Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC N5xNTMCQqBXSXgVN37TFjWj S0066-782X2016000100018 S0066-782X2015005029101 10.5935/abc.20160003 Original Articles Effects of Growth Hormone on Cardiac Remodeling During Resistance Training in Rats Junqueira Adriana 1 Cicogna Antônio Carlos 2 Engel Letícia Estevam 1 Aldá Maiara Almeida 1 Tomasi Loreta Casquel de 2 Giuffrida Rogério 1 Giometti Inês Cristina 1 Freire Ana Paula Coelho Figueira 1 3 Aguiar Andreo Fernando 4 Pacagnelli Francis Lopes 1 Universidade do Oeste Paulista Presidente Prudente SP Brazil Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE), Presidente Prudente, SP – Brazil Universidade do Oeste Paulista Universidade Estadual Paulista Botucatu SP Brazil Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus Botucatu, SP – Brazil Universidade Estadual Paulista Universidade Estadual Paulista Presidente Prudente SP Brazil Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus Presidente Prudente, SP – Brazil Universidade Estadual Paulista Universidade do Norte do Paraná Londrina PR Brazil Universidade do Norte do Paraná, UNOPAR, Londrina, PR – Brazil Universidade do Norte do Paraná Mailing Address: Francis Lopes Pacagnelli, Universidade do Oeste Paulista, Rodovia Raposo Tavares, km 572 – Bairro Limoeiro, Campus II. Postal Code 19.067-175, Presidente Prudente, SP – Brazil E-mail: francispacagnelli@unoeste.br

Author contributions

Conception and design of the research: Junqueira A, Cicogna AC, Aldá MA, Tomasi LC, Giuffrida R, Pacagnelli F; Acquisition of data: Junqueira A, Pacagnelli F; Analysis and interpretation of the data: Engel LE, Giuffrida R, Giometti IC, Aguiar AF, Pacagnelli F; Statistical analysis: Freire APCF; Obtaining financing: Aldá MA, Pacagnelli F; Writing of the manuscript: Junqueira A, Cicogna AC, Engel LE, Aldá MA, Tomasi LC, Giuffrida R, Giometti IC, Aguiar AF, Pacagnelli F; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Junqueira A, Cicogna AC, Engel LE, Aldá MA, Tomasi LC, Giuffrida R, Giometti IC, Freire APCF, Aguiar AF, Pacagnelli F.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 08 12 2015 1 2016 106 1 18 25 15 04 2015 31 08 2015 04 09 2015 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Although the beneficial effects of resistance training (RT) on the cardiovascular system are well established, few studies have investigated the effects of the chronic growth hormone (GH) administration on cardiac remodeling during an RT program.

 Objective:

To evaluate the effects of GH on the morphological features of cardiac remodeling and Ca2+ transport gene expression in rats submitted to RT.

 Methods:

Male Wistar rats were divided into 4 groups (n = 7 per group): control (CT), GH, RT and RT with GH (RTGH). The dose of GH was 0.2 IU/kg every other day for 30 days. The RT model used was the vertical jump in water (4 sets of 10 jumps, 3 bouts/wk) for 30 consecutive days. After the experimental period, the following variables were analyzed: final body weight (FBW), left ventricular weight (LVW), LVW/FBW ratio, cardiomyocyte cross-sectional area (CSA), collagen fraction, creatine kinase muscle-brain fraction (CK-MB) and gene expressions of SERCA2a, phospholamban (PLB) and ryanodine (RyR).

 Results:

There was no significant (p > 0.05) difference among groups for FBW, LVW, LVW/FBW ratio, cardiomyocyte CSA, and SERCA2a, PLB and RyR gene expressions. The RT group showed a significant (p < 0.05) increase in collagen fraction compared to the other groups. Additionally, the trained groups (RT and RTGH) had greater CK-MB levels compared to the untrained groups (CT and GH).

 Conclusion:

GH may attenuate the negative effects of RT on cardiac remodeling by counteracting the increased collagen synthesis, without affecting the gene expression that regulates cardiac Ca2+ transport.

 Keywords: Growth Hormone Rats Motor Activity Exercise Ventricular Remodeling Introduction

The use of growth hormone (GH) as an ergogenic aid has risen dramatically in the past two decades, especially among athletes involved in strength, hypertrophy and power trainings (bodybuilders and weightlifters) and recreational practitioners interested in maintaining good health and enhancing the physique. However, GH use as an ergogenic aid for athletes is forbidden by the World Anti-Doping Agency (WADA),1 because of its direct effects on performance, such as body fat reduction, strength and muscle mass increase, and skeletal muscle regeneration. In addition, the inappropriate use of GH can lead to a decline in performance and irreparable health damage.

Growth hormone can affect heart functioning and cause cardiac hypertrophy, without fibrosis increase.2,3 This response is accompanied by an increase in contractility, changes in the genesis of the cardiac potential of action and peripheral vasodilation.2,3 Some studies have shown the cardioprotective effect of GH after myocardial infarction, easing pathological cardiac remodeling.2 However, other studies have reported the damage caused by the chronic hypersecretion of GH (acromegaly), leading to the development of concentric cardiac hypertrophy with interstitial fibrosis and lymphomononuclear infiltrate. If not controlled, the elevated GH level can lead to heart failure.3,4 Although other risk factors are related to acromegaly, the excess of GH and of its mediator [insulin-like growth factor 1 (IGF-1)] might be the major contributor to cardiovascular disease.4

Growth hormone has been often used to increase muscle mass and strength, and to enhance cardiac function during programs of resistance training (RT). Although the beneficial effects of RT on the cardiovascular system, such as increased capillary density, left ventricular (LV) hypertrophy, changes in connective tissue and benefits to the cardiac function, have been well established,5,6 few studies have investigated the effects of chronic GH administration on cardiac remodeling during RT programs.

