Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia Pfb4jSZqPkSm8nK3HP7Ccmw S0066-782X2015002500588 S0066-782X2015005050134 10.5935/abc.20150134 Original Articles Obesity Resistance Promotes Mild Contractile Dysfunction Associated with Intracellular Ca2+ Handling Sá Felipe Gonçalves dos Santos de 1 Lima-Leopoldo Ana Paula 1 Jacobsen Bruno Barcellos 1 Ferron Artur Junio Togneri 1 Estevam Wagner Muller 1 Campos Dijon Henrique Salomé 2 Castardeli Edson 1 Cunha Márcia Regina Holanda da 1 Cicogna Antonio Carlos 2 Leopoldo André Soares 1 Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Educação Física e Desportos Departamento de Desportos Vitória ES Brazil Centro de Educação Física e Desportos – Departamento de Desportos – Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES, Brazil Universidade Federal do Espírito Santo Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina Departamento de Clínica Médica Botucatu São Paulo Brazil Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Medicina – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo – Brazil Universidade Estadual Paulista Mailing Address: André Soares Leopoldo , Avenida Fernando Ferrari, 514, Goiabeiras, Postal Code 29075-410. Vitória, ES - Brazil. E-mail: andresoaresleopoldo@gmail.com, andre.leopoldo@ufes.br

Author contributions

Conception and design of the research and Obtaining financing: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS; Acquisition of data: Sá FGS, Jacobsen BB, Ferron AJT, Estevam WM, Campos DHS, Castardeli E; Analysis and interpretation of the data: Sá FGS, Jacobsen BB, Ferron AJT, Estevam WM, Campos DHS, Castardeli E, Cunha MRH; Writing of the manuscript: Sá FGS, Lima-Leopoldo AP, Cicogna AC, Leopoldo AS; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Lima-Leopoldo AP, Castardeli E, Cunha MRH, Cicogna AC, Leopoldo AS.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 27 10 2015 12 2015 105 6 588 596 11 05 2015 28 07 2015 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Diet-induced obesity is frequently used to demonstrate cardiac dysfunction. However, some rats, like humans, are susceptible to developing an obesity phenotype, whereas others are resistant to that.

 Objective:

To evaluate the association between obesity resistance and cardiac function, and the impact of obesity resistance on calcium handling.

 Methods:

Thirty-day-old male Wistar rats were distributed into two groups, each with 54 animals: control (C; standard diet) and obese (four palatable high-fat diets) for 15 weeks. After the experimental protocol, rats consuming the high-fat diets were classified according to the adiposity index and subdivided into obesity-prone (OP) and obesity-resistant (OR). Nutritional profile, comorbidities, and cardiac remodeling were evaluated. Cardiac function was assessed by papillary muscle evaluation at baseline and after inotropic maneuvers.

 Results:

The high-fat diets promoted increase in body fat and adiposity index in OP rats compared with C and OR rats. Glucose, lipid, and blood pressure profiles remained unchanged in OR rats. In addition, the total heart weight and the weight of the left and right ventricles in OR rats were lower than those in OP rats, but similar to those in C rats. Baseline cardiac muscle data were similar in all rats, but myocardial responsiveness to a post-rest contraction stimulus was compromised in OP and OR rats compared with C rats.

 Conclusion:

Obesity resistance promoted specific changes in the contraction phase without changes in the relaxation phase. This mild abnormality may be related to intracellular Ca2+ handling.

 Keywords: Obesity-Resistance High-Fat Diet Cardiac Function Ca2+ Handling Rats FAPES 53618009/2011 Introduction

Obesity is characterized by an excess of fat mass influenced by genetic and environmental factors1-3. This multifactorial disease is an independent risk factor for cardiovascular disorders such as hypertension, arteriosclerosis, and coronary heart disease1,4.

Elucidation of the mechanisms involved in obesity‑related cardiac dysfunction requires the use of appropriate diet‑induced models4,5-9. However, it is well known that rats, like humans, show different susceptibilities to the development of diet‑induced obesity, so it is possible to identify subgroups developing obesity and others maintaining a lean phenotype despite a high caloric intake This subgroup of rats that do not become obese even when fed a high-fat diet are categorized as obesity-resistant (OR) rats10-12. These OR rats exhibit lower body weight (BW) gain and less fat deposits than obesity-prone (OP) rats despite similar energy intake10,13. Obesity resistance reflects the ability to accurately sense energy balance and respond to increased energy intake with adaptive responses that counteract a tendency for weight gain14.

Few studies have evaluated the correlation between cardiac function and obesity resistance, and the mechanisms by which OR can promote myocardial dysfunction are not well understood. Carroll et al4 were unable to identify any cardiac abnormalities in OR animals after 12 weeks. Conversely, Louis et al8 showed that OR rats fed a high-fat diet for 17 weeks manifested cardiac dysfunction, reflected by significantly increased isovolumetric relaxation time. Several factors have been proposed as contributors to cardiac dysfunction in obesity models, among them changes in calcium (Ca2+) handling5,9,15. Nevertheless, it is unclear whether changes in Ca2+ handling play a critical role in the development of myocardial dysfunction induced by obesity resistance.

Considering the lack of information regarding cardiac function and the mechanisms underlying the involvement of Ca2+ handling in obesity resistance, this study was designed to test the hypothesis that obesity resistance does not promote myocardial dysfunction or impairs Ca2+ handling in obesity models.

 Methods Animal Models and Experimental Protocol

Thirty-day-old male Wistar rats were randomly distributed into two groups: control (C, n = 54) and obese (Ob, n = 54). The C group was fed a standard diet (RC Focus 1765) and the Ob group was alternately exposed to four palatable high-fat diets (RC Focus 2413, 2414, 2415, and 2416; Agroceres, Rio Claro, Brazil) as previously described5. The sample size was based on previous studies performed in our laboratory6,16,23,29.

BW was recorded weekly after the start of the experimental protocol. Obesity, determined according to BW gain, began to establish at week 3, as previously demonstrated16. At this time point, C and Ob rats were maintained on their respective diets for 15 additional consecutive weeks.

 Animal Care

The animals were maintained in a controlled environment with clean air, 12 hours of light/dark cycles starting at 6 a.m., room temperature maintained at 23 ± 3°C, and relative humidity maintained at 60 ± 5%. All experiments and procedures were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the National Research Council (1996), and were approved by the Ethics Committee for the Use of Animals (UNESP, Botucatu, SP, Brazil), under number 1036.

 Nutritional Profile

Food consumption, calorie intake (CI), feed efficiency (FE), and BW were recorded weekly as previously described5. Fifteen weeks after obesity had developed, the animals were anesthetized with an injection of ketamine (50 mg/kg) and xylazine (0.5 mg/kg). They were then decapitated and thoracotomized, and the epididymal, retroperitoneal and visceral fat depots were dissected and weighed. The adiposity index was calculated with the following formula: (total body fat/final BW) x 100. Body fat was determined from the sum of the individual weight of each fat pad according to the formula: Body fat = epididymal fat + retroperitoneal fat + visceral fat16.

