Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC scmd5DV3bMWLRf4GdsbG88B S0066-782X2016000200105 S0066-782X2016005004102 10.5935/abc.20160015 Original Articles Association between Functional Variables and Heart Failure after Myocardial Infarction in Rats Polegato Bertha F. 1 Minicucci Marcos F. 1 Azevedo Paula S. 1 Gonçalves Andréa F. 1 Lima Aline F. 1 Martinez Paula F. 1 Okoshi Marina P. 1 Okoshi Katashi 1 Paiva Sergio A. R. 1 Zornoff Leonardo A. M. 1 Universidade Estadual Paulista "Júlio de mesquita Filho" Faculdade de Medicina de Botucatu Botucatu SP Brazil Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista "Júlio de mesquita Filho" - UNESP Botucatu, SP - Brazil Universidade Estadual Paulista Mailing Address: Leonardo Antônio Mamede Zornoff, Faculdade de Medicina de Botucatu. Departamento de Clínica Médica, Rubião Jr. Postal Code 18618-970, Botucatu, SP - Brazil. E-mail:lzornoff@fmb.unesp.br, lzornoff@cardiol.br

Author contributions

Conception and design of the research and Writing of the manuscript: Polegato BF, Zornoff LAM; Acquisition of data: Polegato BF, Minicucci MF, Azevedo PS, Gonçalves AF, Lima AF, Martinez PF, Okoshi K; Analysis and interpretation of the data: Polegato BF, Minicucci MF, Azevedo PS, Gonçalves AF, Lima AF, Martinez PF, Okoshi MP Okoshi K, Zornoff LAM; Statistical analysis: Minicucci MF, Paiva SAR; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Minicucci MF, Azevedo PS, Martinez PF, Okoshi MF, Okoshi K, Paiva SAR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 26 01 2016 02 2016 106 2 105 112 19 08 2015 04 11 2015 06 11 2015 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

Heart failure prediction after acute myocardial infarction may have important clinical implications.

 Objective:

To analyze the functional echocardiographic variables associated with heart failure in an infarction model in rats.

 Methods:

The animals were divided into two groups: control and infarction. Subsequently, the infarcted animals were divided into groups: with and without heart failure. The predictive values were assessed by logistic regression. The cutoff values predictive of heart failure were determined using ROC curves.

 Results:

Six months after surgery, 88 infarcted animals and 43 control animals were included in the study. Myocardial infarction increased left cavity diameters and the mass and wall thickness of the left ventricle. Additionally, myocardial infarction resulted in systolic and diastolic dysfunction, characterized by lower area variation fraction values, posterior wall shortening velocity, E-wave deceleration time, associated with higher values of E / A ratio and isovolumic relaxation time adjusted by heart rate. Among the infarcted animals, 54 (61%) developed heart failure. Rats with heart failure have higher left cavity mass index and diameter, associated with worsening of functional variables. The area variation fraction, the E/A ratio, E-wave deceleration time and isovolumic relaxation time adjusted by heart rate were functional variables predictors of heart failure. The cutoff values of functional variables associated with heart failure were: area variation fraction < 31.18%; E / A > 3.077; E-wave deceleration time < 42.11 and isovolumic relaxation time adjusted by heart rate < 69.08.

 Conclusion:

In rats followed for 6 months after myocardial infarction, the area variation fraction, E/A ratio, E-wave deceleration time and isovolumic relaxation time adjusted by heart rate are predictors of heart failure onset.

 Heart Failure / complications Myocardial Infarction Rats Ventricular Dysfunction Introduction

Heart failure syndrome is considered a public health problem with important prognostic implications. In this sense, around 50% of patients with cardiac dysfunction die within 5 years. In addition, 40% of patients die during the period of 1 year after the first hospitalization for heart failure, with many of the deaths occurring as sudden death.1,2

It is currently believed that the myocardial infarction (MI) is the main etiology of ventricular dysfunction. In this sense, epidemiological studies suggest that the signs and symptoms of heart failure are present in 25% of MI cases. Moreover, approximately 40% of MI cases are accompanied by systolic alterations in the left ventricle (LV). Recently, it was verified that 10% of MI patients have a restrictive pattern, suggesting severe diastolic dysfunction.3 Thus, the association between MI and ventricular dysfunction cannot be neglected.

One of the most often used strategies for the study of functional alterations caused by coronary occlusion is the use of the experimental infarction model in rats. Among other factors, this is due to the low cost and simplicity of handling these animals. The most important factor, however, refers to the similarity with the physiopathological changes that occur after an infarction in humans.4

Echocardiography has been widely used in the study of the morphological and functional alterations after coronary occlusion.5-18 However, there has been no consensus on which functional variables are predictive of heart failure in this model. Thus, our objective was to evaluate the functional variables associated with heart failure in the model. In addition, we intend to determine the critical values for heart failure prediction for each variable.

 Methods

The experimental protocol of this study was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of our institution, complying with the Ethical Principies in Animal Experimentation adopted by the Brazilian College of Animal Experimentation.

Experimental infarction

Male Wistar rats, weighing between 200 and 250 g were studied. Acute myocardial infarction was produced according to the previously described method.19,20 Briefly, the rats were anesthetized with ketamine (70 mg/kg) and xylazine (5 mg/kg) and submitted to a left lateral thoracotomy. After exteriorization of the heart, the left atrium was moved away and the left coronary artery was ligated with a 5-0 monofilament nylon suture between the pulmonary artery outflow tract and the left atrium. Subsequently, the heart was returned to the chest, the lungs were inflated with positive pressure and the thorax closed using cotton 10 sutures. Coronary occlusion was not performed in 43 animals (Control Group).

