenates from 2K-1C and 2K rats. The rings were pre-contracted with phenylephrine (0.1 µmol/l) and then exposed to labda-15-oic acid (300 µmol/l). Supernatants were centrifuged using ultra centrifugal filters (#UFC5010BK Amicon Ultra-0.5 mL 10 kDa, Millipore, Billerica, MA, USA). Nitrate was measure colorimetrically following the instructions of a commercially available kit (#780,001, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Results were normalized for protein concentration and are expressed as nmol/mg protein. Protein concentrations in all experiments were determined ( with protein assay reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

 Drugs

Labda-15-oic acid was prepared as stock solutions in dimethyl sulfoxide (DMSO). The other drugs were dissolved in distilled water. The bath concentration of DMSO did not exceed 0.5%, which was shown to have no effect per se on the basal tonus of the preparations or on the agonist-mediated contraction or relaxation. For the in vivo experiments, labda-15-oic acid was diluted in 10% DMSO and then in saline. The concentration of DMSO in the final solution had no effects per se on basal cardiovascular parameters, as previously observed.18

Statistical analysis

Results were expressed as means standard error of the mean (S.E.M.). Data followed a normal distribution. Statistical analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOVA) or paired Student's t test. Post-hoc comparisons were performed after ANOVA analysis using Newman-Keuls multiple comparison test as indicated in the text and tables. For all analyses, p values of less than 0.05 were considered significant. Statistical analysis was carried out using the program Graph Pad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

 Results Blood pressure values in 2K-1C and 2K rats

MAP, DBP and SBP were significantly increased in 2K-1C when compared to 2K rats (Table 1).

Blood pressure values (mmHg) in 2K and 2K-1C rats
2K 2K-1C
Basal After 6 weeks Basal After 6 weeks
MAP 104.3 ± 2.0 100.9 ± 1.6 105.7 ± 1.1 161.3 ± 10.4a
DBP 92.5 ± 1.8 89.8 ± 1.3 96.3 ± 1.1 138.4 ± 11.6a
SBP 127.9 ± 2.8 123.2 ± 2.9 124.6 ± 1.9 207.0 ± 9.2a

Values are means ± S.E.M of n = 12 animals for each group.

Compared to respective basal values (p < 0.05, paired Student's t test). MAP: mean arterial pressure; DBP: diastolic blood pressure; SBP: systolic blood pressure.

 Vasorelaxant action of labda-15-oic acid on aortic rings from 2K-1C and 2K rats

Labda-15-oic acid (Figure 1) reduced the sustained contractions induced by phenylephrine and KCl in endothelium-intact and endothelium-denuded aortas from both 2K-1C and 2K rats (Figure 2). The Emax values (percentage of relaxation) for the relaxant effect of labda-15-oic acid in endothelium-intact and endothelium-denuded rings pre-contracted with phenylephrine were not significantly different in aortas from 2K-1C and 2K rats (Table 2). However, differences were found in the pD2 values for labda-15-oic acid in endothelium-intact and denuded rings pre-contracted with phenylephrine in aortas from 2K, but not 2K-1C rats. In the arteries pre-contracted with KCl, there was no difference between the Emax and pD2 values for labda-15-oic acid in endothelium-intact or denuded rings from both 2K-1C and 2K rats (Table 2). The Emax and pD2 values for labda-15-oic acid in the rings pre-contracted with KCl were not different from those found in phenylephrine-pre-contracted rings from both 2K-1C and 2K rats.

Chemical structure of ent-3-acetoxy-labda-8(17),13-dien- 15-oic acid (labda-15-oic acid; top) and 7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alpha,6 beta,9 alpha-trihydroxy-labd-14-ene-11-one (forskolin, bottom). Relaxation responses induced by labda-15-oic acid on rat aortic rings. The relaxation induced by the labdane was studied on endothelium-intact (E+) and endothelium-denuded (E-) rat aortic rings contracted with either phenylephrine (0.1 µmol/l) or KCl (30 mmol/l). Steady tension was evoked by phenylephrine or KCl and then labda-15-oic acid (0.1 - 300 µmol/l) was added cumulatively.

E<sub>max</sub> (% relaxation) and pD<sub>2</sub> values for labda-15-oic acid and forskolin in endothelium-intact (E+) and endothelium-denuded (E-) aortas from 2K and 2K-1C rats
Pre-contractile agent 2K 2K-1C
E+ (Emax) E- (Emax) E+ (Emax) E- (Emax)
Labda-15-oic acid Phenylephrine 93.7 ± 6.8 (7) 79.2 ± 1.8 (6) 99.0 ± 7.4 (7) 88.8 ± 6.6 (6)
KCl 96.4 ± 4.4 (7) 83.6 ± 6.6 (6) 103.9 ± 3.8 (7) 87.3 ± 7.4 (8)
Forskolin Phenylephrine 110.7 ± 5.3 (7) a 104.0 ± 5.62a (6) 118.8 ± 5.2 (6) a 107.7 ± 8.0 (6) a
KCl 92.6 ± 3.9 (6) 87.8 ± 3.9 (5) 105.9 ± 3.3 (6) 93.2 ± 7.1 (6)
E+ (pD2) E- (pD2) E+ (pD2) E- (pD2)
Labda-15-oic acid Phenylephrine 4.8 ± 0.06 (7) 4.1 ± 0.04 (6)b 4.8 ± 0.11 (7) 4.9 ± 0.08(6)
KCl 4.6 ± 0.08 (7) 4.3 ± 0.06 (6) 4.8 ± 0.10 (7) 4.5 ± 0.08 (8)
Forskolin Phenylephrine 7.5 ± 0.21 (7) c 6.9 ± 0.17(6) b,c 8.0 ± 0.10 (6) c 7.3 ± 0.14(6) b,c
KCl 7.0 ± 0.16 (6) c 7.0 ± 0.15(5) c 7.3 ± 0.20 (6) c 7.0 ± 0.12 (6) c

Numbers within parentheses indicate the number of isolated preparations. Values are means ± S.E.M.

Compared to labda-15-oic acid in aortas pre-contracted with phenylephrine from 2K and 2K-1C rats;

Compared to respective group in E+ aortas from 2K and 2K-1C rats;

Compared to labda-15-oic acid in aortas pre-contracted with phenylephrine or KCl from 2K and 2K-1C rats (p < 0.05, ANOVA followed by Newman-Keuls multiple comparison test).

Forskolin reduced the sustained contractions induced by phenylephrine and KCl in endothelium-intact and endothelium-denuded aortas from both 2K-1C and 2K rats (Figure 3). The Emax values for the relaxant effect of forskolin in endothelium-intact and endothelium-denuded rings pre-contracted with phenylephrine were not significantly different in aortas from 2K-1C and 2K rats (Table 2). However, differences were found in the pD2 values for forskolin in endothelium-intact and denuded rings pre-contracted with phenylephrine in aortas from both 2K-1C and 2K rats. In the arteries pre-contracted with KCl, there was no difference between the Emax or pD2 values for forskolin in endothelium-intact or denuded rings from both 2K-1C and 2K rats (Table 2).