 Determination of Obesity and Obesity

A criterion based on the adiposity index was used to determine the occurrence of obesity and obesity resistance according to several authors4,11,19. After 15 weeks, rats consuming high-fat diets were ranked based on their adiposity indexes. Thus, in the current study, rats on the high-fat diet exhibiting the greatest adiposity indexes were referred to as OP (n = 35), whereas those exhibiting the lowest adiposity indexes were referred to as OR (n = 19). Rats that failed to present the normal characteristic of the C group while fed with a standard diet were no longer used (n = 15).

 Systolic Blood Pressure (SBP)

One week before the rats were euthanized, tail SBP was measured with a tail plethysmograph. The animals were warmed in a wooden box at 40°C for 4 minutes to induce tail arterial vasodilation. A sensor coupled to an electro‑sphygmomanometer attached to a computer was placed in the tail and the SBP was then measured with a specific software (Biopac Systems Inc., CA, USA).

 Glucose Tolerance and Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance (HOMA-IR)

The experiments were performed in the C (n = 34), OP (n = 31), and OR (n = 13) rats after 15 weeks of treatment. After 4–6 hours of fasting, a blood sample was collected from the tip of their tails. The blood glucose level (baseline condition) of each animal was immediately determined using a handheld glucometer (Accu-Chek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN). Subsequently, an injection of glucose solution dissolved in water was administered intraperitoneally(Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, USA), and blood glucose levels were measured after 15, 30, 60, 90, and 120 minutes20. The HOMA-IR reflects the degree of insulin resistance and was calculated with the following formula: HOMA-IR = [fasting glucose (mmol/l) X fasting insulin (mU/ml)]/22.5.

 Metabolic Profile

At the end of the experimental period, the animals were fasted for 12–15 hours, then anesthetized with an intramuscular injection of ketamine (50 mg/kg) and xylazine (0.5 mg/kg), and euthanized by decapitation. Blood samples were collected and the serum was separated by centrifugation at 3,000 X g for 15 minutes at 4°C, and stored at -80°C until further analysis. The serum was analyzed for levels of glucose, triglycerides (TG), total cholesterol (T-Chol), high‑density lipoprotein cholesterol (HDL), low-density lipoprotein cholesterol (LDL), insulin, and leptin. Glucose, TG, T-Chol, HDL, and LDL were measured with an automatic enzymatic analyzer system (Biochemical analyzer BS-200, Mindray, China). Leptin and insulin levels were determined by enzyme‑linked immunosorbent assay (ELISA) method using commercial kits (Linco Research Inc., St. Louis, MO, USA).

 Post-Death Morphological Analysis

The rats were euthanized by thoracotomy, and the hearts, ventricles, and tibia were separated, dissected, weighed, and measured. Cardiac remodeling was determined by analyzing the weight of the heart and the left (LV) and right (RV) ventricles, and their correlation with the tibial length.

 Isolated Papillary Muscle

To assess the intrinsic contractile and mechanical properties of the heart, the isolated papillary procedure was employed as previously described5. This experiment was performed in C (n = 36), OP (n = 35), and OR (n = 18) rats. The papillary muscles were also evaluated under the baseline condition of 2.5 mM Ca2+ and after the inotropic maneuvers of increase in extracellular Ca2+concentration and post-rest contraction (PRC) as previously described5.

 Statistical Analysis

All analyses were performed using the SigmaStat 3.5 software (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, USA). The distribution of the variables was assessed with the Shapiro-Wilk test, and the results were reported as means ± standard deviations. Comparisons between groups were performed using one-way ANOVA for independent samples, and Tukey’s post hoc test. Repeated-measures two-way ANOVA was used to evaluate glucose tolerance and myocardial Ca2+ handling. The level of significance was determined at 5 % (α = 0.05).

 Results General Characteristics of the Experimental Groups

There was no difference in baseline BW among the groups (Table 1). The high-fat diet promoted a substantial increase in body fat and adiposity index in OP rats compared with C and OR rats. Specifically, OP rats had a 86.4% and 78.8% higher body fat content and 66.9% and 60.5% higher adiposity indexes than C and OR rats, respectively. In addition, epididymal, retroperitoneal, and visceral fat pads, as well as final BW were greater in OP rats compared with C and OR rats. Despite the greater amount of energy in the high-fat diet, the calorie intake was similar in both groups due to a reduced food consumption by OP and OR rats in relation to C rats. In addition, FE was higher in the OP group compared with that in the C group. Although FE values were similar in OP and OR rats, this parameter showed a trend towards a lower result in OR when compared with OP rats (p = 0.077).

Characteristics of the experimental groups
Variables Groups
C (n= 39) OP (n= 35) OR (n= 19)
IBW (g) 150 ± 12 152 ± 11 152 ± 10
FBW (g) 486 ± 34 545 ± 46* # 492 ± 41
Weight gain (g) 336 ± 31 393 ± 44* # 340 ± 40
Epididymal fat (g) 7.33 ± 1.72 12.9 ± 3.7* # 7.31 ± 1.94
Retroperitoneal fat (g) 8.74 ± 2.09 17.8 ± 6.2* # 9.84 ± 2.58
Visceral fat (g) 5.95 ± 1.34 10.6 ± 3.7* # 6.00 ± 1.21
Body fat (g) 22.2 ± 4.1 41.3 ± 12.8* # 23.1 ± 4.3
Adiposity index (%) 4.51 ± 0.73 7.53 ± 1.99* # 4.69 ± 0.67
FC (g/day) 26.6 ± 1.9 22.4 ± 2.8* 20.8 ± 3.0&
CI (kcal/day) 78.4 ± 5.7 81.6 ± 10.1 75.9 ± 10.9
FE (%) 2.40 ± 0.24 2.85 ± 0.50* 2.59 ± 0.48

Values are expressed as mean ± standard deviation; n: Number of animals; C: Control; OP: Obesity prone; OR: Obesity resistant; IBW: Initial body weight; FBW: Final body weight; FC: Food consumption; CI: Calorie intake; FE: Feed efficiency;

C versus OP; p < 0.05;

C versus OR; p < 0.05;

OP versus OR, p < 0.05; One-way ANOVA for independent samples and Tukey's post hoc test.

 Glucose, Insulin, HOMA-IR, and Metabolic Profile

There were no statistical differences in glucose and insulin levels between the groups (Figure 1 – A and B). However, the glucose profile and HOMA-IR index were significantly affected by exposure to obesity (Figure 1 – C and D). The OP rats presented higher levels of glucose at time points 60, 90, and 120 minutes compared with C rats (Figure 1 – C). In addition, there was no statistical difference in the glucose profile between C and OR rats (Figure 1 - C). The area under the curve (AUC) for glucose was higher in OP rats than C rats (Table 2). Moreover, the HOMA-IR index was higher in OP rats than C and OR rats (Figure 1 – D). HDL, LDL, T-Chol and SBP were not significantly different between the groups (Table 2). However, TG levels were higher in OP than C rats. Furthermore, OP rats exhibited higher levels of leptin when compared with C and OR rats (Table 2).

