Abstract

Arq Bras Cardiol

abc

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

0066-782X 1678-4170

Sociedade Brasileira de Cardiologia

yV3GMMrjk5mt5gmczt6BFZd

S0066-782X2015002400457

S0066-782X2015005050109

10.5935/abc.20150109

Original Articles

Human Tissue Kallikrein Activity in Angiographically Documented Chronic Stable Coronary Artery Disease

Figueiredo

Estêvão Lanna

1 Magalhães

Carolina Antunes

2 Belli

Karlyse Claudino

3 4 Mandil

Ari

5 Garcia

José Carlos Faria

5 Araújo

Rosanã Aparecida

5 Figueiredo

Amintas Fabiano de Souza

2 Pellanda

Lucia Campos

6 7

1 Hospital Lifecenter Departamento de Cardiologia

Belo Horizonte

Brazil Departamento de Cardiologia – Hospital Lifecenter, Belo Horizonte, MG 2 Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Farmácia Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas

Belo Horizonte

Brazil Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas – Faculdade de Farmácia – Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, MG Universidade Federal de Minas Gerais 3 Hospital de Clínicas de Porto Alegre Laboratório de Pesquisa de Patofisiologia do Exercício Divisão de Cardiologia

Porto Alegre

Brazil Laboratório de Pesquisa de Patofisiologia do Exercício – Divisão de Cardiologia – Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS 4 Duke University Research on Research Network Team

North Carolina

USA Research on Research Network Team – Duke University, North Carolina, USA Duke University 5 Hospital Lifecenter Departamento de Hemodinâmica

Belo Horizonte

Brazil Departamento de Hemodinâmica – Hospital Lifecenter, Belo Horizonte, MG 6 Fundação Universitária de Cardiologia Programa de Pós-Graduação em Cardiologia

Porto Alegre

Brazil Programa de Pós-Graduação em Cardiologia – Fundação Universitária de Cardiologia (PPGFUC/RS), Porto Alegre, RS 7 Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

Porto Alegre

Brazil Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), Porto Alegre, RS – Brazil Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

Mailing Address: Estevão Lanna Figueiredo, Rua Dias Adorno, 39 / 1703 – Santo Agostinho. Postal Code 30190-100, Belo Horizonte, MG – Brazil. E-mail: estevao@cardiol.br, estevaolanna1@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Figueiredo EL, Figueiredo AFS; Acquisition of data: Figueiredo EL, Magalhães CA, Figueiredo AFS, Mandil A, Garcia JCF; Analysis and interpretation of the data and Statistical analysis: Figueiredo EL, Magalhães CA, Figueiredo AFS, Pellanda LC, Belli KC; Obtaining financing: Figueiredo AFS; Writing of the manuscript and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Figueiredo EL, Figueiredo AFS, Pellanda LC, Belli KC; Patients selection: Araújo RA.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

04 09 2015

11 2015

105 5 457 565 29 12 2014 14 05 2015 15 05 2015

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract Background:

Human tissue kallikrein (hK1) is a key enzyme in the kallikrein–kinin system (KKS). hK1-specific amidase activity is reduced in urine samples from hypertensive and heart failure (HF) patients. The pathophysiologic role of hK1 in coronary artery disease (CAD) remains unclear.

Objective:

To evaluate hK1-specific amidase activity in the urine of CAD patients

Methods:

Sixty-five individuals (18–75 years) who underwent cardiac catheterism (CATH) were included. Random midstream urine samples were collected immediately before CATH. Patients were classified in two groups according to the presence of coronary lesions: CAD (43 patients) and non-CAD (22 patients). hK1 amidase activity was estimated using the chromogenic substrate D-Val-Leu-Arg-Nan. Creatinine was determined using Jaffé’s method. Urinary hK1-specific amidase activity was expressed as µM/(min · mg creatinine) to correct for differences in urine flow rates.

Results:

Urinary hK1-specific amidase activity levels were similar between CAD [0.146 µM/(min ·mg creatinine)] and non-CAD [0.189 µM/(min . mg creatinine)] patients (p = 0.803) and remained similar to values previously reported for hypertensive patients [0.210 µM/(min . mg creatinine)] and HF patients [0.104 µM/(min . mg creatinine)]. CAD severity and hypertension were not observed to significantly affect urinary hK1-specific amidase activity.

Conclusion:

CAD patients had low levels of urinary hK1-specific amidase activity, suggesting that renal KKS activity may be reduced in patients with this disease.

Keywords: Human Tissue Kallikrein Tissue Kallikrein Kallikrein-Kinin System Coronary Artery Disease

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

CDS 923/98

Introduction

Coronary artery disease (CAD) caused approximately 1 out of every 6 deaths in the United States in 2007 1. An estimated 16,300,000 Americans have CAD, of which one of the most prevalent risk factors (RFs) is hypertension1. Blood pressure exhibits an inverse relationship with urinary or renal human tissue kallikrein (hK1) activity levels in primary hypertensive patients2^-4. In addition, urinary hK1 levels are significantly reduced in heart failure (HF) patients 5^-7.

Kallikreins (EC 3.4.21.8) comprise a subgroup of the serine protease family and are known to have several physiological functions, including the control of blood pressure, coronary artery perfusion, electrolyte balance, inflammation, and other diverse physiological processes2^,7^-9. Our group has demonstrated that urinary hK1-specific amidase activity is significantly reduced in hypertension and HF patients3^,6.

Hypertension is a RF for both CAD and HF, and HF is the final outcome of untreated hypertension and CAD. However, urinary hK1 levels and their association with the severity of angiographically determined stable CAD remains unknown. The aim of the present study was to evaluate hK1-specific amidase activity in the urine of established or suspected CAD patients.

Methods

We conducted a cross-sectional study from January 2008 to January 2010. Sixty-five individuals were enrolled in the study regardless of gender and race. Random midstream urine samples were collected in the Catheterism Laboratory at the Lifecenter Hospital immediately before cardiac catheterism (CATH) for known or suspected CAD.

This study was approved by the Ethical Research Committees of both the Lifecenter Hospital in Belo Horizonte and the Federal University of Minas Gerais, as well as the National Commission for Ethics in Research. All patients read the protocol, had their queries satisfactorily replied, and provided written informed consent.

Urine samples were transferred to the Clinical Enzymology Laboratory of the Clinical Chemistry Department, Pharmacy School, Federal University of Minas Gerais, and were visually and chemically examined using a dipstick test (Urofita 10U bioBRÁS Diagnósticos, Biobrás S.A., Belo Horizonte, MG, Brazil). All urine samples were negative for all evaluated chemical compounds (e.g., bilirubin, blood, glucose, ketone bodies, nitrites, protein, urobilinogen).

Traditional RFs for CAD were identified through standard interviews conducted directly by physicians, as well as by nurse and pharmacist participating in the study. CATH exams were conducted by interventional cardiologists certified by the Brazilian Society of Interventional Cardiology, and were registered in the hospital records. Patients underwent a thorough clinical interview and physical examination. All symptoms and signs were analyzed, as well as patients’ personal histories and the use and types of cardiovascular or non-cardiovascular medications. All subjects were studied as outpatients.

Inclusion and exclusion criteria

Patients of any gender and race were eligible for inclusion in the study if they were older than 18 years and younger than 75 years, had known or suspected CAD, and provided consent. Suspected CAD was defined by the medical history, physical examination, electrocardiogram, abnormalities in other imaging exams (e.g., exercise test, echocardiogram, and myocardial scintigraphy). The criteria for patient exclusion were non-agreement for study participation, recent history of acute coronary syndrome (< 3 months), serum creatinine level ≥ 1.5 mg/dL or 133 µmol/L for men and ≥ 1.4 mg/dL or 124µmol/L for women, history of severe allergy to ionic contrast agents, or presence of blood or nitrite in the urine.

Presence and severity of CAD

Patients were classified according to the presence or absence of CAD. Diagnostic coronary angiograms were performed under local anesthesia (90% femoral approach and 10% radial) with non-ionic contrast agent and were classified by either of the two examiners through a visual analysis of stenosis as mild (< 40%), moderate (40-70%), and severe (70-100%); flow was classified according to the Thrombolysis In Myocardial Infarction Group criteria10. Questionable cases were reviewed by both examiners, sometimes with the aid of quantitative coronary angiography (Axiom Artis, Siemens, Munich, Germany), and/or were referred for intravascular ultrasonography (IVUS; I-LAB Boston Scientific, Natick, MA, USA). Both examiners were blinded to the hK1-specific amidase activity results.

hK1 amidase activity

hK1 amidase activity was evaluated using the chromogenic substrate D-Val-Leu-Arg-Nan (Chromogenix AB, Italy)11. Substrate hydrolysis was assayed spectrophotometrically at 410 nm to monitor the release of 4-nitroaniline (4-Nan) [ε₄₁₀= 8800/(M · cm)], as previously described12. The assay was performed as previously described6. Specifically, 5 incubation mixtures, identified by capital letters A, B, C, D, and E, contained the following: A, 500 µL of urine and 100 µL of 200 mM glycine-NaOH buffer, pH 9.0 containing 0.05% (w/v) NaN₃ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA); B, 500 µL of urine and 100 µL of a 1000 KIU/mL Trasylol^® solution (strong kallikrein inhibitor also known as aprotinin, bovine pancreatic trypsin inhibitor-BPTI, or Kunitz pancreatic trypsin inhibitor)11; C, 500 µL of urine and 100 µL of a 1 mg/mL SBTI (Sigma) solution (strong serine proteinase and plasma kallikrein inhibitor that is not, however, an hK1 inhibitor)6 in 200 mM of glycine-NaOH buffer, pH 9.0; D, 500 µL of urine and 100µL of 200 mM glycine-NaOH buffer, pH 9.0; and E, 600 µL of 200 mM glycine-NaOH buffer, pH 9.0. The mixtures were preincubated at 37ºC for 10 minutes for temperature equilibration. Next, 400 µL of a 160 µM D-Val-Leu-Arg-Nan substrate solution in 200 mM glycine-NaOH buffer, pH 9.0, were added to the A, B, C, and E mixtures; 400 µL of 200 mM glycine-NaOH buffer, pH 9.0, was added to the D mixture instead of substrate solution. The mixtures were again incubated at 37ºC for 30 minutes, and the reactions were stopped by the addition of 100 µL of 60% (v/v) acetic acid per mixture.

