Arq Bras CardiolabcArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de Cardiologia - SBChFhQwg4R6fjkYBYpnBY9QQyS0066-782X2015002100139S0066-782X201500505009010.5935/abc.20150090Original ArticlesScreening for Fabry Disease in Left Ventricular Hypertrophy: Documentation of a Novel MutationBaptistaAna1MagalhãesPedro1LeãoSílvia1CarvalhoSofia1MateusPedro1MoreiraIlídio1Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto DouroCentro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto DouroUnidade de Vila RealPortugalCentro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro, Unidade de Vila Real - PortugalMailing Address: Ana Baptista, CHTMAD. Avenida da Noruega, Vila Real. Postal Code 5000, Vila Real - Portugal. E-mail: baptista_ana@hotmail.com
Author contributions
Conception and design of the research and Writing of the manuscript: Baptista A, Mateus P; Acquisition of data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Baptista A, Magalhães P, Leão S, Carvalho S, Mateus P; Analysis and interpretation of the data: Baptista A, Magalhães P; Statistical analysis: Baptista A, Leão S.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
070820150820151052139144171120142703201517042015This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution NonCommercial License which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium provided the original work is properly cited.AbstractBackground:
Fabry disease is a lysosomal storage disease caused by enzyme α-galactosidase A deficiency as a result of mutations in the GLA gene. Cardiac involvement is characterized by progressive left ventricular hypertrophy.
Objective:
To estimate the prevalence of Fabry disease in a population with left ventricular hypertrophy.
Methods:
The patients were assessed for the presence of left ventricular hypertrophy defined as a left ventricular mass index ≥ 96 g/m2 for women or ≥ 116 g/m2 for men. Severe aortic stenosis and arterial hypertension with mild left ventricular hypertrophy were exclusion criteria. All patients included were assessed for enzyme α-galactosidase A activity using dry spot testing. Genetic study was performed whenever the enzyme activity was decreased.
Results:
A total of 47 patients with a mean left ventricular mass index of 141.1 g/m2 (± 28.5; 99.2 to 228.5 g/m2] were included. Most of the patients were females (51.1%). Nine (19.1%) showed decreased α-galactosidase A activity, but only one positive genetic test − [GLA] c.785G>T; p.W262L (exon 5), a mutation not previously described in the literature. This clinical investigation was able to establish the association between the mutation and the clinical presentation.
Conclusion:
In a population of patients with left ventricular hypertrophy, we documented a Fabry disease prevalence of 2.1%. This novel case was defined in the sequence of a mutation of unknown meaning in the GLA gene with further pathogenicity study. Thus, this study permitted the definition of a novel causal mutation for Fabry disease - [GLA] c.785G>T; p.W262L (exon 5).
KeywordsFabry disease / complicationsHypertrophy, left ventricularAlpha-Galactosidase / geneticsIntroduction
Establishing the cause of left ventricular hypertrophy (LVH) is a common challenge in clinical practice, given its high prevalence and the variety of diseases with which it may be associated. This is particularly relevant from the clinical standpoint because of the therapeutic implications regarding the different differential diagnoses.
Fabry disease (FD) is a rare X-linked disease caused by enzyme α-Galactosidase A (Gal A) deficiency as a result of GLA gene mutations. Most families present with a "private" mutation found only in that family and, thus, hundreds of causal mutations are currently known. This multiplicity of mutations may contribute to variations in the residual enzyme activity and the different clinical presentations. Enzyme Gal-A deficiency leads to a progressive tissue accumulation of glycosphingolipids, especially of globotriaosylceramide (Gb3), resulting in organ failure. The organs more frequently involved are the kidneys, heart, skin, central and autonomic nervous systems, eyes and auditory system. As regards the cardiac manifestations, Gb3 accumulation leads to LVH, whose etiology is difficult to distinguish from others using the common cardiac imaging methods, especially echocardiography. Currently, suspecting lysosomal storage diseases, namely FD, is key given the availability of enzyme replacement therapy, which brings an impact on disease progression. Thus, innumerable studies have been conducted to assess the prevalence of FD in risk populations. The objective of this study was to evaluate the prevalence of FD in a population of patients with LVH.
Methods
The study was conducted between October 2010 and February 2011 in a hospital center in the region of Tras-os-Montes and Alto Douro, northern Portugal, after approval of the Institutional Ethics Committee. All patients with age > 18 years referred for transthoracic echocardiography (TTE) were considered eligible for the FD screening program. They were included if there was evidence of LVH, defined as a left ventricular (LV) mass / body surface area (BSA) ≥ 96 g/m2, for women, and ≥ 116 g/m2, for men. LV mass was calculated using the formula:
Linear measurements during diastole obtained from two-dimensional echocardiography were used for the calculation. The exclusion criteria were presence of severe aortic stenosis and arterial hypertension when associated with mild LVH - LV mass/BSA < 109 g/m2 (women) and < 132 g/m2 (men), regardless of the hypertension stage. All patients enrolled gave written informed consent prior to undergoing clinical assessment, investigation of multiorgan involvement, and determination of enzyme Gal-A activity.
Clinical assessment
After the inclusion criteria were defined, brief history taking focused on the investigation of symptoms suggestive of FD and multiorgan involvement, especially cardiac, was performed. Thus, the questionnaire included the assessment of history of bouts of pain in extremities; gastrointestinal transit or sweating abnormalities; history of stroke; and presence of shortness of breath/orthopnea or chest pain. Next, blood pressure (BP), height and weight measurements were taken, and angiokeratomas were investigated. Clinical assessment did not include family history for cardiovascular or renal diseases.