Hormonal profiles and comorbidities; n= number of animals. A: Serum glucose; B: Serum insulin; C: Blood glucose levels following an oral glucose load; D: Homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) in control (C, white circles; n = 34), obesity-prone (OP, black squares; n = 31) and obesity-resistant (OR, white triangles; n = 13) rats. Values are expressed as mean ± standard deviation. <sup>*</sup>C versus OP; p < 0.05. Systolic blood pressure, and biochemical and hormonal profiles
Groups
Variables C (n= 34) OP (n= 31) OR (n= 13)
AUC (mg/dL/min) 19823±4166 23718 ± 4172* 21713±3887
SBP (mmHg) 128 ± 8 132 ± 11 131 ± 11
Cholesterol (mg/dL) 59.8 ± 14.0 67.2 ± 14.0 63.7 ± 9.1
Triglycerides (mg/dL) 54.6 ± 14.0 74.0 ± 26.2* 62.4 ± 25.7
HDL (mg/dL) 36.2 ± 22.0 38.9 ± 19.5 40.5 ± 19.3
LDL (mg/dL) 25.5 ± 10.1 28.4 ± 13.4 27.6 ± 14.1
Leptin (ng/mL)§ 3.45 ± 5.47 6.70 ± 14.30* # 3.25 ± 4.66

Values are expressed as mean ± standard deviation; n: Number of animals; C: Control; OP: Obesity prone; OR: Obesity resistant; AUC: Area under the curve for glucose; SBP: Systolic blood pressure; HDL: High-density lipoprotein cholesterol; LDL: Low-density lipoprotein cholesterol;

Values are expressed as median ± semi-interquartile range;

C versus OP; p < 0.05;

OP versus OR, p < 0.05; One-wayANOVA for independent samples and Tukey's post hoc test; §Kruskal-Wallis one-way ANOVA and Dunn's post hoc test.

 Morphological Characteristics

The morphological characteristics of the rats are displayed in Figure 2 (A-F). The absolute heart and LV weights, as well as their correlation with tibial length, were significantly increased in OP rats compared with C and OR rats (Figure 2 – A, B, D and E). Furthermore, OP rats showed greater RV weight and correlation with tibial length than C rats (Figure 2 – C and F). Of note, tibial lengths were similar among the groups.

Morphologic profiles of controls (C, n = 39), obesity-prone (OP, n = 35) and obesity-resistant (OR, n = 19) rats; n = Number of animals. A: Heart weight; B: Left ventricular (LV) weight; C: Right ventricular (RV) weight; D: Heart weight/tibial length; E: LV/tibial length: F: RV/tibial length. Values are expressed as mean ± standard deviation. <sup>*</sup>C versus OP; p < 0.05; #OP versus OR, p < 0.05. Analysis of Myocardial Function and Calcium (Ca<sup>2+</sup>) Handling

The contraction performance of papillary muscles at baseline conditions (Ca2+ of 2.5 mM) was similar for all parameters in the C, OP, and OR groups (Table 3). After 60 seconds of PRC, the maximum developed tension (DT) was lower in OP rats compared with C rats, (C: 7.2 ± 1.7 g/mm2versus OP: 6.4 ± 1.4 g/mm2; Figure 3 – A). Although the significance of this effect was only observed at 60s, the myocardium from OP rats also exhibited lower values of DT in response to PRC at 30s (C: 6.8 ± 1.5 versus OP: 6.1 ± 1.3, p = 0.056). Although at baseline condition, +dT/dt values were similar between C, OP and OR rats, when subjected to PRC at 60 s, this parameter was reduced in OP and OR rats compared to C rats (Figure 3 – B). In addition, there was a trend towards lower +dT/dt in OP and OR rats during the PRC at 30 seconds, when compared with C rats (p = 0.075 and p = 0.076, respectively), but these values were not significantly different between the groups (Figure 3 – B). Figure 3 (D and E) shows that obesity resistance did not impair DT and +dT/dt after increase in extracellular Ca2+ concentration. Furthermore, obesity and obesity resistance failed to elicit any significant effect on the peak of the negative tension derivatives (-dT/dt) at baseline and after maneuvers in the groups (Figure 3 – C and F).

Baseline data from isolated muscle preparations
Variables Groups
C (n= 36) OP (n= 35) OR (n= 18)
DT (g/mm2) 6.77 ± 1.68 6.10 ± 1.68 6.30 ± 1.37
RT (g/mm2) 1.22 ± 0.44 1.03 ± 0.38 0.99 ± 0.27
+dT/dt (g/mm2/s) 75.9 ± 18.8 70.6 ± 19.2 72.5 ± 16.2
-dT/dt (g/mm2/s) 25.3 ± 5.3 24.9 ± 7.0 24.0 ± 5.2
CSA (mm2) 1.10 ± 0.25 1.14 ± 0.29 1.10 ± 0.35

Values are expressed as mean ± standard deviation; n: Number of animals; C: Control; OP: Obesity prone; OR: Obesity resistant Baseline condition 2.5 mM [Ca2+]; DT Maximum developed tension normalized per cross-sectional area of the papillary muscle; RT: Resting tension normalized per cross-sectional area of the papillary muscle; Peak of the positive (+dT/dt) and negative (-dT/dt) tension derivatives normalized per cross-sectional area of the papillary muscle; CSA: Cross-sectional area; One-way ANOVA for independent samples and Tukey's post hoc test.

 Effects of post-rest contraction (PRC; A, B, and C) and increasing extracellular Ca<sup>2+</sup> concentration (D, E, and F) in papillary muscles of control (C; n= 36), obesity-prone (OP; n = 35), and obesity-resistant (OR; n= 18) rats. PRC basal: 0.5 mM [Ca<sup>2+</sup>]. Values are expressed as mean ± standard deviation; n = number of animals. DT: maximum developed tension; Peak of the positive (+dT/dt) and negative (-dT/dt) tension derivatives. <sup>*</sup>C versus OP; p < 0.05; <sup>&</sup>C versus OR; p < 0.05. Discussion

Although obesity and overweight are increasingly widespread, some individuals remain resistant to becoming obese2. Previous studies have shown that this resistance to obesity may be attributed to changes in nutrition and adiposity patterns21,22. Most humans and animals consuming high-fat diets show an increase in BW, with corresponding increase in adiposity levels23,24. In comparison, some animals that are fed high-fat diets present less weight gain and adiposity than others that are prone to obesity.

Few studies have evaluated and identified the cardiac characteristics of OR rats4,8,17. Still, the occurrence of cardiac dysfunction and its mechanisms remain unknown in this animal model. Interestingly, little information is available on the relationship between obesity resistance, cardiac function, and Ca2+ handling. The major finding in the current study was that obesity resistance promotes mild myocardial dysfunction, and this result was related to damage in the contraction phase. We believe that this is the first study to report the role of Ca2+ handling in the myocardium of OR rats.

Fat-enriched diets have been used for decades to model obesity and obesity resistance in rodents17,22,24,25. Using male rats fed a high-saturated fat diet for 20 weeks, these studies reported that 42.5% and 40% rats were classified as OP and OR, respectively. In addition, Carroll et al4 found that 12 weeks of a moderate-fat diet identified 37.5% and 31.25% of OP and OR rats, respectively. The high-fat diet used in the present study was sufficiently intense and long to promote obesity in 64.8% of the rats (OP), whereas 35.2% of the rats did not develop obesity (OR). The literature reveals that obesity resistance is characterized by gain in BW and adiposity at a rate similar to, or lower than that of standard chow-fed rats12,13,26,27. The findings of the current study show that OR animals had significantly reduced final BW and fat deposits compared with the OP group, but similar characteristics as those of C rats. In addition, the adiposity index was 60.5% lower in the OR group compared with the OP group. These results are in line with findings of several other studies17,28.