The mixtures were incubated in quadruplicate. Enzymatic hydrolysis was monitored by measuring the absorbance at 410 nm of the released 4-Nan using a Shimadzu UV 160 A UV-Vis recording spectrophotometer (2-nm spectral band width). The reference cell contained 1000 µL of glycine-NaOH buffer, pH 9.0, and 100 µL of acetic acid solution. The total substrate concentration was determined from the amount of 4-Nan released after complete hydrolysis by an excess of bovine β-trypsin (kindly provided by Dr. Marcelo Matos Santoro, Departamento de Bioquímica e Imunologia, ICB, UFMG, Belo Horizonte, MG, Brazil). The ΔA₄₁₀values were calculated and transformed into reaction rates (v) and expressed as µM/(min · mL urine). The reaction rates were linear up to 60 minutes.

In all evaluated urine samples, the enzymatic activity was completely inhibited by Trasylol^® (incubation mixture B); no inhibition was observed in the presence of SBTI (incubation mixture C), indicating only the presence of the enzyme hK1.

hK1-specific amidase activity was calculated by dividing the reaction rate (v) by the creatinine concentration (mg/mL urine). The result was expressed as µM/(min · mg creatinine) to correct for differences in the urine flow rate13.

Creatinine determination

Creatinine was determined spectrophotometrically using a kit of reagents based on Jaffe’s reaction (Bioclin/Quibasa Química Básica Ltda, Belo Horizonte, MG, Brazil) and expressed as mg/mL urine, as described in our previous reports3^,6^,13. These assays were also performed in quadruplicate.

Confounders

Information about patients’ medication use was obtained through interviews. Drugs were classified into 2 groups: angiotensin converting enzyme inhibitors (ACEI)/angiotensin receptor blockers (ARB) and all other medications. Blood pressure was measured in all patients while at rest and in a sitting position prior to the CATH procedure; this information was classified in the interview according to the international guidelines14^-16.

Statistical analysis

Data were analyzed using Minitab software for Windows, version 15.0, and are expressed as medians because of the irregular distributions of the investigated variables. Differences between groups and the effects of medications on hK1-specific amidase activity in CAD were evaluated using the non-parametric Mann-Whitney test, as the studied population exhibited a non-Gaussian distribution with non-homogeneous variances. Differences between CAD severity subgroups were compared using the non-parametric Kruskal-Wallis test. The frequencies of both genders and the presence or absence of hypertension, angina pectoris, dyspnea, stroke, and diabetes mellitus were compared using the Chi-square test. The presence or absence of gout and hypothyroidism were compared using Fisher’s test. A pvalue < 0.05 was considered statistically significant.

The sample size was calculated based on values determined during our previous studies [difference between groups: HF patients, 0.104 µM/(min · mg creatinine) and controls, 0.260 µM/(min · mg creatinine)] with a standard deviation of 0.23; an estimated 35 patients were needed for each group at a significance level of 0.95 and power of 0.8.

This study was developed within the Research and Innovation Coaching Program, a partnership between the Brazilian Society of Cardiology and the Duke University Research on Research group (USA)17.

Results

From January 2008 to January 2010, 4254 CATHs were performed at Lifecenter Hospital; of these, 65 treated patients were included in this study (Figure 1). Patients were classified into 2 groups according to the presence of coronary lesions: CAD (43 patients), and non-CAD (22 patients). The subgroups were similar with respect to gender and the presence or absence of hypertension. Although CAD patients were significantly older than non-CAD patients, patients with and without hypertension did not differ in terms of age. Among the 43 CAD patients, 36 were hypertensive (Table 1). Among the 22 non-CAD patients, 19 were hypertensive (Table 1).

Figure 1 Flowchart of eligible and included patients in the present study. CATH: Cardiac catheterism; HF: Heart failure; WIC: Written informed consent; CAD: Coronary artery disease.

Table 1 Baseline characteristics of the studied patients

Parameter	CAD Patients (n = 43)	Non-CAD Patients (n = 22)	P
Demographic
Age (years)a	62.5 (55.0-69.0)	56.7 (49.3-64.3)	0.029b
Gender (male/female)	30/13	10/12	0.057c
Physiologic
Hypertensive (yes/no)	36/07	19/03	0.085c
Angina pectoris (yes/no)	18/25	2/20	0.007c
Dyspnea (yes/no)	4/39	4/18	0.516c
Stroke (yes/no)	0/43	1/21	0.338c
Diabetes mellitus (yes/no)	6/37	1/21	0.478c
Gout (yes/no)	1/42	0/22	1.000d
Hypothyroidism (yes/no)	1/42	0/22	1.000d
Biochemical
hK1 sp am act a,e	0.146 (0.085-0.260)	0.189 (0.069-0.323)	0.803b

CAD: Coronary artery disease; Non-CAD: Non coronary artery disease; hK1 sp am act: hK1-specific amidase activity;

Median values; numbers in parentheses are the 25–75% interquartile ranges;

Mann–Whitney test;

Chi-Square test;

Fisher’s test;

μM/(min · mg creatinine).

A p value < 0.05 was considered statistically significant.

Among the 43 CAD patients, the median hK1-specific amidase activity was 0.146 µM/(min · mg creatinine), whereas among the 22 non-CAD subjects this value was 0.189 µM/(min · mg creatinine).

CAD and non-CAD patients did not differ significantly with respect to urinary hK1-specific amidase activity (Table 1).

Among the 43 CAD patients, 14, 6, and 23 had mild, moderate, and severe stenosis, respectively (Table 2). We did not observe any statistically significant effect of CAD severity on urinary hK1-specific amidase activity (Table 2).

Table 2 Urinary hK1-specific amidase activity and CAD classification

Parameter	Mild (n = 14)	Moderate (n = 06)	Severe (n = 23)	p
hK1 sp am act a,b	0.181 (0.097-0.413)	0.245 (0.119-0.545)	0.141 (0.069-0.264)	0.234c

CAD: Coronary artery disease; hK1 sp am act: hK1-specific amidase activity;

μM/(min . mg creatinine);

Median values; numbers in parentheses are the 25-75% interquartile ranges;

Kruskal-Wallis test.

A p value < 0.05 was considered statistically significant

No effect of hypertension on urinary hK1-specific amidase activity was observed in either CAD or non-CAD patients (Table 3).

Table 3 Effect of hypertension on hK1-specific amidase activity in CAD and Non-CAD patients

	CAD (n=43)			Non-CAD (n=22)
	Hyp (n=26)	Non-Hyp (n=17)	p	Hyp (n=10)	Non-Hyp (n=12)	p
hK1 sp am act a,b	0.139	0.245	0.785c	0.202	0.148	0.531c
hK1 sp am act a,b	(0.091-0.250)	(0.066-0.323)		(0.064-0.537)	(0.070-0.266)

CAD: Coronary artery disease; Non-CAD: Non-coronary artery disease; Hyp: Hypertensive; Non-Hyp: Non-hypertensive; hK1-sp am act: hK1 specific amidase activity;

μM/(min. mg creatinine);

Median values: numbers in prenthesis are the 25-75% interquartile ranges;

Mann-Whitney test. A p value < 0.05 was considered statistically significant

Regarding medication use, 16 CAD patients were using ACEI/ARB drugs. There was no statistically significant difference in ACEI or ARB use with respect to urinary hK1-specific amidase activity (Table 4).

Table 4 Effects of medications on hK1-specific amidase activity in CAD patients

	ACEI/ARB (n = 16)	Other medications (n = 27)	p
hK1 sp am act a,b	0.179 (0.089-0.259)	0.153 (0.069-0.291)	0.900c

ACEI/ARB: Angiotensin converting enzyme inhibitor/angiotensin II receptorblocker; hK1 sp am activity: hK1-specific amidase activity;

μM/(min . mg creatinine);

Median value; numbers in parentheses are the 25-75% interquartile ranges;

Mann-Whitney test. A p value < 0.05 was considered statistically significant.

The urinary hK1 specific amidase activity values in CAD patients were within the ranges described previously for HF and hypertensive patients3^,6 (Table 5).

Table 5 Median hKI-specific amidase activity values In heart failure, hypertensive, CAD, and Non-CAD patients

Parameter	HF Patientsa (n = 28)	CAD Patients (n = 43)	Non-CAD Patients (n = 22)	Hyp Patientsb (n = 100)	HF Controlsa (n = 28)	Hyp Controlsb (n = 89)
hK1 sp am act c,d	0.104 (0.067-0.297)	0.146 (0.085-0.280)	0.189 (0.069-0.323)	0.210 (0.100-0.395)	0.213 (0.147-0.401)	0.260 (0.180-0.445)

HF: Heart failure; CAD: Coronary artery disease; Non-CAD: Non-coronary artery disease; Hyp: Hypertensive; hK1 sp am act: hK1-specific amidase activity;

Median values described in Figueiredo et al6;

Median values described in Belo et al3;

μM/(min • mg creatinine;

Median value; numbers in parentheses are the 25-75% interquartile ranges.