Investigation of multiorgan involvement
The cardiac investigation was complemented by electrocardiogram (ECG) - assessment of rhythm, heart rate (HR), PR interval, conduction disturbances, and voltage criteria for LHV (Sokolow-Lyon criteria). For the investigation of renal involvement, BUN and serum creatinine levels were determined, with further estimate of the glomerular filtration rate (GFR) using the MDRD formula (Modification of Diet in Renal Disease). Random urine specimens were also collected to rule out albuminuria, using the microalbuminuria/urine creatinine ratio.
Enzyme Gal-A activity determination
Screening for FD was based on the dried blood spot (DBS) test, with four blood spots placed in a filter paper and allowed to dry at room temperature. Enzyme Gal-A activity was determined in an outside laboratory (laboratory of metabolism, Hamburg University Medical Center). Values between 200 and 2000 pmol/spot*20 h were considered normal.
Genetic screening
Whenever enzyme Gal-A activity was reduced, genetic screening was performed using 10 mL of blood collected in an EDTA tube with further GLA gene sequencing in the Center of Medical Genetics Doctor Jacinto de Magalhaes.
Data were submitted to descriptive analysis using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) program, version 19.0 (SPSS Statistics IBM®), and were expressed as numbers or percentages or mean values ± standard deviation (SD). 95% confidence intervals (95% CI) were used when applicable.
Results
During the study period, 75 patients had inclusion criteria; of these, 28 (37.3%) were excluded for showing arterial hypertension with mild LVH (21 patients), or severe aortic stenosis (7 patients). Screening for FD was then performed in 47 patients, of whom 24 were women (51.1%). The mean age of patients was 65.6 ± 14.5 years (ranging from 25 to 90 years). As regards their ventricular mass, the mean LV mass/BSA was 141.1 ± 28.5 g/m2 (99.2 to 228.5 g/m2) and the mean septal and posterior wall thickness was 15.3 ± 3.4 mm (10 to 24 mm) and 12.9 ± 2.1 mm (9 to 20 mm), respectively.
Clinical characterization of the study population
Most of the study population assessed had a known history of arterial hypertension (n = 35; 74.5%), with a mean systolic BP recorded on the day of assessment of 144.2 ± 30.3 mmHg (96 to 216 mmHg). The summary review of the clinical history suggested the presence of bouts of pain in the extremities in 27.7% of patients, sweating abnormalities in 4.3%, and gastrointestinal transit abnormalities in 29.8%. No skin lesions suggestive of angiokeratoma were found in any of the patients. Eight patients (17.0%) had history of stroke, 66.0% presented with dyspnea, and 40.4% with chest pain.
Of the patients assessed, three (6.4%) were on a regular dialysis program, with the population showing a mean GFR of 81.7 ± 50.2 mL/min/1.73m2 (3.9 to 232.6 mL/min/1.73m2), as estimated from mean creatinine values of 1.4 ± 2.1 mg/dL (0.4 to 14.6 mg/dL). The prevalences of microalbuminuria and proteinuria were of 25.5% and 55.4%, respectively. Electrocardiographic assessment showed normal sinus rhythm in most of the patients (63.8%), with the remaining showing atrial fibrillation (19.1%) or pacemaker rhythm (17.1%). Their mean HR was 71 ± 15 bpm (45 to 110 bpm), PR interval of 169 ± 34 miliseconds (108 to 250 miliseconds), prevalence of atrioventricular and intraventricular conduction disturbance of 8.5% and 23.4%, respectively, with 40.4% of patients with criteria for LVH.
Nine patients, all females, showed reduced enzyme Gal-A activity (19.1%), and were therefore referred for genetic screening. Only one of the genetic studies was able to document a GLA gene mutation. Thus, the incidence of false positives using the enzymatic test with DBS was 88.9%.
Description of the case showing GLA gene mutation
The single positive genetic test showed heterozygosis for [GLA] c.785G>T; p.W262L (exon 5) mutation, which had never been previously described in the literature as the cause of FD. The patient was a 46-year-old female recently diagnosed with arterial hypertension, who had been referred for TTE because of a brain stem stroke. In the clinical assessment, she had history of frequent episodes of bouts of pain in the extremities, especially in hands, and gastrointestinal transit abnormalities, but no angiokeratoma. The ECG revealed normal sinus rhythm, HR of 76 bpm and voltage criteria for LVH with an overload pattern. The echocardiogram showed moderate concentric LVH with grade-II diastolic dysfunction. Renal assessment revealed the presence of microalbuminuria with preserved renal function (creatinine level of 0.6 mg/dL).