Previous studies have shown that obesity resistance can occur due to increased total energy expenditure as well as reduced food intake11,13,21. Joo et al21 observed increased expression of some thermogenic enzymes and decreased expression of lipogenic enzymes in adipose tissues of OR rats fed a high-fat diet. Obesity resistance also showed suppression of lipogenesis and acceleration of fatty-acid oxidation in visceral fat13. The authors suggested that these characteristics are likely to contribute to the anti-obesity phenotype in rats. Moreover, Jackman et al14 demonstrated that to maintain body homeostasis, OR animals tend to decrease their food intake and/or increase their energy expenditure.

Many experiments have demonstrated that disorders induced in rats fed a high-fat diet resemble the human comorbidities caused by obesity, such as glucose intolerance, insulin resistance, hypertension, and dyslipidemia4,18,28-30. In OR models, there have been controversies regarding the presence of comorbidities10,31. In the current study, there were no changes typically associated with obesity in OR rats, since the high-fat diet was not able to promote changes in glucose, lipid, insulin, leptin, or blood pressure profiles. Our data corroborate those of other studies in which elevation of these variables and/or presence of comorbidities were also not identified4,10,31. Of note, Carroll et al4 found an increase in the HOMA-IR in OR rats compared with C rats.

Morphologic analysis indicated that obesity resistance did not induce cardiac remodeling as seen in human obesity4. Instead, OR rats presented lower total heart, and LV and RV weights compared with OP rats. While obesity promoted changes in cardiac structures, such as increase in LV weight (9.0%) and RV weight (21.0%) compared with C rats, OR rats only displayed a slight increase of 8.1% in RV weight, with no significant change in LV weight. Several factors have been implicated in the development of ventricular hypertrophy in obese models, including insulin and leptin18,32,33. Our results suggest that leptin and insulin did not increase sufficiently to promote cardiac remodeling in OR rats.

The purpose of the present investigation was to study the changes in LV myocardial performance using the isolated papillary muscle preparation method. Several investigations currently use these maneuvers to identify changes in the contraction and relaxation phases which may not be observed under baseline conditions9,19,34,35. Along with a lack of increase in BW or fat in the OR rats, the cardiac function in these animals did not change significantly after exposure to a high‑fat diet at baseline conditions. Nevertheless, the myocardial responsiveness to PRC was compromised with specific changes in the contraction phase, but without changes in the relaxation phase. Our data are in disagreement with those of Louis et al8 who have shown that OR rats fed a high‑fat diet for 17 weeks presented cardiac dysfunction during the relaxation phase. Despite the absence of cardiac dysfunction at baseline conditions, the PRC stimulation provided evidences that the impairment of myocardial contraction seen in OR rats was related to changes in intracellular Ca2+ handling. However, there are only a few studies that have reported impaired intracellular Ca2+ handling leading to myocardial dysfunction in OR rodents. In cardiac myocytes, Ca2+ plays an important role in cardiac performance and physiological processes15,36. According to Bögeholz et al36, there are three main ways to modulate the contractile function of myofilaments, namely (1) alteration of cytosolic Ca2+concentration, (2) mechanical change in pretension, and (3) catecholaminergic stimulation.

A possible explanation for the contraction impairment mediated by +dT/dt in OR rats may be related to β-adrenergic system downregulation37, which was not observed in this study. Positive inotropy in response to β-stimulation involves several pathways such as a) phosphorylation of plasma membrane Ca2+ channels by protein kinase A increasing Ca2+entry into the cell, b) phosphorylation of phospholamban and ryanodine receptor (RyR), increasing Ca2+ stores and Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum, respectively, and c) increase in actomyosin shortening velocity, which increases crossbridge cycling37,38. It has been reported that changes in the β-adrenergic system can reduce L-type Ca2+ channels and RyR activity by regulating their phosphorylation status in obesity models5,23,39,40.

 Conclusion

In summary, the results from this investigation demonstrate that mild myocardial function changes caused by obesity resistance are related to specific contraction impairment without changes in the relaxation phase. Future studies are necessary to evaluate the damage to intracellular Ca2+ handling, as well as the β-adrenergic system in OR rodent models.

Sources of Funding

This study was funded by FAPES/ES.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Bruno Barcellos Jacobsen and Artur Junio Togneri Ferron, from Universidade Federal do Espírito Santo.

 Acknowledgments

This study was funded by Grants process n° 53618009/2011 from FAPES, ES, Brazil. This manuscript has been proofread and edited by native English speakers (BioMed Proofreading).

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Ullrich ND Valdivia HH Niggli E PKA phosphorylation of cardiac ryanodine receptor modulates SR luminal Ca2+ sensitivity J Mol Cell Cardiol 2012 53 1 33 42 Resistência à Obesidade Promove Disfunção Contrátil Leve Associada com Trânsito Ca2+ Intracelular Sá Felipe Gonçalves dos Santos de 1 Lima-Leopoldo Ana Paula 1 Jacobsen Bruno Barcellos 1 Ferron Artur Junio Togneri 1 Estevam Wagner Muller 1 Campos Dijon Henrique Salomé 2 Castardeli Edson 1 Cunha Márcia Regina Holanda da 1 Cicogna Antonio Carlos 2 Leopoldo André Soares 1 Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Educação Física e Desportos Departamento de Desportos Vitória ES Brasil Centro de Educação Física e Desportos – Departamento de Desportos – Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES, Brasil Universidade Federal do Espírito Santo Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina Departamento de Clínica Médica Botucatu São Paulo Brasil Departamento de Clínica Médica – Faculdade de Medicina – Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo – Brasil Universidade Estadual Paulista Correspondência: André Soares Leopoldo , Avenida Fernando Ferrari, 514, Goiabeiras. CEP 29075-910, Vitória, ES – Brasil. E-mail: andresoaresleopoldo@gmail.com, andre.leopoldo@ufes.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Obtenção de financiamento: Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS; Obtenção de dados: Sá FGS, Jacobsen BB, Ferron AJT, Estevam WM, Campos DHS, Castardeli E; Análise e interpretação dos dados: Sá FGS, Jacobsen BB, Ferron AJT, Estevam WM, Campos DHS, Castardeli E, Cunha MRH; Redação do manuscrito: Sá FGS, Lima-Leopoldo AP, Cicogna AC, Leopoldo AS; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Lima-Leopoldo AP, Castardeli E, Cunha MRH, Cicogna AC, Leopoldo AS.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

A obesidade induzida por dieta é frequentemente utilizada para demonstração de disfunção cardíaca. No entanto, alguns ratos, como humanos, são suscetíveis ao desenvolvimento de um fenótipo de obesidade, enquanto outros são resistentes.

 Objetivo:

Avaliar a relação entre resistência à obesidade e função cardíaca e o impacto da resistência à obesidade no trânsito de cálcio.

 Métodos:

Ratos Wistar machos com trinta dias de idade foram distribuídos em dois grupos com 54 animais cada: controle (C; dieta padrão) e obesos (quatro dietas palatáveis hiperlipídicas) por 15 semanas. Após o protocolo experimental, os ratos alimentados por dietas hiperlipídicas foram classificados de acordo com o índice de adiposidade e subdivididos em propensos à obesidade (PO) e resistentes à obesidade (RO). Foram avaliados o perfil nutricional, comorbidades e remodelação cardíaca. A função cardíaca foi avaliada pelo estudo do músculo papilar isolado em condições basais e após manobras inotrópicas.

