Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia bLVq7phXTMwkgtJyZ4Qqf7m S0066-782X2015002000045 S0066-782X2015005050053 10.5935/abc.20150053 Original Articles p.Q192R SNP of PON1 seems not to be Associated with Carotid Atherosclerosis Risk Factors in an Asymptomatic and Normolipidemic Brazilian Population Sample Scherrer Daniel Zanetti 1 Zago Vanessa Helena de Souza 1 Vieira Isabela Calanca 1 Parra Eliane Soler 1 Panzoldo Natália Baratella 1 Alexandre Fernanda 1 Secolin Rodrigo 2 Baracat Jamal 3 Quintão Eder Carlos Rocha 4 Faria Eliana Cotta de 1 Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Patologia Clínica São Paulo SP Brazil Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Patologia Clínica, São Paulo, SP - Brazil Universidade Estadual de Campinas Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Genética Médica São Paulo SP Brazil Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Genética Médica, São Paulo, SP - Brazil Universidade Estadual de Campinas Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Radiologia São Paulo SP Brazil Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Radiologia, São Paulo, SP - Brazil Universidade Estadual de Campinas Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Médicas Laboratório de Lípides São Paulo SP Brazil Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Médicas - Laboratório de Lípides (LIM10), São Paulo, SP - Brazil Universidade de São Paulo Mailing Address: Daniel Zanetti Scherrer, R. Tessália Vieira de Camargo, 126. Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, Postal Code 13083-887. Campinas, SP - Brazil. E-mail: zanettis@hotmail.com

Conception and design of the research:Scherrer DZ, Quintão ECR, Faria EC. Acquisition of data:Scherrer DZ, Zago VHS, Vieira IC, Parra ES, Panzoldo NB, Alexandre F, Baracat J. Analysis and interpretation of the data: Scherrer DZ, Zago VHS, Vieira IC, Secolin R, Baracat J, Faria EC. Statistical analysis: Scherrer DZ, Zago VHS, Secolin R. Obtaining financing: Quintão ECR, Faria EC. Writing of the manuscript:Scherrer DZ, Zago VHS, Faria EC. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Scherrer DZ, Zago VHS, Vieira IC, Parra ES, Panzoldo NB, Alexandre F, Secolin R, Quintão ECR, Faria EC.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 07 2015 29 05 2015 105 1 45 52 16 10 2014 12 01 2015 19 01 2015 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution NonCommercial License which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium provided the original work is properly cited. Background:

Evidences suggest that paraoxonase 1 (PON1) confers important antioxidant and anti-inflammatory properties when associated with high-density lipoprotein (HDL).

 Objective:

To investigate the relationships between p.Q192R SNP ofPON1, biochemical parameters and carotid atherosclerosis in an asymptomatic, normolipidemic Brazilian population sample.

 Methods:

We studied 584 volunteers (females n = 326, males n = 258; 19-75 years of age). Total genomic DNA was extracted and SNP was detected in the TaqMan® SNP OpenArray® genotyping platform (Applied Biosystems, Foster City, CA). Plasma lipoproteins and apolipoproteins were determined and PON1 activity was measured using paraoxon as a substrate. High-resolution β-mode ultrasonography was used to measure cIMT and the presence of carotid atherosclerotic plaques in a subgroup of individuals (n = 317).

 Results:

The presence of p.192Q was associated with a significant increase in PON1 activity (RR = 12.30 (11.38); RQ = 46.96 (22.35); QQ = 85.35 (24.83) μmol/min; p < 0.0001), HDL-C (RR= 45 (37); RQ = 62 (39); QQ = 69 (29) mg/dL; p < 0.001) and apo A-I (RR = 140.76 ± 36.39; RQ = 147.62 ± 36.92; QQ = 147.49 ± 36.65 mg/dL; p = 0.019). Stepwise regression analysis revealed that heterozygous and p.192Q carriers influenced by 58% PON1 activity towards paraoxon. The univariate linear regression analysis demonstrated that p.Q192R SNP was not associated with mean cIMT; as a result, in the multiple regression analysis, no variables were selected with 5% significance. In logistic regression analysis, the studied parameters were not associated with the presence of carotid plaques.

 Conclusion:

In low-risk individuals, the presence of the p.192Q variant ofPON1 is associated with a beneficial plasma lipid profile but not with carotid atherosclerosis.