The animals were kept in cages for recovery, fed standard commercial chow and had free access to water, with regular 12 hour light: dark cycles, at a temperature of approximately 25° C and controlled humidity.

 Echocardiographic study

Echocardiography was performed 6 months after the infarction. The animals were anesthetized intramuscularly with ketamine (50 mg/kg) and xylazine (1 mg/kg), for the echocardiographic study. After trichotomy of the anterior chest region, the animals were positioned in the supine position in a specially designed grooves that allows slight left lateral rotation for the examination, using Philips equipment (HDI 5000 model) equipped with a multi-frequency electronic transducer up to 12 MH. All measurements were made in accordance with the recommendations of the American Society of Echocardiography/European Association of Echocardiography.21 Left ventricular cavity image was obtained by positioning the M-mode cursor between the papillary muscles, right below the mitral valve plane. The LV diastolic diameter (LVDD) and left ventricular septal thickness (LVST) were measured at the moment corresponding to the maximum cavity diameter. The LV Systolic diameter (LVSD) was measured at the maximum systolic excursion of the posterior wall of the cavity. Diastolic (DA) and systolic (SA) areas of LV were measured in two-dimensional mode, using planimetry at the parasternal plane of the smaller axis.

LV systolic function was assessed by calculating the area variation fraction (AVF = (DA-SA)/DA) and the posterior wall shortening velocity (PWSV). Diastolic function was assessed by the E/A ratio, the E-wave deceleration time (EDT) and the Isovolumic Relaxation Time Adjusted for Heart Rate (IVRT/HR).22,23

Histological analysis

After the echocardiographic study, the animals were euthanized and the hearts were removed and dissected. The right and left ventricles, including the interventricular septum, were separated. Cardiac tissue samples were fixed in a 10% formaldehyde solution for 48 hours, according to the previously described method.24,25

The histological sections were stained on slides with hematoxylin-eosin (HE) and Masson solution for assessment of the infarcted tissue, using a Leica DM LS microscope coupled to a video camera, which sends digital images to a computer with the Image Pro-Plus imaging analysis program (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA).

The infarction size was determined in 5 to 6-mm sections from the apex, as the values in this region correspond to the mean values obtained from sections of the entire heart.24,25 To estimate the infarction size through histological analysis, the epicardial and endocardial circumferences of the infarcted and non-infarcted segments were determined. The infarction size is expressed as a percentage of the ventricular circumference measurements.

 Heart failure criteria

The diagnosis of heart failure was made by thrombus detection in the left atrium, pleural effusion, ascites, and right ventricular hypertrophy, characterized by the ratio of the right ventricle weight adjusted for body weight > 0.8 mg/g, as previously described.4,26,27

Statistical analysis

The comparisons between the groups after 6 months were carried out using Student's t test when data showed normal distribution. When the data did not have normal distribution, comparisons between groups were performed using the Mann-Whitney U test. Data were expressed as mean ± standard deviation or median, with 25 and 75 percentiles. The predictive values were analyzed by logistic regression. In this analysis, the presence or absence of heart failure was used as the dependent variable. The cutoff values predictive of heart failure were determined using ROC curves. The significance level was set at 5%. Statistical analyses were performed using the SigmaPlot program for Windows, v.12.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA).

 Results

Six months after surgery, 88 animals with infarction (I) and 43 control animals (C) were included in the study.

Echocardiographic variables are shown in Table 1. As expected, the infarction increased the left cavity diameters, LV mass and wall thickness. Additionally, the MI resulted in systolic and diastolic dysfunction, characterized by lower values of the AVF, PWSV, EDT, associated with higher values of E/A ratio and IVRT/HR.

Echocardiographic study after six months of observation
Variables Control (n = 43) AMI (n = 88) p-value
LAD (mm) 5.80 (5.55-6.10) 7.72 (6.70-8.59) < 0.001
LVDD (mm) 8.39 (8.12-8.80) 10.96 (10.32-11.73) < 0.001
LVSD (mm) 4.34 (4.08-4.66) 8.70 (7.61-9.75) < 0.001
LVMI 1.94(1.74-2.11) 3.33 (2.79-4.09) < 0.001
E/A 1.55 (1.40-1.69) 1.68 (1.32-4.85) 0.085
IVRT/HR 59.3 (5452-64.8) 70.4 (61.4-77.9) < 0.001
EDT ( ms) 45 (41-55) 39 (33-48 < 0.001
AVF (%) 67 (64-71) 33 (35-36) < 0.001
PWSV (mm/s) 37 (35-39) 25 (20-28) < 0.001
PWDT 1.49 (1.43-1.59) 1.70 (1.59-1.87) < 0.001

Data are expressed as median with 25 and 75 percentiles. AMI: animals with acute myocardial infarction; LAD: left atrium diameter; LVDD: left ventricular diastolic diameter; LVSD: left ventricular systolic diameter; LVMI: left ventricular mass index; E/A: E/A wave ratio; IVRT/HR: isovolumic relaxation time adjusted by heart rate; EDT: E-wave deceleration time; AVF: area variation fraction; PWSV: posterior wall shortening velocity; EDPP: posterior wall diastolic thickness.

Considering the infarcted animals, 54 animals (61%) developed heart failure. Animals with heart failure had larger infarctions (43.5 ± 7.5% vs. 40.0 ± 8.1%; p = 0.044), higher mass index and left cavity diameters, associated with worsening of functional variables, compared with the infarcted animals without heart failure (Table 2).

