Arq Bras Cardiol abc Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBC J3gmrtzP6TZTbv9JgrK8VZc S0066-782X2015002100151 S0066-782X2015005050059 10.5935/abc.20150059 Original Articles Tramadol Alleviates Myocardial Injury Induced by Acute Hindlimb Ischemia Reperfusion in Rats Takhtfooladi Hamed Ashrafzadeh 1 Asl Adel Haghighi Khiabanian 1 Shahzamani Mehran 2 Takhtfooladi Mohammad Ashrafzadeh 3 Allahverdi Amin 4 Khansari Mohammadreza 5 Islamic Azad University Department of Pathobiology, Science and Research Branch Tehran Iran Department of Pathobiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Isfahan University of Medical Sciences Department of Cardiovascular Surgery Tehran Iran Department of Cardiovascular Surgery, Isfahan University of Medical Sciences, Tehran - Iran Isfahan University of Medical Sciences Islamic Azad University Young Researchers and Elites Club, Science and Research Branch Tehran Iran Young Researchers and Elites Club, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Islamic Azad University Department of Surgery, Science and Research Branch Tehran Iran Department of Surgery, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Islamic Azad University Department of Physiology, Science and Research Branch Tehran Iran Department of Physiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Mailing Address: Mohammad Ashrafzadeh Takhtfooladi, Young Researchers and Elites Club, Science and Research Branch, Islamic Azad University. Postal Code 8177613343, Tehran, Iran. E-mail: dr_ashrafzadeh@yahoo.com

Author contributions

Conception and design of the research: Takhtfooladi HA, Shahzamani M. Acquisition of data: Takhtfooladi MA. Analysis and interpretation of the data: Takhtfooladi HA, Allahverdi A. Statistical analysis: Khansari M. Obtaining financing: Takhtfooladi MA. Writing of the manuscript: Takhtfooladi MA. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Khiabanian AH. Supervision / as the major investigador: Shahzamani M. Histological Analysis: Khiabanian AH. Help with technical procedures: Allahverdi A.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 02 06 2015 08 2015 105 2 151 159 02 01 2015 27 02 2015 11 03 2015 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Abstract Background:

Organ injury occurs not only during periods of ischemia but also during reperfusion. It is known that ischemia reperfusion (IR) causes both remote organ and local injuries.

 Objective:

This study evaluated the effects of tramadol on the heart as a remote organ after acute hindlimb IR.

 Methods:

Thirty healthy mature male Wistar rats were allocated randomly into three groups: Group I (sham), Group II (IR), and Group III (IR + tramadol). Ischemia was induced in anesthetized rats by left femoral artery clamping for 3 h, followed by 3 h of reperfusion. Tramadol (20 mg/kg, intravenous) was administered immediately prior to reperfusion. At the end of the reperfusion, animals were euthanized, and hearts were harvested for histological and biochemical examination.

 Results:

The levels of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx) were higher in Groups I and III than those in Group II (p < 0.05). In comparison with other groups, tissue malondialdehyde (MDA) levels in Group II were significantly increased (p < 0.05), and this increase was prevented by tramadol. Histopathological changes, including microscopic bleeding, edema, neutrophil infiltration, and necrosis, were scored. The total injuryscore in Group III was significantly decreased (p < 0.05) compared with Group II.

 Conclusion:

From the histological and biochemical perspectives, treatment with tramadol alleviated the myocardial injuries induced by skeletal muscle IR in this experimental model.

 Keywords Tramadol/ therapeutic use Heart Injuries Heart/physiopathology Reperfusion Injury Rats Introduction

Restoration of blood flow after a period of ischemia causes ischemia reperfusion (IR) injury. IR injury is a serious clinical problem that occurs in many diseases and surgeries, such as limb orthopedic surgery, organ transplantation, cardiopulmonary bypass, and hypovolaemic shock1,2. During IR, tissues are subjected to destructive proinflammatory cytokines and reactive oxygen species released by inflammatory cells, leading to inflammatory injury and cell apoptosis3,4. IR also affects the secondary organs, including liver5, heart6, kidney7, lung8, and even causes multiple organ failure, which is a common cause of mortality. Therefore, antioxidative, anti-inflammatory, and antiapoptotic agents to attenuate multiple organ injury induced by IR are urgently required.

Various investigators have demonstrated that the opioid pathway is involved in tissue preservation during hypoxia or ischemia, and this protection is mediated via the delta opioid receptor9,10. It has been shown that morphine has cardioprotective effects during IR11,12. Factors, such as respiratory depression and histamine release, are disadvantages of using morphine in the postoperative period of open heart surgery13.

Tramadol is a narcotic-like pain reliever drug as it has an unusual mechanism of action involving opioid, noradrenaline, and serotonin (5-hydroxytryptamine) systems of analgesia. It is certainly useful in the treatment of chronic and acute pain. Although it does not cause respiratory depression, the problems of nausea when used in clinically effective analgesic doses for severe pain and the risk of intra-operative awareness may represent significant disadvantages of tramadol14. Recent research discloses that tramadol decreases lipid peroxidation and regulates noradrenalin uptake; therefore, these therapeutic properties are used for the management of myocardial ischemia15.