 Resultados:

As dietas hiperlipídicas promoveram aumento na gordura corporal e no índice de adiposidade em ratos PO comparados com ratos C e RO. Os perfis de glicose, lipídios e pressão arterial permaneceram inalterados em ratos RO. Além disso, os ratos RO apresentaram peso total do coração e dos ventrículos direito e esquerdo mais baixos do que ratos PO, mas semelhantes aos ratos C. Os músculos cardíacos de todos os ratos apresentaram dados semelhantes na condição basal, mas a resposta miocárdica a um estímulo de contração pós-pausa estava comprometida em ratos PO e RO em comparação aos ratos C.

 Conclusão:

A resistência à obesidade promoveu alterações específicas na fase de contração, sem alterar a fase de relaxamento. Esta anormalidade leve pode estar relacionada com o trânsito intracelular de Ca+2.

 Palavras-Chave: Resistência à Obesidade Dieta Hiperlipídica Função Cardíaca Trânsito de Cálcio Ratos FAPES 53618009/2011 Introdução

A obesidade é caracterizada por um excesso de massa adiposa influenciado por fatores genéticos e ambientais1-3. Esta doença multifatorial é um fator de risco independente para distúrbios cardiovasculares como hipertensão arterial, arteriosclerose e doença coronariana1,4.

A elucidação dos mecanismos envolvidos na disfunção cardíaca induzida pela obesidade requer a utilização de modelos adequados induzidos por dieta4,5-9. No entanto, sabe‑se que os ratos, como os humanos, mostram suscetibilidades diferentes para desenvolver obesidade induzida por dieta, sendo possível identificar subgrupos que desenvolvem obesidade e outros que mantêm um fenótipo magro apesar de uma alta ingestão calórica. Este subgrupo de ratos que não se tornam obesos mesmo quando alimentados com uma dieta hiperlipídica são categorizados como ratos resistentes à obesidade (RO)10-12. Estes RO apresentam menor ganho de peso corporal (PC) e menores depósitos de gordura do que os ratos propensos à obesidade (PO) apesar de ingestão semelhante de energia10,13. Resistência à obesidade reflete a habilidade de perceber com acurácia o balanço energético e responder ao consumo energético aumentado com respostas adaptativas que se opõem à de ganho de peso14.

Poucos estudos têm avaliado a correlação entre resistência à obesidade e função cardíaca e os mecanismos pelos quais a resistência à obesidade pode promover disfunção miocárdica ainda não são bem compreendidos. Carroll e cols.4 não identificaram qualquer anormalidade cardíaca em animais RO após 12 semanas. Por outro lado, Louis e cols.8 mostraram que ratos RO alimentados com uma dieta hiperlipídica por 17 semanas manifestaram disfunção cardíaca, refletida por um tempo significativamente maior de relaxamento isovolumétrico. Vários fatores têm sido propostos como contribuintes para a disfunção cardíaca em modelos de obesidade, entre eles mudanças no trânsito de cálcio (Ca+2)5,9,15. No entanto, não é claro se as mudanças no trânsito de Ca+2 desempenham um papel crítico no desenvolvimento da disfunção miocárdica induzido pela resistência à obesidade.

Considerando a falta de informações sobre a função cardíaca e os mecanismos subjacentes ao envolvimento do trânsito de Ca+2 na resistência à obesidade, este estudo foi elaborado para testar a hipótese de que a resistência à obesidade não promove disfunção miocárdica ou prejudica o trânsito de Ca+2 em modelos de obesidade.

 Métodos Animais e Protocolo Experimental

Ratos Wistar machos com trinta dias de idade foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: controle (C, n = 54) e obeso (Ob, n = 54). O grupo C foi alimentado com uma dieta padrão (RC Focus 1765) e o grupo Ob foi exposto alternadamente a quatro dietas hiperlipídicas palatáveis (RC Focus 2413, 2414, 2415, and 2416; Agroceres, Rio Claro, Brasil) como descrito anteriormente5. O tamanho da amostra foi baseado em estudos anteriores realizados em nosso laboratório6,16-18.

O PC foi registrado semanalmente após início do protocolo experimental. A obesidade foi baseada no ganho de PC e começou a se estabelecer na semana 3, como determinado previamente16. A partir desse momento, os ratos C e Ob foram mantidos em suas respectivas dietas por mais 15 semanas consecutivas.

 Cuidados dos Animais

Os animais foram mantidos em um ambiente controlado com ar puro, ciclos de 12 horas de claro/escuro com início às 6h00 da manhã, temperatura mantida a 23 ± 3°C e umidade relativa de 60 ± 5%. Todos os procedimentos e experimentos foram realizados em conformidade com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicado pelo National Research Council (1996), e foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (UNESP, Botucatu, SP, Brasil), sob o número 1036.

 Perfil Nutricional

O consumo alimentar, ingestão calórica (IC), eficiência alimentar (EA) e PC foram registrados semanalmente como descrito previamente5. Quinze semanas após a obesidade ter se desenvolvido, os animais foram anestesiados com injeção de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (0,5 mg/kg). Os animais foram então decapitados e toracotomizados e os depósitos de gordura foram dissecados e pesados. O índice de adiposidade foi calculado a partir da seguinte fórmula: (gordura corporal total/PC final) x 100. A gordura corporal foi determinada pela somatória de cada depósito de gordura de acordo com a fórmula: Gordura corporal = gordura epididimal + gordura retroperitoneal + gordura visceral16.

 Determinação da Obesidade e Resistência à Obesidade

Um critério baseado no índice de adiposidade foi utilizado para determinar a ocorrência de obesidade e resistência à obesidade, de acordo com vários autores4,11,19. Após 15 semanas, os ratos alimentados com dietas hiperlipídicas foram classificados com base em seus índices de adiposidade. Dessa forma, neste estudo, ratos alimentados com dieta hiperlipídica que exibiram os maiores índices de adiposidade foram referidos como PO (n = 35), enquanto que aqueles que exibiram menores índices de adiposidade foram designados como RO (n = 19). Os ratos que não apresentaram o comportamento normal do grupo C quando alimentados com uma dieta padrão não foram mais utilizados (n = 15).

 Pressão Arterial Sistólica (PAS)

Uma semana antes dos ratos serem eutanasiados, a PAS foi medida na cauda dos animais com um pletismógrafo de cauda. Os animais foram aquecidos em uma caixa de madeira a 40°C por 4 minutos para induzir vasodilatação arterial na cauda. Um sensor acoplado a um eletro‑esfigmomanômetro ligado a um computador foi colocado na cauda e a PAS foi então medida com o uso de um programa específico (Biopac Systems Inc., CA, EUA).

