Abstract

abc

Arq Bras Cardiol

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia

CwSwLTmPP5xsy3yn6yDwjhM

S0066-782X2015002400472

S0066-782X2015005050105

10.5935/abc.20150105

Original Articles

Assessment of Galectin-3 Polymorphism in Subjects with Chronic Chagas Disease

Cruz

Gabriela da Silva

1 Angelo

Ana Luiza Dias

1 Larocca

Ticiana Ferreira

1 2 3 Macedo

Carolina Thé

1 2 3 Noya-Rabelo

Márcia

2 Correia

Luís Claudio Lemos

2 Torreão

Jorge Andion

2 Souza

Bruno Solano de Freitas

1 3 Santos

Ricardo Ribeiro dos

1 3 Soares

Milena Botelho Pereira

1 3

1 Hospital São Rafael Centro de Biotecnologia e Terapia Celular

Salvador

Brazil Centro de Biotecnologia e Terapia Celular – Hospital São Rafael, Salvador, BA - Brazil 2 Hospital São Rafael Departamento de Cardiologia

Salvador

Brazil Departamento de Cardiologia - Hospital São Rafael, Salvador, BA - Brazil 3 FIOCRUZ Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz

Salvador

Brazil Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz - FIOCRUZ, Salvador, BA - Brazil Fundação Oswaldo Cruz

Mailing Address: Ticiana Ferreira Larocca, Av. São Rafael, 2152. Postal Code 41253-190. São Marcos, Salvador, BA - Brazil. Email: ticiana@cbtc-hsr.org

Author contributions

Conception and design of the research: Cruz GS, Angelo ALD, Souza BSF, Santos RR, Soares MBP; Acquisition of data: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Macedo CT, Noya- Rabelo M, Torreão JÁ; Analysis and interpretation of the data: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Macedo CT, Noya- Rabelo M, Correia LCL, Torreão JA, Souza BSF, Soares MBP; Statistical analysis: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Noya- Rabelo M, Correia LCL; Obtaining financing: Santos RR, Soares MBP; Writing of the manuscript: Cruz GS, Larocca TF, Souza BSF; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Macedo CT, Noya- Rabelo M, Correia LCL, Souza BSF, Santos RR, Soares MBP.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

25 08 2015

11 2015

105 5 472 478 21 05 2015 01 06 2015 23 06 2015

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract Background:

Galectin-3, a β-galactoside binding lectin, has been described as a mediator of cardiac fibrosis in experimental studies and as a risk factor associated with cardiovascular events in subjects with heart failure. Previous studies have evaluated the genetic susceptibility to Chagas disease in humans, including the polymorphisms of cytokine genes, demonstrating correlations between the genetic polymorphism and cardiomyopathy development in the chronic phase. However, the relationship between the galectin-3 single nucleotide polymorphism (SNP) and phenotypic variations in Chagas disease has not been evaluated.

Objective:

The present study aimed to determine whether genetic polymorphisms of galectin-3 may predispose to the development of cardiac forms of Chagas disease.

Methods:

Fifty-five subjects with Chagas disease were enrolled in this observational study. Real-time polymerase chain reaction (PCR) was used for genotyping the variants rs4644 and rs4652 of the galectin-3 gene.

Results:

For the SNP rs4644, the relative risk for the cardiac form was not associated with the genotypes AA (OR = 0.79, p = 0.759), AC (OR = 4.38, p = 0.058), or CC (OR = 0.39, p = 0.127). Similarly, for the SNP rs4652, no association was found between the genotypes AA (OR = 0.64, p = 0.571), AC (OR = 2.85, p = 0.105), or CC (OR = 0.49, p = 0.227) and the cardiac form of the disease.

Conclusion:

Our results showed no association between the different genotypes for both SNPs of the galectin-3 gene and the cardiac form of Chagas disease. (Arq Bras Cardiol. 2015; [online].ahead print, PP.0-0)

Keywords: Chagas Disease Galectin 3 Heart Failure Polymorphism, Genetic Chagas Cardiomyopathy

Introduction

Chagas disease (CD), caused by the intracellular parasite Trypanosoma cruzi, is a major public health problem in Latin America and affects millions of people worldwide1. About 30% of the patients develop chronic cardiomyopathy, which is the most severe form of CD and associated with worse prognosis in heart failure2. Since there is no effective treatment in this stage of the disease, it is crucial to identify biomarkers that might be used in the early detection of cardiac disease and prognostic stratification.

Previous studies have evaluated the genetic susceptibility to CD in humans. Polymorphisms of molecules involved in host damage, induced by the parasite, such as IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, and IFN-γ have been determined in subjects with the disease, demonstrating the association between genetic polymorphism and the development of cardiomyopathy in the chronic phase of CD3^-8.

Recently, our group has demonstrated that the galectin-3 gene is overexpressed in the heart of animals chronically infected with Trypanosoma cruzi9^,10. Galectin-3 is a member of the galectin family that binds β-galactosides and is produced by activated macrophages and fibroblasts11. It has been shown to be a mediator of cardiac fibrosis in experimental studies11^,12 and to be related to cardiovascular events and heart failure severity13^,14.