This study aimed at testing the hypothesis that GH administration during RT modulates cardiac remodeling, interfering with morphological parameters and the gene expression of proteins involved in Ca2+ homeostasis, such as sarcoplasmic reticulum calcium-ATPase (SERCA2a) pump, phospholamban (PLB) and ryanodine (RyR). The gene expression of SERCA2a, PLB and RyR was analyzed because of its important role in cardiac contractile function, acting on intracellular Ca2+ homeostasis.7

Methods Animals and procedures

This study assessed 28 male Wistar rats (mean weight of 235 ± 15.2 g) aged 9 weeks-old, from the Central Vivarium of the Oeste Paulista University (UNOESTE), São Paulo, Brazil. The animals were individually labeled, and housed in seven cages containing four animals each, with free access to water and food (SupraLab®). The standard environmental conditions were maintained, with controlled light (12-hour light/dark cycles, with light from 7 AM on), temperature (21 ± 5°C) and relative air humidity (55% ± 5%).

This study was approved by the Committee on Animal Research and Ethics of the UNOESTE (protocols 1688 and 1689), and abided by the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, published by the National Research Council.

 Study design

After an adaptation of seven days, the rats were distributed into four groups: control (CT, n = 7); receiving GH (GH, n = 7); undergoing RT (RT, n = 7); and association of RT and GH administration (RTGH, n = 7).

 GH administration

The GH group animals received 0.2 IU/kg of recombinant human GH (rhGH, Saizen® - Merck) subcutaneously, every 2 days, for 30 consecutive days.8 The other animals received a similar volume of saline solution (0.9% NaCl).

 Resistance training

Physical training was performed according to a protocol of vertical jumps in water, 3 times per week, for 30 consecutive days. One week before starting the experiment, the rats were adapted to water exercise, with a daily increase in the number of sets and weight load of 50% of their total body weight. The training occurred inside a PVC tube (diameter of 25 cm, and depth of 38 cm), filled with warm water (30°C) as described by De Mello Malheiro et al.9 After the adaptation period, the animals initiated the training protocol, each session consisting of 4 sets of 10 jumps at 1-minute rest intervals between the sets. The rats were weighed before each session to recalculate their weight load (50% of the total body weight). The overload consisted in wearing a Velcro vest with fixed weights in the anterior region of the chest. At the end of each training, the animals were dried and returned to their cages.

 Parameters analyzed

By the end of 4 weeks, 72 hours after the last training session, the animals were weighed and sacrificed by exsanguination under anesthesia with ethylic ether. Their hearts were removed and weighed, the left ventricle dissected, and weighed again. The LV apex was frozen in liquid nitrogen, while the LV upper portion was fixed in 10% formalin solution for gene expression and morphological studies, respectively. The humid LV weight (LVW), normalized to the rat’s final body weight (FBW), was used as an index of ventricular hypertrophy (LVW/FBW ratio).

 Morphological study

Samples of cardiac tissue were fixed in 10% formalin solution for 48 hours. After fixation, the tissue was embedded in paraffin blocks, and 4-micrometer histological sections obtained and mounted in glass slides. The histological sections were stained with Hematoxilin-Eosin (HE) to assess the cross-sectional area of cardiomyocytes, by using a LEICA DM750 microscope coupled to a video camera that sends digital images to a computer, which has a program for image analysis (Image Pro-plus, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). The images were obtained by use of a binocular optical microscope. All images were captured by the video camera at the 40x magnification. Image selection for capture and digitalization was performed visually. All analyses were performed by one single examiner, blinded to the group of images. The morphometry of those images obtained and digitalized was performed by using appropriate software. Four LV sections were obtained for each animal. In each section, different fields were captured, chosen according to the site exhibiting the highest number of cells on a cross‑section. For each ventricle analyzed, 50 cells were measured. The myocytes selected were cross-sectioned, had a round shape and visible central nucleus, and were located in the subendocardial layer of the LV muscular wall. This was aimed at standardizing the set of myocytes of the different groups. The mean cardiomyocyte cross-sectional areas obtained for each group were used as indicators of cell size.10

Six-micrometer coronal histological sections were mounted in glass slides and stained with Picrosirius Red, specific for collagen visualization, to assess the LV myocardial interstitium. Collagen fibers were visualized in red and myocytes in yellow. The collagen volume fraction as a percentage was automatically calculated and corresponded to the sum of the collagen areas divided by the sum of the collagen tissue area and the cardiomyocyte cross-sectional area. The images of the cardiac tissue were captured by a LEICA DM LS microscope coupled to a video camera that sends digital images to a computer, which has a program for image analysis (Image Pro‑plus, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). For each ventricle, 20 fields were analyzed, using a 40X objective. The fields far away from the perivascular region were chosen.

 Gene expression of intracellular Ca<sup>2+</sup> regulators

Total RNA was extracted from the cardiac tissue (left ventricle) by using TRIzol Reagent (Invitrogen), and then treated with DNAse according to the manufacturer’s recommendation. Electrophoresis was used to assess RNA integrity. The High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, CA, USA) was used to synthesize complementary DNA (cDNA) from 1000 ng of total RNA. RT-qPCR was used to quantitatively measure the relative levels of mRNA from SERCA2a (Rn00568762_m1), RyR (Rn01470303_m1) and PLB (Rn01434045_m1). TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA) was used according to the manufacturer’s recommendation, as was the Applied Biosystems StepOne Plus detection system. All samples were assessed twice. The cycling conditions were as follows: enzyme activation at 50°C for 2 minutes; denaturation at 95°C for 10 minutes; amplification of cDNA products with 40 denaturation cycles at 95°C for 15 seconds; and annealing/extension at 60°C for 1 minute. Gene expression was quantified in relation to the CT group values and after normalization with β-actin as an internal control (ACTB, Rn00667869_m1), and determined according to the 2-ΔΔCt method, as previously described.11

Measuring CK-MB

Blood was collected for serum biochemistry of creatine kinase muscle-brain fraction (CK-MB) in tubes (Vacutainer®) without anticoagulant. After that, total blood was centrifuged at 3000 rpm (g = 1257). The serum obtained was stored in plastic microtubes and maintained at -20°C. The test was performed with the automatic UV-Kinetic method (Cobas C111, Roche®).