Discussion

To the best of our knowledge, this is the first study to compare urinary hK1-specific amidase activity in human patients with and without angiographically documented stable CAD.

We evaluated hK1-specific amidase activity in the urine of CAD and non-CAD patients and found no statistically significant difference between the groups.

Kallikreins (EC 3.4.21.8) comprise a subgroup of the serine protease family and known to have several physiological functions. These proteins are divided into 2 main groups: plasma (EC 3.4.21.34) and tissue (EC 3.4.21.35) kallikreins2. The human KLK1 gene, located on chromosome 19q13.4, expresses true tissue kallikrein (hK1) in the kidney, pancreas, salivary glands, vasculature, and heart, among other tissues2^,8^,9^,11.The best known biochemical function of hK1 is release of the vasoactive and spasmogenic decapeptide kallidin (lysyl-bradykinin) (Lys-BK) from the plasma protein low molecular weight kininogen; Lys-BK is involved in the control of blood pressure, coronary artery perfusion, electrolyte balance, inflammation, and other diverse physiological processes2^,7^-9. hK1 activity can be measured in the urine using photometric assays with synthetic substrates, or radioimmunoassays11. Many studies concerning the role of KKS in heart and circulatory diseases also address kinins2^,18^,19.

In 2006, we reported the results of a study of 28 HF patients and 28 healthy control subjects in whom the median urinary hK1 specific amidase activity was significantly lower among HF patients [0.104 µM/(min · mg creatinine)] than among controls [0.213 µM/(min · mg creatinine)] (p = 0.020)6.

In 2009, our group also reported a study of 100 non-diabetic primary hypertensive patients and 89 healthy control subjects, in which the median value of urinary hK1-specific amidase activity was significantly lower in hypertensive patients [0.210µM/(min · mg creatinine)] than in controls [0.260 µM/(min . mg creatinine)] (p= 0.010)3.

In the present study, urinary hK1-specific amidase activity did not significantly differ between CAD and non-CAD patients (Table 1). For CAD patients, the median value of urinary hK1-specific amidase activity observed in the present study [0.146 µM/(min · mg creatinine)] remained within the values previously reported for HF [0.104 µM/(min · mg creatinine)] and hypertensive [0.210 µM/(min · mg creatinine)] patients of our previous studies6^,3.

On the other hand, the median value of urinary hK1-specific amidase activity for non-CAD subjects in the present study [0.189 µM/(min · mg creatinine)] was lower than the median values reported for the controls in our previous studies of HF patients [0.213 µM/min · mg creatinine] and hypertensive patients [0.260 µM/(min · mg creatinine)]6^,3 (Table 5).

For further analysis, we compared the median values of urinary hK1-specific amidase activities of HF [0.104µM/(min · mg creatinine)] and hypertensive patients [0.210µM/(min · mg creatinine)] of our previous studies6^,3 with the value reported herein for CAD patients [0.146 µM/(min · mg creatinine)]. We observed no significant differences in these comparisons (p = 0.297 and p = 0.131, respectively). We also compared the median urinary hK1 amidase activities for HF [0.104 µM/(min · mg creatinine)] and hypertensive patients [0.210 µM/(min · mg creatinine)] in our previous studies6^,3 with the value reported herein for non-CAD patients [0.189 µM/(min · mg creatinine)]. Again, no significant differences were observed (p = 0.629 and p = 0.184, respectively). Unlike our previous studies, wherein the controls were asymptomatic and lacked known diseases3^,6, in the present study, all subjects who underwent CATH exhibited symptoms, signs, or suspected CAD. We know that we cannot exclude endothelial or microvascular disease in angiographically normal coronary arteries, and that normal or near-normal coronary angiograms are observed in up to 20% of women with documented myocardial ischemia20^-22. Therefore, we suggest that this type of disease might explain the lack of differences in urinary hK1-specific amidase activities between the 2 groups of patients (CAD and non-CAD).

The results reported in the present study demonstratethat the median value of urinary hK1-specific amidase activity of CAD patients remained within the values previously described for hypertensive and HF patients3^,6 (Table 5). As hK1-specific amidase activity was reduced among patients in those studies, relative to normal controls, we suggest that hK1-specific amidase activity might also be reduced in the group of CAD patients studied herein. We must also consider the fact that our non-CAD group underwent CATH. Therefore, although the non-CAD group lacked angiographically documented CAD, they differed from a completely healthy, disease-free population.

Nolly et al23 reported the presence of a local KKS in rat hearts and suggested that locally generated kinins might help regulate cardiac function.

Some studies have produced direct evidence for a cardioprotective role of tissue kallikrein in infarcted rats.

In 2002, Agata et al24 used a somatic approach to explore the role of the KKS in cardiac remodeling and apoptosis after myocardial infarction (MI) in rats. Rats were submitted to coronary artery ligation to induce MI, and adenovirus carrying the hK1 or luciferase (control) gene was injected into the tail vein at 1 week after surgery. Cardiac output gradually decreased from 2 to 6 weeks after MI, whereas delivery of the kallikrein gene prevented this decrease.

In 2005, Griol-Charhbili et al25 tested the hypothesis that tissue kallikrein (TK) would play a protective role in myocardial ischemia by inducing ischemia-reperfusion (IR) injuries with and without ischemic preconditioning (IPC) or ACE inhibitor (ramiprilat) pretreatment in vivo in littermate wild-type (WT) or TK-deficient (TK^-/-) mice. IR induced similar infarcts in WT and TK^-/- mice. IPC reduced the infarct size by 65% in WT mice and by 40% in TK^-/- mice (P < 0.05, TK^-/- vs. WT). Although ramiprilat also reduced the infarct size by 29% in WT, its effect was completely suppressed in TK^-/- mice. Pretreatment of WT mice with a B2, but not a B1, kinin receptor antagonist reproduced the effects of TK deficiency. However, B2 receptor-deficient mice (B2^-/-) unexpectedly responded to IPC or ramiprilat similarly to WT mice. However, constitutively high levels of B1 receptor gene expression were observed in B2^-/- mice following pretreatment. In WT and TK^-/- mice, both the B2 and B1 mRNA levels increased several fold during IR and increased further still during IPC + IR. Thus, according to the authors, TK and the B2 receptor play critical roles in cardioprotection against ischemia following 2 experimental and potentially clinically relevant maneuvers.

In 2006, Koch et al26 reported a study in which the bradykinin coronary outflow, left ventricular performance, and left ventricular dimensions were investigated in transgenic rats harboring the hK1 gene (hKLK1) under basal and ischemic conditions. The main finding of their study was that transgenic rats harboring hKLK1, which were characterized by increased basal coronary bradykinin levels, demonstrated improved cardiac function and remodeling after MI induction in vivo.

In the same year, Spillmann et al27 induced MI in anesthetized mice by permanently occluding the left anterior descendant coronary artery. hKLK1 was delivered to the peri-infarct myocardium via an adenoviral vector (Ad.hKLK1). Controls received empty vector (Ad.Null) or saline. The survival rates were similar among the groups. Ad.hKLK1 increased the number of circulating endothelial progenitor cells and promoted the growth of capillaries and arterioles in the peri-infarct myocardium. In addition, Ad.hKLK1 increased the number of cardiac progenitor cells in the peri-infarct and suppressed the apoptotic death of peri-infarct cardiomyocytes both in vivo and ex vivo. As a consequence of these beneficial effects, hKLK1-transduced hearts were protected from post-MI ventricular dilatation and showed better systolic and diastolic functions at 5 weeks after MI. Similar results were reported by Pons et al28 in 2008.

In 2007, Yao et al29 reported a study in which they examined the potential therapeutic effects of a consistent, subdepressive dose of infused kallikrein and kinin on ventricular remodeling and neovascularization in rats after MI. At 1 week after coronary artery ligation, tissue kallikrein (TK) or bradykinin (BK) was infused through a minipump for 4 weeks. At 5 weeks after MI, this TK or BK infusion significantly improved cardiac contractility and reduced diastolic dysfunction without affecting systolic blood pressure. The infusions also significantly increased capillary density in the non-infarcted region. The TK and BK infusions also reduced the heart weight/body weight ratio, cardiomyocyte size, and atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide expression levels in the non-infarcted area. The authors concluded that a subdepressive dose of kallikrein or BK could restore impaired cardiac function in rats with post-infarction HF by inhibiting hypertrophy and fibrosis and promoting angiogenesis through increased nitric oxide formation and suppression of oxidative stress and TGF-β1 expression.