Although the manifestations were suggestive of FD (microalbuminuria and LVH), they could also be explained by the history of hypertension and, therefore, the pathogenicity of this novel mutation had to be documented. This process involved three key steps: genetic information, demonstration of accumulation of Gb3 deposits, and family screening. Regarding the study of the mutation, the bioinformatics tools showed that it was causal, and the hypothesis of polymorphism was ruled out when it was not found in the study of 100 individuals from the population. Another aspect corroborating causality was the fact that other causal mutations had already been described in its proximity1,2. Tissue accumulation of Gb3 was demonstrated by cutaneous biopsy, which showed rare lysosomal inclusions with characteristics typical of Gb3 deposits in smooth muscle fibers and increased blood concentrations of lysoGb3. As regards the family study (Figure 1), it was negative for all her siblings, but positive for her daughter, who, at the age of 30 years, also presented with manifestations suggestive of FD: cornea verticilatta, peripheral neuropathic pain, and slightly increased proteins in the 24-hour urine, thus confirming the association of the mutation with the manifestations suggestive of FD. The investigation also included ruling out the involvement of other organs not defined by the study algorithm (dermatological, ophthalmological, ENT and pulmonary assessments were normal) and additional characterization by MRI of cardiac involvement, which demonstrated LVH with no late enhancement, and brain involvement, which demonstrated white matter damage. Blood pressure was also documented by ambulatory BP monitoring under medication. Thus, in a study on FD screening in patients with LVH, one case of FD was documented in association with a causal mutation - [GLA] c.785G>T; p.W262L (exon 5), which had not been previously described in the literature and is associated with neurological, cardiac and renal involvement. The Organizing Committee of Treatment of Lysosomal Storage Disorders approved enzyme replacement therapy for the patient.
Screening for Fabry Disease in Left Ventricular Hypertrophy: Documentation of a Novel Mutation
Discussion
In a population of patients with LVH, after exclusion of cases with severe aortic stenosis and arterial hypertension associated with mild LVH, we documented a FD prevalence of 2.1% (95%CI: 0.1-11.3%). This prevalence is similar to that found in other screening studies in high-risk populations (populations selected with LVH, stroke and patients undergoing dialysis)3, which reported prevalence rates much higher than that estimated in the general population of 0.02 to 0.09 per 10 thousand individuals4. However, the prevalence found should be carefully interpreted taking into consideration the small number of patients analyzed in this study. The importance of screening studies lies on two major factors. First, they seek to increase awareness on FD in target groups, in which there is a higher probability of detecting cases, and thus contribute for the definition of disease prevalence. Second, these studies also provide the opportunity to detect the disease at earlier stages, at which enzyme replacement therapy is more effective.
The available studies on the prevalence of FD in populations with LVH used different criteria for patient inclusion, whether because of different forms of assessing LVH, or because of the cutoff values defined. Most of the studies used the maximum ventricular wall thickness threshold of 13 or 15mm4 as an inclusion criterion, unlike in the present study, in which patient selection was based on the ventricular mass index. Although the typical manifestation of the cardiac involvement in FD is concentric LVH, several cases of asymmetrical LVH have already been documented5. To corroborate this fact, there are studies demonstrating a FD incidence of approximately 1.0% in populations diagnosed with hypertrophic cardiomyopathy6, in which asymmetrical LVH is the most frequent form of presentation. Thus, in the present study, patients with possible FD may have been excluded because increased thickness of a single ventricular wall - usually the ventricular septum, may be not associated with increased LV mass. However, this variable -left ventricular mass index, is one of the main criteria for monitoring the effectiveness of enzyme replacement therapy in the reduction of LVH7, and this is why it was used as a criterion for patient selection.
In this study, enzyme Gal-A activity as assessed by DBS was the method used for FD screening, whose result may be normal in up to 40% of women with FD8. Interpretation of the enzymatic assay is more complicated in females, because the enzyme activity may be normal or at borderline lower limits because of the phenomenon of X-chromosome inactivation (i.e., the permanent epigenetical silencing of one X chromosome creating cellular mosaicism, which explains the disease presentation in women - of delayed onset and with a higher probability of a single-organ involvement)9. This leads to a study limitation: the possibility of underestimating FD prevalence because of false negatives among women although, interestingly, the only positive result occurred in a female patient. The use of the DBS test was based on the fact that it is an easily-accessible screening method in the clinical practice and has advantages over enzyme activity assessment in leukocytes or fibroblasts. First, it requires only a few blood spots for dose determination and, second, it permits easy and quick specimen shipping to specialized laboratories, an important aspect in our study center, where there is no laboratory dedicated to lysosomal storage diseases. Thus, we were interested in analyzing the DBS behavior to determine its further inclusion in the assessment of female patients with suspected FD. In addition to the known false negatives - a reality for which clinicians are aware of, given documentation from multiple studies, as previously mentioned, this screening showed another limitation of the DBS test: a high incidence of false positives, which has been infrequently reported in studies10. Only one in nine of the patients with reduced enzyme activity (all females) had FD confirmed by genetic testing, thus resulting in 88.9% of false positives. Therefore, in the current scenario in which costs are weighted in clinical investigation, this study questions the usefulness of DBS in female patients with suspected FD (high rate of false negatives and false positives).
We observed a low incidence of unspecific manifestations, namely sweating disorders; however, gastrointestinal abnormalities and bouts of pain had an incidence of approximately 30%. This is probably explained by the fact that these are common manifestations of more prevalent diseases such as musculoskeletal and digestive disorders. On the other hand, manifestations of possible multiorgan involvement such as albuminuria had a high incidence, since they are also possible manifestations of hypertensive disease - a common finding in the study population. The assessment of these clinical and laboratory factors, which are common manifestations of FD, is a distinguishing feature of this study. Its inclusion in the screening study, unlike the usual genetic study alone in risk populations, was motivated by the interest in the definition of associations of factors with a higher probability of FD. Thus, the study results could be applied to the clinical practice, such as in the integration of findings in algorithms of etiologic studies on LVH. This way, we could limit genetic studies to certain groups selected according to criteria corroborated by a clinical trial. However, this was not possible because the sample size and the low incidence of FD limited the study power to draw conclusions on the improvement of pre-test probability. These findings were ultimately useful in the assessment of the significance of de novo mutations, as explained bellow.