Previous studies have shown that genetic variants at two galectin-3 gene single nucleotide polymorphism (SNP) sites (rs4644 and rs4652, corresponding to LGALS3 +191 A>C and LGALS3 +292 A>C, respectively) are able to change the protein levels15. Galectin-3 plays an important role in inflammation and fibrosis process, and the relationship between the SNPs in the galectin-3 gene and the phenotypic variations in CD have not been evaluated. We hypothesized that galectin-3 SNPs can influence the development of cardiac forms of Chagas disease. Therefore, the present study aimed to evaluate the correlation of genetic polymorphisms of galectin-3 with severity of the cardiac form of Chagas disease.

Methods Study population

A retrospective observational study was performed between January 2011 and December 2013. A convenience sample of 55 subjects attending the CD outpatient clinic at Hospital São Rafael was studied.

Inclusion criteria were: CD diagnosis confirmed microbiologically by two serological tests (indirect hemagglutination and indirect immunofluorescence), and age from 18 to 70 years. Exclusion criteria were: previous myocardial infarction or history of coronary artery disease, primary valve disease, dialysis treatment for end-stage renal disease, active liver disease, hematologic, neoplastic or bone diseases, and contraindications to magnetic resonance imaging (MRI).

The study complied with the Declaration of Helsinki and was approved by the Ethics Committee. All subjects signed a written informed consent before their inclusion in the study. All subjects underwent a structured medical history and physical examination, blood analysis, 12-lead Electrocardiography (ECG), chest X-Ray, 24-h Holter monitoring, conventional Doppler echocardiogram, and cardiac magnetic resonance.

Genotyping of galectin-3 gene SNPs

Samples of genomic DNA were obtained from peripheral blood mononuclear cells. DNA extraction was performed using the commercial kit QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), according to the manufacturer’s recommendations. The samples were stored in a freezer at -20°C. Genotyping of the SNPs rs4644 and rs4652 of the galectin-3 gene was performed by real-time polymerase chain reaction (PCR) using TaqMan® (Life Technologies, Carlsbad, USA), and the SNPs were amplified using the TaqMan® Universal PCR protocol (Life Technologies). Genotypes of each SNP were determined using the Sequence Detection System software version 1.3.1 (Life Technologies). The probes and primers for the selected SNPs were supplied by the same company.

Doppler echocardiogram

Standard transthoracic echocardiographic examination was performed using the Vivid 7 digital ultrasound system (GE Vingmed Ultrasound AS, Horten, Norway). Three cardiac cycles were stored in cineloop format for offline analysis. Left ventricle (LV) and left atrial dimensions were measured according to the American Society of Echocardiography’s recommendations16. The LV ejection fraction (LVEF) was measured using the biplane Simpson’s method.

Cardiac magnetic resonance imaging

Cardiac magnetic resonance imaging was performed using a Sigma HDx 1.5-T system (General Electric; Fairfield, CT, USA). For assessment of the LV function, electrocardiography-gated, breath-hold long-axis, short-axis, and four-chamber views were acquired in the same location in different sequences. Acquisition parameters used for the dynamic sequence included a repetition time (RT) of 3.5 ms, an echo time (ET) of 1.5 ms, flip angle of 60°, a receiver bandwidth of 125 kHz, a 35 x 35 cm field of view (FOV), a matrix of 256x148, a temporal resolution (TR) of 35 ms, and a slice thickness of 8.0 mm without gap. Delayed enhancement images were acquired every heartbeat, 10 to 20 min after the administration of a gadolinium-based contrast (0.1 mmol/kg) using RT of 7.1 ms, ET of 3.1 ms, flip angle of 20°, first cardiac phase, views per segment 16/32, matrix size of 256 x 192, slice thickness of 8.0 mm, gap between slices of 2 mm, field of view 32 to 38 cm, inversion time 150 to 300 ms, receiver bandwidth of 31.25 kHz, number of excitations of 2. The myocardial delayed enhancement (MDE) technique was used to investigate myocardial fibrosis, which was estimated by a quantitative visual method.

Statistical analysis

Categorical data were expressed as numbers (percentages, 95% confidence interval), and continuous data were expressed as mean ± SD or median (interquartile range). The genotype distribution of the SNPs rs4644 and rs4652 (AA, AC and CC) in subjects with indeterminate form of CD was compared with that in subjects with the cardiac form of CD using the Chi-square test or the Fisher’s exact test. The percentage of myocardial fibrosis was compared between the groups with the 3 different genotypes Kruskal-Wallis test. Mann-Whitney test was used to assess differences in the median of myocardial fibrosis between subjects with and without the SNPs. The association between the cardiac form of CD and each of the genotypes (AA, AC and CC) was estimated by Odds Ratio (OR) and 95% confidence interval (CI). Cases with missing data were dropped from the analysis. Analyses were performed using SPSS version 20.0 (IBM), and p < 0.05 (two-tailed) was considered statistically significant.

Results Clinical and imaging characteristics

The study comprised 55 subjects, 42% were men, with mean age of 58 ± 9 years. The prevalence of hypertension, diabetes, hypercholesterolemia and smoking were 71, 14, 42 and 27% respectively. Regarding the clinical forms, the subjects were distributed as follows: 16 (29%) with the indeterminate form (subjects with no evidence of cardiac involvement or heart failure), 16 (29%) with the cardiac form without ventricular dysfunction and 23 (42%) with the cardiac form with ventricular dysfunction. Seventeen subjects were in NYHA (New York Heart Association) functional class III-IV (31%). The mean LVEF, measured using the biplane Simpson’s method, was 54 ± 15%, and the median percentage of myocardial fibrosis was 9.4% (2.2-17.3). Clinical and demographic characteristics of the subjects are described in Table 1.