In the past few years, the administration of tramadol was shown to protect against IR injuries in local and remote organs15-18. However, the role of tramadol in reducing injury in the myocardium after hindlimb IR has not been addressed yet. In this study, the effect of tramadol on myocardial injury after hindlimb IR was assessed by biochemical and histological changes in rats.

 Methods

Thirty healthy mature male Wistar rats weighing 250–300 g were purchased from the Pasteur Institute of Iran. All experimental procedures and protocols used in this investigation were reviewed and approved by the Committee of Ethics in Research with Animals at the Islamic Azad University Faculty of Veterinary Medicine. They were kept under constant room temperature of 20–22°C, relative humidity of 50%–60%, 12 h/12 h light/dark cycle, with ad libitum access to filtrated tap water and commercial food and were placed in individual plastic cages with soft bedding.

Experimental groups

The rats were randomly divided into three experimental groups of ten rats each (of these ten, five were used for biochemical assays and five for histological analysis): Group I (sham group) was subjected to all procedures, except arterial occlusion. The animals received 2 mL of 0.9% saline via the jugular vein. Group II (IR group) was subjected to IR. Two milliliters of 0.9% saline was administered immediately prior to the reperfusion period. Group III (IR + tramadol group) was subjected to IR. A solution of 20 mg/kg tramadol16 in 0.9% saline solution was administered, with a total volume of 2 mL.

 Anesthesia

The rats were weighed and anesthetized using an intramuscular injection of ketamine hydrochloride 10% and xylazine hydrochloride 2% (50 mg/kg and 10 mg/kg, respectively).

 Surgery

After induction of anesthesia, the animals were placed on a board, in a dorsal, recumbent position, with their thoracic and pelvic limbs immobilized with adhesive tape. The jugular vein was isolated and catheterized for the administration of heparin, tramadol, and normal saline. The left hindlimb was prepared for sterile surgery. A skin incision was made on medial surface of the left hindlimb and femoral artery was isolated and was clamped with a non-traumatic clamp for 3 h and followed by 3 h of reperfusion. Prior to the occlusion of the femoral artery, 250 IU heparin17 was administered via the jugular vein in order to prevent clotting. Rats were maintained in a dorsal, recumbent position and kept anesthetized (additional doses were given in case of necessity) throughout the duration of the ischemic period. Body temperature was maintained with a heating pad and monitored using a rectal thermometer. The vascular forceps was removed and the surgical site was routinely closed with 3/0 polypropylene sutures following the ischemic period. Subjects in Group I underwent a surgical procedure similar to the other groups but the femoral artery was not occluded.

 Specimen collection

At the end of the trial, rats were euthanized with an overdose of pentobarbital injection (300 mg/kg, intraperitoneal) and the hearts were rapidly excised.

 Histological analysis

For histological analysis, the hearts were fixed with 10% formalin and then embedded in paraffin and sectioned into 5-μm thick sections and stained with hematoxylin and eosin (H&E). The sections were examined in a semiquantitative manner, using 250× and 400× magnifications under a light microscope by a pathologist who was blinded to the experiment and data. The histological parameters, such as microscopic bleeding, edema, neutrophil infiltration, and necrosis, were scored according to the classification of Papoutsidakis et al.19 as shown in Table 1. Approximately ten fields of view were examined under each magnification. The total histological score for each specimen was determined by the sum of all the partial scores.

Histological grading (Papoutsidakis et al.)
0 1 2 3 Magnification
Necrosis None or 1-3 dead cells in < 3 FOV ≤ 3 dead cells per FOV in at least 3 FOV or 4-6 cells in no more than 3 FOV 4-6 dead cells per FOV in at least 4 FOV or > 6 cells in no more than 3 FOV > 6 dead cells in at least 4 FOV 400×
Polymorphonuclear leucocytes None or 1-3 cells in < 3 FOV ≤ 3 cells per FOV in at least 3 FOV or 4-6 cells in no more than 3 FOV 4-6 cells per FOV in at least 4 FOV or > 6 cells in no more than 3 FOV > 6 cells in at least 4 FOV 400×
Eosinophils None or 1-3 cells in < 3 FOV ≤ 3 cells per FOV in at least 3 FOV or 4-6 cells in no more than 3 FOV 4-6 cells per FOV in at least 4 FOV or > 6 cells in no more than 3 FOV > 6 cells in at least 4 FOV 400×
Loss of striation None or 1-5 cells in < 3 FOV ≤ 5 cells per FOV in at least 3 FOV or 5-10 cells in no more than 3 FOV 5-10 cells per FOV in at least 4 FOV or > 6 cells in no more than 3 FOV > 10 cells in at least 4 FOV 400×
Edema None < 10% of FOV in at least 3 FOV or > 10% in < 3 FOV 10%-30% of FOV in at least 3 FOV or > 30% in < 3 FOV > 30% of FOV in at least 3 FOV 250×
Microscopic bleeding None Present in <10% of FOV in at least 3 FOV or > 10% in < 3 FOV Present in 10%-30% of FOV in at least 3 FOV or > 30% in < 3 FOV Present in > 30% of FOV in at least 3 FOV 250×