In 2008, Chao et al30 investigated the role of TK in protection against cardiac injury mediated through direct kinin B2 receptor activation in kininogen-deficient Brown Norway Katholiek rats after inducing acute MI. TK was injected locally into the myocardium of Brown Norway Katholiek rats after coronary artery ligation with and without coinjection of icatibant (a kinin B2 receptor antagonist) and N^ω-nitro-L-arginine methyl ester (a nitric oxide synthase inhibitor). One day after MI, TK treatment significantly improved cardiac contractility and reduced the MI size and left ventricle and diastolic pressure in Brown Norway Katholiek rats. Kallikrein attenuated ischemia-induced apoptosis and monocyte/macrophage accumulation in the ischemic myocardium, in conjunction with increased nitric oxide levels and reduced myeloperoxidase activity. Icatibant and N^ω-nitro-L-arginine methyl ester abolished the effects of kallikrein, indicating a kinin-B2 receptor-nitric oxide-mediated event. All of these studies demonstrated the beneficial effects of KKS in animals with acute MI (a severe form of CAD), but none measured tissue kallikrein activities in infarcted animals, as we did in stable CAD and non-CAD human patients. As treatment with injected TK or BK improved cardiac function and prevented HF in ischemic conditions in rats in previous studies, we could suppose that tissue kallikrein activity was also reduced in those animals.

In 2013, Yao et al31 evaluated whether the levels of both tissue kallikrein and the inflammatory biomarker high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) in the peripheral blood would correlate with plaque stability, as well as the relationship among tissue kallikrein expression, macrophage numbers, and angiogenesis in CAD. Tissue kallikrein, vascular endothelial growth factor (VEGF), and hs-CRP plasma levels were measured in 100 patients newly diagnosed with CAD and 33 CAD-free controls. CAD patients were defined as having angiographically diagnosed coronary stenosis amounting to a lumen reduction of at least 50% or greater coronary diameter lumen stenosis in a major coronary artery. CAD patients were further divided according to the number of diseased vessels into single-vessel CAD, multi-vessel CAD, and multi-vessel CAD with acute obstruction of 1 major coronary artery groups. hK1 plasma levels were determined using an ELISA specific for hK1. Patients were stratified according to CAD severity as moderate (n = 33), multi-vessel (n = 35), and multi-vessel with acute coronary syndromes (ACS; n = 32). Patients without CAD were used as controls (n = 33). The authors found that patients with CAD and ACS had significantly elevated levels of tissue kallikrein. In addition, the hs-CRP concentration was increased in patients with ACS. A strong positive correlation between plasma tissue kallilkrein and CAD severity was also demonstrated. The incidence of major adverse cardiovascular events (MACE) during an 8- to 24-month follow-up period significantly correlated with tissue kallikrein levels in the ACS group. The authors concluded that plasma TK levels were a useful predictor for the presence and extent of CAD.

In 2014, Zhang et al32 investigated the relationship between plasma tissue kallikrein levels and the presence and severity of CAD in a Chinese population. The study involved 898 consecutive CAD patients and 905 ethnically and geographically matched controls. CAD was angiographically confirmed in all patients, and the severity of CAD was determined according to the number of affected vessels and coronary stenosis scores. Plasma tissue kallikrein levels, which were measured via ELISA, were significantly higher in CAD patients than in controls (0.347 ± 0.082 vs. 0.256 ± 0.087 mg/L, p < 0.001) and were directly associated with a higher risk of CAD (odds ratio = 3.49, 95% confidence interval: 2.90-4.19). The authors themselves affirmed that paradoxically, the plasma tissue kalllikrein level was independently and positively associated with the presence of human CAD, although numerous studies (as described above) have confirmed the independent cardioprotective effect of tissue kallikrein in animal models. On the other hand, Zhang et al32 used a 1-way ANOVA and multivariable stepwise linear regression analysis to demonstrate that plasma tissue kallikrein levels were negatively associated with the severity of CAD, according to vessel scores (p < 0.001) and stenosis scores (r = -0.211, p < 0.001).

In contrast to these 2 earlier studies, we measured the activity of urinary tissue kallikrein, whose origin is renal, using a spectrophotometric method. The former authors measured tissue kallikrein levels, rather than activity, directly in plasma (via ELISA). However, many tissues (e.g., brain, pancreas, salivary glands, heart) are known to produce plasma tissue kallikrein2.

We also evaluated the effect of CAD severity on urinary hK1-specific amidase activity. As mentioned above, no effect was observed (Table 2). In our published study regarding urinary hK1-specific amidase activity and HF6, we also observed no relationship between HF severity and urinary hK1-specific amidase activity. Yao et al31 observed a strong positive correlation between plasma tissue kallilkrein and CAD severity of CAD, whereas Zhang et al32 demonstrated the opposite result. Therefore, additional studies are truly needed to understand the true role of hK1 in CAD.

We also evaluated the effect of hypertension on urinary hK1-specific amidase activity in CAD and non-CAD patients to exclude possible confounding factors, and observed no effect (Table 3). Regarding medication use among CAD patients, 16 and 27 patients did and did not use angiotensin-converting-enzyme inhibitors/angiotensin receptor blockers (ACEI/ARB), respectively. We found no statistically significant influence of ACEI or ARB use on urinary hK1-specific amidase activity (Table 4).

The results reported in the present study demonstrate that the urinary hK1-specific amidase activity levels in CAD patients remained within the previously described ranges for HF and hypertensive patients6^,3 (Table 5). As hK1 specific amidase activity in those studies was reduced in comparison to that of normal controls, we suggest that urinary hK1-specific amidase activity and, consequently, renal KKS activity, might also be reduced in the studied group of CAD patients. We must consider that patients in our non-CAD group also underwent CATH. Therefore, although the patients in this group were angiographically diagnosed as free of CAD, they might differ from a completely healthy, disease-free population.

Study limitations

This study has some limitations. First, it is cross-sectional and therefore cannot be used to infer causality; however, our aim was to test our hypothesis regarding an association between hK1 and CAD. Second, as observed in ,Figure 1, we evaluated 1971 potentially eligible patients, but could only include 65 (43 with CAD and 22 without CAD) in the study. Despite this fact, the characteristics of our sample were similar to those reported in previous studies of CAD patients1. According to our study aim, we needed to include angiographically documented non-CAD patients to provide a comparison of urinary hK1-specific amidase activity levels with those of angiographically documented CAD patients.

Conclusion

In conclusion, compared with non-CAD controls, the urinary hK1-specific amidase activity was reduced in our population of angiographically documented CAD patients, similar to previously reported findings in HF and hypertensive patients. Although this finding might have been expected, it has not previously been demonstrated. A reduction in urinary hK1-specific amidase activity in CAD patients suggests that renal KKS activity might also be reduced in these patients.

Sources of Funding

This study was partially funded by FAPEMIG.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

Acknowledgements

Research supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) (Proc.: CDS 923/98). The authors are indebted to Aleida Nazareth Soares, for statistical support, and Erick Ramalho, MA, for revising the manuscript.

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e91780

Atividade da Calicreína Tecidual Humana na Doença Coronariana Crônica Estável Angiograficamente Documentada

Figueiredo

Estêvão Lanna

1 Magalhães

Carolina Antunes

2 Belli

Karlyse Claudino

3 4 Mandil

Ari

5 Garcia

José Carlos Faria

5 Araújo

Rosanã Aparecida

5 Figueiredo

Amintas Fabiano de Souza

2 Pellanda

Lucia Campos

6 7

1 Hospital Lifecenter Departamento de Cardiologia

Belo Horizonte

Brazil Departamento de Cardiologia – Hospital Lifecenter, Belo Horizonte, MG 2 Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Farmácia Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas

Belo Horizonte

Porto Alegre

North Carolina

Research on Research Network Team – Duke University, North Carolina, USA 5 Hospital Lifecenter Departamento de Hemodinâmica

Belo Horizonte

Brazil Departamento de Hemodinâmica – Hospital Lifecenter, Belo Horizonte, MG 6 Fundação Universitária de Cardiologia Programa de Pós-Graduação em Cardiologia

Porto Alegre

Brazil Programa de Pós-Graduação em Cardiologia – Fundação Universitária de Cardiologia (PPGFUC/RS), Porto Alegre, RS 7 Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

Porto Alegre

Brasil Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), Porto Alegre, RS – Brasil Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

Correspondência: Estêvão Lanna Figueiredo, Rua Dias Adorno, 39, apto. 1.703, Santo Agostinho. CEP 30190-100, Belo Horizonte, MG – Brasil. E-mail: estevao@cardiol.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Figueiredo EL, Figueiredo AFS; Obtenção de dados: Figueiredo EL, Magalhães CA, Figueiredo AFS, Mandil A, Garcia JCF; Análise e interpretação dos dados e Análise estatística: Figueiredo EL, Magalhães CA, Figueiredo AFS, Pellanda LC, Belli KC; Obtenção de financiamento: Figueiredo AFS; Redação do manuscrito e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Figueiredo EL, Figueiredo AFS, Pellanda LC, Belli KC; Seleção dos pacientes: Araújo RA.

Potencial conflito de interesse

Declaramos não haver conflito de interesses pertinentes.

Resumo Fundamento:

A calicreína tecidual humana (hK1) é enzima-chave do sistema calicreína-cinina (SCC). A atividade amidásica da hK1 está reduzida na urina de pacientes com hipertensão e insuficiência cardíaca (IC); seu papel na doença arterial (DAC) coronariana ainda não está esclarecido.

Objetivo:

Avaliar a atividade amidásica da hK1 na urina de pacientes com DAC.

Métodos:

Sessenta e cinco indivíduos (18 a 75 anos) que se submeteram ao cateterismo cardíaco (CAT) coletaram amostra do jato médio de urina imediatamente antes do CAT. Baseando-se na presença de lesões coronarianas, os pacientes eram classificados em dois grupos: DAC (43 pacientes) e sem DAC (22 indivíduos). A atividade amidásica da hK1 foi estimada com o substrato cromogênico D-Val-Leu-Arg-Nan. Creatinina foi determinada pelo método de Jaffé. A atividade amidásica específica da hK1 urinária foi expressa em µM/(min . mg de creatinina) para corrigir diferenças no fluxo urinário.