Table 1 Subjects' clinical and demographic characteristics

	Subjects (n = 55)
Male gender	23 (41.8)
Age (years)	58 ± 9
Indeterminate form	16 (29)
Cardiac form without ventricular dysfunction	16 (29)
Cardiac form with ventricular dysfunction	23 (42)
NYHA III ou IV	17 (30.9)
Hypertension	39 (70.9)
Diabetes	8 (14.5)
Current smoking	15 (27.3)
Hypercholesterolemia	23 (41.8)
RBBB	27 (49.1)
Hemoglobin (g/dl)	14.0 ± 0.97
Creatinin (mg/dl)	0.87 ± 0.16
LVEF (%)	53.7 ± 15.4
LVESV (ml)	79.1 ± 65.4
LVEDV (ml)	177.3 ± 80.6
LVmass (g)	172.8 ± 57.3
Myocardial fibrosis (%)	9.4 (2.2-17.3)*

Data are expressed as number (percentage) for categorical variables, and as mean ± SD or median (interquartile interval) for continuous variables; NYHA: New York Heart Association CMR: RBBB: Right bundle-branch block; LVEF: Left ventricular ejection fraction; LVESV: Left ventricular end-systolic volume; LVEDV: Left ventricular end-diastolic volume; LV: Left ventricular mass.

n = 40 (delayed enhancement cardiac magnetic resonance).

Genotyping of LGALS3 SNPs

The SNPs genotype distribution is described in Table 2. There was no significant association between LGALS3genotypes (AA, AC, CC) of the SNPs rs4644 and rs4652 and the presence of the cardiac form of CD. For the SNP rs4644, the relative risk of the cardiac form was not associated with the genotype AA (OR = 0.79, 95%CI = 0.17 to 3.63, p = 0.759), AC (OR = 4.38, 95%CI = 0.87 to 22.02, p = 0.058), or CC (OR = 0.39, 95%CI = 0.11 to 1.33, p = 0.127). Similarly, for the SNP rs4652, the genotypes AA (OR = 0.64, 95%CI = 0.13 to 3.06, p = 0.571), AC (OR = 2.85, 95%CI = 0.78 to 10.40, p = 0.105), and CC (OR = 0.49, 95%CI = 0.15 to 1.58, p = 0.227) were not associated with the cardiac form of CD.

Table 2 Genotype and allele frequency of LGALS3 + 191 and LGALS3+292 in 16 subjects with the indeterminate form and 39 subjects with the cardiac form of Chagas disease

LGALS3 polymorphism	Indeterminate form (n=16)	Cardiac form (n = 39)	OR (95% CI)	p value
LGALS3 +191
AA	3 (19, 7-43)	6 (15, 7-30)	0.79 (0.17-3.63)	0.759
AC	2 (12, 4-36)	15 (38, 25-54)	4.38 (0.87-22.02)	0.058
CC	11 (69, 44-86)	18 (46, 32-61)	0.39 (0.11-1.33)	0.127
LGALS3 +292
AA	3 (19, 7-43)	5 (13, 6-27)	0.64 (0.13-3.06)	0.571
AC	4 (25, 10-50)	19 (49, 34-64)	2.85 (0.78-10.40)	0.105
CC	9 (56, 33-77)	15 (38, 25-54)	0.49 (0.15-1.58)	0.227

Data are expressed as number (percentage, 95% confidence interval).

The SNP rs4644 genotype frequencies were not statistically different between the subjects with the indeterminate form and with the cardiac form of CD. (AA [19% vs 15%, p = 0.710], AC [12% vs 38%, p = 0.106] and CC [69% vs 46%, p = 0.149]) (Figure 1). In subjects with the indeterminate form, the most frequent genotype was the CC genotype, with a significantly higher prevalence than the genotypes AA and AC (p = 0.011 and p = 0.003, respectively). In subjects with the cardiac form, two genotypes were found to be more prevalent, AC and CC, as compared with the AA genotype (p = 0.04 and p = 0.006, respectively), with no difference between the prevalence of AC and CC (p = 0.647).

Figure 1 Prevalence of the genotypes AA, AC and CC of the LGALS3 rs4644 in the indeterminate form and cardiac form of Chagas disease. The p-values using two-sided Fisher’s exact test were p = 0.710, p = 0.106 and p = 0.149, respectively. * p = 0.04, compared to AA genotype; ** p = 0.006, compared to AA genotype AA; *** p = 0.011, compared to AA genotype, and p = 0.003, compared to AC genotype

Similar results were observed for the SNP rs4652 genotype distribution between the groups (Figure 2). In subjects with the indeterminate form and subjects with the cardiac form of CD, respectively, the prevalence of the AA genotype was 19% vs 13% (p = 0.678), the prevalence of AC was 25% vs 49% (p = 0.138), and the prevalence of CC was 56% vs 38% (p = 0.249). In subjects with the indeterminate form, there was no significant difference between the three genotypes (AA vs CC, p = 0.066; AA vs AC, p = 1.00; and AC vs AA, p = 0.149). Similarly to the SNP rs4644, in subjects with the cardiac form, genotypes AC and CC were more prevalent, as compared with genotype AA (p = 0.001 and p = 0.018, respectively), with no difference between the prevalence of AC and CC (p = 0.494).