Relaxation responses induced by forskolin on rat aortic rings. The relaxation induced by the labdane was studied on endothelium-intact (E+) and endothelium‑denuded (E-) rat aortic rings contracted with either phenylephrine (0.1 µmol/l) or KCl (30 mmol/l). Steady tension was evoked by phenylephrine or KCl and then forskolin (0.1 nmol/l - 1 µmol/l) was added cumulatively.

The Emax values for forskolin in endothelium-intact and endothelium-denuded rings pre-contracted with phenylephrine, but not KCl, were significantly different from those found for labda-15-oic acid in both 2K-1C and 2K rats. The pD2 values for forskolin in endothelium-intact and denuded rings pre-contracted with either phenylephrine or KCl were significantly different from those found for labda-15-oic acid in both 2K-1C and 2K rats (Table 2).

 Blood pressure experiments

Figure 4 shows representative tracings for the effect of labda-15-oic acid and forskolin on blood pressure of 2K and 2K-1C rats. The maximal variation in MAP induced by labda-15-oic acid and forskolin in conscious 2K-1C and 2K rats is presented in Figure 5. A bolus injection of labda-15-oic acid or forskolin produced a decrease in MAP in conscious 2K-1C and 2K rats. The MAP values returned to basal levels after injection of labda-15-oic acid. On the other hand, MAP values did not return to basal levels after administration of forskolin at 1 mg/kg (Figure 5). Labda-15-oic acid induced a more pronounced fall in blood pressure in 2K when compared to 2K-1C rats. On the other hand, forskolin was found to be more effective at inducing decrease in MAP in 2K-1C when compared to 2K rats (Figure 5). Values of blood pressure before and after drug administration are described in Table 3.

Representative traces of the hypotensive action displayed by labda-15-oic acid (0.3 – 3 mg/kg) and forskolin (0.1 – 1 mg/kg) on conscious 2K and 2K-1C rats. Traces represent the mean values of the maximal decrease in mean arterial pressure of 5 to 6 animals. Effect of labda-15-oic acid (0.3 – 3 mg/kg) and forskolin (0.1 – 1 mg/kg) on mean arterial pressure (MAP). Maximal variation in MAP (mmHg) induced by intravenous injection of the labdanes was evaluated in conscious 2K and 2K-1C rats. Each bar represents the mean ± S.E.M. of 5 to 6 experiments. *Compared with vehicle; #Compared with 2K rats (p < 0.05, ANOVA followed by Newman-Keuls multiple comparison test).

Blood pressure values (mmHg) in 2K and 2K-1C rats before and after drug administration (labda-15-oic acid or forskolin) and its respective values ΔMAP and %ΔMAP
MAP (mmHg)
Before After ΔMAP %ΔMAP
Labda-15-oic acid 2K
Vehicle 103.5 ± 6.7 (5) 98.9 ± 7.0 4.6 ± 2.4 4.4 ± 2.3
Labda-15-oic acid (0.3 mg/kg) 100.5 ± 5.5 (5) 96.3 ± 8.4 4.2 ± 3.3 4.8 ± 3.8
Labda-15-oic acid (1 mg/kg) 99.8 ± 6.2 (5) 70.6 ± 15.6 29.2 ± 12.7 30.3 ± 13.6
Labda-15-oic acid (3 mg/kg) 98.5 ± 6.4 (5) 48.6 ± 12.4a 49.9 ± 8.5b 53.6 ± 10.9 b
Labda-15-oic acid 2K-1C
Vehicle 163.7 ± 15.2 (6) 159.3 ± 16.2 4.4 ± 3.0 3.0 ± 2.3
Labda-15-oic acid (0.3 mg/kg) 161.6 ± 15.8 (6) 154.0 ± 16.5 7.6 ± 3.3 5.2 ± 2.5
Labda-15-oic acid (1 mg/kg) 160.0 ± 15.6 (6) 148.0 ± 15.7 12.0 ± 3.6 7.9 ± 2.7
Labda-15-oic acid (3 mg/kg) 160.2 ± 15.8 (6) 109.7 ±19.2a 50.5 ± 9.9b 33.8 ± 8. 4b
Forskolin 2K
Vehicle 113.9 ± 3.0 (5) 107.5 ± 4.3 6.4 ± 1.7 5.7 ± 1.5
Forskolin (0.1 mg/kg) 104.9 ± 4.5 (5) 90.9 ± 5.2a 14.0 ± 2.7 13.4 ± 2.8
Forskolin (0.3 mg/kg) 108.1 ± 5.0 (5) 75.8 ± 10.8a 32.3 ± 10.0b 29.9 ± 9.6b
Forskolin (1 mg/kg) 107.4 ± 4.0 (5) 77.0 ± 3.1a 30.4 ± 5.2b 27.9 ± 3.8b
Forskolin 2k-1C
Vehicle 169.1 ± 12.8 (5) 163.3 ± 15.1 5.8 ± 4.6 3.7 ± 2.5
Forskolin (0.1 mg/kg) 170.4 ± 16.6 (5) 153.2 ± 12.9a 17.2 ± 6.1 9.4 ± 3.1
Forskolin (0.3 mg/kg) 167.6 ± 16.3 (5) 130.9 ± 12.4a 36.7 ± 5.7b 21.7 ± 2.5b
Forskolin (1 mg/kg) 166.0 ± 16.9 (5) 97.1 ± 16.0a 68.9 ± 8.5b 42.4 ± 6.2b

Numbers within parentheses indicate the number of animals. Values are means ± S.E.M.

Significant difference compared to baseline, before drug infusion (p < 0.05, paired Student’s t test).

Compared with vehicle (p < 0.05, ANOVA followed by Newman-Keuls multiple comparison test). MAP: mean arterial pressure.

 NOx measurements

Figure 6 show that NOx basal levels in aortas from 2K-1C rats are lower than those found in aortas from 2K rats. Labda-15-oic acid induced nitrate generation in endothelium-intact aortas from both 2K-1C and 2K rats. Labda-15-oic acid-induced nitrate generation was lower in arteries from 2K-1C rats when compared to 2K rats (Figure 6).

Effect of labda-15-oic acid on nitrate levels in endothelium-intact aortic rings from 2K and 2K-1C rats. Each bar represents the mean ± S.E.M. of 6 to 8 independent preparations. *Compared with basal values for 2K rats; #Compared with basal values for 2K-1C rats; <sup>ƒ</sup>Compared with stimulation with labda-15-oic acid in 2K-1C rats (p < 0.05, ANOVA followed by Newman-Keuls multiple comparison test).