 Tolerância à Glicose e Índice de Resistência Insulínica (HOMA-IR)

Os experimentos foram realizados nos ratos C (n = 34), PO (n = 31) e RO (n = 13) após 15 semanas de tratamento. Após 4–6 horas de jejum, uma amostra de sangue foi coletada da ponta da cauda. O nível de glicemia (condição basal) de cada animal foi determinado imediatamente com um glicosímetro portátil (Accu-Chek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN). Posteriormente, uma injeção de solução de glicose dissolvida em água foi administrada intraperitonealmente(Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, EUA), e os níveis de glicose no sangue foram medidos após 15, 30, 60, 90 e 120 minutos20. O índice HOMA-IR reflete o grau de resistência à insulina e foi calculado com a seguinte fórmula: HOMA-IR = [glicemia de jejum (mmol/l) X insulinemia de jejum (mU/ml)]/22.5.

 Perfil Metabólico

Ao final do período experimental, os animais foram colocados em jejum por 12 a 15 horas, e em seguida anestesiados com uma injeção intramuscular de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (0,5 mg/kg) e eutanasiados por decapitação. Foram colhidas amostras de sangue e o soro foi separado por centrifugação a 3.000 X g durante 15 minutos a 4°C e armazenado a -80°C até análise posterior. O soro foi utilizado para análise dos níveis de glicose, triglicerídeos (TG), colesterol total (Col-T), colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL), insulina e leptina. Glicose, TG, Col-T, HDL e LDL foram medidos com um sistema de análise enzimática automático (Biochemical analyzer BS-200, Mindray, China). Os níveis de leptina e insulina foram determinados pelo método de ensaio de imunoadsorção por ligação enzimática (ELISA) com uso de kits comerciais (Linco Research Inc., St. Louis, MO, USA).

 Análise Morfológica

Os ratos foram eutanasiados por toracotomia, e os corações, ventrículos e tíbia foram separados, dissecados, pesados e medidos. A remodelação cardíaca foi determinada através da análise do peso do coração e dos ventrículos esquerdo (VE) e direito (VD), e suas correlações com o comprimento da tíbia.

 Músculo Papilar Isolado

Para avaliar as propriedades intrínsecas contráteis e mecânicas do coração, o procedimento de isolamento papilar foi empregado como previamente descrito5. Este experimento foi realizado em ratos C (n = 36), PO (n = 35) e RO (n = 18). Os músculos papilares também foram avaliados na condição basal de 2,5 mM Ca+2 e após as manobras inotrópicas de aumento na concentração extracelular de Ca+2e potencial pós-pausa (PPP) como descrito anteriormente5.

 Análise Estatística

Todas as análises foram realizadas com o software SigmaStat 3.5 (SYSTAT Software Inc., San Jose, CA, USA). A distribuição das variáveis foi avaliada com o teste de Shapiro-Wilk e os resultados foram relatados como médias ± desvios-padrão. Comparações entre os grupos foram realizadas com ANOVA unifatorial para amostras independentes e teste post hoc de Tukey. ANOVA bifatorial para medidas repetidas foi utilizada para avaliar a tolerância à glicose e o trânsito de Ca+2 miocárdico. O nível de significância foi determinado em 5% (α = 0,05).

 Resultados Características Gerais dos Grupos Experimentais

Não houve diferença no PC inicial entre os grupos (Tabela 1).A dieta hiperlipídica promoveu um aumento substancial na gordura corporal e no índice de adiposidade em ratos PO comparado com ratos C e RO. Especificamente, em comparação aos ratos C e RO, os ratos PO apresentaram respectivamente teor de gordura corporal 86,4% e 78,8% maior e índices de adiposidade 66,9% e 60,5%, mais elevados. Além disso, os depósitos de gordura epididimal, retroperitonal e visceral, bem como o PC final foram maiores em ratos PO comparados com ratos C ou RO. Apesar da maior quantidade de energia na dieta hiperlipídica, a ingestão calórica foi semelhante entre os grupos devido a um consumo alimentar reduzido pelos ratos PO e RO em relação aos ratos C. Além disso, a EA foi maior no grupo PO em comparação ao grupo C. Embora os valores de EA tenham sido semelhantes em ratos PO e RO, este parâmetro mostrou um resultado inferior sem significância estatística em ratos RO quando comparados com ratos PO (p = 0,077).

Características dos grupos experimentais
Variáveis Grupos
C (n = 39) PO (n = 35) RO (n = 19)
PCI (g) 150 ± 12 152 ± 11 152 ± 10
PCF (g) 486 ± 34 545 ± 46* # 492 ± 41
Ganho de peso (g) 336 ± 31 393 ± 44* # 340 ± 40
Gordura epididimal (g) 7,33 ± 1,72 12,9 ± 3,7* # 7,31 ± 1,94
Gordura retroperitoneal (g) 8,74 ± 2,09 17,8 ± 6,2* # 9,84 ± 2,58
Gordura visceral (g) 5,95 ± 1,34 10,6 ± 3,7* # 6,00 ± 1,21
Gordura corporal (g) 22,2 ± 4,1 41,3 ± 12,8* # 23,1 ± 4,3
Índice de adiposidade (%) 4,51 ± 0,73 7,53 ± 1,99* # 4,69 ± 0,67
CA (g/dia) 26,6 ± 1,9 22,4 ± 2,8* 20,8 ± 3,0&
IC (kcal/dia) 78,4 ± 5,7 81,6 ± 10,1 75,9 ± 10,9
EA (%) 2,40 ± 0,24 2,85 ± 0,50* 2,59 ± 0,48

Os valores estão expressos como média ± desvio-padrão; n: Número de animais; C: Controle; PO: Propensos à obesidade; RO: Resistentes à obesidade; PCI: Peso corporal inicial; PCF: Peso corporal final; CA: Consumo alimentar; IC: Ingestão de calorias; EA: Eficiência alimentar;

C versus PO; p < 0,05;

C versus RO; p < 0,05;

PO versus RO, p < 0,05; ANOVA unifatorial para amostras independentes e teste post hoc de Tukey.

 Glicose, Insulina, HOMA-IR e Perfil Metabólico

Não houve diferenças estatísticas nos níveis de glicose e insulina entre os grupos (Figura 1 – A e B). No entanto, o perfil de glicose e o índice HOMA-IR foram significativamente afetados pela exposição à obesidade (Figura 1 – C e D). Os ratos PO apresentaram níveis mais altos de glicose nos tempos de 60, 90 e 120 minutos em comparação aos ratos C (Figura 1 – C). Além disso, não houve diferença estatística no perfil de glicose entre ratos C e RO (Figura 1 – C). A área sob a curva (AUC) para a glicose foi superior em ratos PO em relação aos ratos C (Tabela 2). Além disso, o índice HOMA‑IR foi maior em ratos PO do que em ratos C e RO (Figura 1 – D). HDL, LDL, Col-T e PAS não foram significativamente diferentes entre os grupos (Tabela 2). No entanto, os níveis de TG foram maiores em ratos PO do que em ratos C. Além disso, os ratos PO exibiram níveis mais elevados de leptina quando comparados com ratos C e RO (Tabela 2).