Figure 2 Prevalence of the genotypes AA, AC and CC of the LGALS3 rs4652 in the indeterminate form and cardiac form of Chagas disease. The p-values using twosided Fisher’s exact test were p = 0. 678, p = 0.138 and p = 0.249, respectively; * p = 0.018, compared to the AA genotype; ** p = 0.001, compared to the AA genotype Myocardial fibrosis

There was no statistically significant difference in the median percentage of myocardial fibrosis between subjects with and without the presence of any of the SNPs rs4644 and rs4652 genotypes (Table 3).

Table 3 Median percentage of myocardial fibrosis in subjects with and without galectin-3 SNPs by genotype

	Without the SNP	With the SNP	p value
rs4644 AA	4.3 (0.0-14.4)	1.6 (0.0-4.7)	0.261
rs4644 AC	4.4 (0.0-9.8)	1.6 (0.0-19.2)	0.969
rs4644 CC	1.6 (0.0-15.0)	5.2 (0.2-18.5)	0.441
rs4652 AA	4.3 (0.0-14.0)	2.0 (0.3-10.6)	0.743
rs4652 AC	4.4 (0.0-10.0)	1.7 (0.0-15.1)	0.862
rs4652 CC	1.9 (0.0-14.1)	4.8 (0.0-10.0)	0.681

SNP: Single nucleotide polymorphism; Data are expressed as median (interquartile interval); p-values of Mann-Whitney U test.

The median percentage of myocardial fibrosis was not statistically different between the AA, AC and CC genotypes (p = 0.508), or between SNP rs4644 and SNP rs4652 (p = 0.903 (Figure 3).

Figure 3 Percentage of myocardial fibrosis in subjects with the AA, AC and CC genotypes of the LGALS3 rs4644 (A) and rs4652 (B), p = 0.508 and p = 0.903, respectively. Discussion

This study evaluated the association between genetic variants of the LGALS3 gene, encoding for galectin-3, and disease severity in subjects with CD. Since galectin-3 has been previously found to be highly correlated with fibrosis, we also evaluated the association of the three genotypes of the SNPs rs4644 and rs4652 with myocardial fibrosis. We found no significant difference in the prevalence of any of the genotypes between the subjects with the indeterminate form and the cardiac form of the disease. Also, there was no difference in the median of myocardial fibrosis between subjects with the AA, AC and CC genotypes of the SNPs in question.

The genetic predisposition to galectin-3 polymorphism has been previously associated with rheumatoid arthritis, another inflammatory disease. Hu et al15 described an association between this rheumatic disease and the LGALS3 +292C allele. Although we have shown that the LGALS3 +191C and LGALS3 + 292C allele carriage was relatively high in subjects with the cardiac form of CD, the CC genotype, at least for the SNP rs4644, was relatively more frequent among subjects with the indeterminate form. Thus, we could not confirm the possible role of the presence of CC genotype or AA genotype for both SNPs as a protective or a risk factor for developing the cardiac form of CD. Similarly, no relationship between the genetic polymorphisms in the gene encoding galectin-3 and the median of myocardial fibrosis was observed.

Conclusion

Studies at the levels of genes and proteins contribute to the understanding of the role of genetic variants in the etiology of diseases, as well as to elucidate their potential as therapeutic targets, risk predictors and prognostic markers. Our findings did not lead to a significant conclusion on the role of galectin-3 polymorphism in the development of the cardiac form of CD. In addition, further studies with long-term follow up are necessary to evaluate whether other genetic variants play a role in inflammation and fibrosis in the indeterminate form of CD, to identify possible variants associated with disease progression in CD.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESB.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Acknowledgments

The authors thank Dr. Kyan James Allahdadi, PhD, for carefully reviewing the manuscript.

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Avaliação do Polimorfismo da Galectina-3 em Indivíduos com Doença de Chagas Crônica

Cruz

Gabriela da Silva

1 Angelo

Ana Luiza Dias

1 Larocca

Ticiana Ferreira

1 2 3 Macedo

Carolina Thé

1 2 3 Noya-Rabelo

Márcia

2 Correia

Luís Claudio Lemos

2 Torreão

Jorge Andion

2 Souza

Bruno Solano de Freitas

1 3 Santos

Ricardo Ribeiro dos

1 3 Soares

Milena Botelho Pereira

1 3

1 Hospital São Rafael Centro de Biotecnologia e Terapia Celular

Salvador

Brasil Centro de Biotecnologia e Terapia Celular – Hospital São Rafael, Salvador, BA - Brasil 2 Hospital São Rafael Departamento de Cardiologia

Salvador

Brasil Departamento de Cardiologia - Hospital São Rafael, Salvador, BA - Brasil 3 FIOCRUZ Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz

Salvador

Brasil Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz - FIOCRUZ, Salvador, BA - Brasil Fundação Oswaldo Cruz

Correspondência: Ticiana Ferreira Larocca, Av. São Rafael, 2152. CEP 41253-190. São Marcos, Salvador, BA - Brasil. Email: ticiana@cbtc-hsr.org