To date, more than 600 GLA gene variants have been described and most of them is unique for each family. However, as more studies on FD screening started to be conducted, an unexpected high number of individuals with mutations of unknown significance was observed, with a prevalence rate estimated at 0.6% in high-risk populations, although only 0.12% have typical clinical manifestations or decreased enzyme activity11. Thus, the significance of these mutations is not easy to define, because many of the screening studies involve high-risk populations that express one single specific symptom - the inclusion criteria, LVH in the case of this study and, thus, the symptom may be not related to the GLA gene variant detected or may be an FD manifestation in its non-classic form. In this study on FD screening in a predominantly hypertensive population (74.5%) with LVH, this became a clear issue. We found a GLA gene mutation not previously described in the literature - [GLA] c.785G>T; p.W262L (exon 5), whose significance could not be defined based on the finding of LVH on TTE. The patient had been diagnosed with hypertension and, thus, the LVH findings along with the presence of microalbuminuria and history of stroke could be explained either by FD or by arterial hypertension with target-organ involvement, given that the manifestations can overlap in both situations. This led to a clinical investigation focused on proving the pathogenicity associated with the mutation, which involved three key steps: bioinformatics techniques, histological diagnosis, and family screening. The assessment of the occasional pathogenicity of the mutation involved the documentation of its absence in the study of 100 chromosomes of individuals from the general population, thus excluding the hypothesis of polymorphism. Then, we proceeded to a literature review in the search for mutations described in its proximity, which also increases the probability of pathogenicity, and found the p. W262C (c.786G>C) mutation documented by Schafer et al.12, and the p. W262X (c.785G>A) mutation described by Shabbeer et al.13. The use of bioinformatics tools defined the mutation as causal. We used the PolyPhen-2® (Polymorphism Phenotyping v2) program, which predicts the possible impact of the replacement of one amino acid on the structure and function of human proteins (Figure 2). Accumulation of Gb3 deposits - histological diagnosis of FD, was demonstrated by cutaneous biopsy, which showed sparse lysosomal inclusions with characteristics typical of Gb3 deposits exclusively in smooth muscle fibers thus corroborating the relationship between genotype and phenotype. The process was concluded with family screening focused on confirming the association of the mutation with clinical manifestations in multiple patients. Documentation of the mutation in a normotensive first-degree relative (daughter) associated with early manifestations of FD (cornea verticillata, peripheral neuropathic pain, and increased 24-hour urine proteins) also helped to establish a causal relationship between the mutation found - [GLA] c.785G>T; p.W262L (exon 5), and FD.
Use of bioinformatics tools to estimate the causality of the mutation.
Conclusions
In a population of patients with left ventricular hypertrophy, after exclusion of severe aortic stenosis and arterial hypertension associated with mild left ventricular hypertrophy, we documented a Fabry disease prevalence of 2.1%. This stresses the importance of including this disease among the differential diagnoses of left ventricular hypertrophy. This screening study also documented an issue regarding these research methods that is not related to Fabry disease - the occurrence of a mutation of unknown significance in GLA gene, and showed the clinical management required to define the role of the mutation on the development of the clinical presentation. Thus, this study allowed the definition of a novel causal mutation for Fabry disease - [GLA] c.785G>T; p.W262L (exon 5).
Sources of Funding
There were no external funding sources for this study.
Study Association
This study is not associated with any thesis or dissertation work.
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Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa e Redação do manuscrito: Baptista A, Mateus P; Obtenção de dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Baptista A, Magalhães P, Leão S, Carvalho S, Mateus P; Análise e interpretação dos dados: Baptista A, Magalhães P; Análise estatística: Baptista A, Leão S.
Potencial conflito de interesse
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
ResumoFundamento:
A doença de Fabry é uma doença lisossomal de sobrecarga provocada pela deficiência da enzima α-galactosidase A como resultado de mutações no gene GLA. O envolvimento cardíaco carateriza-se por hipertrofia ventricular esquerda progressiva.
Objetivo:
Estimar a prevalência da doença de Fabry numa população com hipertrofia ventricular esquerda.
Métodos:
Os doentes foram avaliados para a presença de hipertrofia ventricular esquerda definida por massa do ventrículo esquerdo indexada como ≥ 96 g/m2 para mulheres ou ≥ 116 g/m2 para homens. Estenose aórtica severa e hipertensão arterial, com hipertrofia ventricular esquerda discreta, foram critério de exclusão. Todos os doentes incluídos foram avaliados para a atividade da enzima α-galactosidase A com testes de gota seca. No caso de atividade enzimática diminuída, realizava-se estudo genético.
Resultados:
Foram incluídos 47 doentes com uma média de massa indexada de 141,1 g/m2 (± 28,5; 99,2 a 228,5 g/m2]. A maioria (51,1%) dos doentes era do sexo feminino. Nove deles (19,1%) tinham diminuição da atividade da α-galactosidase A, mas apenas um teste genético foi positivo − [GLA] c.785G>T; p.W262L (éxon 5), uma mutação não descrita na literatura. O trabalho de investigação clínica permitiu estabelecer uma associação entre a mutação e a apresentação clínica.