FOV: fields of view

 Biochemical assays

Evidence of oxidative stress was determined from heart tissue homogenates using glutathione peroxidase (GPx), catalase (CAT), and superoxide dismutase (SOD) activities and the levels of malondialdehyde (MDA). Each heart was stored separately at −80°C until analysis. The tissues were homogenized in 0.1 M phospate buffer (pH 7.4) with an Ultra Turrax homogenizer. The homogenates were centrifuged at 5000 rpm at 4°C for 10 min; the supernatants were removed and assayed for MDA, GPx, and SOD activities. Tissue GPx and SOD activities were measured with a Hitachi 917 autoanalyser using commercial kits. SOD and GPx activities were expressed as U/mg protein in tissue samples. Tissue MDA levels were determined by the thiobarbituric acid method of Okhawa et al.20 MDA levels were expressed as nmol/mg protein in tissue samples. CAT activities were determined by measuring the decrease in hydrogen peroxide concentration at 230 nm by the method of Beutler21. CAT activity was expressed U/mg protein in tissue samples.

 Statistical analysis

Data were analyzed using SPSS statistical software package (version 18). Distribution of the groups was analyzed with one sample Kolmogorov–Smirnov test. The results were analyzed using analysis of variance for comparing multiple means (ANOVA) with post-hoc test analysis. Biochemical data were tested using the Kruskal–Wallis nonparametric test. Data are shown as the mean ± standard deviation and the significance level was 5%.

 Results

The experimental procedure was well tolerated and no animals died during the experiment.

Biochemical results

SOD, CAT, GPx, and MDA levels were measured in the heart tissues after 3 h of reperfusion. The levels of SOD, CAT, and GPx were significantly lower in Group II than those in the other groups (Figures 1–3). The reductions in the levels of these molecules were reversed by intravenous injection of tramadol. In comparison with other groups, tissue MDA levels in group II were significantly increased (Figure 4) and this was prevented by tramadol.

Superoxide dismutase (SOD; U/mg protein) in heart tissue between the groups studied. IR: ischemia reperfusion; and IR + T: ischemia reperfusion + tramadol. Data were expressed as mean ± SD. *: The significant digits in all group were p < 0.001. Catalase (CAT; U/mg protein) in heart tissue between the groups studied. IR: ischemia reperfusion and IR + T: ischemia reperfusion + tramadol. Data were expressed as mean ± SD. *: The significant digits in all group were p < 0.001 Glutathione peroxidase (GPX; U/mg protein) in heart tissue between the groups studied. IR: ischemia reperfusion and IR + T: ischemia reperfusion + tramadol. Data were expressed as mean ± SD. *: The significant digits in all group were p < 0.001 Malendialdehyde (MDA; nmol/mg protein) in heart tissue between the groups studied. IR: ischemia reperfusion and IR + T: ischemia reperfusion + tramadol. Data were expressed as mean ± SD. *: The significant digits in all group were p < 0.001 Histological results

Histopathological changes, including microscopic bleeding, edema, neutrophil infiltration, and coagulative necrosis, were scored. The total injury score in Group III was significantly decreased compared with Group II (Figure 5). Representative H&E-stained microscopic images of myocardial tissue from Groups II and III are presented in Figures 6 and 7, respectively.

Histological grading between the groups studied. IR: ischemia reperfusion and IR + T: ischemia reperfusion + tramadol. Data were expressed as mean ± SD. *: The significant digits in all group were p < 0.001 Photomicrograph of myocardium in the ischemia reperfusion group showing coagulative necrosis. Muscle cells with pyknotic nuclei were stained more deeply with eosin in the area of coagulative necrosis (hematoxylin and eosin staining, bar = 100 μm) Representative photomicrograph of myocardium in the ischemia reperfusion + tramadol group showing nearly normal structure (hematoxylin and eosin staining, bar = 100 μm) Discussion

The local and remote consequences of limb IR injury continue to be a serious clinical problem for general vascular surgeons, interventional radiologists, and cardiologists. Reperfusion of the skeletal muscle causes activation and adhesion of polymorphonuclear neutrophils, with the release of proinflammatory substances and the formation of free radicals, which include nitrogen-derived reactive nitrogen species and oxygen-derived reactive oxygen species, such as superoxide, peroxide, and hydroxyl radicals22-24. In addition, the proinflammatory and injurious factors activated in large amounts after skeletal muscle IR injury circulate via both the venous and lymph systems and induce distant organ injury25. This distant organ injury may be a component of systemic inflammatory response syndrome, acute respiratory distress syndrome, or multi‑organ dysfunction syndrome, which are initially triggered by muscle-derived inflammatory mediators26.

As far as we know, there are only a few reports demonstrating remote myocardial injury following skeletal muscle IR injury.8 The results of Takhtfooladi et al.27 indicated that hindlimb IR induces severe myocardial damage and that N-acetylcysteine has protective effects on the myocardium after hindlimb IR. Their data supported the concept that temporary occlusion of the femoral artery induced myocardial injury in rats27.