Echocardiographic study of infarcted animals after 6 months of observation
Variables Without HF (n = 34) With HF (n = 54) p-value
LAD (mm) 6.90 ± 1.29 8.16 ± 1.30 < 0.001
LVDD (mm) 10.6 ± 0.84 11.4 ± 1.05 < 0.001
LVSD (mm) 8.17 ± 1.13 9.02 ± 1.39 0.002
LVMI 3.14 (2.81-3.59) 3.64 (2.78-4.50) 0.018
E/A 1.43 (1.24-1.70) 3.91 (1.35-6.27) 0.002
IVRT/HR (ms) 73.9 ± 12.1 66.7 ± 12.0 0.008
EDT (ms) 43.1 ± 8.8 38.3 ± 10.2 0.036
AVF (%) 33.3 ± 8.6 29.6 ± 7.6 0.040
PWSV 25.9 (22.6-28.4) 24.2 (20.6-28.3) 0.344

Data are expressed as mean ± standard deviation (for normal distribution) or median with 25 and 75 percentiles (for non-normal distribution). HF: heart failure; LAD: left atrium diameter; LVDD: left ventricular diastolic diameter; LVSD: left ventricular systolic diameter; LVMI: left ventricular mass index; E/A: E/A wave ratio; IVRT/HR: isovolumic relaxation time adjusted by heart rate; EDT: E-wave deceleration time; AVF: area variation fraction; PWSV: posterior wall shortening velocity.

Table 3 shows the results of the regression analyses. AVF, E/A ratio, EDT and IVRT/HR were the functional variables predictors of heart failure. However, we found that the predictive value was low for the functional variables, suggesting the importance of other variables. Additionally, the cutoff values of the functional variables associated with heart failure were: AVF: < 31.18% (Figure 1); E/A ratio > 3.077 (Figure 2); EDT: < 42.11 ms (Figure 3) and IVRT/HR: < 69.08 (Figure 4).

Heart failure predictors 6 months after coronary occlusion
Variables OR 95%CI p-value
E/A 1.529 1.183-1.976 0.001
IVRT/HR 0.949 0.911-0.989 0.013
EDT (ms) 0.951 0.906-0.998 0.040
AVF (%) 0.944 0.892-0.999 0.045
PWSV (mm/s) 0.077 0.905-1.055 0.554

OR: odds ratio; 95%CI: 95% confidence interval; E/A: E wave/A wave ratio; IVRT/HR, isovolumic relaxation time adjusted by heart rate; DTE: deceleration time of E wave; AVF: area variation fraction; PWSV: posterior wall shortening velocity.

Cutoff value for the area variation fraction, as a heart failure predictor 6 months after infarction. Area under the curve: 0.6277; 95% confidence interval: 0.5066 to 0.7489; p-value: 0.044; cutoff < 31.18; sensitivity: 55.60%; specificity: 57.34%.

Cutoff value for the E/A ratio as a heart failure predictor 6 months after infarction. Area under the curve: 0.6985; 95% confidence interval: 0.5875 to 0.8095, p-value: 0.0017; cutoff > 3,077; sensitivity: 57.93%o; specificity: 62.56%o.

Cutoff value for the deceleration time of the E wave, as a heart failure predictor 6 months after infarction. Area under the curve: 0.6533; 95% confidence interval: 0.5341 to 0.7724; p-value: 0.0218; cutoff < 42.11; sensitivity: 59.77%; specificity: 51.85%.

Cutoff value for the isovolumic relaxation time adjusted by heart rate as a heart failure predictor 6 months after infarction. Area under the curve: 0.6544; 95% confidence interval: 0.5398 to 0.7691; p-value: 0.01512; cutoff < 69.08; sensitivity: 55.10%; specificity: 60.49%.

Discussion

The aim of our study was to evaluate the functional variables associated with heart failure in an experimental MI model in rats. Our data suggested that AVF, E/A ratio, EDT and IVRT/HR are predictors of heart failure 6 months after infarction.

The first aspect to be considered is that in our study, most animals (61%) with infarction developed heart failure. In a previous study, we determined that infarctions affecting 40% of LV are required for the development of heart failure in this model.26 in accordance with this concept, in this study, the animals showed, on average, large infarcts. In this sense, we can infer that the coronary occlusion model in rats is appropriate for the study of the heart failure syndrome.

The second important aspect is related to the fact that, as expected, animals with heart failure had worsening of functional variables related to systolic function, when compared with animals without failure. However, in the regression analysis, the AVF, but not LVPW, was predictive of heart failure onset. It is believed that in models of regional LV akinesia, one-dimensional echocardiographic methods of functional assessment may be flawed. In this situation, it is recommended to use, for instance, the Simpson's method in humans. AVF is obtained through the analysis of the SA and DA, using the two-dimensional technique. However, the LVPW is obtained in single-dimensional mode. Therefore, our results emphasize that, in this model, similar to what occurs in humans, it is preferable to use systolic functional analysis with two-dimensional technique, such as AVF, for instance.

Another prominent aspect is related to the diastolic function. Unlike systolic function, the study of diastolic function through echocardiography in the rat model is not well standardized. Some of the main technical difficulties are the small size of the animal, with its implications on the transducer and heart rate of around 300 beats per minute. In our study, however, all assessed diastolic function variables were associated with heart failure onset. Thus, in this model, diastolic function assessed by E/A ratio, EDT and IVRT/HR were predictors of heart failure 6 months after coronary occlusion.

The most important aspect of our study is that heart failure prediction in the MI rat model has important implications. Although there is no consensus on the definition of cardiac dysfunction and heart failure, they are usually diagnosed by elevated end-diastolic pressure (PD2) of the LV (invasive hemodynamic method) and the presence of clinical signs assessed after death (RV hypertrophy, ascites, pleural effusion and left atrial thrombus), respectively. Therefore, our study suggests that echocardiography is a useful non-invasive tool for the prediction of this syndrome, as systolic function variables, as well the diastolic function parameters, little studied in this model, were associated with heart failure.