Conclusão:
Em uma população de doentes com hipertrofia ventricular esquerda, documentamos uma prevalência de doença de Fabry de 2,1%. O novo caso foi definido na sequência de uma mutação de significado indeterminado no gene GLA com posterior estudo de patogenicidade. Este estudo permitiu, assim, definir uma nova mutação causal para doença de Fabry - [GLA] c.785G>T; p.W262L (éxon 5).
Palavras-chave:Doença de Fabry / complicaçõesHipertrofia Ventricular EsquerdaAlfa-Galactosidase / genéticaIntrodução
O estudo etiológico da Hipertrofia Ventricular Esquerda (HVE) é um desafio comum na prática clínica, dada à sua elevada frequência e à multiplicidade de patologias que podem se manifestar. Esse aspecto é de particular relevância clínica, em razão das implicações terapêuticas associadas aos diferentes diagnósticos diferenciais.
A Doença de Fabry (DF) é uma doença rara ligada ao X, que é provocada pela deficiência da enzima α-Galactosidase A (Gal A) como resultado de mutações no gene GLA. A maioria das famílias apresenta um mutação "privada", encontrada apenas naquela família e, assim, são conhecidas atualmente centenas de mutações causais. Essa multiplicidade de mutações pode contribuir para variações na atividade enzimática residual e para as diferentes apresentações clínicas. A deficiência da enzima Gal A leva ao acúmulo progressivo nos tecidos de glicoesfingolípidos, principalmente de Globotriosilceramido (Gb3), conduzindo à falência de órgãos. Os órgãos mais frequentemente envolvidos são os rins, o coração, a pele, o sistema nervoso central e o autônomo, os olhos e o aparelho auditivo. A nível cardíaco, a acumulação de Gb3 conduz à HVE, que é difícil de distinguir das restantes etiologias com os métodos comuns de imagem cardíaca, especialmente por ecocardiografia. Atualmente, a suspeita de doenças de sobrecarga lisossomais, nomeadamente a DF, é fundamental pela disponibilidade de terapêutica de substituição enzimática, com impacto na progressão da doença. Assim, começaram a surgir inúmeros estudos para avaliar a prevalência da DF em populações de risco. O objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência da DF numa população de doentes com HVE.
Métodos
O estudo decorreu entre outubro de 2010 e fevereiro de 2011 num centro hospitalar da região de Trás-os-Montes e Alto Douro, no interior norte de Portugal, após aprovação da Comissão de Ética Hospitalar. Todos os doentes com mais de 18 anos referenciados para realização de Ecocardiograma Transtorácico (ETT) foram considerados elegíveis para o programa de rastreio de DF, sendo incluídos se houvesse evidência de HVE definida por massa do Ventrículo Esquerdo (VE)/ área de superfície corporal (ASC) ≥ 96 g/m2, para o sexo feminino, e de 116 g/m2, para o masculino. O cálculo da massa do VE efetuou-se com a fórmula:
Para tal, foram usadas medições lineares em diástole obtidas a partir da ecografia bidimensional. Foram considerados critérios de exclusão a presença de estenose aórtica severa e a hipertensão arterial, quando associada a HVE discreta - massa VE/ASC < 109 g/m2 (mulher) e < 132 g/m2 (homem), independentemente do estádio de hipertensão arterial. Todos os doentes incluídos assinaram um consentimento informado previamente à realização da avaliação clínica, pesquisa de envolvimento multiorgânico e determinação da atividade enzimática Gal A.
Avaliação clínica
Após a definição de critérios de inclusão, os doentes foram submetidos a uma história clínica sumária dirigida à pesquisa de sintomas sugestivos de manifestações da DF e de envolvimento multiorgânico, nomeadamente cardíaco. Assim, o inquérito incluiu a avaliação de história de crises álgicas nas extremidades, alterações do trânsito gastrintestinal ou da sudorese, história de Acidente Vascular Cerebral (AVC) e presença de dispneia/ortopneia ou dor torácica, seguida de pesquisa de angioqueratomas e medição da Pressão Arterial (PA), peso e altura. A avaliação clínica não incluiu a história familiar cardiovascular ou renal.
Pesquisa de envolvimento multiorgânico
Os doentes complementavam o estudo cardíaco com a realização de Eletrocardiograma (ECG) - avaliação do ritmo, Frequência Cardíaca (FC), intervalo PR, alterações da condução e critérios de voltagem para HVE (critérios de Sokolow-Lyon). O envolvimento renal foi avaliado por meio de uma coleta de sangue para determinação de creatinina e ureia séricas, com posterior estimativa da Taxa de Filtração Glomerular (TFG) pela fórmula MDRD (sigla do inglês Modification of Diet in Renal Disease) e de amostra de urina ocasional para avaliação de albuminúria por meio do uso do ratio microalbuminúria/creatinina urinária.
Determinação da atividade enzimática Gal A
O rastreio de DF baseou-se no Teste de Gota Seca (DBS, sigla do inglês Dried Blood Spot), com transferência de quatro gotas de sangue para um papel de filtro, deixado para secar em temperatura ambiente, com a avaliação da atividade enzimática Gal A realizada em laboratório externo (laboratório metabólico do Hamburg University Medical Center). Valores entre 200 e 2000 pmol/spot*20 h foram considerados normais.
Rastreio genético
Quando a atividade enzimática Gal A estava reduzida, procedia-se ao estudo genético por meio de uma coleta de 10 mL de sangue para tubo de EDTA com posterior sequenciação do gene GLA no Centro de Genética Médica Doutor Jacinto de Magalhães.