Previous studies have shown that the use of tramadol after IR in animals attenuated the oxidative injuries. Nagakannan et al.28 demonstrated the neuroprotective effect of tramadol against transient forebrain ischemia in rats. Tramadol provides a cardioprotective effect against myocardial IR in isolated rat hearts15. Wagner et al.29 suggested that tramadol given to humans in high doses actually caused myocardial injury, with increased troponin 1 and decreased inducible nitric oxide synthases expression, possibly due to the systemic undesirable serotonergic effect on diseased coronary arteries.

A recent study showed that ischemia for 2 h was sufficient to obtain a considerable degree of injury in skeletal muscles and the intravenous injection of 20 mg/kg tramadol prevented this deleterious effect16. Similarly, tramadol at a similar dose was found to be beneficial on lung injuries induced by skeletal muscle IR when femoral artery clamping was applied17. Furthermore, tramadol (20 mg/kg) was determined to be protective against cerebral injuries caused by hindlimb IR in rats18. There is growing evidence regarding tramadol’s beneficial effects in ameliorating IR; however, its role in reducing the damage in heart tissue after skeletal muscle IR has not been addressed yet.

In our study, the antioxidant potential of tramadol was investigated using MDA, GPx, CAT, and SOD contents in myocardial tissue following acute hindlimb IR. The MDA level is a marker of tissue lipid peroxidation. The amount of MDA accumulation in tissue is an index of the extent of lipid peroxidation and oxidative stress15,30. The lower levels of MDA observed in the group receiving tramadol compared with the IR group supports the hypothesis that tramadol may reduce oxidative stress by scavenging peroxyl radicals. GPx activity is known to depend on reduced levels of glutathione, glutathione transferase, and glutathione reductase. Activities of these enzymes play an essential role in the cellular defense against free radicals15,30. Data regarding SOD support a possible antioxidant effect of tramadol. The decreased levels of MDA and elevated levels of SOD activity in tissues may be evidence of decreased lipid peroxidation and increased antioxidant capacity.

The analysis of the myocardium under light microscopy revealed the presence of more edema, neutrophil infiltration, and coagulative necrosis in Group II than in Group III; this shows tramadol’s tendency to attenuate these injuries, a trend that has statistical significance. This observation was supported by Takhtfooladi et al.27, who demonstrated that temporary occlusion of the femoral artery in rats resulted in histological changes.

 Conclusion

The results of this study confirmed that the administration of tramadol significantly decreased myocardial injuries induced by hindlimb IR. This protective effect of tramadol is probably ascribed to anti-inflammatory activity. We underscore the necessity of human studies with tramadol that may be beneficial in preventing remote organ injury, particularly during surgical interventions.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

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Takhtfooladi MA Jahanshahi G Sotoudeh A Jahanshahi A Protective effects of N-acetylcysteine on myocardial injury induced by hind limb ischaemia reperfusion; Histological study in rat model Comp Clin Pathol 2014 23 1237 1240 28 Nagakannan P, Shivasharan BD, Thippeswamy BS, Veerapur VP. Effect of tramadol on behavioral alterations and lipid peroxidation after transient forebrain ischemia in rats. Toxicol Mech Methods. 2012; 22(9):674-8. Nagakannan P Shivasharan BD Thippeswamy BS Veerapur VP Effect of tramadol on behavioral alterations and lipid peroxidation after transient forebrain ischemia in rats Toxicol Mech Methods 2012 22 9 674 678 29 Wagner R, Piler P, Bedanova H, Adamek P, Grodecka L, Freiberger T. Myocardial injury is decreased by late remote ischaemic preconditioning and aggravated by tramadol in patients undergoing cardiac surgery: a randomised controlled trial, Interact. Cardiovasc. Thorac Surg . 2010;11(6):758-62. 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Polat A Emre MH Effects of melatonin or acetylsalicylic acid on gastric oxidative stress after bile duct ligation in rats J Gastroenerol 2006 41 5 433 439 Artigo Original Tramadol Atenua Lesões Miocárdicas Induzidas pela Reperfusão Pós- Isquêmica Aguda de Membros Posteriores em Ratos Takhtfooladi Hamed Ashrafzadeh 1 Asl Adel Haghighi Khiabanian 1 Shahzamani Mehran 2 Takhtfooladi Mohammad Ashrafzadeh 3 Allahverdi Amin 4 Khansari Mohammadreza 5 Islamic Azad University Department of Pathobiology, Science and Research Branch Tehran Iran Department of Pathobiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Isfahan University of Medical Sciences Department of Cardiovascular Surgery Tehran Iran Department of Cardiovascular Surgery, Isfahan University of Medical Sciences, Tehran - Iran Isfahan University of Medical Sciences Islamic Azad University Young Researchers and Elites Club, Science and Research Branch Tehran Iran Young Researchers and Elites Club, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Islamic Azad University Department of Surgery, Science and Research Branch Tehran Iran Department of Surgery, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Islamic Azad University Department of Physiology, Science and Research Branch Tehran Iran Department of Physiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran - Iran Islamic Azad University Correspondência: Mohammad Ashrafzadeh Takhtfooladi, Young Researchers and Elites Club, Science and Research Branch, Islamic Azad University. CEP 8177613343, Tehran, Iran. E-mail: dr_ashrafzadeh@yahoo.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Takhtfoo HA, Shahzamani M. Obtenção de dados: Takhtfoo MA. Análise e interpretação dos dados: Takhtfoo HA, Allahverdi A. Análise estatística: Khansari M. Obtenção de financiamento: Takhtfoo MA. Redação do manuscrito: Takhtfoo MA. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Khiabanian AH. Supervisão / como investigador principal: Shahzamani M. Análise Histológica: Khiabanian AH. Ajuda com procedimentos técnicos: Allahverdi A.