Previous studies have evaluated the association between echocardiographic parameters and heart failure. However, most studies have assessed the association between echocardiography and PD2, and not with heart failure clinical variables.6-10 Martinez et al.5 assessed the association between morphological and functional cardiac variables with the clinical manifestations of heart failure. However, the echocardiographic variables were studied through cluster analysis.5 Therefore, we believe that our study adds important information about the role of echocardiography as a predictor of long-term heart failure in this model.

Finally, it is already well-established that the major determinant of ventricular function, of the remodeling process and, consequently, of heart failure onset in this model, is the size of the infarction.4,26,28,29 In our study, however the difference in infarction size among animals with and without heart failure, although significant, was low (43 ± 7% vs. 40 ± 8%, respectively). Therefore, we conclude that other factors rather than the infarction size, are important determinants of heart failure onset in this model.

Among the possible candidates, we can include changes in ventricular cavity diameter, wall thickness alterations, changes in the normal LV configuration, from elliptical to the rounded shape, among others. Therefore, in some situations, changes in geometry alone could be responsible for ventricular global function impairment, by changing the load conditions to which the heart is submitted.

 Conclusion

In rats followed for 6 months after MI, the area variation fraction, the E/A ratio, E-wave deceleration time and the isovolumic relaxation time adjusted by heart rate were predictors of heart failure onset.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 Errata

In the original article “Association between Functional Variables and Heart Failure after Myocardial Infarction in Rats”, adjust the name of author Aline F. Lima to Aline R. Lima.

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Lang RM Bierig M Devereaux RB Flachskampf FA Foster E Pellikka PA Chamber Quantification Writing Group American Society of Echocardiography's Guidelines and Standards Committee European Association of Echocardiography Recommendations for chamber quantification: a report from the American Society of Echocardiography's Guidelines and Standards Committee and the Chamber Quantification Writing Group, developed in conjunction with the European Association of Echocardiography, a branch of the European Society of Cardiology J Am Soc Echocardiogr 2005 18 12 1440 1463 22 Minicucci MF, dos Santos PP, Rafacho BP, Gonçalves AF, Silva RA, Chiuso-Minicucci F, et al. Mechanisms involved in the beneficial effects of spironolactone after myocardial infarction. PLoS One. 2013;8(9):e76866. Minicucci MF dos Santos PP Rafacho BP Gonçalves AF Silva RA Chiuso-Minicucci F Mechanisms involved in the beneficial effects of spironolactone after myocardial infarction PLoS One 2013 8 9 e76866 23 Gonçalves AF, Santos PP, Rafacho BP, Batista DF, Azevedo PS, Minicucci MF, et al. Vitamin D supplementation intensifies cardiac remodeling after experimental myocardial infarction. Int J Cardiol. 2014;176(3):1225-6. Gonçalves AF Santos PP Rafacho BP Batista DF Azevedo PS Minicucci MF Vitamin D supplementation intensifies cardiac remodeling after experimental myocardial infarction Int J Cardiol 2014 176 3 1225 1226 24 Minicucci MF, Azevedo PS, Oliveira SA Jr, Martinez PF, Chiuso-Minicucci F, Polegato BF, et al. Tissue vitamin A insufficiency results in adverse ventricular remodeling after experimental myocardial infarction. Cell Physiol Biochem. 2010;26(4-5):523-30. Minicucci MF Azevedo PS Oliveira SA Jr Martinez PF Chiuso-Minicucci F Polegato BF Tissue vitamin A insufficiency results in adverse ventricular remodeling after experimental myocardial infarction Cell Physiol Biochem 2010 26 4-5 523 530 25 Gonçalves AF, Congio LH, dos Santos PP, Rafacho BP, Pereira BL, Claro RF, et al. Pamidronate attenuates diastolic dysfunction induced by myocardial infarction associated with changes in geometric patterning. Cell Physiol Biochem. 2015;35(1):259-69. Gonçalves AF Congio LH dos Santos PP Rafacho BP Pereira BL Claro RF Pamidronate attenuates diastolic dysfunction induced by myocardial infarction associated with changes in geometric patterning Cell Physiol Biochem 2015 35 1 259 269 26 Minicucci MF, Azevedo PS, Martinez PF, Lima AR, Bonomo C, Guizoni DM, et al. Critical infarct size to induce ventricular remodeling, cardiac dysfunction and heart failure in rats. Int J Cardiol. 2011;151(2):242-3. Minicucci MF Azevedo PS Martinez PF Lima AR Bonomo C Guizoni DM Critical infarct size to induce ventricular remodeling, cardiac dysfunction and heart failure in rats Int J Cardiol 2011 151 2 242 243 27 Lima AR, Martinez PF, Okoshi K, Guizoni DM, Zornoff LA, Campos DH, et al. Myostatin and follistatin expression in skeletal muscles of rats with chronic heart failure. Int J Exp Pathol. 2010;91(1):54-62. Lima AR Martinez PF Okoshi K Guizoni DM Zornoff LA Campos DH Myostatin and follistatin expression in skeletal muscles of rats with chronic heart failure Int J Exp Pathol 2010 91 1 54 62 28 Zornoff LA, Matsubara BB, Matsubara LS, Paiva SA, Spadaro J. Early rather than delayed administration of lisinopril protects the heart after myocardial infarction in rats. Basic Res Cardiol. 2000;95(3):208-14. Zornoff LA Matsubara BB Matsubara LS Paiva SA Spadaro J Early rather than delayed administration of lisinopril protects the heart after myocardial infarction in rats Basic Res Cardiol 2000 95 3 208 214 29 Pfeffer MA, Pfeffer JM, Fishbein MC, Fletcher PJ, Spadaro J, Kloner RA, et al. Myocardial infarct size and ventricular function in rats. Circ Res. 1979;44(4):503-12. Pfeffer MA Pfeffer JM Fishbein MC Fletcher PJ Spadaro J Kloner RA Myocardial infarct size and ventricular function in rats Circ Res 1979 44 4 503 512 Articles Associação entre Variáveis Funcionais e Insuficiência Cardíaca após o Infarto do Miocárdio em Ratos Polegato Bertha F. 1 Minicucci Marcos F. 1 Azevedo Paula S. 1 Gonçalves Andréa F. 1 Lima Aline F. 1 Martinez Paula F. 1 Okoshi Marina P. 1 Okoshi Katashi 1 Paiva Sergio A. R. 1 Zornoff Leonardo A. M. 1 Universidade Estadual Paulista "Júlio de mesquita Filho" Faculdade de Medicina de Botucatu Botucatu SP Brazil Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista "Júlio de mesquita Filho" - UNESP Botucatu, SP - Brasil Universidade Estadual Paulista Correspondência: Leonardo Antônio Mamede Zornoff, Faculdade de Medicina de Botucatu. Departamento de Clínica Médica, Rubião Jr. CEP 18618-970, Botucatu, SP - Brasil. E-mail:lzornoff@fmb.unesp.br, lzornoff@cardiol.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito: Polegato BF, Zornoff LAM; Obtenção de dados: Polegato BF, Minicucci MF, Azevedo PS, Gonçalves AF, Lima AF, Martinez PF, Okoshi K; Análise e interpretação dos dados: Polegato BF Minicucci MF, Azevedo PS, Gonçalves AF, Lima AF, Martinez PF, Okoshi MF, Okoshi K, Zornoff LAM; Análise estatística: Minicucci MF, Paiva SAR; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Minicucci MF, Azevedo PS, Martinez PF, Okoshi MP Okoshi K, Paiva SAR.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