 Paraoxonase-1 / genetics Polymorphism, genetic Carotid Artery Diseases / physiopathology Lipoproteins, HDL CNP 159980/2012-7 FAPESP 471380/2008-13 Introduction

Human paraoxonase 1 (PON1 -OMIM 168820) is a calcium-dependent serum esterase composed of 354 amino acids, with a molecular weight of 43kDa, and coded in chromosome 7q21. It is expressed in a variety of tissues, but synthesized mainly in the liver. PON1 binds to high-density lipoprotein (HDL) through interaction of hydrophobic N-terminus with phospholipids and with apolipoprotein A-1 (apo A-1)1 leading to HDL important antioxidant and anti-inflammatory properties2.

Previous studies suggest that PON1 activity could influence HDL-C levels, probably because of the involvement of PON1 in the protection against HDL oxidation3. Furthermore, PON1 is present in small and dense HDL particles4, indicating that there is a relationship between PON1 activity and HDL size5.

The relationship between PON1 activity and coronary heart disease (CHD) risk in humans has been reported among various ethnic populations; thus, two meta-analyses confirm the association of a lower PON1 activity with increased CHD risk regardless of age and ethnicity6 , 7.

PON1 activity is under genetic and environmental regulation and varies widely among individuals and populations8. The SNP rs662, found in the coding region, leads to a substitution of glutamine (CAA) for arginine (CGA) at position 192 (p.Q192R)9.In addition to its effects on the enzymatic activity, several studies have been carried out to elucidate the relationship of this SNP with established cardiovascular disease (CVD) in different populations. The p.192R variant frequency was increased in CVD groups of Japanese, Caucasian and Asian-Indian populations10 - 12; however, the same associations were not found in Turkish and Finnish populations13 - 14.

In the Brazilian population, the p.Q192R SNP distribution varies among ethnic groups15; additionally, the impact of the p.192R variant on established CVD is conflicting16 - 18. Moreover, there are no studies in our population relating SNP to CVD risk in asymptomatic individuals; indeed, studies associating the polymorphism with subclinical carotid disease in healthy individuals are rare19.

In view of the results obtained in studies in different ethnic groups, and the scarcity of studies in low-risk populations, we investigated the relationships of p.Q192R SNP of PON1 with biochemical parameters and carotid atherosclerosis in an asymptomatic, normolipidemic Brazilian population.

 Methods Study population

This study comprised 584 individuals selected among 1536 normolipidemic and asymptomatic volunteers of both genders, aged 19 to 75 years, who had undergone free health checkups in primary health care centers between 2008 and 2012 in Campinas and Americana (São Paulo, Brazil), as previous described by Parra et al.20. At admission, the individuals underwent a complete clinical evaluation and answered a detailed questionnaire to provide data on family history of premature coronary artery disease (CAD), (defined as the occurrence of acute events and/or death in first-degree relatives), past and current health status, exercise and diet habits, alcohol and tobacco use, and medications. The exercise habits were evaluated through a questionnaire adapted from Baecke et al.21, consisting of 16 questions that include three indexes of habitual physical activities in the last 12 months, defined as (i) occupational or labor physical activity index; (ii) free time physical exercise index; and (iii) free time and locomotion activity index. Furthermore, diet habits were evaluated by a dietary frequency questionnaire (classified as daily, weekly and monthly/no consumption) adapted from Furlan-Viebig and Pastor-Valero22 of ten food classes as follows: (i) milk and dairy products; (ii) meat, fish and eggs; (iii) vegetables; (iv) fruits; (v) natural juices; (vi) breads, cereals and tubers; (vii) oils and fats; (viii) sweets, snacks and treats; (ix) non‑alcoholic beverages and (x) preparations and miscellaneous.

Exclusion criteria included regular use of medications, especially those which interfere with the lipid metabolism, such as statins, hormonal replacement therapy and contraceptives. The medications allowed in the protocol included: (1) vitamins, nutritional supplements and homeopathy; (2) antidepressants; (3) analgesics (sporadic use); (4) antiallergics and proton pump inhibitors; and (5) two or more of the mentioned medications combined. Additionally, we excluded volunteers with thyroid dysfunction; dyslipidemia; diabetes mellitus; metabolic syndrome; obesity; pregnancy; arterial hypertension; liver, lung or kidney diseases; alcohol abuse (> 14g/day); and smoking.