Potencial Conflito de Interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Resumo Fundamento:

Lesões a órgãos ocorrem não apenas durante períodos de isquemia, mas paradoxalmente, também durante a reperfusão. Sabe-se que a reperfusão pós-isquêmica (RPI) causa lesões tanto remotas quanto locais no órgão afetado.

 Objetivo:

Este estudo avaliou os efeitos do tramadol no coração como órgão remoto, após RPI aguda dos membros posteriores.

 Métodos:

Trinta ratos Wistar, machos, adultos e saudáveis, foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo I (controle), Grupo II (RPI) e Grupo III (RPI + tramadol). Isquemia foi induzida em ratos anestesiados através do pinçamento da artéria femoral esquerda por 3 horas, seguidas de 3 horas de reperfusão. Tramadol foi administrado (20 mg/kg, IV) imediatamente antes da reperfusão. Ao final da reperfusão, os animais foram sacrificados e seus corações coletados para exames histológicos e bioquímicos.

 Resultados:

Os níveis de superóxido-dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa-peroxidase (GPx) foram maiores nos grupos I e III que no grupo II (p < 0.05). Em comparação aos outros grupos, os níveis tissulares de malondialdeído (MDA) estavam significativamente mais elevados no grupo II (p < 0.05), o que foi evitado pelo uso de tramadol. Foram pontuadas as alterações histopatológicas, incluindo micro-hemorragia, edema, infiltração por neutrófilos e necrose. A pontuação total das lesões do grupo III foi significativamente menor (p < 0.05) em comparação ao grupo II.

 Conclusão:

Do ponto de vista histológico e bioquímico, o tratamento com tramadol diminuiu as lesões miocárdicas induzidas pela RPI da musculatura esquelética neste modelo experimental.

 Palavras-chave Tramadol/uso terapêutico Traumatismos Cardíacos Coração/fisiopatolologia Traumatismo por Referfusão Ratos Introdução

O restabelecimento do fluxo sanguíneo depois de um período de isquemia causa lesões por reperfusão pós-isquêmica (RPI). As lesões por RPI são um problema clínico sério, que ocorre em muitas patologias e cirurgias, tais como cirurgias ortopédicas em membros, transplantes de órgãos, circulação extracorpórea e choque hipovolêmico1,2. Durante a RPI, os tecidos são submetidos a citocinas pró-inflamatórias destrutivas e a espécies reativas de oxigênio, liberadas pelas células inflamatórias, que levam a lesões inflamatórias e apoptose celular3,4. A RPI também afeta os órgãos secundários, incluindo o fígado5, o coração6, os rins7, os pulmões8 e chega mesmo a causar falência múltipla de órgãos, uma causa comum de mortalidade. Portanto, é urgentemente necessária a busca de agentes antioxidantes, anti-inflamatórios e antiapoptóticos para atenuar as lesões a múltiplos órgãos que a RPI induz.

Diversos pesquisadores demonstraram que a via metabólica opioide está envolvida na preservação dos tecidos durante a hipóxia ou isquemia e que essa proteção é mediada pelo receptor opioide delta9,10. Provou-se que a morfina tem efeitos cardioprotetores durante a RPI11,12. Fatores tais como depressão respiratória e liberação de histamina são as desvantagens do uso da morfina no período pós-operatório da cirurgia cardíaca de peito aberto13.

O tramadol é um fármaco interessante, pois tem um mecanismo de ação incomum que envolve os sistemas de analgesia opioide, da noradrenalina e da serotonina (5-hidroxitriptamina). Ele certamente é útil no tratamento de dores crônicas e agudas. Embora o tramadol não cause depressão respiratória, os problemas de náusea quando usado em doses analgésicas clinicamente eficazes contra dores severas, além do risco de consciência durante a operação, podem representar desvantagens significativas desse fármaco14. Pesquisas recentes revelam que o tramadol diminui a peroxidação de lipídios e regula a reabsorção de noradrenalina; portanto, essas propriedades terapêuticas são usadas no manejo da isquemia do miocárdio15.

Nos últimos anos, o tramadol demonstrou proteger órgãos locais e remotos contra lesões por RPI15–18. Entretanto, o papel do tramadol na redução de lesões do miocárdio após RPI de membros posteriores ainda não foi abordado. Neste estudo, foi examinado o efeito do tramadol em lesões do miocárdio após RPI, através da avaliação de alterações bioquímicas e histológicas em ratos.