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Cruz GS, Angelo ALD, Souza BSF, Santos RR, Soares MBP; Obtenção de dados: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Macedo CT, Noya- Rabelo M, Torreão JÁ; Análise e interpretação dos dados: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Macedo CT, Noya- Rabelo M, Correia LCL, Torreão JA, Souza BSF, Soares MBP; Análise estatística: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Noya- Rabelo M, Correia LCL; Obtenção de financiamento: Santos RR, Soares MBP; Redação do manuscrito: Cruz GS, Larocca TF, Souza BSF; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Cruz GS, Angelo ALD, Larocca TF, Macedo CT, Noya- Rabelo M, Correia LCL, Souza BSF, Santos RR, Soares MBP.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Resumo Fundamento:

A galectina-3, uma lectina de ligação à β-galactosidase, foi descrita como um mediador de fibrose cardíaca em estudos experimentais e um fator de risco associado com eventos cardiovasculares em indivíduos com insuficiência cardíaca. Estudos prévios avaliaram a susceptibilidade genética para doença de Chagas em humanos, incluindo polimorfismos dos genes de citocinas, demonstrando correlações entre o polimorfismo genético e o desenvolvimento de cardiomiopatia na fase crônica. No entanto, a relação entre polimorfismos de nucleotídeo único (single nucleotide polymorphism, SNP) e variações fenotípicas na doença de Chagas ainda não foi avaliada.

Objetivo:

O presente estudo teve como objetivo determinar se os polimorfismos genéticos da galectina-3 podem predispor ao desenvolvimento de formas cardíacas da doença de Chagas.

Métodos:

Cinquenta e cinco indivíduos com doença de Chagas foram incluídos neste estudo observacional. A genotipagem das variantes rs4644 e rs4652 do gene da galectina-3 foi realizada por PCR (reação em cadeia de polimerase).

Resultados:

Para o SNP rs4644, não houve associação entre o risco relativo para a forma cardíaca e os genótipos AA (OR = 0,79, p = 0,759), AC (OR = 4,38, p = 0,058), ou CC (OR = 0,39, p = 0,127). Similarmente, para o SNP rs4652, não foi encontrada associação entre os genótipos AA (OR = 0,64, p = 0,571), AC (OR = 2,85, p = 0,105), ou CC (OR = 0,49, p = 0,227) e a forma cardíaca da doença.

Conclusão:

Nossos resultados não mostraram associação entre os diferentes genótipos para ambos SNPs do gene da galectina-3 e a forma cardíaca da doença de Chagas. (Arq Bras Cardiol. 2015; [online].ahead print, PP.0-0)

Palavras-chave: Doença de Chagas Galectina 3 Insuficiência Cardíaca Polimorfismo Genético Cardiomiopatia Chagásica

Introdução

A Doença de Chagas (DC), causada por um parasita intracelular Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública na América Latina e afeta milhões de pessoas em todo o mundo1. Cerca de 30% dos pacientes apresentam miocardiopatia crônica, a qual é a forma mais grave da DC, associada a um pior prognóstico entre as insuficiências cardíacas2. Uma vez que não existe tratamento efetivo nesse estágio da doença, é fundamental a identificação de biomarcadores que possam ser utilizados na detecção precoce de doença cardíaca e na estratificação prognóstica.

Estudos prévios avaliaram a susceptibilidade genética à DC em humanos. Polimorfismos de moléculas envolvidas no dano ao hospedeiro, induzidas pelo parasita, foram determinados em indivíduos com a doença, tais como IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α, e IFN-γ, demonstrando a associação entre polimorfismo genético e o desenvolvimento de miocardiopatia na fase crônica da DC3^-8.

Recentemente, nosso grupo demonstrou a superexpressão do gene de galectina-3 no coração de animais cronicamente infectados com Trypanosoma cruzi9^,10. A galectina-3 é um membro da família galectina que se liga a β-galactosidases e é produzida por macrófagos e fibroblastos ativados11. Estudos experimentais demonstraram que a galectina-3 é um mediador de fibrose cardíaca11^,12, e está relacionada a eventos cardiovasculares e à gravidade da insuficiência cardíaca13^,14.

Estudos prévios demonstraram que variantes genéticas em dois sítios de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) do gene da galectina-3 (rs4644 e rs4652, correspondendo a LGALS3 +191 A>C e LGALS3 +292 A>C, respectivamente) são capazes de alterar os níveis da proteína15. A galectina-3 exerce um importante papel no processo de inflamação e fibrose, e a relação entre SNPs no gene que codifica a galectina-3 e variações fenotípicas na DC não foi avaliada. Nossa hipótese era a de que SNPs no gene que codifica a galectina-3 podem influenciar o desenvolvimento de formas cardíacas da DC. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a correlação de polimorfismos genéticos da galectina-3 e a gravidade da forma cardíaca da DC.

Métodos População do estudo

Um estudo retrospectivo observacional foi realizado entre janeiro de 2011 a dezembro de 2013. Uma amostra de conveniência de 55 indivíduos atendidos no ambulatório de doença de Chagas do Hospital São Rafael foi estudada.