 Data analysis

To compare the parameters studied between the experimental groups and to validate the assumptions of data normality and homogeneity of variance, the Shapiro-Wilk and Levene’s tests were performed, respectively. Data with normal distribution underwent one-way analysis of variance (one-way ANOVA) and Tukey’s test for contrasts, while the Kruskal-Wallis test was used for data with non-normal distribution. Parametric variables were expressed as mean ± standard deviation, and non-parametric as median and 25th and 75th percentiles. The SPSS software for Windows, version13.0, was used in all analyses, and the statistical significance level adopted was 5%.

 Results

Table 1 and Figure 1 show the anatomic and morphological parameters indicating cardiac remodeling, and Figure 2 shows data on gene expression. The FBW, LVW, LVW/FBW ratio and cardiomyocyte cross-sectional area (Table 1) showed no statistical difference (p > 0.05), and neither has the gene expression of the regulatory proteins (RyR, SERCA2a and PLB) (Figure 2). However, the RT group showed a significant increase (p < 0.05) in the interstitial collagen fraction as compared to all other groups (Table 1). That increase did not occur when RT was combined with GH (RTGH group) (Table 1). In addition, the groups trained (RT and RTGH) showed higher CK-MB levels as compared to the non-trained ones (CT and GH) (Figure 3).

Anatomical parameters (weight) expressed as mean ± standard deviation, median and 25<sup>th</sup> and 75<sup>th</sup> percentiles, and cardiomyocyte cross-sectional area and interstitial collagen fraction expressed as mean ± standard deviation
Variables Groups
CT GH RT RTGH
FBW (g) 297.27 ± 22.14 313.81 ± 14.02 304.30 ± 29.08 292.05 ± 15.96
305.10 309 307.10 285.30
[286.90 – 315.00] [300.40 – 332.40] [286.5 – 332.00] [273.40 – 332.40]
LVW (g) 0.74 ± 0.31 0.87 ± 0.25 0.75 ± 0.26 0.77 ± 0.23
0.61 0.74 0.67 0.68
[0.53 – 1.16] [0.62 – 1.14] [0.43 – 0.73] [0.60 – 0.98]
LVW/FBW (mg/g) 2.48 ± 0.95 2.76 ± 0.79 2.55 ± 1.04 2.64 ± 0.81
2.04 2.35 2.12 2.38
[1.85 – 3.80] [2.07 – 3.53] [1.27 – 2.38] [2.03 – 3.35]
CSA (μm2) 343.64 ± 56.67 364.06 ± 48.31 412.84 ± 78.50 344.44 ± 35.43
IC (%) 2.55 ± 1.10 2.19 ± 0.70 5.74 ± 2.62 2.54 ± 0.65

CT: No exercise and no growth hormone (control); GH: No exercise + growth hormone; RT: Resistance training; RTGH: Resistance training + growth hormone; FBW: Final body weight; LVW: Left ventricular weight; CSA: Cardiomyocyte cross-sectional area; μm2: Micrometer; IC: Interstitial collagen fraction; g: Grams. * p < 0.05 vs. CT, GH, RTGH groups.

 Technique of myocardial collagen staining: Picrosirius Red. Optical microscope, 40X magnification. Collagen stained in red. A – control group (CT); B – growth hormone group (GH); C – resistance training group (RT); D – resistance training and growth hormone group (RTGH). Relative levels of mRNA determined by qPCR of ryanodine (RyR), sarcoplasmic reticulum calcium-ATPase (SERCA2a) and phospholamban (PLB), expressed as mean ± standard deviation. CT: Control group; GH: Growth hormone group; RT: Resistance training group; RTGH: Resistance training + growth hormone group. Measurement of creatine kinase muscle-brain fraction (CK-MB) by use of biochemical analysis, expressed as mean ± standard deviation. CT: Control group; GH: Growth hormone group; RT: Resistance training group; RTGH: Resistance training + growth hormone group. *p < 0.05 (statistically significant difference): CT versus RT; p < 0.05 CT versus RTGH; p < 0.05 GH versus RT; p < 0.05 GH versus RTGH. Discussion

This study aimed at investigating the effects of GH administration, isolated or combined with RT, on the morphological parameters and gene expression of the major proteins involved with Ca2+ transport (SERCA2a, PLB and RyR) during cardiac remodeling. This study’s findings were: 1) RT isolated acted on cardiac remodeling, increasing LV collagen density; and 2) GH administration during RT modulates cardiac remodeling, attenuating the increase in collagen fraction, without altering myocardial damage and the proteins involved with Ca2+ transport.

The RT group showed higher collagen synthesis then the other groups. That could be explained by the cardiac pressure overload imposed by the mechanical stress of RT, which could have induced collagen breakdown, thus stimulating collagen synthesis.12,13 That hypothesis is supported by a study showing an increase in interstitial collagen formation induced by aerobic training or RT.4 The study by De Souza et al.5 has shown a 2.8% increase in the interstitial collagen fraction in the group submitted to RT (control group = 5.5% and trained group = 9%). In our study, that increased from 2.55% to 5.74%. Our collagen fraction values are not in accordance with those of the study by De Souza et al.,5 because the age and weight of the animals were different. However, other studies by our team with male Wistar rats of similar weights corroborate our findings, in which the collagen fraction varied from 2.5% to 3% in the control group.14,15 Our results expand the previous observations, showing for the first time that an increase in collagen synthesis can occur during RT with no change in the cardiomyocyte cross-sectional area. That effect can be attributed, at least partially, to the cardiomyocyte damage16 induced by physical exercise,17-19 as demonstrated in our study by the elevation in CK-MB levels.

Curiously, the increase in collagen synthesis was attenuated when GH was combined with RT. The result is consistent with previous studies showing a cardioprotective effect of GH on the synthesis of type I and III collagen during pathological cardiac remodeling.20,21 In rats with ventricular hypertrophy induced by chronic pressure overload, GH induced a cardioprotective effect, attenuating myocardial fibrosis.21 However, not analyzing the collagen type (IαI, IαII and III) was a limitation of our study, because it can vary according to the type of stimulus (physiological or pathological), and with the supplementation of substances and exercise intensity. Thus, further studies are necessary to determine the collagen type and the molecular pathways that are activated in response to different exercise types.