Discussion

The present findings show that labda-15-oic acid was more effective at inducing vascular relaxation in endothelium-intact aortas from 2K rats pre-contracted with phenylephrine when compared to the endothelium-denuded ones. This result is in accordance with previous finding from our laboratory showing that the relaxation induced by labda-15-oic acid is partially dependent on the endothelial cGMP-NO pathway.13 On the other hand, in aortas from 2K-1C rats, no difference on labda-15-oic acid-induced relaxation was observed between endothelium-intact and denuded rings. Altered vascular tone is a characteristic feature of most forms of experimental and human hypertension and has been associated with endothelial dysfunction with consequent impairment of endothelium-dependent vasodilatation and reduced NO signalling.19-21 Since endothelial-derived NO partially mediates the vasorelaxant effect of labda-15-oic acid, the decrease in potency for the relaxant action of the labdane in aortas from 2K-1C rats might be due to the decreased NO bioavailability described in hypertensive states. In fact, this hypothesis is strengthened by the fact that labda-15-oic acid-induced nitrate generation in arteries from 2K-1C was lower than that found in arteries from 2K rats. It is also important to note that we found lower basal NOx content in arteries from 2K-1C when compared to aortas from 2K rats, further corroborating previous observations showing decreased availability of basal NO in renovascular hypertension.22-24

The activation of K+ channels leads to hyperpolarization of vascular smooth muscle cells, decrease in voltage-dependent Ca2+ channel activity, and vasodilatation.25 The activation of voltage-dependent and ATP-sensitive K+ channels, as well as large-conductance and low-conductance Ca2+-activated K+ channels was described to play a role in the vasorelaxant response induced by labda-15-oic acid13. It is well established that endothelium-dependent vasodilatation and smooth muscle cell hyperpolarization are impaired in aortic segments from 2K-1C hypertensive rats.26 Abnormal function of vascular smooth muscle large-conductance Ca2+-activated K+ channels and ATP-sensitive K+ channels play a key role in the impaired relaxation of aortas from 2K-1C rats,27,28 and may also contribute to the decreased endothelium-dependent vasodilatation induced by labda-15-oic acid in aortas from 2K-1C rats.

In the present study, no differences were found in the inhibitory action displayed by labda-15-oic acid in arteries pre-contracted with KCl in both 2K and 2K-1C rats. The contraction induced by KCl on smooth muscle is mediated by cell membrane depolarisation and an increase in Ca2+ influx through voltage-operated Ca2+ channels.29,30 Thus, we can suggest that labda-15-oic acid blocks extracellular Ca2+ influx through interference with voltage-operated channels in 2K and 2K-1C rats.

Forskolin relaxed endothelium-intact and endothelium-denuded aortas pre-contracted with phenylephrine, but not KCl, to a greater extent than labda-15-oic acid in both 2K and 2K-1C rats. Moreover, forskolin was more potent than labda-15-oic acid at inducing vascular relaxation in arteries pre-contracted with phenylephrine or KCl in both 2K and 2K-1C rats. Possible explanations for these effects are related to the chemical structure of the labdanes and/or their mechanisms of action. Analyzing the chemical structure of labda-15-oic acid and forskolin (Figure 1) we observe that, despite the fact that these two compounds are classified as labdane type-diterpenes, it is noteworthy the presence of great number of hydrogen-bond-donor groups (HBD; hydrophilic group), highlighting the hydroxyl moieties at C-1, C-6 and C-9, in the forskolin skeleton in comparison with the chemical structure of labda-15-oic acid, which contains only two hydrophilic groups at C-3 and C-16. Moreover, it is also possible to observe that these natural compounds differ from each other in their inverted configurations of the carbons C-5, C-9 and C-10. Previous studies have shown that chemical differences on diterpenes alter their cardiovascular properties,17,31 and might be the source of discrepancy between the effects of labda-15-oic acid and forskolin here described.

Labdanes exert their cardiovascular effects by acting at multiple sites,11,12,32 and for this reason, several intracellular pathways were described to mediate the vascular relaxation induced by these compounds.33 The increase in cAMP levels, due to activation of adenylyl cyclase and the subsequent activation of PKA is the main mechanism underlying the vascular relaxation induced by the labdane forskolin.9 However, forskolin also increases endothelial production of NO via activation of eNOS.34 On the other hand, the mechanisms underlying the vasorelaxant action of labda-15-oic acid are not related to adenylyl cyclase activation and involve blockage of extracellular Ca2+ influx, increased endothelial NO production and the opening of K+ channels.13 The differences in the mechanisms underlying the vascular responses of these two labdanes could also be responsible for the different cardiovascular responses displayed by labda-15-oic acid and forskolin.

Improvements in the pharmacological treatment of hypertension contribute to a reduction in the incidence of cardiovascular diseases.35 Labdane-type diterpenes could be considered a promising source of new prototypes for the discovery and development of novel cardiovascular therapeutic agents. The hypotensive action of labdane-type diterpenes is related to their myorelaxant action.5,6,11,12 Recently, we described that labda-15-oic acid induces vascular relaxation and hypotension in normotensive rats.13 Since labda-15-oic acid relaxed aortas from 2K-1C rats, we hypothesized that the labdane could exert antihypertensive action in vivo. In the present study, intravenous administration of labda-15-oic acid induced a short-lasting hypotension in 2K and 2K-1C rats, further showing that labda-15-oic acid exert antihypertensive effect in vivo. Labda-15-oic acid induced a less pronounced decrease in blood pressure compared to forskolin, further strengthening the idea that chemical differences alters the hypotensive action displayed by labdane-type diterpenes. It is also important to note that labda-15-oic acid causes hypotension through peripheral vasodilatation, mediated in part by NO,13 while forskolin effects are mainly mediated by activation of adenylate cyclase and the increase in cAMP levels.5-9 This observation is relevant since, as mentioned before, endothelial dysfunction with consequent impairment of endothelium-dependent vasodilatation and reduced NO signalling is a characteristic feature of hypertension.19-21 This characteristic of the hypertensive state could explain, at least in part, the reduced effect of labda-15-oic acid in comparison to forskolin.

Some limitations for the present study should be considered. Despite the fact that labda-15-oic acid decreased blood pressure in an animal model of renovascular hypertension, it is not possible to guarantee that this labdane will be also effective on other animal models of hypertension or human hypertension. Another point that should be considered is that the vasorelaxant effect of the labdane should also be tested in resistance vessels since those are more important in the regulation of blood pressure. Finally, our findings show the effects of labda-15-oic acid after intravenous injection of the compound but we do not have information on the bioavailability and cardiovascular effects of this compound after oral administration.

 Conclusions

Diterpenes likely fulfill the definition of a pharmacological preconditioning class of compounds and may have therapeutic use in cardiovascular diseases. Using a combined in vivo and in vitro approach, the present investigation shows for the first time that labda-15-oic acid induces vascular relaxation in arteries from 2K-1C hypertensive rats. Administration of the labdane in vivo induced a fall in blood pressure in hypertensive rats. The initial experimental studies on the cardiovascular effects of labdanes are important and needed, since such information is a prerequisite to any rational and safety use of these compounds in the treatment of hypertension.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESP.

Study Association

This study is associated with the Post Graduate Program in Pharmacology - Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo (USP).

 Acknowledgements

We thank Drs. Evelin C. Carnio and Marcelo E. Batalhão for blood pressure measurements. This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP - 2010/01009-3 and 2011/13630-7). J.A.S. is supported by a master fellowship from CAPES.

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E-mail: crtirapelli@eerp.usp.br, crtlilo@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Simplicio JA, Tirapelli CR; Obtenção de dados: Simplicio JA, Simão MR; Análise e interpretação dos dados: Simplicio JA, Simão MR, Ambrosio SR, Tirapelli CR; Análise estatística: Simplicio JÁ; Obtenção de financiamento: Tirapelli CR; Redação do manuscrito: Simplicio JÁ; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Ambrosio SR, Tirapelli CR.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Diterpenos do tipo labdano induzem uma queda da pressão arterial por meio do relaxamento do músculo liso vascular; todavia, não há estudos que descrevam os efeitos de labdanos em ratos hipertensos.