Os critérios de inclusão foram: DC confirmada microbiologicamente por dois testes sorológicos (hemaglutinação indireta e imunofluorescência indireta), e idade entre 18 a 70 anos. Os critérios de exclusão foram: história de infarto do miocárdio ou de doença arterial coronariana, doença primária das valvas cardíacas, hemodiálise por falência renal crônica, doença hepática ativa, doenças hematológicas, neoplásicas ou ósseas, e contraindicações para realização de exame de ressonância magnética (RM). O estudo estava de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética. Todos os indivíduos assinaram um termo de consentimento antes de serem incluídos no estudo. Uma história médica estruturada de todos os voluntários foi obtida, e todos se submeteram a exame físico, análise de sangue, eletrocardiograma de 12 derivações, radiografia de tórax, monitoramento (24 h) com Holter, ecocardiograma com Doppler convencional, e ressonância magnética cardíaca.

Genotipagem do polimorfismo de nucleotídeo único do gene da galectina-3

Amostras do DNA genômico foram obtidas de células mononucleares de sangue periférico. A extração do DNA foi realizada utilizando-se o kit comercial QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), seguindo‑se as especificações do fabricante. As amostras foram armazenadas em freezer a -20 ºC. A genotipagem dos SNPs rs4644 e rs4652 do gene da galectina-3 foi realizada por PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real com o sistema TaqMan® (Life Technologies, Carlsbad, USA), e os SNPs foram amplificados usando o protocolo do sistema TaqMan® Universal PCR (Life Technologies). Os genótipos de cada SNP foram determinados pelo programa Sequence Detection System, versão 1.3.1 (Life Technologies). Os primers e as sondas para identificação dos SNPs foram obtidos de uma mesma empresa.

Ecocardiograma com Doppler

O ecocardiograma transtorácico foi realizado utilizando‑se o sistema de ultrassom digital Vivid 7 (GE Vingmed Ultrasound AS, Horten, Norway). Três ciclos cardíacos foram registrados e armazenados digitalmente para posterior análise. Medidas do ventrículo esquerdo (VE) e do ventrículo direito (VD) foram obtidas de acordo com as recomendações da Sociedade Americana de Ecocardiografia (American Society of Echocardiography)16. A fração de ejeção do VE (FEVE) foi calculada pelo método de Simpson biplano.

Ressonância magnética cardíaca

A ressonância magnética cardíaca foi realizada utilizando‑se o sistema Sigma HDx 1.5-T (General Electric; Fairfield, CT, EUA). Para avaliação da função do ventrículo esquerdo, foram adquiridas imagens sincronizadas ao eletrocardiograma, em apneia expiratória, nos planos eixo curto, eixo longo e quatro câmaras, em sequências diferentes. Os parâmetros de aquisição aplicados para a sequência dinâmica foram: tempo de repetição (TR) de 3,5 ms, tempo de eco (TE) de 1,5 ms, ângulo de inclinação (flip angle) de 60°, largura de banda de 125 kHz, campo de visão de 35 x 35 cm, matriz de 256 x 148, resolução temporal (RT) de 35 ms, e espessura de corte de 8,0 mm, sem intervalo entre os cortes. Imagens por técnica de realce tardio foram adquiridas a cada batimento cardíaco, 10 a 20 minutos após a administração de um contraste a base de gadolínio (0,1 mmol/kg), utilizando TR de 7,1 ms, TE de 3,1 ms, ângulo de inclinação de 20°, primeira fase do ciclo cardíaco, número de linhas por seguimento de 16/32, tamanho da matriz 256 x 192, espessura de corte de 8,0 mm, intervalo entre os cortes de 2 mm, campo de visão de 32 a 38 cm, tempo de inversão de 150 a 300 ms, largura de banda de 31,25 kHz, 2 NEX (número de excitações). A técnica de realce tardio foi usada para investigar a presença de fibrose miocárdica, a qual foi estimada por um método visual quantitativo.

Análise estatística

Os dados categóricos foram expressos em números (porcentagens, intervalo de confiança de 95%), e os dados contínuos foram expressos como média ± DP ou mediana e intervalo interquartil. A distribuição dos genótipos dos SNPs rs4644 e rs4652 (AA, AC e CC) nos indivíduos com a forma indeterminada da DC foi comparada com a distribuição nos indivíduos com a forma cardíaca da DC usando o teste de chi-quadrado ou o teste exato de Fisher. O percentual de fibrose miocárdica foi comparado entre os grupos com os 3 genótipos diferentes utilizando o teste de Kruskal-Wallis. Quando comparados separadamente os genótipos, analisando a mediana de fibrose miocárdica entre indivíduos com e sem a presence do SNP, foi utilizado o teste de Mann-Whitney. A associação entre a forma cardíaca da DC e cada um dos genótipos (AA, AC e CC) foi estimada pela razão de chances (odds ratio) e intervalo de confiança de 95%. Os casos com dados faltantes não foram incluídos na análise. As análises foram realizadas utilizando o programa SPSS, versão 20.0 (IBM), e valores de p inferiores a 0,05 (teste bicaudal) foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados Características clínicas e de imagem

O estudo envolveu 55 indivíduos, 42% homens, com idade média de 58 ± 9 anos. A prevalência de hipertensão, diabetes, hipercolesterolemia e tabagismo foi de 71, 14, 42 e 27%, respectivamente. Os indivíduos foram distribuídos quanto às formas clínicas em: 16 (29%) com a forma indeterminada (sem evidência de envolvimento cardíaco ou insuficiência cardíaca), 16 (29%) com a forma cardíaca sem disfunção ventricular, e 23 (42%) com a forma cardíaca com disfunção ventricular. Segundo a classificação da NYHA (New York Heart Association), 17 indivíduos encontravam‑se na classe funcional III-IV (31%). A FEVE, calculada pelo método de Simpson biplano, foi de 54 ± 15%, e a mediana do percentual de fibrose miocárdica foi de 9,4% (2,2- 17,3). Características demográficas e clínicas dos indivíduos encontram-se descritas na Tabela 1.