Despite the increase in collagen synthesis, no difference was observed in the cardiomyocyte cross-sectional areas or in the LVW/FBW ratio following RT isolated or combined with GH, demonstrating that no cardiac hypertrophy occurred. Our cardiomyocyte cross-sectional area values (CT group: mean of 343.64µ2) are in accordance with those of another study also using male Wistar rats of similar weights (control group: 305.6 - 333µ2).15

Those results are not in accordance with the results of other studies involving different overload stimuli.21-26 Moreira et al.21 have not found changes in the LWE/FBW ratio of rats submitted to chronic pressure overload in an aortic stenosis model after a short period of treatment with GH (1 mg/kg for 14 days). Those authors have only shown myocardial fibrosis attenuation as a cardioprotective effect, indicating a specific effect of that hormone. In addition, Sugizaki et al.22 have not evidenced differences in the LVW/FBW ratio in rats swimming with weight overload (5% of body weight). The animals were submitted to five swimming sessions per week, for 12 consecutive weeks. However, Baraúna et al.23 have reported an increase in the diameter of cardiomyocytes of rats submitted to an RT protocol consisting in upper body extension (with maximum lifted weight with the exercise apparatus), 4 sets of 12 repetitions, using 65% to 75% of one repetition maximum, for 4 or 12 weeks.

That type of training induced concentric cardiac hypertrophy with neither ventricular dysfunction nor cavity reduction. The reasons for the conflicting results are not clear, but can be due to the training protocol (period, intensity, volume) and GH doses used.23,26

The exact cellular and molecular mechanisms of the reported effects of GH and RT on the heart have not been completely elucidated.23,24,26 In this study, no change in the genes related to cardiac Ca2+ transport was observed. The cardiomyocytes express receptors for the secretion of GH and IGF-1, and such receptors are influenced by hemodynamic changes. Both hormones are believed to have stimulating effects on myocardial contractility.26 In addition, those hormones and GH-releasing peptides, such as ghrelin, have beneficial cardiac effects.26-28 Ma et al.7 have reported that the activation of the GHS-R1a ghrelin receptor produced an inotropic effect on ischemic cardiomyocytes resulting from ischemia/reperfusion injury, because they might protect or recover Ca2+ transport proteins, such as SERCA2a and PLB. In this study, we expected that the effect on cardiac remodeling could be mediated by the elevation in the expression of those genes, resulting from GH administration, because that hormone boosts the cell protein synthesis and mRNA formation. However, that did not occur.

Two possible physiological explanations for that fact could be the lower sensitivity of the cardiovascular tissue to the direct effect of GH,24 and the negative feedback of GH and IGF due to their exogenous administration, which could have interfered in the regulation of GH synthesis and secretion.27-29 In addition, the lack of GH effects on RT and the genes of Ca2+ transport can be due to the training protocol. Previous studies have already reported the change in gene expression of cardiac Ca2+ after a training program of 8 weeks.29-32 Although RT increases the intracellular Ca2+ concentration, increasing cardiomyocyte contractility and overexpression of SERCA2a, and, consequently, of its regulator PLB,30,31 our results showed no change in the variables assessed in the time period assessed.

 Conclusions

The RT caused cardiac interstitial collagen remodeling without changes in cardiomyocyte cross-sectional areas. That, however, did not occur when the RT was associated with GH administration. The results indicate that GH can attenuate the effects of RT on cardiac remodeling by counterbalancing the increase in collagen synthesis, without affecting the expression of the genes that regulate cardiac Ca2+ transport.

Sources of Funding

This study was funded by Universidade do Oeste Paulista and Universidade Estadual Paulista

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Adriana Junqueira, from Universidade do Oeste Paulista.

 Acknowledgements

The authors thank the Coordination for the Improvement of Higher-Level-Education Personal - CAPES (PROSUP, master’s program).

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Medeiros A Rolim NP Oliveira RS Rosa KT Mattos KC Casarini DE Exercise training delays cardiac dysfunction and prevents calcium handling abnormalities in sympathetic hyperactivity-induced heart failure mice J Appl Physiol (1985) 2008 104 1 103 109 Efeitos do Hormônio do Crescimento na Remodelação Cardíaca Durante Treinamento Resistido em Ratos Junqueira Adriana 1 Cicogna Antônio Carlos 2 Engel Letícia Estevam 1 Aldá Maiara Almeida 3 Tomasi Loreta Casquel de 2 Giuffrida Rogério 1 Giometti Inês Cristina 1 Freire Ana Paula Coelho Figueira 1 3 Aguiar Andreo Fernando 4 Pacagnelli Francis Lopes 1 Universidade do Oeste Paulista Presidente Prudente SP Brasil Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE), Presidente Prudente, SP – Brasil Universidade do Oeste Paulista Universidade Estadual Paulista Botucatu SP Brazil Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus Botucatu, SP – Brasil Universidade Estadual Paulista Universidade Estadual Paulista Presidente Prudente SP Brasil Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus Presidente Prudente, SP – Brasil Universidade Estadual Paulista Universidade do Norte do Paraná Londrina PR Brasil Universidade do Norte do Paraná, UNOPAR, Londrina, PR – Brasil Universidade do Norte do Paraná Correspondência: Francis Lopes Pacagnelli, Universidade do Oeste Paulista, Rodovia Raposo Tavares, km 572 – Bairro Limoeiro, Campus II. CEP 19.067-175, Presidente Prudente, SP – Brasil. E-mail: francispacagnelli@unoeste.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Junqueira A, Cicogna AC, Aldá MA, Tomasi LC, Giuffrida R, Pacagnelli F; Obtenção de dados: Junqueira A, Pacagnelli F; Análise e interpretação dos dados: Engel LE, Giuffrida R, Giometti IC, Aguiar AF, Pacagnelli F; Análise estatística: Freire APCF; Obtenção de financiamento: Aldá MA, Pacagnelli F; Redação do manuscrito: Junqueira A, Cicogna AC, Engel LE, Aldá MA, Tomasi LC, Giuffrida R, Giometti IC, Aguiar AF, Pacagnelli F; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Junqueira A, Cicogna AC, Engel LE, Aldá MA, Tomasi LC, Giuffrida R, Giometti IC, Freire APCF, Aguiar AF, Pacagnelli F.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Apesar de os efeitos benéficos do treinamento resistido (TR) sobre o sistema cardiovascular estarem bem estabelecidos, poucos estudos têm investigado os efeitos crônicos da administração de hormônio do crescimento (GH) sobre a remodelação cardíaca durante um programa de TR.