 Objetivo:

O presente estudo foi desenvolvido para investigar as ações cardiovasculares do labdano ácido ent-3-acetóxi-labda-8(17),13-dieno-15-óico (labda-15-óico) na hipertensão renal dois rins-1 clipe (2R-1C).

 Métodos:

Foram feitos experimentos de reatividade vascular em anéis aórticos isolados de ratos machos 2R-1C e normotensos (2R). A medição de Nitrato/Nitrito (NOx) foi feita nas aortas por meio de ensaio colorimétrico. As medidas de pressão arterial foram feitas em ratos conscientes.

 Resultados:

O ácido labda-15-óico (0,1 - 300 µmol/l) e a forscolina (0,1 nmol/l - 1 µmol/l) relaxaram as aortas com endotélio intacto e as aortas sem endotélio dos ratos 2R-1C e 2R. O labda-15-óico mostrou-se mais eficaz na indução do relaxamento em aortas com endotélio intacto de 2R pré-contraídas com fenilefrina em comparação àquelas sem endotélio. A forscolina mostrou-se mais potente do que o ácido labda-15-óico na indução do relaxamento vascular nas artérias tanto de ratos 2R-1C quanto de ratos 2R. O aumento dos níveis de NOx induzido pelo ácido labda-15-óico foi menor nas artérias de ratos 2R-1C em comparação a ratos 2R. A administração intravenosa de ácido labda-15-óico (0,3-3 mg/kg) ou forscolina (0,1-1 mg/kg) induziu hipertensão em ratos 2R-1C e 2R conscientes.

 Conclusão:

Os presentes resultados mostram que o labda-15-óico induz relaxamento vascular e hipotensão em ratos hipertensos.

 Palavras-chave: Labdano Relaxamento Vascular Diterpenos Forscolina Hipertensão Renovascular Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2010/01009-3 2011/13630-7 Introdução

O tratamento de hipertensão arterial com produtos derivados de plantas é bem descrito na literatura.1-4 Um grande número de plantas medicinais com atividade anti-hipertensiva foi quimicamente investigado e diterpenos são apontados como seus principais constituintes. Por isso, muitos estudos focam nas propriedades cardiovasculares desses compostos. Por exemplo o diterpeno forscolina do tipo labdano (7 beta-acetoxi-8, 13-epóxi-1 alfa, 6 beta, 9 alfa-tri-hidróxi-labd-14-eno-11-um) diminui a pressão arterial por meio de um mecanismo que envolve o relaxamento do músculo liso vascular.5-8 Na vasculatura, a forscolina ativa a enzima adenilil ciclase, que por sua vez aumenta a produção de AMPc e a ativação da proteína cinase dependente de AMPc (PKA).9 A extrusão de cálcio da membrana plasmática e hiperpolarização do músculo liso vascular são mecanismos também relacionados às ações vasculares da forscolina.10 Em humanos, a administração intravenosa de forscolina diminuiu a resistência vascular e reduziu a pressão arterial diastólica (PAD).7,8

Outros diterpenos do tipo labdano, como labdano ácido 8(17), 12E, 14-labda trien-18-óico e labd-8 (17)-en -15 óico também foram descritos como indutores do relaxamento vascular e da hipotensão em ratos normotensos.11,12 Descrevemos recentemente que o labdano ácido ent-3-acetóxi-labda-8(17), 13-dien-15 óico (labda-15-óico) induziu relaxamento vascular por meio do bloqueio do influxo de Ca2+, ativação da via do óxido nítrico endotelial (NO)-GMPc e abertura dos canais para K+.13 A adminitração intravenosa de labda-15-óico induziu diminuição na pressão arterial em ratos normotensos; essa resposta foi parcialmente atenuada pelo L-NAME, sugerindo a participação do NO nesta resposta.13 É importante notar que doses mais baixas de ácido labda-15-óico (0,3-3 mg/kg) foram necessárias para induzir hipotensão em comparação com outros labdanos previamente testados, como ácido 8 (17), 12E, 14-labdatrien-18-óico (5-30 mg/kg)11 e ácido labd-8 (17)-eno-15-óico (1-10 mg/kg).12 Com base nesses resultados iniciais com ácido labda-15-óico, temos a hipótese de que este composto induziria relaxamento vascular e hipotensão em ratos hipertensos. No presente estudo, procuramos avaliar as ações cardiovasculares do ácido labda-15-óico em animais hipertensos.

 Métodos Isolamento do ácido labda-15-óico

O isolamento do ácido labda-15-óico foi feito como previamente descrito.14 Cem gramas de óleo-resina foram cromatografados sobre gel de sílica 60 H (Merck, art. 7736), usando cromatografia líquida sob vácuo 9 (CLV) com quantidades cada vez maiores de acetato de etilo (EtOAc) em n-hexano como eluente. Esse procedimento resultou em seis frações (2000 ml cada), chamadas de F1 (34,7 g; n-hexano), F2 (13,5 g; 20% EtOAc), F3 (11,4 g; 40% EtOAc), F4 (9,7 g; 60% EtOAc), F5 (7,6 g; 80% EtOAc), e F6 (17,8 g; EtOAc) após evaporação do solvente. A fração F4 foi inicialmente cromatografada via CLV sobre gel de sílica 60 H (Merck, art. 7736) conforme descrito acima, para criar frações adicionais (F4.1 a F4.5). O ácido labda-15-óico (1132,0 mg) foi obtido do F4,3 por meio de cromatografia de média pressão (flash) com uso de gel de sílica 60 (Merck, art. 9385), isocrático n-hexano: EtOAc:CHCl3 (5:2:3) como fase móvel, e quociente de vazão de 5 ml/min.15 A pureza do (-) -ácido acetoxicopálico (98%) foi estimada por cromatografia líquida de alta eficiência, análise por espectrometria de massa e dados espectrais de ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 e carbono-13.

 Hipertensão renovascular

A hipertensão renovascular foi induzida em ratos conforme previamente descrito. Ratos Wistar macho com peso entre 180 e 200 gramas (35 dias de vida) foram anestesiados com tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.) e após uma laparotomia mediana, um clipe de prata com diâmetro interno de 0,2 mm foi colocado em volta da artéria renal esquerda. Ratos normotensos 2 rins (2R) foram submetidos apenas à laparotomia. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida antes e depois de seis semanas da laparotomia mediana em animais não anestesiados, por meio de pletismografia de cauda; os ratos considerados hipertensos foram aqueles cuja PAS estava acima de 160 mmHg. Seis semanas após a cirurgia, os ratos foram sacrificados e as aortas torácicas foram isoladas.16 Um total de 26 ratos 2R e 28 ratos 2R-1C foram usados neste presente estudo. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Campus de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (#09.1.1007.53.0).