A predição de insuficiência cardíaca após o infarto agudo do miocárdio pode ter importantes implicações clínicas.

 Objetivo:

Analisar as variáveis funcionais ecocardiográficas associadas com insuficiência cardíaca no modelo do infarto em ratos.

 Métodos:

Os animais foram divididos em dois grupos: infarto e controle. Após, os animais infartados foram divididos em grupos com e sem insuficiência cardíaca. Os valores preditivos foram avaliados por regressão logística. Os valores de corte preditivos de insuficiência cardíaca foram determinados por meio de curvas ROC.

 Resultados:

Após 6 meses da cirurgia, 88 animais com infarto e 43 animais controle foram incluídos no estudo. O infarto aumentou os diâmetros das cavidades esquerdas, a massa e a espessura da parede do ventrículo esquerdo. Adicionalmente, o infarto resultou em disfunção sistólica e diastólica, caracterizada por menores valores da fração de variação de área, velocidade de encurtamento da parede posterior, tempo de desaceleração da onda E, associada com maiores valores da relação E/A e tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca. Dentre os animais infartados, 54 (61%) desenvolveram insuficiência cardíaca. Ratos com insuficiência cardíaca apresentaram maiores índices de massa e diâmetros das cavidades esquerdas, associadas com piora das variáveis funcionais. A fração de variação de área, relação E/A, tempo de desaceleração da onda E e tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca foram variáveis funcionais preditoras de insuficiência cardíaca. Os valores de corte das variáveis funcionais associados com insuficiência cardíaca foram: fração de variação de área < 31,18%; E/A > 3,077; tempo de desaceleração da onda E < 42,11 e tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca < 69,08.

 Conclusão:

Em ratos acompanhados por 6 meses após o infarto, a fração de variação de área, relação E/A, tempo de desaceleração da onda E e tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca são preditores do aparecimento de insuficiência cardíaca.

 Insuficiência Cardíaca / complicações Infarto do Miocárdio Ratos Disfunção Ventricular Introdução

A síndrome de insuficiência cardíaca é considerada um problema de saúde pública com importantes implicações prognósticas. Nesse sentido, ao redor de 50% dos pacientes com diagnóstico de disfunção cardíaca morrerão no período de 5 anos. Adicionalmente, 40% dos pacientes morrem no período de 1 ano após a primeira hospitalização por insuficiência cardíaca, sendo boa parte dos óbitos por morte súbita.12

Atualmente, acredita-se que o infarto do miocárdio (IM) seja a principal etiologia da disfunção ventricular. Nesse sentido, estudos epidemiológicos sugerem que os sinais e sintomas de insuficiência cardíaca estão presentes em 25% dos casos de IM. Além disso, aproximadamente 40% dos casos de IM são acompanhados por alterações sistólicas do ventrículo esquerdo (VE). Recentemente, evidenciou-se que 10% dos pacientes com IM apresentam padrão restritivo, sugerindo disfunção diastólica grave.3 Assim, a associação entre IM e disfunção ventricular não pode ser negligenciada.

Uma das estratégias mais utilizadas para o estudo das alterações funcionais decorrentes da oclusão coronariana é o uso do modelo do infarto experimental no rato. Entre outros fatores, isso é decorrência do baixo custo e da simplicidade do manejo dos animais. O fator mais importante, no entanto, refere-se à similaridade com as alterações fisiopatológicas que ocorrem após o infarto, em humanos.4

O ecocardiograma vem sendo bastante utilizado no estudo das alterações morfológicas e funcionais após a oclusão coronariana.5-18 No entanto, não tem havido consenso sobre quais variáveis funcionais são preditoras de insuficiência cardíaca nesse modelo. Assim, nosso objetivo foi avaliar as variáveis funcionais associadas com quadro de insuficiência cardíaca no modelo indicado. Adicionalmente, pretendemos determinar os valores críticos de predição de insuficiência cardíaca para cada variável.