Resultados:

A atividade amidásica da hK1 urinária foi semelhante entre os pacientes com DAC [0,146 µM/(min . mg de creatinina)] e aqueles sem DAC [0,189 µM/(min . mg de creatinina)] (p = 0,803), e permaneceu entre os baixos valores previamente publicados para pacientes com hipertensão primária [0,210 µM/(min . mg de creatinina)] e para aqueles com IC [0,104 µM/(min . mg de creatinina)], respectivamente. Nenhum efeito estatisticamente significativo da gravidade da DAC e da hipertensão sobre a atividade amidásica da hK1 urinária foi observado.

Conclusão:

A atividade amidásica da hK1 na urina estava reduzida nos pacientes com DAC, o que pode sugerir que a atividade do SCC renal esteja reduzida nessa doença.

Palavras-chave: Calicreína Tecidual Humana Calicreína Tecidual Sistema Calicreína-Cinina Doença Arterial Coronariana

Introdução

A Doença arterial coronariana (DAC) causou aproximadamente uma em cada seis mortes nos Estados Unidos em 2007 1. Estima-se que 16 milhões e 300 mil americanos tenham DAC, e a hipertensão é um dos mais prevalentes fatores de risco1. A pressão sanguínea apresenta uma relação inversa em relação aos níveis da atividade da calicreína tecidual humana (hK1) urinária ou renal em pacientes com hipertensão primária2^-4. Além disso, os níveis de hK1 urinária estão significativamente reduzidos na insuficiência cardíaca (IC)5^-7.

Calicreínas (EC 3.4.21.8) são um subgrupo da família das serino-proteases conhecidas por apresentarem várias funções fisiológicas, incluindo o controle da pressão sanguínea, a perfusão das artérias coronarianas, o equilíbrio eletrolítico, a inflamação e outros diversos processos fisiológicos2^,7^-9. Nosso grupo demonstrou que a atividade amidásica específica da hK1 urinária está significativamente reduzida em pacientes com hipertensão primária e IC3^,6.

A hipertensão é um fator de risco para a DAC e a IC. Por outro lado, a IC é a via final para a hipertensão não tratada e a DAC. No entanto, os níveis da atividade da hK1 urinária e sua associação com a gravidade da DAC estável angiograficamente determinada permanecem desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade amidásica específica da hK1 medindo sua atividade na urina de pacientes com DAC estabelecida ou suspeita.

Métodos

Realizou-se um estudo transversal, de janeiro de 2008 a janeiro de 2010. Foram incluídos no estudo 65 indivíduos de qualquer sexo e raça. Amostras do jato médio de urina foram coletadas no Laboratório de Hemodinâmica do Hospital Lifecenter momentos antes da realização do cateterismo cardíaco (CAT) em indivíduos com DAC conhecida ou suspeita.

O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa do Hospital Lifecenter de Belo Horizonte e da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e também foi aprovado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa. Todos os pacientes leram o protocolo, tiveram suas dúvidas satisfatoriamente esclarecidas e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

As amostras de urina foram transferidas para o Laboratório de Enzimologia Clínica do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da UFMG, onde foram visualmente e quimicamente examinadas com fita reagente (Urofita 10 U bioBRÁS Diagnósticos, Biobrás S.A., Belo Horizonte, MG, Brasil). Todas as amostras de urina foram negativas para todos os compostos químicos avaliados (bilirrubina, sangue, glicose, corpos cetônicos, nitritos, proteínas e urobilinogênio).

Fatores de risco tradicionais para DAC foram determinados por meio de entrevistas padrão realizadas pelos próprios médicos, bem como pela enfermeira e pela farmacêutica participante do estudo. Os exames de CAT foram realizados por cardiologistas intervencionistas certificados pela Sociedade Brasileira de Hemodinâmica e Cardiologia Intervencionista e registrados nos registros do hospital. Os pacientes passaram por uma completa entrevista clínica, bem como por exame físico. Todos os sintomas e sinais clínicos dos pacientes, seus antecedentes pessoais e tipos de medicação (cardiovascular ou não) foram analisados. Todos os sujeitos foram estudados como pacientes externos.

Critérios de inclusão e exclusão

Foram incluídos no estudo pacientes de qualquer sexo e raça, desde que maiores de 18 anos e com menos de 75 anos, com DAC conhecida ou suspeita, e que dessem seu consentimento. DAC suspeita foi definida pela história médica, exame físico, eletrocardiograma, anormalidades em outros exames de imagem (teste ergométrico e cintilografia miocárdica). Os critérios para exclusão foram: não concordância em participar do estudo, pacientes que tiveram recentemente síndromes coronarianas agudas (SCA, menos de 3 meses), creatinina sérica ≥ 1,5 mg/dL ou 133 µmol/L para os homens e 1,4 mg/dL ou 124 µmol/L para as mulheres, história de grave alergia a contrastes iônicos, presença de sangue ou nitrito na urina.

Presença e gravidade da doença arterial coronariana

Os pacientes foram classificados quanto à presença ou ausência de DAC. Coronariografias diagnósticas foram realizadas sob anestesia local (90% por acesso femoral e 10%, radial) utilizando contraste não iônico e classificados por cada um dos dois examinadores pela análise visual da estenose como branda (<40%), moderada (40 a 70%) e grave (70 a 100%), e o fluxo sanguíneo foi classificado de acordo com critérios do Thrombolysis In Myocardial Infarction(TIMI) Study Group10. Casos duvidosos foram revistos por ambos os examinadores com o auxílio de angiografia coronariana quantitativa (AXIOM Artis, Siemens, Munich, Alemanha) e/ou submetidos a ultrassom intravascular IVUS (I-LAB Boston Scientific, Natick, MA, Estados Unidos). Nenhum dos examinadores conhecia os resultados da atividade amidásica específica da hK1.

Atividade amidásica da hK1

A atividade amidásica da hK1 foi determinada com o substrato cromogênico D-Val-Leu-Arg-Nan (Chromogenix AB, Itália)11. A hidrólise do substrato foi obtida espectrofotometricamente em 410 nm, monitorando-se a liberação de 4-Nitroanilina (4-Nan) [Ɛ₄₁₀= 8.800/(M . cm)], como descrito previamente12. O ensaio foi realizado como já descrito6. Especificamente, cinco misturas de incubação, identificadas pelas letras A, B, C, D e E, continham: A - 500µL de urina e 100 µL de tampão glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0, contendo 0,05% (peso/volume) de NaN₃ (Sigma Chemical Co , Estados Unidos); B - 500µL de urina e 100µL de uma solução de Trasylol®a 1.000 KIU/mL (um forte inibidor de hK1, também conhecido como aprotinina, inibidor pancreático bovino de tripsina-BPTI, ou inibidor pancreático de tripsina de Kunitz)11; C - 500 µL de urina e 100 µL de uma solução de inibidor de tripsina de soja (SBTI), que é um forte inibidor de serino-proteases e de calicreína plasmática, entretanto, não é inibidor da hK16, a 1 mg/mL em tampão glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0;

D - 500 µL de urina e 100 µL de tampão glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0; e E - 600 µL de tampão glicina NaOH 200 mM, pH 9,0. As misturas foram pré-incubadas a 37ºC durante 10 minutos para equilíbrio da temperatura. Em seguida, 400 L de uma solução de D-Val-Leu-Arg-Nan, o substrato, a 160 µM em tampão glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0 eram adicionados às misturas A, B, C e E e 400 µL do tampão glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0, ao invés da solução do substrato, eram adicionados à mistura D. As misturas foram, novamente, incubadas a 37ºC durante 30 minutos e a reação foi paralisada pela adição de 100 µL de solução de ácido acético a 60% (volume/volume). As misturas foram incubadas em quadruplicatas. A hidrólise enzimática foi monitorada medindo-se a absorvância da 4-Nan, liberada em 410 nm em um espectrofotômetro Shimadzu UV 160 UV-Vis (com largura da banda espectral de 2 nm). A cubeta de referência continha 1000 µL de tampão glicina-NaOH 200 mM, pH 9,0 e 100 µL da solução de ácido acético a 60%. A concentração total do substrato foi determinada a partir da quantidade de 4-Nan liberada na hidrólise completa por excesso de beta-tripsina bovina (que foi gentilmente fornecida pelo Professor Dr. Marcelo Matos Santoro, do Departamento de Bioquímica e Imunologia do ICB da UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil). O ΔA₄₁₀ foi calculado e transformado em velocidade de reação (v) expressa em µM/(min . mL de urina). As velocidades das reações eram lineares com o tempo até 60 minutos.

Em todas as amostras de urina avaliadas, a atividade enzimática foi completamente inibida pelo Trasylol® (mistura de incubação B) e nenhuma inibição foi observada na presença de SBTI (mistura de incubação C), indicando somente a presença da enzima hK1.

A atividade amidásica específica da hK1 era calculada dividindo-se a velocidade da reação (v) pela concentração de creatinina (mg/mL de urina). O resultado foi expresso em µM/(min . mg de creatinina) para corrigir diferenças no fluxo urinário13.