 Objetivo:

avaliar os efeitos do GH sobre a remodelação cardíaca em suas características morfológicas e na expressão dos genes do trânsito de Ca2+ em ratos submetidos ao TR.

 Métodos:

Ratos Wistar machos foram divididos em 4 grupos (n = 7 por grupo): controle (CT), GH, TR e TR com GH (TRGH). A dose de GH foi de 0,2 UI/kg, a cada dois dias, por 30 dias. O modelo de TR utilizado foi o salto vertical em água (4 séries de 10 saltos, 3 vezes/semana) durante 30 dias consecutivos. Após o período experimental, as seguintes variáveis foram analisadas: peso corporal final (PCF), peso do ventrículo esquerdo (PVE), razão PVE/PCF, área seccional de cardiomiócitos (ASC), fração de colágeno, creatina quinase fração músculo-cérebro (CK-MB) e expressão gênica de SERCA2a, fosfolambam (PLB) e rianodina (RyR).

 Resultados:

Não houve diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos para PCF, PVE, razão PVE/PCF, ASC, e expressão gênica de SERCA2a, PLB e RyR. O grupo TR mostrou um significativo aumento (p < 0,05) da fração de colágeno em comparação aos outros. Além disso, os grupos treinados (TR e TRGH) apresentaram maiores níveis de CK-MB em comparação aos não treinados (CT e GH).

 Conclusão:

Esses resultados indicam que o GH pode atenuar os efeitos negativos do TR na remodelação cardíaca por contrabalançar o aumento da síntese de colágeno, sem afetar a expressão de genes que regulam o trânsito de Ca2+ cardíaco.

 Palavras-Chave: Hormônio do Crescimento Ratos Atividade Motora Exercício Remodelação Ventricular Introdução

O uso do hormônio do crescimento (GH) como um auxílio ergogênico aumentou acentuadamente nas duas últimas décadas, em especial entre os atletas envolvidos com treinamento de força, hipertrofia e potência (fisiculturistas e levantadores de peso) e praticantes recreativos interessados em manter a saúde e melhorar a estética corporal. No entanto, o uso do GH como um auxílio ergogênico para atletas é proibido pela Agência Mundial Anti-Doping (WADA),1 devido a seus efeitos diretos sobre o desempenho, incluindo a redução de gordura corporal, o aumento de força e massa muscular, e a melhora regenerativa do músculo esquelético. Por outro lado, o uso indevido de GH pode levar ao declínio do desempenho e irreparáveis danos à saúde.

O GH pode afetar o funcionamento do coração e causar hipertrofia cardíaca, sem aumento de fibrose.2,3 Essa resposta é acompanhada por um aumento da contratilidade, alterações na gênese dos potenciais de ação cardíacos e vasodilatação periférica.2,3 Algumas pesquisas têm mostrado o efeito cardioprotetor do GH após infarto do miocárdio, amenizando a remodelação cardíaca patológica.2 Por outro lado, há estudos que relatam os danos do GH em indivíduos com hipersecreção crônica desse hormônio (acromegalia), conduzindo ao desenvolvimento de hipertrofia cardíaca concêntrica com fibrose intersticial e infiltrado linfomononuclear. Nesse contexto, se a sobrecarga do hormônio não for controlada, pode evoluir para insuficiência cardíaca.3,4 Embora outros fatores de risco estejam relacionados com acromegalia, é provável que o excesso de GH e de seu mediador [fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I)] seja o principal contribuinte para a doença cardiovascular.4

O GH tem sido muitas vezes utilizado para aumentar a massa muscular e a força, e para melhorar a função cardíaca durante programas de treinamento resistido (TR). Embora os efeitos benéficos do TR no sistema cardiovascular estejam bem estabelecidos (aumento da densidade capilar, hipertrofia ventricular esquerda, alterações no tecido conjuntivo e benefícios na função cardíaca),5,6 poucos estudos investigaram os efeitos da administração crônica de GH na remodelação cardíaca durante um programa de TR.

Portanto, este estudo teve como propósito testar a hipótese de que a administração de GH durante o TR modula a remodelação cardíaca interferindo nos parâmetros morfológicos e na expressão gênica de proteínas envolvidas na homeostase do Ca2+, como a bomba cálcio-ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolambam (PLB) e rianodina (RyR). Analisamos a expressão gênica de SERCA2a, PLB e RyR devido ao seu importante papel na função contrátil cardíaca atuando na homeostase do Ca2+ intracelular.7

Métodos Animais e Procedimentos

Foram utilizados 28 ratos Wistar machos, com peso médio de 235 ± 15,2 gramas, 9 semanas de idade, provenientes do Biotério Central da Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE), São Paulo, Brasil. Os animais foram alojados em 7 caixas com 4 animais cada, receberam marcação individual e tiveram acesso livre a água e ração (SupraLab®). Foram mantidas as condições ambientais padrão, com controle de luz (ciclos claro/escuro de 12 horas, luz a partir das 7 AM), de temperatura ambiente (21 ± 5°C) e de umidade relativa de ar (55 ± 5%). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA) da UNOESTE com os protocolos n° 1688 e 1689 e realizado conforme o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado pelo National Research Council.

 Desenho do estudo

Os ratos foram direcionados ao Biotério de Experimentação Animal da UNOESTE e, após 7 dias de aclimatação, foram distribuídos em 4 grupos: controle (CT, n = 7); com administração de GH (GH, n = 7); com TR (TR, n = 7); e associação de TR com administração de GH (TRGH, n = 7).