 Métodos

O protocolo experimental do presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal de nossa instituição, estando em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

Infarto experimental

Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando entre 200 e 250 g. O infarto agudo foi produzido de acordo com método já descrito previamente.19,20 Em resumo, os ratos foram anestesiados com quetamina (70 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), e submetidos à toracotomia lateral esquerda. Após exteriorização do coração, o átrio esquerdo foi afastado, e a artéria coronária esquerda foi ligada com fio mononáilon 5-0 entre a saída da artéria pulmonar e o átrio esquerdo. A seguir, o coração retornou ao tórax, os pulmões foram inflados com pressão positiva e o tórax, fechado por suturas com algodão 10. Em 43 animais, não foi realizada oclusão coronariana (Grupo controle).

Os animais foram mantidos em gaiolas para recuperação, alimentados com ração comercial padrão e com livre acesso a água, com controle de luz - ciclos de 12 horas, temperatura de aproximadamente 25°C e umidade controlada.

 Estudo ecocardiográfico

O ecocardiograma foi realizado 6 meses após o infarto. Os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina (50 mg/kg) e xilazina (1 mg/kg), por via intramuscular, para o estudo ecocardiográfico. Após tricotomia da região anterior do tórax, os animais foram posicionados em decúbito dorsal em canaleta especialmente projetada e que permite leve rotação lateral esquerda para realização do exame, utilizando-se equipamento da Philips (modelo HDI 5000) dotado de transdutor eletrônico multifrequencial até 12 MHz. Todas as medidas foram efetuadas de acordo com as recomendações daAmerican Society of Echocardiography/ European Association of Echocardiography.21 A imagem da cavidade ventricular esquerda foi obtida posicionando o cursor do modo-M entre os músculos papilares, logo abaixo do plano da valva mitral. O diâmetro diastólico do VE (DDVE) e a espessura septal do VE (HDVE) foram medidos no momento correspondente ao diâmetro máximo da cavidade. O diâmetro sistólico do VE (DSVE) foi medido no momento da excursão sistólica máxima da parede posterior da cavidade. As áreas diastólicas (AD) e sistólicas (AS) do VE foram medidas no modo bidimensional, por meio de planimetria, no plano paraesternal do eixo menor.

A função sistólica do VE foi avaliada calculando-se a fração de variação de área (FAV = (AD-AS)/AD) e a velocidade de encurtamento da parede posterior (VEPP). A função diastólica foi avaliada pela relação E/A, pelo tempo de desaceleração da onda E (TDE) e pelo tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca (TRIV/RR).22,23

Análise histológica

Após o estudo ecocardiográfico, os animais foram sacrificados e os corações foram retirados e dissecados. Os ventrículos direito e esquerdo, incluindo o septo interventricular, foram separados. Amostras de tecido cardíaco foram fixadas em solução de formol a 10% por período de 48 horas, segundo método já descrito.24,25

Os cortes histológicos foram corados em lâmina com solução Hematoxilina-Eosina (HE) e Masson para aferição do tecido infartado, empregando-se microscópio Leica DM LS acoplado à câmera de vídeo, que envia imagens digitais a um computador dotado de programa de análise de imagens Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, EUA).

O tamanho do infarto foi determinado em cortes entre 5 e 6 mm do ápice, pelo fato de os valores desta região corresponderem à média dos valores obtidos de cortes de todo coração.24,25 Para estimativa do tamanho do infarto, por meio de análise histológica, foram determinadas as circunferências epicárdicas e endocárdicas dos segmentos infartados e não infartados. O tamanho do infarto é expresso como porcentual das medidas da circunferência ventricular.

 Critérios de insuficiência cardíaca

O diagnóstico de insuficiência cardíaca foi feito pela detecção de trombo no átrio esquerdo, derrame pleural, ascite e hipertrofia do ventrículo direito, caracterizado pela relação do peso do ventrículo direito ajustado pelo peso corpóreo > 0,8 mg/g, conforme descrito previamente.4,26,27

Análise estatística

As comparações entre os grupos após 6 meses foram feitas com o teste t de Student quando os dados apresentavam distribuição normal. Quando os dados apresentavam distribuição não normal, as comparações entre os grupos foram feitas com o teste U Mann-Whitney. Os dados foram expressos em média ± desvio padrão ou mediana, com percentil 25 e 75. Os valores preditivos foram analisados por regressão logística. Nessa análise, utilizamos, como variável dependente, a presença ou não de insuficiência cardíaca. Os valores de corte preditivos de insuficiência cardíaca foram determinados por meio de curvas ROC. O nível de significância foi 5%. As análises estatísticas foram feitas com o programa SigmaPlot para Windows v12.0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA).

 Resultados

Após 6 meses da cirurgia, 88 animais com infarto (I) e 43 animais controle (C) foram incluídos no estudo.

As variáveis ecocardiográficas estão mostradas na Tabela 1. Conforme esperado, o infarto aumentou os diâmetros das cavidades esquerdas, a massa e a espessura da parede do VE. Adicionalmente, o infarto resultou em disfunção sistólica e diastólica, caracterizada por menores valores da FAV, VEPP TDE, associada com maiores valores da relação E/A e TRIV/RR.