 Métodos

Trinta ratos Wistar machos, saudáveis e adultos, pesando entre 250–300 g, foram comprados do Instituto Pasteur do Irã. Todos os procedimentos e protocolos utilizados nesta pesquisa foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisas com Animais da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Islâmica Azad. Os animais foram mantidos sob uma temperatura ambiente constante de 20–22˚C, umidade relativa de 50–60%, ciclos claro-escuro de 12 h/12 h e acesso a água de torneira filtrada e ração comercial ad libitum. Os ratos foram colocados em gaiolas plásticas individuais com assoalho macio.

Grupos experimentais

Os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos experimentais de dez ratos cada um (entre os 10 de cada grupo, cinco foram usados para provas bioquímicas e cinco para análise histológica). O Grupo I (de controle) foi submetido a todos os procedimentos, exceto a oclusão arterial. Os animais receberam 2 mL de soro fisiológico a 0,9% pela veia jugular. O Grupo II foi submetido à RPI. 2 mL de soro fisiológico a 0,9% foram administrados imediatamente antes do período de reperfusão. O Grupo III (IR + tramadol) também foi submetido à RPI e recebeu uma solução de 20 mg/kg de tramadol16 em soro fisiológico a 0,9%, com um volume total de 2 mL.

 Anestesia

Os ratos foram pesados e anestesiados através de uma injeção intramuscular de cloridrato de cetamina a 10% e cloridrato de xilazina a 2% (respectivamente, 50 mg/kg e 10 mg/kg).

 Cirurgia

Depois da indução da anestesia, os animais foram colocados numa plataforma, em decúbito dorsal, com seus membros torácicos e pélvicos imobilizados com fita adesiva. A veia jugular foi isolada e cateterizada para a administração de heparina, tramadol e soro fisiológico comum. O membro posterior esquerdo foi preparado para cirurgia estéril. Foi feita uma incisão cutânea na superfície medial do membro posterior esquerdo e a artéria femoral foi isolada e pinçada com uma pinça não traumática durante 3 h, seguidas de 3 h de reperfusão. Antes da oclusão da artéria femoral, 250 UI de heparina 17 foram administradas pela veia jugular, para evitar a coagulação. Os ratos foram mantidos em decúbito dorsal e anestesiados (doses adicionais foram administradas quando necessário) por toda a duração do período de isquemia. A temperatura corporal foi mantida com uma almofada térmica e monitorada com um termômetro retal. O fórceps vascular foi removido e o local da cirurgia fechado de forma rotineira com suturas 3-0 de polipropileno depois do período de isquemia. Os indivíduos do Grupo I foram submetidos a um procedimento cirúrgico semelhante ao dos outros grupos, mas a artéria femoral não foi ocluída.

 Coleta de amostras

Ao final do procedimento, os ratos foram sacrificados com a injeção de uma overdose de pentobarbital (300 mg/kg, i.p.), e os corações foram rapidamente extraídos.

 Análise histológica

Para a análise histológica, os corações foram fixados com formol a 10%, depois incluídos em parafina, cortados em seções de 5 μm de espessura e corados com hematoxilina e eosina. As seções foram examinadas de forma semiquantitativa, usando ampliações de 250× e 400× num microscópio óptico por um patologista sem conhecimento do experimento e dos dados. Os parâmetros histológicos, tais como micro-hemorragia, edema, infiltração por neutrófilos e necrose, foram pontuados de acordo com a classificação de Papoutsidakis e cols.19, como mostra a Tabela 1. Foram examinados aproximadamente dez campos de visualização em cada ampliação. A pontuação histológica total de cada amostra foi determinada pela soma de todas as pontuações parciais.

Graduação histológica (Papoutsidakis e cols.)
0 1 2 3 Ampliação
Necrose Nenhuma ou 1-3 células mortas em menos de 3 campos de visualização ≤ 3 células mortas por campo em pelo menos 3 campos, ou 4-6 células mortas em não mais que 3 campos 4-6 células mortas por campo em pelo menos 4 campos, ou > 6 células mortas em não mais que 3 campos > 6 células mortas em pelo menos 4 campos 400×
Leucócitos polimorfonucleares Nenhum, ou 1-3 células em < 3 campos ≤ 3 células por campo em pelo menos 3 campos, ou 4-6 células em não mais que 3 campos 4-6 células por campo em pelo menos 4 campos, ou > 6 células em não mais que 3 campos > 6 células em pelo menos 4 campos 400×
Eosinófilos Nenhum, ou 1-3 células em < 3 campos ≤ 3 células por campo em pelo menos 3 campos, ou 4-6 células em não mais que 3 campos 4-6 células por campo em pelo menos 4 campos, ou > 6 células em não mais que 3 campos > 6 células em pelo menos 4 campos 400×
Perda de estriação Nenhuma, ou 1-5 células em < 3 campos ≤ 5 células por campo em pelo menos 3 campos, ou 5-10 células em não mais que 3 campos 5-10 células por campo em pelo menos 4 campos, ou > 6 células em não mais que 3 campos > 10 células em pelo menos 4 campos 400×
Edema Nenhum < 10 % dos campos em pelo menos 3 campos, ou > 10 % em < 3 campos 10-30% dos campos em pelo menos 3 campos, ou > 30% em < 3 campos > 30% dos campos em pelo menos 3 campos 250×
Micro-hemorragia Nenhuma Presente em < 10% dos campos em pelo menos 3 campos, ou > 10% em < 3 campos Presente em 10-30% dos campos em pelo menos 3 campos, ou > 30% em < 3 campos Presente em > 30% dos campos em pelo menos 3 campos 250×