Tabela 1 Características clínicas e demográficas dos participantes

	Indivíduos (n = 55)
Sexo masculino	23 (41,8)
Idade (anos)	58 ± 9
Forma indeterminada	16 (29)
Forma cardíaca sem disfunção ventricular	16 (29)
Forma cardíaca com disfunção ventricular	23 (42)
NYHA III ou IV	17 (30,9)
Hipertensão	39 (70,9)
Diabetes	8 (14,5)
Tabagismo	15 (27,3)
Hipercolesterolemia	23 (41,8)
BRD	27 (49,1)
Hemoglobina (g/dL)	14,0 ± 0,97
Creatinina (mg/dL)	0,87 ± 0,16
FEVE (%)	53,7 ± 15,4
VSFVE (ml)	79,1 ± 65,4
VDFVE (ml)	177,3 ± 80,6
Massa do VE (g)	172,8 ± 57,3
Myocardial fibrosis (%)	9,4 (2,2-17,3)*

Dados expressos como número (percentual) para variáveis categóricas, e como média ± DP ou mediana (intervalo interquartile) para variáveis contínuas; NYHA: New York Heart Association; BRD: Bloqueio do ramo direito do feixe de His; FEVE: Fração de ejeção do ventrículo esquerdo; VSFVE: Volume sistólico final do ventrículo esquerdo; VDFVE: Volume diastólico final do ventrículo esquerdo; VE: Ventrículo esquerdo;

n = 40 (ressonância magnética cardíaca pela técnica do realce tardio).

Genotipagem dos SNPs do gene LGALS3

A distribuição dos genótipos dos SNPs encontra-se na Tabela 2. Não houve associação significativa entre os genótipos do gene LGALS3 (AA, AC, CC) dos SNPs rs4644 e rs4652 e a presença da forma cardíaca da DC. Para o SNP rs4644, o risco relativo da forma cardíaca não foi associado com o genótipo AA (OR = 0,79, IC 95% = 0,17 – 3,63, p = 0,759), AC (OR = 4,38, IC 95% = 0,87 – 22,02, p = 0,058), ou CC (OR = 0,39, IC 95% = 0,11 – 1,33, p = 0,127). Similarmente, para o SNP rs4652, o genótipo AA (OR = 0,64, IC 95% = 0,13 – 3,06, p = 0,571), AC (OR = 2,85, IC 95% = 0,78 – 10,40, p = 0,105), e CC (OR = 0,49, IC 95% = 0,15 – 1,58, p = 0,227) não se associaram com a forma cardíaca da DC.

Tabela 2 Frequência dos genotipos e dos alelos dos genes LGALS3 + 191 e LGALS3+292 em 16 indivíduos com a forma indeterminada e 39 indivíduos com a forma cardíaca da doença de Chagas

Polimorfismo do gene LGALS3	Forma indeterminada (n=16)	Forma cardíaca (n = 39)	OR (IC 95%)	Valor de p
LGALS3 +191
AA	3 (19, 7-43)	6 (15, 7-30)	0,79 (0,17-3,63)	0,759
AC	2 (12, 4-36)	15 (38, 25-54)	4,38 (0,87-22,02)	0,058
CC	11 (69, 44-86)	18 (46, 32-61)	0,39 (0,11-1,33)	0,127
LGALS3 +292
AA	3 (19, 7-43)	5 (13, 6-27)	0.64 (0,13-3,06)	0,571
AC	4 (25, 10-50)	19 (49, 34-64)	2,85 (0,78-10,40)	0,105
CC	9 (56, 33-77)	15 (38, 25-54)	0,49 (0,15-1,58)	0,227

Dados expressos em números (porcentagem, intervalo de confiança de 95%).

As frequências dos genótipos do SNP rs4644 não foram estatisticamente diferentes entre os indivíduos com a forma indeterminada e aqueles com a forma cardíaca da DC [AA (19%vs15%, p = 0,710), AC (12% vs 38%, p = 0,106) e CC (69% vs 46%, p = 0,149)] (Figura 1). Nos indivíduos com a forma indeterminada, o genótipo mais frequente foi o genótipo CC, com prevalência significativamente maior que os genótipos AA e AC (p = 0,011 e p = 0,003, respectivamente). Em indivíduos com a forma cardíaca, dois genótipos foram mais prevalentes, AC e CC, em comparação ao genótipo AA, sem diferença significativa entre a prevalência de AC e CC (p = 0,647).

Figure 1 Prevalência dos genótipos AA, AC e CC do LGALS3 rs4644 na forma indeterminada e na forma cardíaca da Doença de Chagas. Os valores de p usando o teste exato de Fisher (bilateral) foram p = 0,710, p = 0,106 e p = 0,149 respectivamente. * p = 0,04 em comparação ao genótipo AA; ** p = 0,006 em comparação ao genótipo AA; *** p = 0,011 em comparação ao genótipo AA; e p = 0,003 em comparação ao genótipo AC.