Preparação do anel vascular

A aorta torácica foi removida rapidamente, tecidos conectivos aderentes foram removidos, e a aorta foi cortada em anéis (5-6 mm de comprimento). Dois ganchos de aço inoxidável foram passados através do lúmen de cada anel. Um gancho foi conectado a um transdutor de força isométrica (TRI201; Panlab, Espanha) para medir a tensão nos vasos. Os anéis foram colocados em câmara para órgão isolado contendo 5 ml de solução de Krebs, gaseificada com 95% O2 / 5% CO2 e mantida a 37°C. A composição da solução Krebs era (mmol/l): NaCl, 118,0; KCl, 4,7; KH2PO4, 1,2; MgSO4, 1,2; NaHCO3, 15,0; Glicose, 5,5; CaCl2, 2,5. Os anéis foram esticados até chegarem à tensão basal de 1,5 g, o que foi determinado por experimentos de relação comprimento-tensão; foram então deixadas por 60 min para se equilibrarem. Durante esse tempo, o fluído do banho foi trocado a cada 15-20 min. Em alguns anéis, o endotélio foi removido mecanicamente, enrolando cuidadosamente o lúmen do vaso num fio metálico. A integridade endotelial foi avaliada qualitativamente pelo grau de relaxamento causado pela acetilcolina (1 µmol/l), na presença de uma contração mantida induzida por fenilefrina (0,1 µmol/l). Para estudos de vasos com endotélio intacto, um anel era descartado se o relaxamento com acetilcolina não fosse de 50% ou mais. Para estudos de vasos sem endotélio, um anel era descartado se houvesse qualquer grau de relaxamento. As curvas concentração-resposta ao agonista foram obtidas por meio de um programa de ajuste de regressão não-linear. (Graph Pad Prism 3.0; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). A potência e a resposta máxima do agonista foram expressas como pD2 (-logEC50) e Emax (efeito máximo extraído do agonista), respectivamente.

 Efeito do ácido labda-15-óico em anéis de aorta contraídos com fenilefrina ou KCl

Uma tensão constante foi induzido por fenilefrina (concentrações de 0,1 µmol/l para anéis com endotélio intacto e 0,03 µmol/l para anéis sem endotélio foram usados para induzir contrações de magnitude similar); O ácido labda-15-óico foi então adicionado de forma gradual (0,1 - 300 µmol/l). O efeito do ácido labda-15-óico na contração sustentada induzida por KCl (30 mmol/l) em anéis com endotélio intacto ou sem endotélio também foi examinado. Para comparação, o efeito da forscolina (0,1 nmol/l - 1 µmol/l) nas contrações induzidas por fenilefrina e KCl em anéis com endotélio intacto e anéis sem endotélio foi avaliado.

 Experimentos de pressão arterial

Experimentos de pressão arterial foram feitos conforme previamente descrito.17 Um dia antes dos experimentos, os ratos foram anestesiados com tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.), e um cateter (um segmento de 4 cm de PE-10 ligado termicamente a um segmento de 13 cm de PE-50) (Clay Adams, Parsippany, NJ, EUA) foi inserido na aorta abdominal através da artéria femoral para registro de pressão arterial e frequência cardíaca. Um segundo cateter foi implantado na veia jugular para administração intravenosa de medicamentos. Ambos os cateteres foram implantados subcutaneamente e exteriorizadas no dorso do animal. Durante o experimento, ratos movendo-se livremente foram mantidos em gaiolas individuais, e a pressão arterial média (PAM) foi registrada por um amplificador HP-7754A (Hewlett Packard, EUA) conectado a uma placa de aquisição de sinal (MP-100, BIOPAC, USA) e processada por um computador. O ácido labda-15-óico (0,3-3 mg/kg) ou a forscolina (0,1-1 mg/kg) foram administrados via injeção de bolus intravenosa. Tanto o ácido labda-15-óico (0,3-3 mg/kg) quanto a forscolina (0,1-1 mg/kg) foram administrados em diferentes animais. Os resultados de pressão arterial foram calculados com base na média da PAM obtida no platô da resposta.

 Medida dos níveis de Nitrato/Nitrito (NOx)

Níveis de NOx foram medidos em sobrenadantes de homogenatos da aorta com endotélio intacto de ratos 2R-1C e 2R. Os anéis foram pré-contraídos com fenilefrina (0,1 µmol/l) e então expostos ao ácido labda-15-óico (300 µmol/l). o sobrenadante foi centrifugado usando filtros de ultracentrífuga (#UFC5010BK Amicon Ultra-0.5 mL 10 kDa, Millipore, Billerica, MA, EUA). O nitrato foi medido colorimetricamente seguindo instruções do kit comercializado (#780,001, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA). Os resultados foram normalizados pela concentração de proteína e estão expressos como nmol/mg de proteína. A concentração proteica de todos os experimentos foram determinadas com ensaio de reagente de proteína (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

 Drogas

O ácido labda-15-óico foi preparado como solução estoque em dimetil sulfóxido (DMSO). As demais drogas foram dissolvidos em água destilada. A concentração do banho de DMSO não excedeu 0,5%, o que não influencia no tônus basal das preparações nem na contração e relaxamento mediado pelo agonista. Para os experimentos in vivo, o ácido labda-15-óico foi diluído em DMSO 10% e depois em salina. A concentração de DMSO na solução final não influencia nos parâmetros cardiovasculares basais, conforme previamente observado.18

Análise estatística

Os resultados foram expressos como a media ± erro padrão da média (EPM). Os dados seguiram uma distribuição normal. A análise estatística feita foi por ANOVA de uma via, ou o teste t de Student pareado. Comparações post-hoc foram feitas após a análise ANOVA, pelo teste Newman-Keuls de comparação múltipla, conforme indicado no texto e nas tabelas. Para todas as análises, valores p abaixo de 0,05 foram considerados significativos. A análise estatística foi conduzida por meio do programa Graph Pad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).

 Resultados Valores de pressão arterial em ratos 2R-1C e 2R

PAM, PAD e PAS aumentaram significativamente em ratos 2R-1C em comparação com ratos 2R (Tabela 1).

Valores de pressão arterial (mmHg) em ratos 2R e 2R-1C
2R 2R-1C
Basal Após 6 semanas Basal Após 6 semanas
PAM 104,3 ± 2,0 100,9 ± 1,6 105,7 ± 1,1 161,3 ± 10,4a
PAD 92,5 ± 1,8 89,8 ± 1,3 96,3 ± 1,1 138,4 ± 11,6a
PAS 127,9 ± 2,8 123,2 ± 2,9 124,6 ± 1,9 207,0 ± 9,2a

Valores são medias ± EPM de n = 12 animais para cada grupo.

Comparado com valores basais respectivos (p < 0,05, teste t de Student pareado). PAM: pressão arterial média; PAD: pressão arterial diastólica; PAS: pressão arterial sistólica.