FOV: campos de visão

 Exame bioquímico

As evidências de estresse oxidativo foram determinadas a partir de homogeneizados de tecido cardíaco através das atividades da glutationa-peroxidase (GPx), catalase (CAT) e superóxido-dismutase (SOD), e dos níveis de malondialdeído (MDA). Cada coração foi mantido num recipiente separado a -80˚C até o momento da análise. Os tecidos foram homogeneizados numa solução tampão de fosfato 0,1 M (pH 7.4) com um homogeneizador Ultra Turrax. Os homogeneizados foram centrifugados a 5000 rpm e a +4˚C por 10 min, e os sobrenadantes foram removidos e examinados quanto ao MDA e às atividades de GPx e SOD. As atividades tissulares de GPx e SOD foram medidas com um autoanalisador Hitachi 917, usando kits comerciais. As atividades de SOD e GPx foram expressas em U/mg de proteína nas amostras de tecido. Os níveis tissulares de MDA foram determinados pelo método do ácido tiobarbitúrico de Okhawa e cols.20 Os níveis de MDA foram expressos como nmol/mg de proteína nas amostras de tecido. As atividades de CAT foram determinadas pela medição da diminuição da concentração de peróxido de hidrogênio a 230 nm, pelo método de Beutler21. A atividade de CAT foi expressa em U/mg de proteína nas amostras de tecido.

 Análise estatística

Os dados foram analisados com o pacote de software estatístico SPSS (versão 18). A distribuição dos grupos foi analisada com um teste de Kolmogorov–Smirnov para uma amostra. Os resultados foram submetidos a uma análise de variância para a comparação de múltiplas médias (ANOVA), com análise post–hoc do teste. Os dados bioquímicos foram submetidos ao teste não paramétrico de diferença Kruskal–Wallis. Os dados são apresentados como média ± desvio-padrão e o nível de significância foi de 5%.

 Resultados

O procedimento experimental foi bem tolerado e nenhum animal foi morto durante o experimento.

Resultados bioquímicos

Os níveis de SOD, CAT, GPx e MDA foram medidos nos tecidos cardíacos depois de 3 h de reperfusão. Os níveis de SOD, CAT e GPx foram significativamente menores no Grupo II que nos outros grupos (Figuras 1–3). Por outro lado, a lesão por RPI atenuou os níveis dessas moléculas e essa atenuação foi revertida pela injeção intravenosa de tramadol. Em comparação com os outros grupos, os níveis tissulares de MDA no Grupo II foram significativamente aumentados (Figure 4), o que foi evitado pelo tramadol.

SOD, superóxido-dismutase (U/mg de proteína) no tecido cardíaco entre os grupos estudados. *RPI: reperfusão pós-isquêmica; RPI+T: reperfusão pós-isquêmica + tramadol. Dados expressos como média ± desvio-padrão. *: p < 0,00 CAT, catalase (U/mg de proteína) no tecido cardíaco entre os grupos estudados. *RPI: reperfusão pós-isquêmica; RPI+T: reperfusão pós-isquêmica + tramadol. Dados expressos como média ± desvio-padrão. *: p < 0,00. GPx, glutationa-peroxidase (U/mg de proteína) no tecido cardíaco entre os grupos estudados. *RPI: reperfusão pós-isquêmica; RPI+T: reperfusão pós-isquêmica + tramadol. Dados expressos como média ± desvio-padrão. *: p < 0,00. MDA, malondialdeído (nmol/mg de proteína) no tecido cardíaco entre os grupos estudados. RPI: reperfusão pós-isquêmica; RPI+T: reperfusão pós-isquêmica + tramadol. Dados expressos como média ± desvio-padrão. *: p < 0,00. Resultados histológicos

As alterações histopatológicas, incluindo micro-hemorragia, edema, infiltração por neutrófilos e necrose coagulativa, foram pontuadas. A pontuação total das lesões no Grupo III foi significativamente menor que a do Grupo II (Figura 5). Imagens microscópicas representativas do miocárdio nos Grupos II e III, coradas por hematoxilina e eosina, são apresentadas nas Figuras 6 e 7, respectivamente.