Determinação da creatinina

A creatinina era determinada espectrofotometricamente com um kitde reagentes baseado na reação de Jaffé (Bioclin/Quibasa Química Básica Ltda., Belo Horizonte, MG, Brasil) e expressa em mg/mL de urina, como previamente descrito3^,6^,13. Os ensaios foram também realizados em quadruplicatas.

Confundidores

Informações sobre as medicações que os pacientes usavam foram obtidas por meio de entrevista. Os medicamentos foram classificados em dois grupo: um com inibidores da enzima conversora de angiotensina (IECA)/bloqueadores do receptor da angiotensina (BRA); o outro, com qualquer medicação. A pressão arterial era medida com o paciente em repouso, na posição sentada, antes da realização do CAT, e classificada na entrevista de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais14^-16.

Análise estatística

Os dados foram analisados usando-se o programa Minitab® para Windows, versão 15.0, e expressos como medianas, por causa da distribuição irregular das variáveis investigadas. Diferenças entre os grupos e os efeitos de medicamentos sobre a atividade amidásica específica da hK1 na DAC foram avaliadas por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney, uma vez que a população estudada tinha uma distribuição não gaussiana, com varianças não homogêneas. Diferenças entre os grupos de gravidade da DAC foram comparadas pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. As frequências de ambos os sexos e a presença ou ausência de hipertensão, angina pectoris, dispneia, acidente vascular encefálico (AVE) e diabetes melito foram comparadas pelo teste Qui-Quadrado. A presença ou a ausência de gota e hipotireoidismo foi comparada pelo teste de Fisher. Valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

O tamanho da amostra foi calculado baseado em valores encontrados em nossos estudos prévios [diferença entre grupos: patientes com IC 0,104 µM/(min . mg creatinina)] e controles 0,260 µM/(min . mg creatinina), respectivamente], com desvio padrão de 0,23, estimando a necessidade de 35 pacientes em cada grupo, considerando o nível de significância de 0,95 e poder de 0,8.

Este estudo foi desenvolvido dentro do Programa Research and Innovation Coaching, uma parceria entre a Sociedade Brasileira de Cardiologia (SBC) e o grupo de Pesquisa Research on Research, da Duke University, nos Estados Unidos17.

Resultados

De janeiro de 2008 a janeiro de 2010, 4.254 CATs foram realizados no Hospital Lifecenter, com 65 pacientes sendo incluídos neste estudo (Figura 1). Quanto à presença de lesões coronarianas, os pacientes foram classificados em dois grupos: DAC (43 pacientes) e sem DAC (22 indivíduos) (Tabela 1). Os pacientes com DAC foram significativamente mais velhos que os pacientes sem DAC, mas a idade não diferiu entre aqueles com e sem hipertensão. Os subgrupos foram semelhantes quanto ao sexo e à presença ou ausência de hipertensão. Entre os 43 pacientes com DAC, 35 eram hipertensos e, entre os 22 indivíduos sem DAC, 20 eram hipertensos.

Figura 1 Fluxograma dos pacientes elegíveis e incluídos no estudo. CATs: Cateterismo cardíaco; IC: Insuficiência cardíaca; CI: Consentimento informado; DAC: Doença arterial coronariana.

Tabela 1 Características basais dos pacientes estudados

Parâmetro	Pacientes com DAC (n = 43)	Pacientes sem DAC (n = 22)	Valor de p
Demográfico
Idade (anos)a	62,5 (55,0-69,0)	56,7 (49,3-64,3)	0,029b
Sexo (masculino/feminino)	30/13	10/12	0,057c
Fisiológico
Hipertenso (sim/não)	36/07	19/03	0,085c
Angina pectoris (sim/não)	18/25	2/20	0,007c
Dispneia (sim/não)	4/39	4/18	0,516c
AVE (sim/não)	0/43	1/21	0,338c
Diabetes melitos (sim/não)	6/37	1/21	0,478c
Gota (sim/não)	1/42	0/22	1,000d
Hipotiroidismo (sim/não)	1/42	0/22	1,000d
Bioquímico
Ativ am esp hK1c,d	0,146 (0,085-0,260)	0,189 (0,069-0,323)	0,803b

Valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Dados expressos como medianas; números entre parênteses são o intervalo interquartis 25% e 75%, respectivamente;

teste de Mann-Whitney;

teste do Qui-Quadrado;

teste de Fisher;

μM/(min . mg de creatinina)". DAC: Doença arterial coronariana; AVE: Acidente vascular encefálico; Ativ am esp hK1: Atividade amidásic específica da hK1.

Entre os 43 pacientes com DAC, a mediana da atividade amidásica específica da hK1 urinária foi de 0,146 µM/(min . mg de creatinina), enquanto que entre os 22 indivíduos sem DAC, foi de 0,189 µM/(min . mg de creatinina), respectivamente.

Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre as medianas da atividade amidásica específica da hK1 urinária para os pacientes com DAC e aqueles sem DAC.

Entre os pacientes com DAC, 14 tinham uma doença leve, 6 moderada e 23 grave (Tabela 2). Não foi observado efeito estatisticamente significativo da gravidade da DAC sobre a atividade amidásica específica da hK1 urinária.

Tabela 2 Atividade amidásica específica da hK1 urinária e classificação da doença arterial coronariana

Parâmetro	Branda (n = 14)	Moderada (n = 06)	Grave (n = 23)	Valor de p
Ativ am esp hK1c,^d	0,181 (0,097-0,413)	0,245 (0,119-0,545)	0,141 (0,069-0,264)	0,234c

Valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

μM/(min . mg de creatinina);

Dados expressos como medianas, números entre parênteses representam o intervalo interquartis 25% e 75%, respectivamente;

teste de Kruskall-Wallis; Ativ am esp hK1: Atividade amidásic especifica da hK1.

Entre os pacientes com DAC e aqueles sem DAC, não foi observado efeito estatisticamente significativo da hipertensão sobre a atividade amidásica específica da hK1 urinária (Tabela 3).

Tabela 3 Efeito da hipertensão sobre a atividade amidásica específica da hK1 em pacientes com e sem doença arterial coronariana

	DAC (n = 43)			Sem DAC (n = 22)
	Hip (n = 26)	Sem hip (n = 17)	p	Hip(n = 10)	Sem hip (n = 12)	p
Ativ am esp hK1c,^d	0,139	0,245	0,785c	0,202	0,148	0,531c
Ativ am esp hK1c,^d	(0,091-0,250)	(0,066-0,323)		(0,064-0,537)	(0,070-0,266)

Valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

μM/(min . mg de creatinina);

Dados expressos como medianas, números entre parênteses representam o intervalo interquartis 25% e 75%, respectivamente;

Teste de Mann-Whitney. DAC: Doença arterial coronariana; Sem DAC: Sem doença arterial coronariana; Hip: Hipertensos; Sem hip: Sem hipertensão; Ativ am esp hK1: Atividade amidásic específica da hK1.

Com relação às medicações, 16 pacientes com DAC estavam usando IECA/BRA. Não foi observado efeito estatisticamente significativo do uso de IECA/BRA sobre a atividade amidásica específica da hK1 urinária (Tabela 4).

Tabela 4 Efeitos de medicamentos sobre a atividade amidásica específica da hK1 na doença arterial coronariana

	IECA/BRA (n = 16)	Outros medicamentos (n = 27)	Valor de p
Ativ am esp hK1c,^d	0,179 (0,089-0,259)	0,153 (0,069-0,291)	0,900c

Valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Dados expressos como medianas, números entre parênteses são o intervalo interquartis 25% e 75%, respectivamente;

μM/(min. mg de creatinina);

teste de Mann-Whitney. IECA/BRA: inibidor da enzima conversora de angiotensina/bloqueador do receptor da angiotensina II; Ativ am esp hK1: Atividade amidásic específica da hK1.

O valor da mediana da atividade amidásica específica da hK1 urinária nos pacientes com DAC permaneceu dentro daqueles já descritos para pacientes com IC e hipertensão3^,6 (Tabela 5).

Tabela 5 Valores das medianas da atividade amidásica específica da hK1 nos pacientes com hipertensão, insuficiência cardíaca e doença arterial coronariana

Parâmetro	ICa (n = 28)	DAC (n = 43)	Sem DAC (n = 22)	Hipb (n = 100)	Controle ICa (n = 28)	Controle Hipb (n = 89)
Ativ am esp hK1c,d	0,104 (0,067- 0,297)	0,146 (0,085-0,280)	0,189 (0,069-0,323)	0,210 (0,100-0,395)	0,213 (0,147-0,401)	0,260 (0,180-0,445)

valores de medianas descritos em Figueiredo e cols.6;

valores de medianas descritos em Belo e cols.3;

μM/(min . mg de creatinina);

dados expressos como medianas, números entre parênteses representam o intervalo interquartis 25% e 75%, respectivamente; IC: Insuficiência cardíaca; DAC: Doença arterial coronariana; Sem DAC: Sem doença arterial coronariana; Hip: Hipertensos; Ativ am esp hK1: Atividade amidásic específica da hK1.

Discussão

Até onde vai nosso conhecimento, este é o primeiro estudo comparando a atividade amidásica específica da hK1 urinária em pacientes humanos com DAC estável e sem DAC angiograficamente documentada.

Mediu-se a atividade amidásica específica da hK1 na urina de pacientes com DAC e sem DAC, e nenhuma diferença estatística significativa entre os dois grupos foi observada.