 Ação vasorelaxante do ácido labda-15-óico em anéis aórticos de ratos 2R-1C e 2R

O ácido labda-15-óico (Figura 1) reduziu as contrações sustentadas induzidas por fenilefrina e KCl em aortas com endotélio intacto e aortas sem endotélio tanto de ratos 2R-1C quanto de ratos 2R (Figura 2). Os valores de Emax (porcentagem de relaxamento) para o efeito relaxante do ácido labda-15-óico em anéis com endotélio intacto e anéis sem endotélio, pré-contraídos com fenilefrina não mostraram diferenças significativas nas aortas dos ratos 2R-1C e 2R (Tabela 2). Todavia, diferenças foram encontradas nos valores de pD2 para o ácido labda-15-óico em anéis com endotélio intacto e sem endotélio, pré-contraídos com fenilefrina em aortas de ratos 2R, mas não em ratos 2R-1C. Em artérias pré-contraídas com KCl, não houve diferença entre os valores de Emax e os valores de pD2 para o ácido labda-15-óico em anéis com endotélio intacto e sem endotélio em ratos 2R-1C nem 2R (Tabela 2). Os valores de Emax e de pD2 para o ácido labda-15-óico nos anéis pré-contraídos com KCl não se mostraram diferentes daqueles encontrados em anéis pré-contraídos com fenilefrina para ratos 2R-1C nem 2R.

Estrutura química do ácido ent-3-acetóxi-labda-8(17),13-dieno- 15-óico (labda-15-óico; superior) e 7 beta-acetoxi-8, 13-epóxi-1 alfa, 6 beta, 9 alfa-tri-hidróxi-labd-14-eno-11-um (forscolina; inferior). Respostas de relaxamento induzidas pelo ácido labda-15-óico em anéis aórticos de ratos. O relaxamento induzido pelo labdano foi estudado em anéis aórticos com endotélio intacto (E+) e sem endotélio (E-) de ratos, contraídos com fenilefrina (0,1 <italic>µ</italic>mol/l) ou KCl (30 mmol/l). Tensão constante foi induzida pela fenilefrina ou pelo KCl e, então, o ácido labda-15-óico (0,1-300 <italic>µ</italic>mol/l) foi adicionado cumulativamente.

Valores de E<sub>max</sub> (% relaxamento) e pD<sub>2</sub> para ácido labda-15-óico e forscolina em aórtas com endotélio intacto (E+) e sem endotélio (E-) de ratos 2R e 2R-1C
Agente pré-contráctil 2R 2R-1C
E+ (Emax) E- (Emax) E+ (Emax) E- (Emax)
Ácido labda-15-óico Fenilefrina 93,7 ± 6,8 (7) 79,2 ± 1,8 (6) 99,0 ± 7,4 (7) 88,8 ± 6,6 (6)
KCl 96,4 ± 4,4 (7) 83,6 ± 6,6 (6) 103,9 ± 3,8 (7) 87,3 ± 7,4 (8)
Forscolina Fenilefrina 110,7 ± 5,3 (7) a 104,0 ± 5,62a (6) 118,8 ± 5,2 (6) a 107,7 ± 8,0 (6) a
KCl 92,6 ± 3,9 (6) 87,8 ± 3,9 (5) 105,9 ± 3,3 (6) 93,2 ± 7,1 (6)
E+ (pD2) E- (pD2) E+ (pD2) E- (pD2)
Ácido labda-15-óico Fenilefrina 4,8 ± 0,06 (7) 4,1 ± 0,04 (6)b 4,8 ± 0,11 (7) 4,9 ± 0,08(6)
KCl 4,6 ± 0,08 (7) 4,3 ± 0,06 (6) 4,8 ± 0,10 (7) 4,5 ± 0,08 (8)
Forscolina Fenilefrina 7,5 ± 0,21 (7) c 6,9 ± 0,17(6) b,c 8,0 ± 0,10 (6) c 7,3 ± 0,14(6) b,c
KCl 7,0 ± 0,16 (6) c 7,0 ± 0,15(5) c 7,3 ± 0,20 (6) c 7,0 ± 0,12 (6) c

Números entre parênteses indicam o número de preparações isoladas. Valores são medias ± EPM.

Comparado com ácido labda-15-óico em aortas pré-contraídas com fenilefrina de ratos 2R e 2R-1C,

Comparado com o grupo respectivo em aortas E+ de ratos 2R e 2R-1C,

Comparado com ácido labda-15-óico em aortas pré-contraídas com fenilefrina ou KCl de ratos 2R e 2R-1C (p<0,05, ANOVA seguido de teste Newman-Keuls de comparação múltipla).

A forscolina reduziu as contrações sustentadas induzidas por fenilefrina e KCl em aortas com endotélio intacto e sem endotélio de ratos 2R-1C e 2R (Figura 3). Os valores de Emax para o efeito relaxante de forscolina em anéis com endotélio intacto e sem endotélio, pré-contraídos com fenilefrina não se mostraram significativamente diferentes em aortas de ratos 2R-1C e 2R (Tabela 2). Todavia, diferenças foram encontradas em valores de pD2 para forscolina em anéis com endotélio intacto e sem endotélio, pré-contraídos com fenilefrina em aortas de ratos 2R-1C e 2R. As artérias pré-contraídas com KCl, não mostraram diferença entre os valores de Emax ou de pD2 para forscolina em anéis com endotélio intacto e sem endotélio de ratos 2R-1C e 2R (Tabela 2).

Respostas de relaxamento induzidas por forscolina em anéis aórticos de ratos. O relaxamento foi induzido pelo labdano foi estudado em anéis aórticos com endotélio intacto (E+) e sem endotélio (E-) de ratos, contraídos com fenilefrina (0,1 <italic>µ</italic>mol/l) ou KCl (30 mmol/l). Tensão constante foi induzida pela fenilefrina ou KCl e, então, forscolina (0,1 nmol/l - 1 <italic>µ</italic>mol/l) foi adicionada cumulativamente.

Os valores de Emax para forscolina em anéis com endotélio intacto e sem endotélio, pré-contraídos com fenilefrina, mas não com KCl, se mostraram significativamente diferentes daqueles encontrados para ácido labda-15-óico em ratos 2R-1C e 2R. Os valores de pD2 para forscolina em anéis com endotélio intacto e sem endotélio, pré-contraídos com fenilefrina ou KCl mostraram-se significativamente diferentes daqueles encontrados para o ácido labda-15-óico em ratos 2R-1C e 2R (Tabela 2).

 Experimentos de pressão arterial

A figura 4 mostra traçados representativos do efeito do ácido labda-15-óico e da forscolina na pressão arterial de ratos 2R-1C e 2R. A variação máxima da PAM induzida pelo ácido labda-15-óico e pela forscolina na pressão em ratos 2R-1C e 2R conscientes está demonstrada na Figura 5. A administração em bolus de ácido labda-15-óico ou forscolina causou uma diminuição na PAM em ratos 2R-1C e 2R conscientes. Os valores da PAM retornaram a níveis basais após a injeção de ácido labda-15-óico. Por outro lado, valores da PAM não retornaram a níveis basais após a administração de forscolina a 1 mg/kg (Figura 5). O ácido labda-15-óico induziu uma queda mais pronunciada na pressão arterial em 2R em comparação a 2R-1C. Por outro lado, a forscolina mostrou-se mais eficiente na indução de uma diminuição da PAM em ratos 2R-1C, em comparação com ratos 2R (Figura 5). Valores da pressão arterial antes e depois da administração da droga estão descritos na Tabela 3.