 Administração de GH

Os animais do grupo GH receberam 0,2 UI/kg de GH recombinante humano (rhGH, Saizen® - Merck) por via subcutânea, a cada 2 dias, por 30 dias consecutivos.8 Os demais animais receberam solução fisiológica (NaCl 0,9%) em volume similar.

 Treinamento resistido

O treinamento físico foi realizado por meio de um protocolo de saltos verticais na água, 3 vezes por semana por 30 dias consecutivos. Uma semana antes de iniciar o experimento, os ratos foram adaptados ao exercício na água, aumentando o número de séries a cada dia de adaptação e com sobrecarga de 50% do seu peso corporal total. O treinamento ocorreu dentro de um tubo de PVC (25 cm de diâmetro com 38 cm de profundidade), com água aquecida (30°C) no seu interior, conforme descrito por De Mello Malheiro et al.9 Após esse período de adaptação, os animais iniciaram o protocolo de treinamento e cada sessão consistiu de 4 séries de 10 saltos com intervalo de 1 minuto entre as séries para descanso. Os ratos foram pesados antes de cada sessão, a fim de recalcular a carga acrescentada (sobrecarga de 50% do seu peso corporal total). A sobrecarga foi feita por meio de pesos fixos com um colete com velcro posicionado na região anterior do tórax. Ao final de cada treino, os animais foram secados para retornarem às suas caixas.

 Parâmetros analisados

Ao final das 4 semanas, após 72 horas da última sessão de treinamento, os animais foram pesados, anestesiados com éter etílico e sacrificados por exsanguinação. Seus corações foram retirados e pesados, sendo o ventrículo esquerdo (VE) dissecado e então pesado. O ápice do VE foi congelado em nitrogênio líquido e a porção superior foi fixada em formol tamponado a 10% para as análises de expressão gênica e morfológica, respectivamente. O peso úmido do VE (PVE) normalizado para peso corpóreo final do rato (PCF) foi utilizado como índice de hipertrofia ventricular.

 Estudo morfológico

Amostras de tecido cardíaco foram fixadas em solução de formol tamponado a 10% por um período de 48 horas. Após fixação, o tecido foi incluído em blocos de parafina, obtendo‑se a seguir cortes histológicos coronais de 4 micrômetros. Esses cortes histológicos foram corados em lâmina com solução de Hematoxilina-Eosina (HE) para aferição de áreas seccionais dos cardiomiócitos, empregando-se microscópio LEICA DM LS acoplado a câmera de vídeo, que envia imagens digitais a computador dotado de programa de análise de imagens (Image Pro‑plus, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, EUA). As imagens foram obtidas por meio de microscópio óptico binocular. Todas as imagens foram capturadas por câmara de vídeo no aumento de 40x. A seleção das imagens para captura e digitalização foi feita visualmente. Todas as análises foram realizadas por um único avaliador cego para o grupo de imagens. A morfometria dessas imagens obtidas e digitalizadas foi realizada utilizando‑se software apropriado para tal fim. Quatro cortes de VE foram obtidos para cada animal. Em cada corte, realizou-se a captura de diferentes campos, escolhidos de acordo com o local contendo o maior número de células visualizadas em corte transversal. Foram mensuradas 50 células por ventrículo analisado. Os miócitos selecionados estavam seccionados transversalmente e apresentavam forma redonda, núcleo visível no centro da célula e localizavam-se na camada subendocárdica da parede muscular do VE. Esse cuidado visou a uniformizar ao máximo o conjunto de miócitos dos diferentes grupos. As áreas seccionais médias obtidas para cada grupo foram utilizadas como indicador do tamanho celular.10

Lâminas com cortes histológicos coronais de 6 micrômetros e corados pela técnica de Picrosirius Red, específica para visualização de colágeno, foram feitas para avaliação do interstício do miocárdio do VE. Assim, as fibras colágenas foram visualizadas em vermelho e os miócitos em amarelo. O volume de fração do colágeno em porcentagem foi calculado automaticamente e correspondeu à soma das áreas de colágeno dividida pela soma da área de tecido colágeno e a área seccional de cardiomiócitos. As imagens do tecido cardíaco foram capturadas por microscópio LEICA DM LS acoplado a câmera de vídeo, que envia imagens digitais a computador dotado de programa de análise de imagens (Image Pro-plus, Media Cyberetics, Silver Spring, Maryland, EUA). Foram analisados 20 campos por ventrículo, utilizando objetiva de 40X. Os campos escolhidos estavam afastados da região perivascular.

 Expressão gênica relativa de reguladores do Ca<sup>2+</sup> intracelular

O RNA total foi extraído do tecido cardíaco ventrículo esquerdo (VE) utilizando‑se TRIzol (Invitrogen), sendo em seguida tratado com DNAse de acordo com orientação do fabricante. A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese. O kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems, CA, EUA) foi usado para a síntese de DNA complementar (cDNA) a partir de 1000 ng de RNA total. Utilizou-se RT-qPCR para medir quantitativamente os níveis relativos de RNAm de SERCA2a (Rn00568762_m1), RyR (Rn01470303_m1) e PLB (Rn01434045_m1). Para tal, utilizaram-se TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA, EUA), conforme as instruções do fabricante, e o sistema de detecção Applied Biosystems StepOne Plus. Todas as amostras foram avaliadas duas vezes. As condições de ciclagem foram as seguintes: ativação da enzima a 50°C por 2 minutos; desnaturação a 95°C por 10 minutos; amplificação dos produtos de cDNA por 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos; e anelamento/extensão a 60°C por 1 minuto. A expressão gênica foi quantificada em relação aos valores do grupo CT e após normalização por um controle interno β-actina (ACTB, Rn00667869_m1), sendo determinada pelo método 2-ΔΔCt, como anteriormente descrito.11

Dosagem de CK-MB

Foi realizada coleta de sangue para bioquímica sérica da creatina quinase fração músculo-cérebro (CK-MB) em tubos (Vacutainer®) sem anticoagulante. Após a coleta, o sangue total foi centrifugado a 3000 rpm (g = 1257). O soro obtido foi acondicionado em microtubos plásticos e mantido a -20°C. A bioquímica sérica foi realizada por meio do método cinético UV automatizado (Cobas C111, Roche®).