Perfis hormonais e comorbidades; n = número de animais. A: Glicemia; B: Insulinemia; C: Níveis de glicemia após sobrecarga oral de glicose; D: Modelo homeostático para avaliar resistência insulínica (HOMA-IR) em ratos controle (C, círculos brancos; n = 34), propensos à obesidade (PO, quadrados pretos; n = 31) e resistentes à obesidade (RO, triângulos brancos; n = 13). Os valores são expressos como média ± desvio-padrão <sup>*</sup> C versus PO; p < 0,05. Pressão arterial sistólica e perfis bioquímicos e hormonais
Variáveis Grupos
C (n = 34) PO (n = 31) RO (n = 13)
AUC (mg/dL/min) 19823±4166 23718±4172* 21713± 3887
PAS (mmHg) 128 ± 8 132 ± 11 131 ± 11
Colesterol (mg/dL) 59,8 ± 14,0 67,2 ± 14,0 63,7 ± 9,1
Triglicerídeos (mg/dL) 54,6 ± 14,0 74,0 ± 26,2* 62,4 ± 25,7
HDL (mg/dL) 36,2 ± 22,0 38,9 ± 19,5 40,5 ± 19,3
LDL (mg/dL) 25,5 ± 10,1 28,4 ± 13,4 27,6 ± 14,1
Leptina (ng/mL)§ 3,45 ± 5,47 6,70 ± 14,30* # 3,25 ± 4,66

Os valores estão expressos como média ± desvio-padrão; n: Número de animais; C: Controle; PO: Propensos à obesidade; RO: Resistentes à obesidade; AUC: Área sob a curva para a glicose; PAS: Pressão arterial sistólica; HDL: Colesterol da lipoproteína de alta densidade; LDL: Colesterol da lipoproteína de baixa densidade;

Os valores estão expressos em mediana ± intervalo semi-interquartil;

C versus PO; p < 0,05;

PO versus RO, p < 0,05; ANOVA unifatorial para amostras independentes e teste post hoc de Tukey; §Kruskal-Wallis ANOVA unifatorial e teste post hoc de Dunn.

 Características Morfológicas

As características morfológicas dos ratos estão exibidas na Figura 2 (A – F). O peso absoluto do coração e o peso do VE, assim como suas correlações com o comprimento da tíbia foram significativamente mais elevados em ratos PO comparados com ratos C e RO (Figura 2 – A, B, D e E). Além disso, os ratos PO mostraram maior peso de VD e correlação com o comprimento da tíbia do que ratos C (Figura 2 – CeF). É interessante ressaltar que os comprimentos tibiais foram semelhantes entre os grupos.

Perfis morfológicos dos ratos controles (C, n = 39), propensos à obesidade (PO, n = 35) e resistentes à obesidade (RO, n = 19); n = número de animais. A: Peso do coração; B: Peso do ventrículo esquerdo (VE); C: Peso do ventrículo direito (VD); D: Peso do coração/comprimento da tíbia; E: VE/comprimento da tíbia: F: VD/comprimento da tíbia. Os valores são expressos como média ± desvio-padrão. <sup>*</sup> C versus PO; p < 0,05; p < 0,05; #PO versus RO, p < 0,05. Análise da Função Miocárdica e Trânsito de Cálcio (Ca<sup>+2</sup>)

O desempenho da contração dos músculos papilares em condições basais (Ca+2: 2,5 mM) foi semelhante para todos os parâmetros nos grupos C, PO e RO (Tabela 3). Após 60 segundos de PPP, a tensão máxima desenvolvida (TD) foi menor em ratos PO em comparação com ratos C (C: 7,2 ± 1,7 g/mm2versus PO: 6,4 ± 1,4 g/mm2; Figura 3 – A). Embora este efeito tenha sido significativo apenas aos 60 segundos, o miocárdio de ratos PO também mostrou valores menores de TD em resposta ao PPP aos 30 segundos (C: 6,8 ± 1,5 g/mm2versus PO: 6,1 ± 1,3 g/mm2; p = 0,056). O pico dos valores basais da velocidade máxima de variação positiva da tensão desenvolvida (+dT/dt) foi semelhante entre os ratos C, PO e RO quando submetidos à PPP aos 60 segundos, mas este parâmetro se mostrou reduzido em ratos PO e RO em comparação a ratos C (Figura 3 – B). Além disso, +dT/dt em ratos PO e RO apresentou menores valores durante o PPP aos 30 segundos quando comparados com ratos C (p = 0,075 e p = 0,076, respectivamente), mas esses valores não foram significativamente diferentes entre os grupos (Figura 3 – B). A Figura 3 (D e E) mostra que a resistência à obesidade não afetou a TD e a +dT/dt após o aumento na concentração extracelular de Ca+2. Além disso, a obesidade e a resistência à obesidade não provocaram nenhum efeito significativo sobre a velocidade máxima de variação negativa da tensão desenvolvida (-dT/dt) na condição basal e após manobras nos grupos (Figura 3 - C e F).

Dados de base da preparação muscular isolada
Variáveis Grupos
C (n = 36) PO (n = 35) RO (n = 18)
TD (g/mm2) 6,77 ± 1,68 6,10 ± 1,68 6,30 ± 1,37
TR (g/mm2) 1,22 ± 0,44 1,03 ± 0,38 0,99 ± 0,27
+dT/dt (g/mm2/s) 75,9 ± 18,8 70,6 ± 19,2 72,5 ± 16,2
-dT/dt (g/mm2/s) 25,3 ± 5,3 24,9 ± 7,0 24,0 ± 5,2
AST (mm2) 1,10 ± 0,25 1,14 ± 0,29 1,10 ± 0,35

Os valores estão expressos em média ± desvio-padrão; n: Número de animais; C: Controle; PO: Propensos à obesidade; RO: Resistentes à obesidade. Linha de base condição -2.5 mM [Ca+2]; TD: Tensão máxima desenvolvida normalizada pela área seccional transversa do músculo papilar; TR: Tensão de repouso normalizada pela área seccional transversa do músculo papilar; velocidade máxima de variação positiva (+ dT/dt) e negativa (-dT/dt) da tensão desenvolvida normalizada pela área seccional transversa do músculo papilar; AST: Área de secção transversal; ANOVA unifatorial para amostras independentes e teste post hoc de Tukey.

 Efeitos do potencial pós-pausa (PPP; A, B e C) e aumento na concentração de Ca<sup>+2</sup> extracelular (D, E e F) no músculo papilar de ratos controle (C; n = 36), propensos à obesidade (PO; n = 35) e resistentes à obesidade (RO; n = 18). PPP basal: 0,5 mM [Ca<sup>+2</sup>]. Os valores são expressos como média ± desvio-padrão; n = Número de animais. Tensão máxima desenvolvida (TD); velocidade máxima de variação positiva (+dT/dt) e negativa (-dT/dt) da tensão desenvolvida. <sup>*</sup>C versus PO; p < 0,05; <sup>&</sup> C versus RO; p < 0,05. Discussão

Apesar da obesidade e do sobrepeso serem cada vez mais generalizados, alguns indivíduos permanecem resistentes a se tornarem obesos2. Estudos anteriores mostraram que esta resistência à obesidade pode ser atribuída a mudanças na nutrição e padrões de adiposidade21,22. A maioria dos seres humanos e animais que consumem dietas hiperlipídicas mostram um aumento no PC, com correspondente aumento nos níveis de adiposidade23,24. Em comparação, alguns animais que são alimentados com dietas hiperlipídicas apresentam menor ganho de peso e adiposidade do que outros que são propensos à obesidade.