Traçados representativos da ação hipotensiva demonstrada pelo ácido labda-15-óico (0,3 – 3 mg/kg) e pela forscolina (0,1 – 1 mg/kg) em ratos 2R-1C e 2R conscientes. Os traçados representam o valor médio da diminuição máxima da pressão arterial média de 5-6 animais. – Efeitos do ácido labda-15-óico (0,3–3 mg/kg) e da forscolina (0,1–1 mg/kg) na pressão arterial média (PAM). Variação máxima na PAM (mmHg) induzida por injeção intravenosa dos labdanos foi avaliada em ratos 2R e 2R-1C conscientes. Cada barra representa a média ± erro padrão da média (EPM) de 5‑6 experimentos. *Comparado com veículo, #Comparado com ratos 2R (p < 0,05, ANOVA seguido de teste Newman-Keuls de comparação múltipla).

Valores de pressão arterial (mmHg) em ratos 2R e 2R-1C antes e depois da administração do medicamento (ácido labda-15-óico ou forscolina) e seus respectivos valores ΔPAM and %ΔPAM
PAM (mmHg)
Antes Depois ΔPAM %ΔPAM
Ácido labda-1-5-óico 2R
Veículo 103,5 ± 6,7 (5) 98,9 ± 7,0 4,6 ± 2,4 4,4 ± 2,3
Ácido labda-15-óico (0,3 mg/kg) 100,5 ± 5,5 (5) 96,3 ± 8,4 4,2 ± 3,3 4,8 ± 3,8
Ácido labda-15-óico (1 mg/kg) 99,8 ± 6,2 (5) 70,6 ± 15,6 29,2 ± 12,7 30,3 ± 13,6
Ácido labda-15-óico (3 mg/kg) 98,5 ± 6,4 (5) 48,6 ± 12,4a 49,9 ± 8,5b 53,6 ± 10,9 b
Ácido labda-1-5-óico 2R-1C
Veículo 163,7 ± 15,2 (6) 159,3 ± 16,2 4,4 ± 3,0 3,0 ± 2,3
Ácido labda-15-óico (0,3 mg/kg) 161,6 ± 15,8 (6) 154,0 ± 16,5 7,6 ± 3,3 5,2 ± 2,5
Ácido labda-15-óico (1 mg/kg) 160,0 ± 15,6 (6) 148,0 ± 15,7 12,0 ± 3,6 7,9 ± 2,7
Ácido labda-15-óico (3 mg/kg) 160,2 ± 15,8 (6) 109,7 ±19,2a 50,5 ± 9,9b 33,8 ± 8, 4b
Forscolina 2R
Veículo 113,9 ± 3,0 (5) 107,5 ± 4,3 6,4 ± 1,7 5,7 ± 1,5
Forscolina (0,1 mg/kg) 104,9 ± 4,5 (5) 90,9 ± 5,2a 14,0 ± 2,7 13,4 ± 2,8
Forscolina (0,3 mg/kg) 108,1 ± 5,0 (5) 75,8 ± 10,8a 32,3 ± 10,0b 29,9 ± 9,6b
Forscolina (1 mg/kg) 107,4 ± 4,0 (5) 77,0 ± 3,1a 30,4 ± 5,2b 27,9 ± 3,8b
Forscolina 2R-1C
Veículo 169,1 ± 12,8 (5) 163,3 ± 15,1 5,8 ± 4,6 3,7 ± 2,5
Forscolina (0,1 mg/kg) 170,4 ± 16,6 (5) 153,2 ± 12,9a 17,2 ± 6,1 9,4 ± 3,1
Forscolina (0,3 mg/kg) 167,6 ± 16,3 (5) 130,9 ± 12,4a 36,7 ± 5,7b 21,7 ± 2,5b
Forscolina (1 mg/kg) 166,0 ± 16,9 (5) 97,1 ± 16,0a 68,9 ± 8,5b 42,4 ± 6,2b

Números entre parênteses indicam o número de animais. Valores são a media ± EPM.

Diferença significativa em comparação com a linha de base, antes da infusão da droga (p < 0,05, teste t de Student pareado).

Comparado com veículo (p < 0,05, ANOVA seguido de teste Newman-Keuls de comparação múltipla). PAM: pressão arterial média.

 Medida dos níveis de NOx

A figura 6 mostra que níveis basais de NOx em aortas de ratos 2R-1C são menores do que aqueles encontrados nas aortas de ratos 2R. O ácido labda-15-óico induziu uma formação de nitrato em aortas com endotélio intacto de ratos 2R-1C e 2R. A formação de nitrato induzida pelo ácido labda-15-óico mostrou-se menor em artérias de ratos 2R-1C, em comparação a ratos 2R (Figura 6).

Efeito do ácido labda-15-óico sobre os níveis de nitrato em anéis aórticos com endotélio intacto de ratos 2R e 2R-1C. Cada barra representa a média ± erro padrão da média (EPM) de 6-8 preparações independentes. *Comparado com valores basais para ratos 2R, #Comparado com valores basais para ratos 2R-1C, <sup>ƒ</sup>Comparado com estimulação com ácido labda-15-óico em ratos 2R-1C (p < 0,05, ANOVA seguido de teste Newman-Keuls de comparação múltipla).

Discussão

As presentes conclusões indicam que o ácido labda-15-óico mostrou-se mais efetivo na indução do relaxamento vascular, em ratos 2R, em aortas com endotélio intacto pré-contraídas com fenilefrina, em comparação com aortas sem endotélio. Esse resultado está de acordo com descobertas anteriores de nosso laboratório, que mostram que o relaxamento induzido pelo ácido labda-15-óico é parcialmente dependente da via do óxido nítrico endotelial (NO)-GMPc.13 Por outro lado, em aortas de ratos 2R-1C, não foram observadas diferenças no relaxamento induzido pelo ácido labda-15-óico entre anéis com endotélio intacto e sem endotélio. O tônus vascular alterado é característica da maioria das formas de hipertensão experimental e humana e está associado a disfunção endotelial com consequente dano à vasodilatação endotélio-dependente e redução da sinalização de NO.19-21 Considerando-se que NO derivado do endotélio medeia parcialmente o efeito vasorelaxante do ácido labda-15-óico, a diminuição da potência para a ação relaxante do labdano nas aortas de ratos 2R-1C pode ser causada pela diminuição da biodisponibilidade de NO descrita em estados hipertensivos. Na verdade, essa hipótese ganha força com o fato de que a geração de nitrato, induzida pelo ácido labda-15-óico, nas artérias de 2R-1C foi mais baixa do que aquela encontrada nas artérias de ratos 2R. Também é importante notar que encontramos menor conteúdo de NOx basal nas artérias de 2R-1C em comparação a aortas de ratos 2R, corroborando ainda mais observações anteriores que mostram disponibilidade reduzida de NO basal em hipertensão renovascular.22-24

A ativação de canais para K+ leva a hiperpolarização de céluas do músculo liso vasclar, diminuição da atividade dos canais para Ca2+ dependentes de voltagem e vasodilatação.25 A ativação dos canais para K+ dependentes de voltagem e sensíveis ao ATP, assim como de canais para K+ ativados por Ca2+ de alta e baixa condutância, tiveram participação na resposta vasorelaxante induzida pelo ácido labda-15-óico.13 Está bem estabelecido que a vasodilatação dependente do endotélio e a hiperpolarização das células do músculo liso mostram-se comprometidas em segmentos aórticos de ratos hipertensivos 2R-1C.26 A função anormal dos canais para K+ ativados por Ca2+ de alta condutância, e dos canais para K+ sensíveis ao ATP presentes no músculo liso vascular tem uma participação no relaxamento comprometido das aortas dos ratos 2R-1C,27,28 e também pode contribuir para a redução da vasodilatação dependente do endotélio induzida pelo ácido labda-15-óico nas aortas de ratos 2R-1C.