Calicreínas (EC 3.4.21.8) constituem um subgrupo da família das serino-proteases conhecidas por terem várias funções fisiológicas. Elas são divididas em dois principais grupos: calicreínas plasmáticas (EC 3.4.21.34) e teciduais (EC 3.4.21.35)2. O gene humano KLK1, localizado no cromossomo 19q13.4, expressa a verdadeira calicreína tecidual (hK1) em tecidos como rins, pâncreas, glândulas salivares, vasos e coração2^,8^,9^,11. A principal função bioquímica conhecida da hK1 é a liberação, da proteína plasmática cininogênio de baixo peso molecular, do decapeptídeo vasoativo e espasmogênico calidina (lisil-bradicinina - Lis-BK), que é envolvido no controle da pressão sanguínea, da perfusão das artérias coronárias, do equilíbrio eletrolítico, da inflamação e em outros diversos processos fisiológicos2^,7^-9. A atividade da hK1 pode ser medida na urina tanto por ensaio fotométrico, utilizando-se substratos sintéticos, quanto por radioimunoensaio11. Muitos estudos sobre o papel do SCC nas doenças cardíacas e circulatórias são relacionados às cininas2^,18^,19.

Em 2006, publicamos os resultados de um estudo com 28 pacientes com IC e 28 sujeitos sadios como controles, no qual o valor da mediana da atividade amidásica específica da hK1 urinária foi significativamente menor nos pacientes com IC [0,104 µM/(min . mg de creatinina)] do que nos controles [0,213 µM/(min . mg de creatinina)] (valor de p = 0,020)6.

Em 2009, nosso grupo publicou estudo realizado com 100 pacientes não diabéticos com hipertensão primária e 89 indivíduos controles sadios, no qual o valor da mediana da atividade amidásica específica da hK1 urinária foi significativamente menor nos pacientes hipertensos [0,210µM/(min . mg de creatinina) do que nos controles [0,260 µM/(min . mg de creatinina)] (valor de p= 0,010)3.

No presente estudo, a atividade amidásica específica da hK1 urinária não foi significativamente diferente entre os pacientes com DAC e os indivíduos sem DAC (Tabela 1). O valor da mediana da atividade amidásica específica da hK1 urinária para os pacientes com DAC [0,146 µM/(min . mg de creatinina)] permaneceu entre os valores reportados para os pacientes hipertensos [0,210 µM/(min . mg de creatinina)] e para aqueles com IC [0,104 µM/(min . mg de creatinina)] de nossos prévios estudos3^,6.

Por outro lado, o valor da mediana da atividade amidásica específica da hK1 urinária para os sujeitos sem DAC encontrado no presente estudo [0,189 µM/(min . mg de creatinina)] foi menor do que os das medianas reportados para ambos os controles para os pacientes com IC [0,213µM/(min . mg de creatinina)] e para os pacientes hipertensos [0,260 µM/(min . mg de creatinina)] de nossos prévios estudos6^,3 (Tabela 5).

Para aprofundar a análise, comparou-se o valor da mediana da atividade amidásica específica da hK1 urinária para pacientes com IC [0,104 µM/min . mg de creatinina)] e para hipertensos [0,210 µM/(min . mg de creatinina)] de nossos prévios estudos6^,3, com o valor agora descrito para os pacientes com DAC [0,146 µM/(min . mg de creatinina)]. Nenhuma diferença significativa foi observada (valor de p = 0,131 e valor de p = 0,297, respectivamente). Comparou-se, também, os valores das medianas das atividades amidásicas específicas da hK1 urinária para pacientes com IC [0,104 µM/(min . mg de creatinina)] e para pacientes hipertensos [0,210 µM/(min . mg de creatinina)] de nossos estudos prévios6^,3, com o valor agora descrito para pacientes sem DAC [0,189 µM/(min . mg de creatinina)]. Nenhuma diferença significativa foi também observada (valor de p= 0,184 e valor de p = 0,629, respectivamente). Diferente de nossos estudos prévios, nos quais os controles eram assintomáticos e sem doença conhecida3^,6, no presente estudo, todos os sujeitos submetidos aos CATs tinham sintomas, sinais ou suspeitas de DAC. Sabe-se que não se pode excluir doença endotelial ou microvascular em artérias coronarianas angiograficamente normais, e sabe-se também que angiografias normais ou quase normais são observadas em até 20% de mulheres com isquemia miocárdica documentada20^-22. Assim, sugerimos que tal fato provavelmente explicaria a falta de diferença na atividade amidásica específica da hK1 urinária observada entre os dois grupos de pacientes (DAC e sem DAC).

Os resultados apresentados no presente estudo sugerem que a atividade amidásica específica da hK1 urinária nos pacientes com DAC está dentro dos valores já descritos para pacientes com IC e para pacientes hipertensos3^,6 (Tabela 5). Uma vez que, naqueles estudos, a atividade amidásica específica da hK1 estava reduzida em comparação com os controles normais, sugerimos que a atividade amidásica específica da hK1 poderia estar reduzida no grupo de pacientes com DAC estudado. Deve-se levar em conta o fato de que nosso grupo sem DAC foi submetido ao Cat. Assim, embora esse grupo tivesse ausência angiograficamente documentada de DAC, eles poderiam diferir de uma população completamente livre de outras doenças.

Um SCC local presente nos corações de ratos foi reportado por Nolly e cols.23, que sugeriram que as cininas produzidas localmente poderiam ajudar a regular a função cardíaca.

Há alguns trabalhos mostrando evidências diretas para algum papel cardioprotetor da calicreína tecidual em ratos infartados.

Em 2002, Agata e cols.24usaram a abordagem somática para explorar o papel do SCC no remodelamento cardíaco e na apoptose após infarto do miocárdio (IM) em ratos. Ratos foram submetidos à ligação da artéria coronária para induzir ao IM, e adenovírus transportando o gene da hK1 ou da luciferase (controle) foi injetado na veia da cauda 1 semana após a cirurgia. O débito cardíaco diminuiu gradualmente de 2 a 6 semanas após o IM, enquanto que a liberação do gene da hK1 preveniu essa diminuição.

Em 2005, Griol-Charhbili e cols.25 testaram a hipótese de que a calicreína tecidual (CT) exerceria um papel protetor na isquemia miocárdica, provocando lesão de reperfusão da isquemia, com e sem o pré-condicionamento isquêmico (PCI) ou pré-tratamento com IECA (ramiprilat), in vivo em ninhadas de camundongos do tipo selvagem (TS) ou deficientes de calicreína tecidual (CT^-/-). Reperfusão da isquemia (RI) induziu a infartos semelhantes nos camundongos TS e deficientes de calicreína tecidual (TK^-/-). PCI reduziu a extensão do infarto em 65% nos camundongos TS e em 40% nos camundongos CT^-/- (valor de p < 0,05; CT^-/-vs. TS). Ramiprilat também reduziu a extensão do infarto em 29% nos TS, mas, nos CT^-/-, esse efeito foi completamente suprimido. O pré-tratamento dos camundongos TS com um antagonista do receptor B2 de cininas, mas não do receptor B1, reproduziu os efeitos da deficiência da CT. No entanto, camundongos deficientes do receptor B2 (B2^-/-) inesperadamente responderam ao PCI ou ao ramiprilat como os camundongos TS. Não obstante o pré-tratamento dos camundongos B2^-/-, a expressão genética do receptor B1 foi constitutivamente alta. Nos camundongos TS e CT^-/-, os níveis de ambos os mARN B2 e B1 aumentaram várias vezes durante a RI e ainda mais durante o PCI+RI. Assim, segundo os autores, a CT e o receptor B2 disputam um papel crítico na cardioproteção produzida por dois procedimentos experimentais de relevância clínica potencial (o PCI e a inibição da ECA) durante a isquemia.

Em 2006, Koch e cols.26 reportaram um estudo no qual eles investigaram a fluxo de bradicinina (BK) coronariana, o desempenho do ventrículo esquerdo e as dimensões ventriculares esquerdas de ratos transgênicos portadores do gene da hK1 (hKLK1) sob condições basais e isquêmicas. O principal achado de seus estudos foi que os ratos transgênicos portadores do gene hKLK1, que foram caracterizados por níveis basais aumentados de BK coronariana, mostraram uma melhora na função cardíaca e no remodelamento cardíaco após indução in vivo de IM.

No mesmo ano, Spillmann e cols.27 induziram IM camundongos anestesiados ocluindo permanentemente a artéria coronária descendente anterior. O gene hKLK1 foi liberado ao miocárdio peri-infarto por meio de um vetor adenoviral (Ad.hKLK1). Os controles receberam Ad.vazio ou salina. A taxa de sobrevivência foi semelhante entre os grupos. O Ad.hKLK1 aumentou o número de células endoteliais progenitoras circulantes e promoveu o crescimento de capilares e arteríolas no miocárdio peri-infarto. Além disso, Ad.hKLK1 aumentou a abundância de células progenitoras cardíacas no peri-infarto e suprimiu a morte apoptótica de cardiomiócitos peri-infarto tanto in vivo quanto ex vivo. Como consequência desses efeitos benéficos, após 5 semanas do IM, corações com hKLK1-transferidos foram protegidos da dilatação ventricular pós-IM e mostraram melhores funções sistólica e diastólica. Resultados semelhantes foram reportados, em 2008, por Pons e cols.28.