Resultados semelhantes foram observados para a distribuição dos genótipos para SNP rs4652 entre os grupos (Figura 2). Nos indivíduos com a forma indeterminada e naqueles com a forma cardíaca da DC, respectivamente, a prevalência do genótipo AA foi de 19% vs 13% (p = 0,678), de AC foi de 25% vs 49% (p = 0,138), e a prevalência de CC foi de 56% vs 38% (p = 0,249). Nos indivíduos com a forma indeterminada, não houve uma diferença significativa entre os três genótipos (AA vs CC, p = 0,066; AA vs AC, p = 1,00; e AC vs AA, p = 0,149). Similarmente ao SNP rs4644, nos indivíduos com a forma cardíaca, os genótipos AC e CC foram mais prevalentes quando comparados ao genótipo AA (p = 0,001 e = 0,018, respectivamente), sem diferença significativa entre a prevalência de AC e CC (p = 0,494).

Figure 2 Prevalência dos genótipos AA, AC e CC do LGALS3 rs4652 na forma indeterminada e na forma cardíaca da doença de Chagas. Os valores de p usando o teste exato de Fisher (bilateral) foram p = 0,678, p = 0,138 e p = 0,249 respectivamente. * p = 0,018 em comparação ao genótipo AA. ** p = 0,001 em comparação ao genótipo AA. Fibrose miocárdica

Não houve diferença estatisticamente significativa na mediana de fibrose miocárdica entre indivíduos com e sem a presença de qualquer um dos genótipos dos SNPs rs4644 e rs4652 (Tabela 3).

Tabela 3 Mediana do percentual de fibrose miocárdica em indivíduos com ou sem polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) por genótipo

	Sem SNP	Com SNP	Valor de p
rs4644 AA	4,3 (0,0-14,4)	1,6 (0,0-4,7)	0,261
rs4644 AC	4,4 (0,0-9,8)	1,6 (0,0-19,2)	0,969
rs4644 CC	1,6 (0,0-15,0)	5,2 (0,2-18,5)	0,441
rs4652 AA	4,3 (0,0-14,0)	2,0 (0,3-10,6)	0,743
rs4652 AC	4,4 (0,0-10,0)	1,7 (0,0-15,1)	0,862
rs4652 CC	1,9 (0,0-14,1)	4,8 (0,0-10,0)	0,681

SNP: Polimorfismos de nucleotídeo único (single nucleotide polymorphism); dados expressos em mediana (intervalo interquartil); valores de p derivados do teste de Mann-Whitney.

A mediana do percentual de fibrose miocárdica também não foi estatisticamente diferente entre os genótipos AA, AC e CC dos SNPs rs4644 (p = 0,508) e rs4652 (p = 0,903, Figura 3).

Figure 3 Frequência de fibrose miocárdica em indivíduos com os genótipos AA, AC e CC de rs4644 (A) e rs4652 (B) do gene LGALS3 p = 0,508 e p = 0,903, respectivamente Discussão

O presente estudo avaliou a associação entre as variantes genéticas do gene LGALS3, que codifica a galectina-3, e a gravidade da doença em indivíduos com DC. Uma vez que a galectina-3 foi previamente correlacionada com fibrose, também avaliamos a associação dos três genótipos dos SNPs rs4644 e rs4652 com fibrose miocárdica. Nós não encontramos diferença significativa na prevalência de qualquer dos genótipos entre os indivíduos com a forma indeterminada e a forma cardíaca da doença. Além disso, não houve diferença na mediana de fibrose miocárdica entre os indivíduos com os genótipos AA, AC e CC dos SNPs em questão.

A predisposição genética para o polimorfismo da galectina-3 já foi associada com artrite reumatoide, outra doença inflamatória. Hu e cols.15 descreveram a associação entre essa doença reumática e o alelo LGALS3 +292C. Apesar de termos demonstrado que a frequência de LGALS3 +191C e LGALS3 + 292C foi relativamente maior nos indivíduos com a forma cardíaca da DC, o genótipo CC, pelo menos para SNP rs4644, foi relativamente mais frequente entre os indivíduos com a forma indeterminada. Assim, nós não confirmamos o possível papel da presença do genótipo CC ou do genótipo AA para ambos SNPs como um fator protetor ou de risco para o desenvolvimento da forma cardíaca da DC. Similarmente, não foi observada relação entre os polimorfismos genéticos no gene que codifica a galectina-3 e a frequência de fibrose miocárdica.

Conclusão

Estudos a níveis de genes e proteínas contribuem para o entendimento sobre o papel de variantes genéticas na etiologia das doenças, bem como seu potencial papel como alvos terapêuticos, preditores de risco e marcadores prognósticos.

Os nossos resultados não conduziram a uma conclusão significativa sobre o papel do polimorfismo da galectina-3 no desenvolvimento da forma cardíaca da DC. Estudos adicionais com longo seguimento são necessários para avaliar se outras variantes genéticas desempenham um papel na inflamação e fibrose na forma indeterminada da DC, para identificar possíveis variantes associadas com a progressão da doença.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPESB.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós‑graduação.

Agradecimentos

Os autores agradecem o Dr. Kyan James Allahdadi pela revisão cuidadosa do artigo.