Estudo ecocardiográfico após 6 meses de observação
Variáveis Controle (n = 43) IAM (n = 88) Valor de p
AE (mm) 5,80 (5,55-6,10) 7,72 (6,70-8,59) < 0,001
DDVE (mm) 8,39 (8,12-8,80) 10,96 (10,32-11,73) < 0,001
DSVE (mm) 4,34 (4,08-4,66) 8,70 (7,61-9,75) < 0,001
IMVE 1,94(1,74-2,11) 3,33 (2,79-4,09) < 0,001
E/A 1,55 (1,40-1,69) 1,68 (1,32-4,85) 0,085
TRIV/RR 59,3 (5452-64,8) 70,4 (61,4-77,9) < 0,001
TDE ( ms) 45 (41-55) 39 (33-48 < 0,001
FAV (%) 67 (64-71) 33 (35-36) < 0,001
VEPP (mm/s) 37 (35-39) 25 (20-28) < 0,001
EDPP 1,49 (1,43-1,59) 1,70 (1,59-1,87) < 0,001

Os dados são expressos em mediana com percentil 25 e 75. IAM: animais infartados; AE: diâmetro do átrio esquerdo; DDVE: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE: diâmetro sitólico do ventrículo esquerdo; IMVE: índice de massa do ventrículo esquerdo; E/A: relação entre as ondas E e A; TRIV/RR: tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca; TDE: tempo de desaceleração da onda E; FAV: fração de variação de área; VEPP: velocidade de encurtamento da parede posterior; EDPP: espessura diastólica da parede posterior.

Considerando os animais infartados, 54 animais (61%) desenvolveram insuficiência cardíaca. Os animais com insuficiência cardíaca apresentaram maiores infartos (43,5 ± 7,5% vs. 40,0 ± 8,1%; p = 0,044), maiores índices de massa e diâmetros das cavidades esquerdas, associados com piora das variáveis funcionais, em comparação com os animais infartados sem insuficiência cardíaca (Tabela 2).

Estudo ecocardiográfico de animais infartados após 6 meses de observação
Variáveis Sem IC (n = 34) Com IC (n = 54) Valor de p
AE (mm) 6,90 ± 1,29 8,16 ± 1,30 < 0,001
DDVE (mm) 10,6 ± 0,84 11,4 ± 1,05 < 0,001
DSVE (mm) 8,17 ± 1,13 9,02 ± 1,39 0,002
IMVE 3,14 (2,81-3,59) 3,64 (2,78-4,50) 0,018
E/A 1,43 (1,24-1,70) 3,91 (1,35-6,27) 0,002
TRIV/RR (ms) 73,9 ± 12,1 66,7 ± 12,0 0,008
TDE (ms) 43,1 ± 8,8 38,3 ± 10,2 0,036
FAV (%) 33,3 ± 8,6 29,6 ± 7,6 0,040
VEPP 25,9 (22,6-28,4) 24,2 (20,6-28,3) 0,344

Os dados são expressos em média ± desvio padrão (para distribuição normal) ou mediana com percentil 25 e 75 (para distribuição não normal). IC: insuficiência cardíaca; AE: diâmetro do átrio esquerdo; DDVE: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; IMVE: índice de massa do ventrículo esquerdo; E/A: relação entre as ondas E e A; TRIV/RR: tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca; TDE: tempo de desaceleração da onda E; FAV: fração de variação de área; VEPP: velocidade de encurtamento da parede posterior.

Na Tabela 3, estão os resultados das análises de regressão. FAV, relação E/A, TDE e TRIV/RR foram as variáveis funcionais preditoras de insuficiência cardíaca. No entanto, verificamos que o valor preditivo foi baixo para as variáveis funcionais, sugerindo a importância de outras variáveis. Adicionalmente, os valores de corte das variáveis funcionais, associados com insuficiência cardíaca, foram: FAV: < 31,18% (Figura 1); E/A: > 3,077 (Figura 2); TDE: < 42,11 ms (Figura 3) e TRIV/RR: < 69,08 (Figura 4).

Fatores preditores de insuficiência cardíaca após 6 meses da oclusão coronariana
Variáveis OR IC 95% Valor de p
E/A 1,529 1,183-1,976 0,001
TRIV/RR 0,949 0,911-0,989 0,013
TDE (ms) 0,951 0,906-0,998 0,040
FAV (%) 0,944 0,892-0,999 0,045
VEPP (mm/s) 0,077 0,905-1,055 0,554

OR: odds ratio; IC95%: intervalo de confiança de 95%; E/A: relação entre as ondas E e A; TRIV/RR: tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca; TDE: tempo de desaceleração da onda E; FAV: fração de variação de área; VEPP: velocidade de encurtamento da parede posterior.

Valor de corte para a fração de variação de área, como preditora de insuficiência cardíaca, 6 meses após o infarto. Áurea sob a curva: 0,6277; intervalo de confiança de 95%: 0,5066-0,7489; valor de p: 0,044; cutoff < 31,18; sensibilidade: 55,60%; especificidade: 57,34%.

Valor de corte para a relação E/A, como preditora de insuficiência cardíaca, 6 meses após o infarto. Áurea sob a curva: 0,6985; intervalo de confiança de 95%: 0,5875-0,8095; valor de p: 0,0017; cutoff > 3,077; sensibilidade: 57,93%; especificidade: 62,56%.

Valor de corte para o tempo de desaceleração da onda E, como preditora de insuficiência cardíaca, 6 meses após o infarto. Áurea sob a curva: 0,6533; intervalo de confiança de 95%: 0,5341-0,7724; valor de p: 0,0218; cutoff < 42,11; sensibilidade: 59,77%; especificidade: 51,85%.