Os dados foram submetidos a uma análise descritiva com recurso ao programa de análise estatística Statistical Package for the Social Science (SPSS), versão 19.0 (SPSS Statistics IBM®), e foram apresentados como número ou percentagem, ou como valores médios ± Desvio Padrão (DP). Quando aplicável, foram usados Intervalos de Confiança de 95% (IC95%).
Resultados
Durante o período de estudo, 75 doentes apresentaram critérios de inclusão, dos quais foram excluídos 28 doentes (37,3%): 21 por hipertensão arterial com HVE discreta e sete por estenose aórtica severa. O rastreio de DF realizou-se então num total de 47 doentes, dos quais 24 eram mulheres (51,1%). A idade média dos doentes foi de 65,6 ± 14,5 anos (intervalo de 25 a 90 anos). Quanto à massa ventricular, apresentavam uma média de massa VE/ASC de 141,1 ± 28,5 g/m2 (99,2 a 228,5 g/m2) e de espessura de septo e parede posterior de 15,3 ± 3,4 mm (10 a 24 mm) e 12,9 ± 2,1 mm (9 a 20 mm), respectivamente.
Caracterização clínica da população
A maioria da população avaliada tinha história conhecida de hipertensão arterial (n = 35; 74,5%), com um registo de PA sistólica média no dia da avaliação de 144,2 ± 30,3 mmHg (96 a 216 mmHg). A revisão sumária da história clínica sugeria a presença de crises álgicas nas extremidades em 27,7% dos doentes, alterações da sudorese em 4,3% e alterações do trânsito gastrintestinal em 29,8%. Não foram encontradas lesões cutâneas sugestivas de angioqueratomas em nenhum dos doentes. Oito pacientes (17,0%) tinham história de AVC, 66,0% apresentavam clínica de dispneia e 40,4% de dor torácica.
Dos doentes avaliados, três estavam em programa regular de diálise (6,4%), com a população apresentando média de TFG de 81,7 ± 50,2 mL/min/1,73m2 (3,9 a 232,6 mL/min/1,73m2), estimada a partir de valores médios de creatinina de 1,4 ± 2,1 mg/dL (0,4 a 14,6 mg/dL). A prevalência de microalbuminúria foi de 25,5% e de proteinúria de 55,4%. A avaliação eletrocardiográfica mostrou ritmo sinusal na maioria dos doentes (63,8%), com os restantes a apresentarem fibrilação auricular (19,1%) ou ritmo de marca-passo (17,1%). Apresentavam também uma FC média de 71 ± 15 bpm (45 a 110 bpm), intervalo PR de 169 ± 34 milissegundos (108 a 250 milissegundos), prevalência de perturbação de condução auriculoventricular de 8,5% e intraventricular de 23,4%, com 40,4% dos doentes com critérios de HVE.
Nove doentes, todos do sexo feminino, apresentaram redução da atividade enzimática gal A (19,1%), sendo, por isso, referenciados para rastreio genético. Apenas um dos testes genéticos apresentou documentação de uma mutação no gene GLA. Assim, a incidência de falsos-positivos com o uso do teste enzimático por DBS foi de 88,9%.
Descrição do caso com mutação no gene GLA
O único teste genético positivo revelou heterozigotia para a mutação [GLA] c.785G>T; p.W262L (éxon 5), mutação não descrita na literatura como causal para DF. Tratava-se de uma doente do sexo feminino, de 46 anos e diagnóstico recente de hipertensão arterial, que foi referenciada para realização de ETT no contexto de AVC do tronco encefálico. Na avaliação clínica, apresentava história de episódios frequentes de crises álgicas nas extremidades, principalmente nas mãos, e alterações do trânsito intestinal, sem angioqueratomas. No ECG, apresentou ritmo sinusal, FC de 76 bpm e critérios de voltagem para HVE com padrão de sobrecarga e ecocardiograma, que mostravam HVE concêntrica de grau moderado com disfunção diastólica grau II. A avaliação renal revelou presença de microalbuminúria com função renal preservada (creatinina de 0,6 mg/dL).
Apesar das manifestações serem sugestivas de DF (microalbuminúria e HVE), estas podiam ser também explicadas pela história de hipertensão arterial e, por isso, foi necessário documentar a patogenicidade da nova mutação. Esse processo envolveu três passos fundamentais: informação genética, demonstração de acumulação de depósitos de Gb3 e rastreio familiar. Relativamente ao estudo da mutação, as ferramentas bioinformáticas estimaram-na como causal, sendo excluída a hipótese de polimorfismo ao não ser encontrada no estudo de cem indivíduos da população. Outro aspecto a favor da causalidade da mutação encontrada, é o facto de já estarem descritas mutações causais na sua proximidade1,2. Foi demonstrada a acumulação tecidular de Gb3 por biópsia cutânea, que mostrou inclusões lisossomais escassas de características típicas de depósitos de Gb3 ao nível das fibras musculares lisas e aumento da concentração sanguínea de lysoGB3. Quanto ao estudo familiar (Figura 1), foi negativo para todos os irmãos, mas positivo para a filha, que, aos 30 anos, apresentava também manifestações sugestivas de DF: córnea verticilata, dor neuropática periférica e proteínas discretamente aumentadas na urina de 24 horas, confirmando a associação da mutação com manifestações sugestivas de DF. O estudo da doente foi ainda complementado com a avaliação de envolvimento de outros órgãos não definidos pelo algoritmo do estudo (as avaliações dermatológica, oftalmológica, otorrino e respiratória foram normais) e pela caracterização adicional por ressonância magnética do atingimento cardíaco, que mostrou HVE sem realce tardio, e do atingimento cerebral, que demonstrou lesão da substância branca. Foi ainda documentado controle tensional por monitorização ambulatória de PA sob medicação. Assim, num estudo de rastreio de DF em doentes com HVE foi documentado um caso de DF associado a uma mutação causal: [GLA] c.785G>T; p.W262L (éxon 5), não descrita previamente na literatura e que se associa a envolvimento neurológico, cardíaco e renal. A doente foi aprovada para início de terapia de substituição enzimática pela Comissão Organizadora do Tratamento de Doenças Lisossomais de Sobrecarga.