No presente estudo não foram encontradas diferenças na ação inibitória demonstrada pelo ácido labda-15-óico nas artérias pré-contraídas com KCl em ratos 2R e 2R-1C. A contração induzida por KCl no músculo liso é mediada pela despolarização da membrana celular e aumento do influxo de Ca2+ através dos canais para Ca2+ operados por voltagem.29,30 Dessa forma, podemos sugerir que o ácido labda-15-óico bloqueia o influxo de Ca2+extracelular por meio de interferência com canais operados por voltagem em ratos 2R e 2R-1C.

A forscolina relaxou aortas com endotélio intacto e sem endotélio, pré-contraídas com fenilefrina (mas não com KCl) mais do que o ácido labda-15-óico em ratos 2R e 2R-1C. Além disso, a forscolina mostrou-se mais potente do que o ácido labda-15-óico na indução de relaxamento vascular em artérias pré-contraídas com fenilefrina ou KCl em ratos 2R-1C e 2R. Possíveis explicações para esses efeitos estão relacionadas à estrutura química dos labdanos e/ou de seus mecanismos de ação. Analisando a estrutura química do ácido labda-15-óico e da forscolina (Figura 1), observamos que apesar desses dois compostos serem classificados como diterpenos do tipo labdano, há notável presença de um grande número de grupos doadores de ligação de hidrogênio (grupo hidrofílico), ressaltando os radicais hidroxila em C-1, C-6 e C-9 esqueleto da forscolina em comparação com a estrutura química do ácido labda-15-óico, que contém apenas dois grupos hidrofílicos em C-3 e C-16. Além disso, também é possível observar que esses compostos naturais diferem uns dos outros em suas configurações invertidas dos carbonos C-5, C-9 e C-10. Estudos prévios mostraram que diferenças químicas nos diterpenos alteram suas propriedades cardiovasculares,17,31 e podem ser fonte da discrepância entre os efeitos do ácido labda-15-óico e da forscolina aqui descritos.

Labdanos exercem seus efeitos cardiovasculares agindo em vários locais,11,12,32 e por isso diversas vias intracelulares fazem o papel da mediação do relaxamento vascular induzido por esses compostos.33 O aumento nos níveis de AMPc, devido à ativação da adenilil ciclase e ativação subsequente de PKA é o principal mecanismo responsável pelo relaxamento vascular induzido pelo labdano forscolina.9 Entretanto, a forscolina também aumenta a produção endotelial de NO via ativação de eNOS.34 Por outro lado, os mecanismos responsáveis pela ação vasorelaxante do ácido labda-15-óico não estão relacionados com a ativação da adenilil ciclase e envolvem o bloqueio do influxo de Ca2+ extracelular, o aumento da produção endotelial de NO e a abertura dos canais para K+.13 As diferenças nos mecanismos responsáveis pela respostas vasculares desses dois labdanos também podem ser responsáveis pelas diferentes respostas cardiovasculares demonstradas pelo ácido labda-15-óico e pela forscolina.

Aprimoramentos no tratamento farmacológico da hipertensão contribuem para uma redução na incidência de doenças cardiovasculares.35 Diterpenos do tipo labdano também podem ser considerados fonte promissora de novos protótipos para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos cardiovasculares. A ação hipotensora de diterpenos do tipo labdano está relacionada a sua ação miorrelaxante.5,6,11,12 Recentemente, descrevemos que o ácido labda-15-óico induz relaxamento vascular e hipotensão em ratos normotensos.13 Considerando-se que o ácido labda-15-óico relaxou aortas nos ratos 2R-1C, levantamos a hipótese de que o labdano poderia exercer uma ação anti-hipertensiva in vivo. No presente estudo a administração intravenosa de ácido labda-15-óico induziu uma hipotensão de curta duração em ratos 2R e 2R-1C, demonstrando ainda mais que o ácido labda-15-óico exerce efeito anti-hipertensivo in vivo. O ácido labda-15-óico induziu uma redução menos pronunciada na pressão arterial em comparação à forscolina, fortalecendo a idéia de que diferenças químicas alteram a ação hipotensora demonstrada por diterpenos do tipo labdano. Também é importante notar que o ácido labda-15-óico causa hipotensão por meio da vasodilatação periférica, mediada em parte por NO,13 ao passo que os efeitos da forscolina são mediados principalmente pela ativação da adenilil ciclase e aumento nos níveis de AMPc.5-9 Essa observação é relevante já que, conforme mencionado anteriormente, a disfunção endotelial com prejuízos na vasodilatação dependente do endotélio e a redução da sinalização mediada pelo NO é característica da hipertensão.19-21 Essa característica do estado hipertensivo pode explicar, pelo menos em parte, o efeito reduzido do ácido labda-15-óico em comparação à forscolina.

Algumas limitações do presente estudo devem ser consideradas. O fato de o ácido labda-15-óico ter reduzido a pressão arterial em um modelo animal de hipertensão renovascular, não é garatia de que esse labdano também será efetivo em outros modelos animais de hipertensão ou na hipertensão humana. Outro ponto a ser considerado é que o efeito vasorelaxante do labdano deve também ser testado em vasos de resistência, uma vez que estes são mais importantes na regulação da pressão arterial. Finalmente, nossas descobertas mostram os efeitos do ácido labda-15-óico após injeção intravenosa do composto, mas não temos informações sobre a biodisponibilidade e os efeitos cardiovasculares desse composto após administração oral.

 Conclusões

Diterpenos provavelmente cumprem o pré-requisito farmacológico de uma classe de compostos, e podem ter uso terapêutico em doenças cardiovasculares. Usando uma combinação de abordagens in vivo e in vitro, a presente investigação mostra pela primeira vez que o ácido labda-15-óico induz relaxamento vascular em artérias de ratos hipertensos 2R-1C. Administração de labdano in vivo induziu uma queda na pressão arterial de ratos hipertensos. Os estudos experimentais iniciais sobre os efeitos cardiovasculares dos labdanos são importantes e necessários, considerando-se tal informação um pré-requisito para qualquer uso racional e seguro desses compostos no tratamento de hipertensão.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPESP.

Vinculação acadêmica

Este estudo é vinculado ao programa de Pós-Graduação em Farmacologia - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP).

 Agradecimentos

Agradecemos os Drs Evelin C. Carnio e Marcelo E. Batalhão pela medição de pressão arterial. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP - 2010/01009-3 and 2011/13630-7). J.A.S. é apoiado por uma bolsa de mestrado da CAPES.