Valor de corte para o tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca, como preditora de insuficiência cardíaca, 6 meses após o infarto. Áurea sob a curva: 0,6544; intervalo de confiança de 95%: 0,5398-0,7691; valor de p: 0,01512; cutoff < 69,08; sensibilidade: 55,10%; especificidade: 60,49%.

Discussão

O objetivo de nosso trabalho foi avaliar as variáveis funcionais associadas com quadro de insuficiência cardíaca, no modelo do IM experimental em ratos. Nossos dados sugeriram que FAV, relação E/A, TDE e TRIV/RR são preditores de insuficiência cardíaca 6 meses após o infarto.

O primeiro aspecto a ser considerado é que, em nosso estudo, a maioria dos animais (61%) com infarto desenvolveu quadro de insuficiência cardíaca. Em estudo prévio, determinamos que, para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, nesse modelo, são necessários infartos comprometendo 40% do VE.26 Em acordo com esse conceito, nesse estudo , os animais apresentaram, em média, grandes infartos. Nesse sentido, podemos inferir que o modelo de oclusão coronariana em ratos é adequado para o estudo da síndrome de insuficiência cardíaca.

O segundo aspecto relevante refere-se ao fato de que, conforme esperado, os animais com insuficiência cardíaca apresentaram piora das variáveis funcionais relativas à função sistólica, em comparação com os animais sem insuficiência. No entanto, na análise de regressão, a FAV, mas não a VEPP foi preditora do aparecimento de insuficiência cardíaca. Acredita-se que, em modelos de acinesia regional do VE, métodos ecocardiográficos de avaliação funcional monodimensionais podem ser falhos. Nessa situação, recomenda-se o uso, por exemplo, do método de Simpson, em humanos. A FAV é obtida pela análise das AS e AD, utilizando técnica bidimensional. No entanto, a VEPP é obtida no modo monodimensional. Portanto, nossos resultados enfatizam que, nesse modelo, a exemplo do que ocorre em humanos, é preferível o uso de análise funcional sistólica com técnica bidimensional como, por exemplo, a FAV.

Outro aspecto proeminente está relacionado com a função diastólica. Diferentemente da função sistólica, o estudo da função diastólica no modelo do rato com o ecocardiograma não está tão bem padronizado. Algumas das principais dificuldades técnicas são o tamanho pequeno do animal, com suas implicações no transdutor e a frequência cardíaca ao redor de 300 batimentos por minuto. Em nosso estudo, no entanto, todas as variáveis analisadas de função diastólica foram associadas com o aparecimento de insuficiência cardíaca. Assim, nesse modelo, a função diastólica, avaliada pela relação E/A, o TDE e o TRIV/RR foram preditores de insuficiência cardíaca 6 meses após a oclusão coronariana.

O aspecto mais relevante do nosso estudo é que a predição de insuficiência cardíaca no modelo de ratos com IM tem importantes implicações. Apesar de não haver consenso sobre a definição de disfunção cardíaca e insuficiência cardíaca, usualmente elas são diagnosticadas por elevação da pressão diastólica final (PD2) do VE (método hemodinâmico invasivo) e presença de sinais clínicos em avaliação após a morte (hipertrofia do VD, ascite, derrame pleural e trombo no átrio esquerdo), respectivamente. Portanto, nosso estudo sugere que o ecocardiograma é ferramenta não invasiva útil para a predição dessa síndrome, pois tanto variáveis de função sistólica, como parâmetros de função diastólica, pouco estudadas nesse modelo, foram associadas com a insuficiência cardíaca.

Estudos prévios avaliaram a relação entre os parâmetros ecocardiográficos e a insuficiência cardíaca. No entanto, a maioria dos estudos analisou a relação entre o ecocardiograma com a PD2 e não com variáveis clínicas de insuficiência cardíaca.6-10 Martinez et al.5 avaliaram a relação entre variáveis morfológicas e funcionais cardíacas com as manifestações clínicas de insuficiência cardíaca. No entanto, as variáveis ecocardiográficas foram estudadas por agrupamento(cluster analysis).5Portanto, acreditamos que nosso estudo acrescenta importantes informações sobre o papel do ecocardiograma como preditor em longo prazo de insuficiência cardíaca, nesse modelo.

Finalmente, já está bem estabelecido que o principal determinante da função ventricular, do processo de remodelação e, consequentemente, do aparecimento de insuficiência cardíaca, nesse modelo, é o tamanho do infarto.4,26,28,29 Em nosso estudo, no entanto, a diferença nos tamanhos de infarto entre os animais com e sem insuficiência cardíaca, apesar de significativa, foi pequena (43 ± 7% vs. 40 ± 8%, respectivamente). Portanto, podemos concluir que outros fatores, que não o tamanho do infarto, são importantes determinantes do aparecimento de insuficiência cardíaca, nesse modelo. Entre os possíveis candidatos, podemos incluir mudanças no diâmetro da cavidade ventricular, alterações na espessura da parede, mudança de configuração normal do VE de elíptica para forma mais arredondada, entre outros. Desse modo, em algumas situações, as alterações na geometria, por si, poderiam ser responsáveis pelo comprometimento da função global do ventrículo, por alterar as condições de carga a que o coração é submetido.

 Conclusão

Em ratos acompanhados por 6 meses após o infarto, a fração de variação de área, a relação E/A, o tempo de desaceleração da onda E e o tempo de relaxamento isovolumétrico ajustado pela frequência cardíaca foram preditores do aparecimento de insuficiência cardíaca.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

 Errata

No artigo original “Associação entre Variáveis Funcionais e Insuficiência Cardíaca após o Infarto do Miocárdio em Ratos”, corrigir o nome da autora Aline F. Lima para Aline R. Lima.