Em 2007, Yao e cols.29 publicaram um estudo, no qual eles examinaram os efeitos potenciais terapêuticos de um fornecimento estável de hK1 e da infusão de cinina em uma dose subdepressora sobre o remodelamento ventricular e a neovascularização em ratos após IM. Uma semana após a ligação da artéria coronária, CT ou BK foi infundida por meio de uma minibomba durante 4 semanas. Em 5 semanas após o IM, CT e infusão de BK melhorou significativamente a contractilidade e reduziu a disfunção diastólica, sem afetar a pressão sanguínea sistólica. CT e infusão de BK também reduziram a razão peso cardíaco/peso corporal, o tamanho dos cardiomiócitos, e a expressão dos peptídeos atrial natriurético e natriurético cerebral na área não infartada. Os autores concluíram que uma dose subdepressora de hK1 ou BK pode restaurar a função cardíaca prejudicada em ratos com IC pós-infarto, inibindo hipertrofia e fibrose, e promovendo angiogênese, por meio da formação aumentada de óxido nítrico (ON) e da supressão do estresse oxidative, e além da expressão de fator de transformação de crescimento beta 1 (TGF-β1).

Em 2008, Chao e cols.30 investigaram o papel da CT na proteção contra dano cardíaco por meio da ativação direta do receptor B2 de cinina usando ratos marrons Katholiek noruegueses deficientes em cininogênio, após IM agudo. A CT foi injetada localmente no miocárdio desses ratos após ligação da artéria coronária com e sem a injeção de icatibant (um antagonista do receptor B2 de cinina) e de N^w-nitro-L-arginina metil éster (um inibidor da ON sintetase). Um dia após o IM, o tratamento com CT aumentou significativamente a contratilidade cardíaca, reduzindo o tamanho do IM e a pressão diastólica ventricular esquerda nos ratos. A hK1 atenuou a apoptose induzida pela isquemia e o acúmulo de monócitos/macrófagos no miocárdio isquêmico em combinação com níveis aumentados de ON e reduzida atividade da mieloperoxidase. Icatibant e N^w-nitro-L-arginina metil éster aboliram os efeitos da hK1, indicando um evento mediado pelo receptor B2 de cinina e ON. Todos estes estudos mostraram efeitos benéficos do SCC em animais com IM agudo (uma forma severa de DAC), mas nenhum deles mediu a atividade da CT nos animais infartados como fizemos com nossos pacientes humanos com DAC estável e com os sem DAC. Uma vez que nestes estudos prévios a injeção de hK1 melhorou a função cardíaca e previniu a IC em condições isquêmicas em ratos, pode-se supor que a atividade da CT em ratos estava diminuída.

Em 2013, Yao e cols.31avaliaram se níveis de CT e biomarcador inflamatório, a proteína C-reativa de alta sensibilidade (as-PCR), no sangue periférico correlacionam-se com a estabilidade da placa, bem como a relação da expressão da CT, número de macrófagos e angiogênese na DAC. Os níveis plasmáticos da CT, do fator de crescimento endotelial vascular (FCEV) e da as-PCR foram medidos em 100 pacientes recém-diagnosticados com DAC e em 33 controles sem DAC. Os pacientes com DAC foram definidos como tendo estenose coronária angiográfica de pelo menos 50% de redução do lúmen ou maior estenose do diâmetro luminar em uma principal artéria coronária. De acordo com o número de vasos doentes, os pacientes com DAC foram posteriormente divididos em grupo DAC de um único vaso, grupo DAC multivaso e grupo DAC com obstrução aguda de uma principal artéria coronária. Os níveis plasmáticos da CT humana foram determinados usando ELISA específica para a CT humana. De acordo com a gravidade da DAC, os pacientes foram estratificados como moderada (n = 33), multivaso (n = 35) e multivaso com síndromes coronárias agudas (SCA) (n = 32). Pacientes sem DAC foram usados como controles (n = 33). Os autores encontraram que pacientes com DAC e SCA tinham níveis significativamente elevados da CT. Além disso, a concentração de as-PCR estava aumentada na SCA. Uma forte correlação positiva entre a CT plasmática e a gravidade da DAC também foi demonstrada. Principais eventos cardiovasculares adversos (PECA) durante 8 a 24 meses de acompanhamento significativamente correlacionaram com os níveis da CT no grupo SCA. Eles concluíram que os nívieis plasmáticos da CT eram um preditor útil para a presença e extenção da DAC.

Em 2014, Zhang e cols.32 investigaram a relação dos níveis da CT plasmática com a presença e gravidade da DAC em uma população chinesa. O estudo envolveu 898 pacientes consecutivos com DAC e 905 controles, etnicamente e geograficamente emparelhados. A DAC foi confirmada angiograficamente em todos os pacientes, e a gravidade da DAC foi expressa pelo número de vasos afetados e a quantidade de estenose coronária. Os níveis plasmáticos da CT foram medidos usando-se um método de ELISA, tendo sido significativamente mais altos nos pacientes com DAC do que nos controles (0,347 ± 0,082 vs. 0,256 ± 0,087 mg/L; valor de p< 0,001), e diretamente associados com um risco mais alto de DAC (Odds Ratio - OR = 3,49; Intervalo de Confiança de 95% - IC95% = 2,90 ; -4,19). Os autores, eles mesmos, afirmaram que é um paradoxo que o nível da CT plasmática fosse independentemente e positivamente associado com a presença de DAC humana, embora numerosos estudos (como aqueles previamente mostrados acima) tenham confirmado o efeito cardioprotetor da CT em modelos animais. Por outro lado, ANOVA unidirecional e análise de regressão multivariável passo a passo demonstraram, no estudo de Zhang e cols.32, que os níveis plasmáticos da CT foram negativamente associados com a gravidade da DAC, de acordo com o número de vasos (valor de p< 0,001) e o número de estenoses (r= -0,211; valor de p< 0,001).

Diferentemente desses dois últimos estudos, em nosso trabalho, medimos a atividade da hK1 urinária, cuja origem é renal, por um método espectrofotométrico. Os autores precedentes mediram os níveis de CT diretamente no plasma (com ELISA), e não sua atividade. Por outro lado, já se sabe que a CT no plasma tem sua origem em muitos tecidos (cérebro, pâncreas, glândulas salivares e coração)2.

Avaliamos, também, o efeito da gravidade de DAC sobre a atividade amidásica específica da hK1 urinária. Como mencionado acima, nenhum efeito foi observado (Tabela 2). Em estudo publicado sobre a atividade amidásica específica da hK1 na IC6, não observamos relação entre a gravidade da IC e os valores da atividade amidásica específica da hK1 urinária. Yao e cols.31encontraram uma forte correlação positiva entre a CT plasmática e a gravidade da DAC, enquanto Zhang e cols.32demonstraram o oposto. Assim, estudos adicionais são realmente necessários para se entender o real papel da hK1 na DAC.

Avaliamos ainda o efeito da hipertensão sobre a atividade amidásica específica da hK1 urinária nos pacientes com DAC e nos sem DAC, a fim de excluir possíveis fatores de confusão e, nenhum efeito foi observado (Tabela 3). Com relação aos medicamentos que os pacientes com DAC estavam fazendo uso, 16 eram usuários de IECA/BRA e 27, não. Não houve nenhuma influência estatisticamente significativa do uso de IECA ou BRA sobre a atividade amidásica específica da hK1 urinária (Tabela 4).

Os resultados reportados no presente estudo mostraram que a atividade amidásica específica da hK1 urinária nos pacientes com DAC permaneceu dentro dos valores já descritos para pacientes com IC e com hipertensão6^,3(Tabela 5). Uma vez que, naqueles estudos, a atividade amidásica específica da hK1 estava reduzida em comparação com controles normais, sugerimos que a atividade amidásica da hK1 urinária e, consequentemente, a atividade do SCC renal poderia estar reduzida no grupo de pacientes com DAC estudado. Deve-se ainda levar em conta o fato de que nosso grupo sem DAC foi submetido ao CAT. Assim, embora os pacientes deste grupo tenham apresentado ausência angiograficamente documentada de DAC, eles poderiam diferir de uma população completamente livre de outras doenças.

Limitações do estudo

Este estudo teve algumas limitações. Primeiro, é transversal e, portanto, não pode ser usado para inferir casualidade; nosso objetivo, porém, foi testar a hipótese da associação entre hK1 e DAC. Segundo, como observado na Figura 1, 1.971 pacientes possivelmente elegíveis foram avaliados e somente 65 deles puderam ser incluídos no estudo, 43 com DAC e 22 sem DAC. A despeito disso, as características de nossa amostra foram semelhantes àquelas reportadas em estudos prévios com pacientes com DAC1. De acordo com o objetivo deste estudo, necessitávamos usar pacientes sem DAC, angiograficamente documentados, para a comparação da atividade amidásica específica da hK1 urinária nos pacientes com DAC angiograficamente documentada.

Conclusão

Como nos pacientes com IC e hipertensão, em comparação com controles normais, a atividade amidásica específica da hK1 urinária estava reduzida nessa população de pacientes com DAC angiograficamente documentada. Embora este pudesse ser um achado esperado, até agora nunca foi demonstrado. Se a atividade amidásica específica da hK1 urinária está reduzida nos pacientes com DAC, podemos sugerir que a atividade do SCC renal esteja também reduzida nos pacientes com DAC.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado pela FAPEMIG.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós‑graduação.

Agradecimentos

Pesquisa apoiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas gerais (FAPEMIG), processo CDS 923/98. Os autores agradecem a Aleida Nazareth Soares, pelo auxílio estatístico, e a Erick Ramalho, pela revisão do manuscrito.