Graduação histológica entre os grupos estudados. RPI: reperfusão pós-isquêmica; RPI+T: reperfusão pós-isquêmica + tramadol. Dados expressos como média ± desvio-padrão. *: p < 0,00 Microfotografia do miocárdio no grupo com reperfusão pós-isquêmica, mostrando necrose coagulativa. As células musculares com núcleos picnóticos foram coradas mais profundamente pela eosina na área de necrose coagulativa (coloração por hematoxilina e eosina; traço de referência = 100 μm) Microfotografia representativa do miocárdio no grupo com reperfusão pós-isquêmica + tramadol, mostrando uma estrutura quase normal (coloração por hematoxilina e eosina; traço de referência = 100 μm) Discussão

As consequências locais e remotas de lesões aos membros por RPI continuam sendo um problema clínico sério para cirurgiões gerais vasculares, radiologistas intervencionistas e cardiologistas. A reperfusão do músculo esquelético provoca ativação e adesão de neutrófilos polimorfonucleares, com a liberação de substâncias pró-inflamatórias e a formação de radicais livres, que são espécies reativas derivadas do nitrogênio ou do oxigênio, tais como superóxido, peróxido e radicais hidroxila22–24. Além disto, os fatores de lesão pró-inflamatórios e tissulares, ativados em grandes quantidades após lesões dos músculos esqueléticos por RPI, circulam tanto através do sistema venoso quanto do linfático e induzem lesões em órgãos distantes25. Essa lesão de órgãos distantes às vezes pode ser um componente de uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica, de desconforto respiratório agudo ou de disfunção de múltiplos órgãos, que inicialmente são desencadeadas por mediadores inflamatórios derivados dos músculos26.

Até onde sabemos, há apenas alguns relatos que demonstram lesões remotas do miocárdio em seguida a lesões de músculos esqueléticos por RPI.8 Os resultados de Takhtfooladi e cols.27 indicam que a RPI de membros posteriores induz danos severos ao miocárdio e que a N-acetilcisteína possui efeitos protetores contra lesões do miocárdio após RPI de membros posteriores. Seus dados apoiam esta visão de que a oclusão temporária da artéria femoral induz lesões do miocárdio em ratos27.

Estudos anteriores demonstraram que o uso do tramadol depois da RPI em animais atenuou as lesões oxidativas. Nagakannane e cols.28 demonstraram o efeito neuroprotetor do tramadol contra a isquemia temporária do cérebro anterior em ratos. O tramadol proporciona um efeito cardioprotetor contra a RPI do miocárdio em corações isolados de ratos15. Wagner e cols.29 sugeriram que o tramadol administrado a seres humanos em altas doses na verdade provocava lesões do miocárdio, com aumento da expressão da troponina 1 e diminuição da expressão induzível das sintases do óxido nítrico, possivelmente devido a um efeito serotonérgico sistêmico indesejável nas artérias coronárias doentes.

Um estudo recente mostrou que uma isquemia de 2 h era suficiente para obter um grau considerável de lesão em músculos esqueléticos. A injeção intravenosa de 20 mg/kg de tramadol evitou esse efeito deletério16. De forma semelhante, descobriu-se que o tramadol, numa dose semelhante, era benéfico em lesões pulmonares induzidas por RPI de músculos esqueléticos através do pinçamento da artéria femoral17. Além disto, determinou-se que o tramadol (20 mg/kg) protegia contra lesões cerebrais causadas por RPI de membros posteriores em ratos18. Há evidências crescentes com relação aos efeitos benéficos do tramadol na melhora após RPI. Entretanto, seu papel na redução dos danos ao coração após RPI de músculos esqueléticos ainda não havia sido abordado.

No nosso estudo, o potencial antioxidante do tramadol foi investigado analisando os teores de MDA, GPx, CAT e SOD no tecido miocárdico após RPI aguda de membros posteriores. O nível de MDA é um marcador da peroxidação de lipídios nos tecidos. A quantidade de MDA acumulado nos tecidos é um indicador da extensão da peroxidação de lipídios e do estresse oxidativo15,30. A presença de níveis reduzidos de MDA nos grupos que receberam tramadol, comparados aos outros grupos que sofreram RPI, apoia a hipótese de que o tramadol apresenta efeitos de redução do estresse oxidativo, por remover radicais peroxila. Sabe-se que a atividade de GPx depende de níveis reduzidos de glutationa, glutationa-transferase e glutationa-redutase. As atividades destas enzimas desempenham um papel essencial na defesa celular contra os radicais livres 15,30. Os dados quanto à SOD apoiaram a probabilidade de um efeito antioxidante do tramadol. Os teores diminuídos de MDA e os níveis aumentados de atividade da SOD nos tecidos podem ser uma evidência de menor peroxidação de lipídios e de maior capacidade antioxidante.

A análise do miocárdio sob microscopia óptica revelou a presença de edema, infiltração por neutrófilos e necrose coagulativa no Grupo II, onde a incidência dessas lesões foi maior que no Grupo III. Isto demonstra que o tramadol tende a atenuar essas lesões; essa tendência é estatisticamente significativa. Esta observação é apoiada por Takhtfooladi e cols.27, que demonstraram que a oclusão temporária da artéria femoral de ratos resultou em alterações histológicas.

 Conclusão

Os resultados deste estudo confirmaram que a administração de tramadol diminuiu significativamente as lesões miocárdicas induzidas pela RPI de membros posteriores. Este efeito protetor do tramadol deve-se provavelmente a uma atividade anti-inflamatória. Ressaltamos a necessidade de estudos com o tramadol em seres humanos, que seriam hipoteticamente benéficos na prevenção de lesões a órgãos remotos, em especial durante intervenções cirúrgicas.

Fontes de financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.