Venous blood samples were drawn after a 12h fasting period for serum and EDTA plasma separation by centrifugation (4°C, 1000 x g, 10 minutes), and stored at -80°C until analysis. In another visit, the volunteers underwent carotid ultrasonography.

The Medical Sciences Ethics Committee of the University of Campinas approved this study and all volunteers gave written informed consent.

 Biochemical analysis

Fresh serum samples were analyzed for total cholesterol, HDL-C, triglycerides and glucose in Modular Analytics® EVO (Roche Diagnostics, Burgess Hill, West Sussex, UK) using Roche Diagnostics® reagents (Mannheim, Germany). Apolipoproteins A-1 and B were determined by nephelometry in BN II (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany) automated system using commercially available assays (Dade-Boehringer®, Deerfield, Illinois, USA). Low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) was calculated using the Friedwald formula23, while very-low density lipoprotein cholesterol (VLDL-C) was calculated using the formula triglycerides/521.

C-reactive protein (CRP) was measured by immunoturbidimetry in a high-sensitivity method (hsCRP), using the commercially available assay Tina-quant CRP (Latex) HS-Roche (Roche Diagnostics®, Mannheim, Germany).

HDL particle size was determined by the dynamic light scattering (DLS) technique after chemical precipitation of apo B-containing lipoproteins in plasma samples using polyethylene glycol (PEG) 8000 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)24. The measurements were performed in triplicate in the Nanotrac Particle Size Analyzer (Microtrac, North Largo, Florida, USA) and a 100nm polymeric nanoparticle was used as the standard; a control sample obtained from the same individual plasma was used in all determinations.

Plasma activity of cholesteryl ester transfer protein (CETP) and phospholipid transfer protein (PLTP) was determined by radiometric assays using exogenous substrates25 , 26.Additionaly, PON1 activity was measured using paraoxon (diethyl-p-nitrophenylphosphate, Sigma, St. Louis, MO, USA) as substrate27.

 SNP genotyping

Total genomic DNA was extracted from peripheral mononuclear blood cells, according to the standard phenol/chloroform method. Quality, integrity and concentration were determined and DNA samples were stored at −20 °C prior to use.

Genotype analysis for p.Q192R SNP of PON1 was performed using the OpenArray®Real-Time PCR Platform (Applied Biosystems, Foster City, CA), following the manufacturer’s standard protocol. The genotypes were determined using the TaqMan®Genotyper Software 1.0.1. (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Individuals with the GG genotype were designated as RR (p.192R homozygous), while those with the AA genotype were named QQ (p.192Q homozygous) and those with the GA genotype (heterozygous) were designated as RQ.

 Carotid intima-media thickness (cIMT) measurements

All volunteers were invited to undergo carotid intima‑media thickness measurements and a subgroup of 317 individuals underwent the test. Carotid ultrasonography was performed by a single trained sonographer, blind to the study subjects. High-resolution B-mode ultrasonography was carried out using a 6-9 MHz linear array ultrasound imaging system (ATL HDI 1500 and 3500 Ultrasound System, Advanced Technology Laboratories Ultrasound, Bothell, EUA) and longitudinal measurements were made of segments of the common carotid arteries at the distal wall and at 1 cm from the bifurcation. Mean cIMT was calculated based on the average of five measurements of the right and left sides and expressed in millimeters (mm); the presence of carotid plaques was also investigated.

 Statistical analyses

Statistical analyses were performed using the SPSS 16.0 (SPSS Inc., USA) and R software (R Development Core Team, Vienna, Austria). Normal distribution of the variables was determined by the Kolmogorov-Smirnov test. Normal data are expressed as mean ± standard deviation, and non-normal data are expressed as median (interquartile range).

Comparisons between genotypes were performed using ANOVA or Kruskal-Wallis, followed by the Bonferroni’s test for normal and non-normal data, respectively. Additionally, chi-square test was performed for categorical variables. When necessary, the comparisons were adjusted by ANCOVA for age, gender and body mass index (BMI).

Stepwise regression analyses were performed to verify the main determinants of PON1 activity, and included the variables age, gender, BMI, HDL particle size, CETP, PLTP and p.Q192R SNP of PON1 . The RR genotype was used as a reference group.