Numa população de doentes com HVE, após exclusão de estenose aórtica severa e hipertensão arterial associada à HVE discreta, documentamos uma prevalência de DF de 2,1% (IC95%: 0,1-11,3%). Essa prevalência aproximou-se da de outros estudos de rastreio em populações de alto risco (populações selecionadas com HVE, AVC e com doentes em diálise)3, que documentaram frequências muito superiores à prevalência estimada na população geral de 0,02 a 0,09 por 10 mil pessoas4. No entanto, a interpretação da prevalência encontrada deve ser cautelosa, tendo em conta o baixo número de doentes analisados neste estudo. A importância dos estudos de rastreio advém de dois fatores principais: além de procurarem aumentar o grau de alerta para a DF em grupos-alvo, onde há maior probabilidade de detectar doentes e, assim, contribuir para a definição da prevalência da doença, oferecem também uma oportunidade para detectar a doença em fases mais precoces, altura em que o início de terapia de substituição enzimática oferece mais benefícios.
Os estudos existentes sobre a prevalência de DF em populações com HVE utilizaram diferentes critérios para a inclusão de doentes, quer por diferenças na forma de avaliação de HVE, quer nos valores definidos. A maioria dos estudos utilizou como critério de inclusão a espessura máxima das paredes ventriculares com definição de um limiar de 13 ou 15 mm4, ao contrário deste estudo, em que a seleção dos doentes se baseou na massa ventricular indexada. Apesar da manifestação típica de envolvimento cardíaco na DF ser a HVE concêntrica, estão já documentados múltiplos casos de HVE assimétrica5 e, para reforçar esse aspecto, existem os estudos que demonstram uma incidência de DF de cerca de 1,0% em populações com diagnóstico de cardiomiopatia hipertrófica6, em que a HVE assimétrica é a forma de apresentação mais frequente. Assim, neste estudo, podem ter sido excluídos doentes com possível DF, pois o aumento da espessura de uma só parede ventricular, habitualmente o septo interventricular, poder não se associar ao aumento da massa do VE. No entanto, essa variável, a massa ventricular esquerda indexada, é um dos principais critérios para monitorização da eficácia da terapia de substituição enzimática na redução da HVE7, o que motivou seu uso como critério de seleção de doentes.
Neste estudo, a atividade enzimática Gal A por teste de DBS foi o método utilizado para rastreio de DF, cujo resultado pode ser normal em até 40% das mulheres com DF8. A interpretação do ensaio enzimático é mais complicada no sexo feminino, pois a atividade enzimática pode ser normal ou nos limites inferiores do normal fruto do fenômeno de inativação do cromossomo X (isto é, o silenciar epigenético permanente de um dos cromossomos X criando um mosaicismo celular, que explica a apresentação da doença nas mulheres - mais tardia e com maior probabilidade de envolvimento de um único órgão)9. Daí resulta uma limitação do estudo: a possibilidade de subestimar a prevalência de DF por falsos-negativos nas mulheres, apesar de curiosamente o único resultado positivo ter sido numa doente do sexo feminino. O uso do teste de DBS prendeu-se com o fato de que é um método de rastreio acessível na prática clínica e que apresenta vantagens sobre a avaliação da atividade enzimática nos leucócitos ou fibroblastos. Primeiro, requer apenas algumas gotas de sangue para o doseamento e, em segundo, possibilita o envio fácil e rápido das amostras para laboratórios especializados, aspecto importante no centro de realização do estudo onde não existe um laboratório dedicado às doenças de sobrecarga lisossomais. Assim, interessava avaliar o comportamento do DBS para determinação de sua inclusão futura na avaliação de doentes do sexo feminino com suspeita de DF. Além dos reconhecidos falsos-negativos, uma realidade para a qual os clínicos estão já em alerta, pela documentação em múltiplos estudos, como referido anteriormente, este rastreio mostrou um outro aspecto limitador do teste de DBS - uma elevada incidência de falsos-positivos, aspecto pouco ilustrado em estudos10. Apenas um em nove dos doentes com redução da atividade enzimática (todos do sexo feminino) obteve confirmação de DF por teste genético, do que resultam 88,9% de falsos-positivos. Dessa forma, na situação atual em que os custos são ponderados na investigação clínica, este estudo questiona ainda mais a utilidade do DBS nos doentes do sexo feminino com suspeita de DF (elevada taxa de falsos-negativos e positivos).