Poucos estudos têm avaliado e identificado as características cardíacas de ratos RO4,8,17. Mesmo assim, a ocorrência de disfunção cardíaca e seus mecanismos são desconhecidos neste modelo animal. Curiosamente, há pouca informação disponível sobre a relação entre resistência à obesidade, função cardíaca e trânsito de Ca+2. O achado mais importante do presente estudo foi que a resistência à obesidade promove disfunção miocárdica leve, e que este resultado se relacionou com dano na fase de contração. Acreditamos que este seja o primeiro estudo a relatar o papel do trânsito de Ca+2 no miocárdio de ratos RO.

Dietas hiperlipídicas têm sido utilizadas há décadas para caracterizar a obesidade e resistência à obesidade em roedores17,22,24,25. Utilizando ratos machos alimentados com uma dieta hiperlipídica saturada por 20 semanas, estes estudos relataram que 42,5% e 40% dos ratos foram classificados como PO e RO, respectivamente. Além disso, Carroll e cols.4 encontraram que 12 semanas de uma dieta moderada em gorduras identificou 37,5% e 31,25% de ratos PO e RO, respectivamente. A dieta hiperlipídica utilizada no presente estudo foi suficientemente intensa e longa para promover obesidade em 64,8% dos ratos (PO), enquanto que 35,2% dos ratos não desenvolveram obesidade (RO). A literatura revela que a resistência à obesidade é caracterizada por ganho de PC e adiposidade em um ritmo semelhante ou menor do que aquele em ratos alimentados com ração padrão12,13,26,27. Os achados deste estudo mostram que os animais RO apresentaram PC final e depósitos de gordura significativamente menores em comparação aos do grupo PO, mas com características semelhantes às dos ratos C. Além disso, o índice de adiposidade foi 60,5% menor no grupo RO em comparação ao grupo PO. Esses resultados estão de acordo com os achados de vários outros estudos17,28.

Estudos anteriores mostraram que a resistência à obesidade pode ocorrer devido a um aumento no gasto energético total, bem como a uma redução na ingesta alimentar11,13,21. Joo e cols.21 observaram uma expressão aumentada de algumas enzimas termogênicas e expressão reduzida de enzimas lipogênicas nos tecidos adiposos de ratos RO alimentados com uma dieta hiperlipídica. A resistência à obesidade também mostrou supressão da lipogênese e aceleração da oxidação de ácidos graxos na gordura visceral13. Os autores sugeriram que estas características provavelmente contribuem para o fenótipo anti-obesidade em ratos. Além disso, Jackman e cols.14 demonstraram que para manter a homeostasia corporal, os animais RO tendem a diminuir sua ingesta alimentar e/ou a aumentar seu gasto de energia.

Muitos experimentos têm demonstrado que os distúrbios induzidos em ratos alimentados com uma dieta hiperlipídica se assemelham a comorbidades humanas causadas pela obesidade, tais como intolerância à glicose, resistência à insulina, hipertensão e dislipidemia4,18,28-30. Nos modelos RO, têm ocorrido controvérsias sobre a presença de comorbidades10,31. No presente estudo, não houve alterações normalmente associadas com obesidade em ratos RO, pois a dieta hiperlipídica não foi capaz de promover mudanças nos perfis de glicose, lipídios, insulina, leptina ou pressão arterial. Nossos dados corroboram os de outros estudos nos quais a elevação dessas variáveis e/ou presença de comorbidades também não foi identificada4,10,31. É importante mencionar que Carroll e cols.4 encontraram um aumento no HOMA-IR em ratos RO em comparação com ratos C.

A análise morfológica indicou que a resistência à obesidade não induziu remodelamento cardíaco como visto na obesidade humana4. Ao invés disso, ratos RO apresentaram peso cardíaco total e de VE e VD inferior aos de ratos PO. Enquanto que a obesidade promoveu alterações nas estruturas cardíacas, como o aumento do peso do VE (9%) e VD (21%) em comparação aos ratos C, os ratos RO exibiram apenas um leve aumento de 8,1% no peso do VD, sem mudança significativa no peso do VE. Vários fatores têm sido implicados no desenvolvimento da hipertrofia ventricular em modelos de obesidade, incluindo insulina e leptina18,32,33. Nossos resultados sugerem que a leptina e a insulina não aumentaram suficientemente para promover remodelação cardíaca em ratos RO.

O objetivo da presente investigação foi o de estudar as mudanças no desempenho do miocárdio no VE utilizando o método de análise do músculo papilar isolado. Várias investigações têm utilizado atualmente estas manobras para identificar alterações nas fases de contração e relaxamento que podem não ser observadas em condições basais9,19,34,35. Junto com a ausência de aumento de PC ou gordura nos ratos RO, a função cardíaca não se alterou significativamente após exposição a uma dieta hiperlipídica em condições basais. Todavia, a resposta miocárdica à PPP se mostrou comprometida com mudanças específicas na fase de contração, mas sem alterações na fase de relaxamento. Nossos dados discordam dos de Louis e cols.8 que demostraram que ratos RO alimentados com uma dieta hiperlipídica por 17 semanas apresentaram disfunção cardíaca na fase de relaxamento. Apesar da ausência de disfunção cardíaca nas condições basais, a estimulação da PPP forneceu evidências de que o comprometimento da contração miocárdica visto em ratos RO estava relacionado a mudanças no trânsito intracelular de Ca+2. No entanto, há poucos estudos que relataram um comprometimento do trânsito intracelular de Ca+2 levando à disfunção miocárdica em roedores RO. Em miócitos cardíacos, o Ca+2 desempenha um papel importante na performance cardíaca e nos processos fisiológicos15,36. De acordo com Bögeholz e cols.36, há três maneiras principais de modular a função contrátil de miofilamentos, (1) alteração da concentração citossólica de Ca+2, (2) mudança mecânica na pré-tensão e (3) estimulação catecolaminérgica.

Uma possível explicação para o comprometimento da contração mediado por +dT/dt em ratos RO pode estar relacionada à regulação negativa do sistema β-adrenérgico37, a qual não foi observada neste estudo. A inotropia positiva em resposta à estimulação β envolve várias vias como a) fosforilação de canais de Ca+2 da membrana plasmática pela proteína quinase A aumentando a entrada de Ca+2 para o interior da célula, b) fosforilação de fosfolambam e receptor de rianodina (RyR), aumentando as reservas de Ca+2 e liberação de Ca+2 do retículo sarcoplasmático, respectivamente e c) aumento da velocidade de encurtamento da actomiosina, o que aumenta o ciclo de pontes cruzadas37,38. Tem sido relatado que mudanças no sistema β-adrenérgico podem reduzir os canais de Ca+2 do tipo L e a atividade da RyR através da regulação dos seus estados de fosforilação em modelos de obesidade5,23,39,40.

 Conclusão

Em resumo, os resultados desta investigação demonstram que uma mudança leve na função miocárdica causada pela resistência à obesidade está relacionada a um comprometimento específico na contração sem alterações na fase de relaxamento. Futuros estudos são necessários para avaliar o dano ao trânsito intracelular de Ca+2, bem como o sistema β-adrenérgico em modelos de roedores com RO.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por FAPES/ES.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Bruno Barcellos Jacobsen e Artur Junio Togneri Ferron pela Universidade Federal do Espírito Santo.

 Agradecimentos

Este estudo foi financiado por bolsa da FAPES, ES, Brasil, processo n° 53618009/2011 Este manuscrito foi revisado e editado por nativos em inglês (BioMed Proofreading).