 Análise dos dados

Para comparar os parâmetros estudados entre os grupos experimentais e validar os pressupostos de normalidade dos dados e homogeneidade de variâncias, realizaram-se os testes de Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente. Para os dados com distribuição normal, recorreu-se a análise de variância em uma via (ANOVA one-way) com contrastes pelo método de Tukey ou ainda teste de Kruskal-Wallis para os dados com distribuição não normal. As variáveis paramétricas foram expressas em média ± desvio padrão e as não paramétricas em mediana e percentis a 25% e 75%. Todas as análises foram realizadas com o uso do software SPSS para Windows v.13.0. O nível de significância estatística adotado para todas as análises foi de 5%.

 Resultados

Os parâmetros que indicam remodelação cardíaca, anatômicos e morfológicos, estão apresentados na Tabela 1 e Figura 1, e os dados de expressão gênica estão apresentados na Figura 2. As variáveis PCF, PVE, relação PVE/PCF e a área seccional de cardiomiócitos (Tabela 1) não mostraram diferença estatística (p > 0,05), nem a expressão das proteínas regulatórias (RyR, SERCA2a, e PLB) (Figura 2). No entanto, o grupo TR apresentou um aumento significativo (p < 0,05) na fração de colágeno intersticial, quando comparado com todos os outros grupos (Tabela 1). Esse aumento não ocorreu quando o TR foi combinado com GH (grupo TRGH) (Tabela 1). Além disso, os grupos treinados (TR e TRGH) apresentaram maiores níveis de CK-MB quando comparados aos não treinados (CT e GH) (Figura 3).

Parâmetros anatômicos (pesos) expressos em média ± desvio padrão, mediana e percentis a 25% e 75% e área seccional de cardiomiócitos e fração de colágeno intersticial expressos em média ± desvio padrão
Variáveis Grupos
CT GH TR TRGH
PCF (g) 297,27 ± 22,14 313,81 ± 14,02 304,30 ± 29,08 292,05 ± 15,96
305,10 309 307,10 285,30
[286,90 – 315,00] [300,40 – 332,40] [286,5 – 332,00] [273,40 – 332,40]
PVE (g) 0,74 ± 0,31 0,87 ± 0,25 0,75 ± 0,26 0,77 ± 0,23
0,61 0,74 0,67 0,68
[0,53 – 1,16] [0,62 – 1,14] [0,43 – 0,73] [0,60 – 0,98]
PVE/PCF (mg/g) 2,48 ± 0,95 2,76 ± 0,79 2,55 ± 1,04 2,64 ± 0,81
2,04 2,35 2,12 2,38
[1,85 – 3,80] [2,07 – 3,53] [1,27 – 2,38] [2,03 – 3,35]
ASC (μm2) 343,64 ± 56,67 364,06 ± 48,31 412,84 ± 78,50 344,44 ± 35,43
IC (%) 2,55 ± 1,10 2,19 ± 0,70 5,74 ±2,62 2,54± 0,65

CT: Grupo controle (sem exercício e sem hormônio do crescimento); GH: Grupo sem exercício + hormônio do crescimento; TR: Grupo treinamento resistido; TRGH: Grupo treinamento resistido + hormônio do crescimento; PCF: Peso corpóreo final; PVE: Peso do ventrículo esquerdo; ASC: Área seccional de cardiomiócitos; μm2: Micrômetro; IC: Fração de colágeno intersticial; g: Gramas. * p < 0,05 vs. grupo CT, GH, TRGH.

 Técnica de coloração do colágeno miocárdico - Picrosirius Red. Microscópio óptico com objetiva de 40X. O colágeno é corado em vermelho. A – grupo controle (CT); B – grupo hormônio do crescimento (GH); C – grupo treinamento resistido (TR); D – grupo treinamento resistido e hormônio do crescimento (TRGH). Níveis relativos de RNAm determinados por qPCR da rianodina (RyR), Ca<sup>+2</sup>-ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA2a) e fosfolambam (PLB), expressos em média ± desvio padrão. CT: Grupo controle; GH: Grupo hormônio do crescimento; TR: Grupo treinamento resistido; TRGH: Grupo treinamento resistido e hormônio do crescimento. Dosagem da creatina quinase fração músculo-cérebro (CK-MB) por análise bioquímica, expressa em média ± desvio padrão. CT: Grupo controle; GH: Grupo hormônio do crescimento; TR: Grupo treinamento resistido; TRGH: Grupo treinamento resistido e hormônio do crescimento. *p < 0,05 (diferença estatisticamente significativa): CT versus TR; p < 0,05 CT versus TRGH; p < 0,05 GH versus TR; p < 0,05 GH versus TRGH. Discussão

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração de GH, isolada ou combinada com TR, nos parâmetros morfológicos e na expressão gênica das principais proteínas envolvidas no trânsito de Ca2+ (SERCA2a, PLB e RyR) durante a remodelação cardíaca. Os achados deste estudo foram: 1) o TR isolado atuou na remodelação cardíaca, promovendo aumento na densidade de colágeno no VE; e 2) o GH durante o TR modulou a remodelação cardíaca, atenuando o aumento da fração de colágeno, sem alterar a lesão miocárdica e as proteínas envolvidas no trânsito de Ca2+.

O grupo TR apresentou maior síntese de colágeno em comparação aos outros. Uma possível explicação para esses achados é que a sobrecarga de pressão cardíaca imposta pelo estresse mecânico do TR pode ter induzido a degradação do colágeno e, assim, estimulado a síntese do colágeno.12,13 Essa hipótese é apoiada por estudo anterior que mostrou um aumento na formação de colágeno intersticial induzido pelo treinamento aeróbio ou de resistência.4 O estudo De Souza et al.5 mostrou que a fração do colágeno intersticial aumentou em 2,8% no grupo que realizou TR (grupo controle = 5,5% e grupo treinado = 9%). No nosso estudo, o aumento foi de 2,55% para 5,74%. Nossos valores de fração do colágeno discordam daqueles do estudo de De Souza et al.,5 uma vez que a idade e o peso dos animais eram diferentes. Entretanto, outras pesquisas do nosso grupo com ratos Wistar machos e pesos semelhantes corroboram nossos dados, onde a fração de colágeno variou de 2,5% a 3% no grupo controle.14,15 Nossos resultados expandem as observações anteriores, mostrando pela primeira vez que um aumento na síntese de colágeno pode ocorrer durante TR sem mudança da área seccional de cardiomiócitos. Esse efeito pode ser atribuído, pelo menos em parte, à lesão dos cardiomiócitos16 induzida pelo exercício físico,17-19 como demonstrado no nosso estudo por elevação dos níveis de CK-MB.