Verificamos uma baixa incidência de manifestações inespecíficas, nomeadamente alterações da sudorese, porém as alterações gastrintestinais e crises álgicas manifestaram incidência perto dos 30%, aspecto explicado provavelmente por estas serem alterações comuns em doenças de incidência mais elevada, como as patologias osteoarticulares e do foro digestivo. Pelo contrário, as manifestações de possível envolvimento multiorgânico, como a albuminúria, apresentaram incidência elevada, dado serem também manifestações possíveis de doença hipertensiva − um achado comum na população em estudo. A avaliação desses fatores clínicos e laboratoriais, que são manifestações habituais da DF, constituiu um aspecto diferenciador deste estudo. Sua inclusão no estudo de rastreio, ao contrário do habitual estudo genético isolado em populações de risco, foi motivada pelo interesse na definição de associações de fatores com maior probabilidade de DF. Dessa forma os resultados do estudo poderiam ser transportados para a prática clínica, como, por exemplo, na integração dos achados em algoritmos de estudo etiológico da HVE. Assim, conseguiríamos limitar o estudo genético a determinados grupos, com seleção fundamentada num estudo clínico. No entanto, isso não foi possível, pois o tamanho da amostra e a baixa incidência de DF limita o poder do estudo para retirar conclusões sobre a melhoria da probabilidade pré-teste. Estes dados acabaram por ser úteis na avaliação do significado de mutações de novo, como se explica de seguida.
Atualmente, estão descritas mais de 600 variantes do gene GLA, e a maioria das mutações é única para cada família, mas com o aumento dos estudos de rastreio de DF surgiu inesperadamente um elevado número de indivíduos com mutações de significado indeterminado com uma prevalência estimada de 0,6% em populações de alto risco, embora apenas 0,12% apresente manifestações típicas ou atividade enzimática diminuída11. Assim, o significado dessas mutações não é fácil de definir, pois muitos dos estudos de rastreio envolvem populações de alto risco, que expressam um único sintoma específico, o critério de inclusão, como no caso deste estudo, a HVE, e, assim, o sintoma pode não estar relacionado com a variante do gene GLA detectada ou pode constituir uma manifestação de DF na forma não clássica. Neste estudo de rastreio de DF numa população maioritariamente hipertensa (74,5%) com HVE, esse problema tornou-se claro. Foi encontrada uma mutação no gene GLA não descrita previamente na literatura − [GLA] c.785G>T; p.W262L (éxon 5), cujo significado não podia ser definido com base no achado de HVE no ETT. Tratava-se de uma doente com diagnóstico de hipertensão e, assim, os achados de HVE, juntamente da presença de microalbuminúria e história de AVC, poderiam ser explicados quer por DF quer por hipertensão arterial com atingimento de órgãos-alvo, em razão das manifestações serem sobreponíveis nos dois quadros. Esse aspecto conduziu a uma investigação clínica orientada para a comprovação de patogenicidade associada à mutação, que envolveu três passos fundamentais: técnicas de bioinformática, diagnóstico histológico e realização de rastreio familiar. A avaliação da patogenicidade eventual da mutação passou por documentar sua ausência no estudo de cem cromossomos de indivíduos da população geral, excluindo a hipótese de um polimorfismo. Em seguida, foi efetuada uma revisão da literatura procurando mutações descritas em sua proximidade, o que também aumenta a probabilidade de patogenicidade, encontrando-se a mutação p. W262C (c.786G>C), documentada por Schafer e cols.12, e a mutação p. W262X (c.785G>A), documentada por Shabbeer e cols.13. A aplicação das ferramentas bioinformáticas considerou a mutação como causal; foi usado o programa PolyPhen-2® (Polymorphism Phenotyping v2), que prediz o possível impacto da substituição de um aminoácido na estrutura e função de proteínas humanas (Figura 2). A demonstração de acumulação de depósitos de Gb3, diagnóstico histológico de DF, foi realizada por biópsia cutânea, que mostrou inclusões lisossomais escassas de características típicas de depósitos de Gb3, exclusivamente ao nível das fibras musculares lisas, corroborando, assim, a relação genótipo com fenótipo. O processo foi finalizado com o rastreio familiar com objetivo de confirmar a associação da mutação a manifestações clínicas em múltiplos doentes. A documentação da mutação em familiar de primeiro grau normotenso (filha) associada a manifestações precoces de DF (córnea verticilata, dor neuropática periférica e proteínas aumentadas na urina de 24 horas) ajudou também na formalização de uma relação causal entre a mutação encontrada, [GLA] c.785G>T; p.W262L (éxon 5), e DF.
Aplicação de ferramentas bioinformáticas na estimativa da causalidade da mutação.
Conclusões
Numa população de doentes com hipertrofia ventricular esquerda, após exclusão de estenose aórtica severa e hipertensão arterial associada a hipertrofia ventricular esquerda discreta, documentamos a prevalência de doença de Fabry em 2,1% da população, o que alerta para a necessidade de incluir essa doença nos diagnósticos diferenciais da hipertrofia ventricular esquerda. Este estudo de rastreio documentou ainda um problema desses métodos de pesquisa não selecionado de doença de Fabry - aparecimento de uma mutação de significado indeterminado no gene GLA e mostrou a orientação clínica necessária para definir o papel da mutação na contribuição para o quadro clínico. Este estudo permitiu, desse modo, definir uma nova mutação causal para doença de Fabry - [GLA] c.785G>T; p.W262L (éxon 5).
Fontes de financiamento
O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.
Vinculação acadêmica
Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.