Curiosamente, o aumento na síntese de colágeno foi atenuado quando o GH foi combinado com TR. Esse resultado é consistente com estudos prévios que mostraram um efeito cardioprotetor do GH na síntese de colágeno tipo I e III durante a remodelação cardíaca patológica.20,21 Em ratos com hipertrofia ventricular induzida por sobrecarga crônica de pressão, o GH induziu efeito cardioprotetor, atenuando a fibrose miocárdica.21 No entanto, uma limitação do nosso estudo foi não ter analisado o tipo de colágeno (IαI, IαII e III), que pode variar de acordo com o tipo de estímulo (fisiológico ou patológico), bem como com a suplementação de substâncias e a intensidade de exercício. Assim, mais pesquisas são necessárias para determinar o tipo de colágeno e as vias moleculares que são ativadas em resposta a diferentes tipos de exercícios.

Apesar do aumento da síntese de colágeno, nenhuma diferença foi observada na área seccional de cardiomiócitos ou na relação PVE/PCF seguindo TR isolado ou combinado com GH, demonstrando que não ocorreu hipertrofia cardíaca. Os nossos valores da área seccional de cardiomiócitos (grupo CT: média de 343,64 µ2) estão de acordo com os de outro estudo que também utilizou ratos machos Wistar e com pesos semelhantes (grupo controle: 305,6 - 333 µ2).15

Esses resultados discordam daqueles de outros estudos envolvendo diferentes estímulos de sobrecarga.21-26 Por exemplo, Moreira et al.21 não encontraram alterações na relação PVE/PCF de ratos submetidos a sobrecarga crônica de pressão em um modelo de estenose aórtica após um curto período de tratamento com GH (1 mg/kg durante 14 dias). Esses autores mostraram apenas a atenuação da fibrose do miocárdio como efeito cardioprotector, o que indica um efeito específico desse hormônio. Além disso, Sugizaki et al.22 não evidenciaram diferenças de PVE/PCF em ratos submetidos a natação com sobrecarga de peso (5% do peso corporal). Os animais foram submetidos a 5 sessões de natação semanalmente durante 12 semanas consecutivas. No entanto, Baraúna et al.23 observaram um aumento no diâmetro dos cardiomiócitos em ratos submetidos a um protocolo de TR que consistia na extensão do tronco com a sobrecarga do equipamento por 4 séries de 12 repetições com 65% a 75% de uma repetição máxima por 4 ou 12 semanas.

Esse tipo de treinamento induziu hipertrofia cardíaca concêntrica sem disfunção ventricular e diminuição das câmaras. As razões para os resultados conflitantes não são claras, mas eles podem ser devidos ao protocolo de treinamento (período, intensidade, volume) e às doses de GH utilizadas.23,26

Os exatos mecanismos celulares e moleculares relatados referentes aos efeitos do GH e do TR no coração não foram totalmente elucidados23,24,26. Neste estudo não houve alterações nos genes relacionados ao trânsito de Ca2+ cardíaco. Os cardiomiócitos expressam receptores para a secreção de GH e IGF-I e esses receptores são influenciados por alterações hemodinâmicas. Acredita-se que ambos os hormônios têm efeitos estimuladores sobre a contratilidade do miocárdio.26 Além disso, esses hormônios e peptídeos liberadores de GH, tais como a grelina, têm efeitos cardíacos benéficos.26-28 Ma et al.7 mostraram que a ativação do receptor de grelina GHS-R1a produziu um efeito inotrópico em cardiomiócitos isquêmicos resultantes de lesões por isquemia/reperfusão provavelmente por proteger ou recuperar as proteínas do trânsito de Ca2+, como SERCA2a e PLB. Esperava-se no presente estudo que esse efeito na remodelação cardíaca pudesse ser mediado pela elevação na expressão desses genes, devido à administração do GH, uma vez que ele estimula a síntese proteica da célula e a formação de RNAm. Isso, porém, não ocorreu.

Duas possíveis explicações fisiológicas para esse fato poderiam ser a menor sensibilidade do tecido cardiovascular à ação direta do GH24 e o feedback negativo de GH e IGF pela sua administração exógena, o que pode ter interferido na regulação da síntese e secreção de GH.27-29 Além disso, a falta de efeitos do GH sobre o TR e os genes do trânsito de Ca2+ pode dever-se ao protocolo de treino. Estudos anteriores já haviam observado a mudança na expressão gênica de Ca2+ cardíaca após um programa de treinamento de 8 semanas.29-32 Embora o TR promova uma elevação na concentração de Ca2+ no interior da célula, aumentando o grau de contratilidade dos cardiomiócitos e a superexpressão alvo de SERCA2a e, consequentemente, do seu regulador PLB,30,31 nossos resultados mostram que não houve alteração das variáveis em questão no período de tempo avaliado.

 Conclusões

O TR promoveu remodelação intersticial do colágeno cardíaco sem alterações da área seccional de cardiomiócitos. Esse aumento, no entanto, não ocorreu quando o TR foi combinado com o GH. Esses resultados indicam que o GH pode atenuar os efeitos do TR na remodelação cardíaca por contrabalançar o aumento da síntese de colágeno, sem afetar a expressão dos genes que regulam o trânsito de Ca2+ cardíaco.

Fontes de financiamento

>O presente estudo foi financiado pela Universidade do Oeste Paulista e Universidade Estadual Paulista.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Adriana Junqueira pela Universidade do Oeste Paulista.

 Agradecimentos

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior - CAPES (Taxa PROSUP, mestrado).