Univariate and multiple linear regression analyses were performed to evaluate the influence of HDL-C, apo A-1, HDL particle size, hsCRP, PON1 activity and p.Q192R SNP on mean cIMT; the analyses were controlled for age, gender and BMI. In addition, logistic regression analysis determined the odds ratio (OR) for the presence of carotid plaques according to HDL-C, apo A-1, HDL particle size, hsCRP, PON1 activity and p.Q192R SNP, also controlled for age, gender and BMI. The G* Power software was used in order to evaluate whether the sample had statistical power to detect associations, according to the following parameters: OR = 1.5; significance level α = 0.008 (adjusted for multiple comparisons); two-tailed; statistical power 1-β = 80%. In this way, the sample showed 99.9% and 54.98% of statistical power for multiple linear regression and logistic regression analysis, respectively.

P-values < 0.05 (corrected by Bonferroni for multiple tests) were considered statistically significant.

 Results

The study population was comprised of 56% females and 44% males, and genotype frequency was 37%, 45% and 19% for RR, RQ and QQ groups, respectively. The p.Q192R SNP was in Hardy–Weinberg equilibrium. Furthermore, all volunteers were asymptomatic; non-smokers; had no past or current history of thyroid dysfunction, dyslipidemias, diabetes mellitus or other endocrine diseases; no pregnancy, obesity, metabolic syndrome, arterial hypertension; no liver, lung or kidney diseases.

Clinical and biochemical characteristics were described and compared between genotypes, as shown in table 1. QQ volunteers presented a significant increase in PON1 activity, total cholesterol, HDL-C and apo A-1 when compared to RQ or RR groups. No significant differences were observed regarding all the other biochemical parameters, mean cIMT, presence of plaques, family history of premature CAD, alcohol consumption, medication use and physical activity indexes. Additionally, the frequencies (daily, weekly and monthly/no consumption) of the ten studied food classes were not significantly different between the genotypes, as follows: milk and dairy products (p = 0.716); meat, fish and eggs (p = 0.269); vegetables (p = 0.766); fruits (p = 0.198); natural juices (0.412); breads, cereals and tubers (0.136); oils and fats (p = 0.435); sweets, snacks and treats (p = 0.545); non-alcoholic beverages (p = 0.454) and preparations and miscellaneous (p = 0.874).

Descriptive and comparative analyses of clinical, anthropometrlcal and biochemical parameters among PON1 p.Q192R genotypes
Parameters RR (n = 215) RQ (n = 260) QQ (n = 109) p
Gender (Female/Male) 112/103 153/107 61/48 -
Age (years) 45 (23) 44 (27) 46 (17) -
BMI (kg/m2) 23.6 ± 2.8 23.4 ± 2.9 24.5 ± 2.9 -
Waist circumference (cm) 78 (15) 76 (13) 74 (10) 0.413
SBP (mmHg) 120 (15) 120 (20) 120 (20) 0.334
DBP (mmHg) 80 (10) 80 (14) 80 (8) 0.260
Total cholesterol (mg/dL) 170 ± 32 174 ± 29 176 ± 30 0.044†
HDL-C (mg/dL) 45 (37) 62 (39) 69 (29) < 0.001† ‡
HDL size (nm) 7.85 (0.91) 8.00 (1.02) 8.06 (0.88) 0.467
Triglycerides (mg/dL) 77 (43) 74 (45) 64 (33) 0.054
LDL-C (mg/dL) 100 ± 26 101 ± 23 101 ± 22 0.550
VLDL-C (mg/dL) 15 (8) 15 (9) 13 (7) 0.069
Apo A-I (mg/dL) 140.76 ± 36.39 147.62 ± 36.92 147.49 ± 36.65 0.019†
Apo B (mg/dL) 76.37 ± 19.64 76.80 ± 17.11 75.54 ± 18.72 0.472
CETP(%) 13.55 ± 5.45 13.38 ± 5.92 13.20 ± 5.24 0.616
PLTP (nmolesFC/mL/h) 6321 (3074) 6086 (2253) 6088 (2393) 0.414
PON1 (Mmol/min) 12.30 (5.90) 46.95 (22.35) 85.35 (21.18) < 0.001* † ‡
Glucose (mg/dL) 84 (12) 83 (10) 84 (9) 0.499
hsCRP (mg/L) 0.80 (1.00) 0.80 (1.13) 0.90 (1.65) 0.231
Mean cIMT (mm) 0.60 (0.20) 0.60 (0.30) 0.58 (0.15) 0.207
Carotid Plaques (Yes/No, %) 19/81 18/82 11/89 0.712
Family history of premature CAD (Yes/No, %) 7/30 6/39 6/15 0.659
Alcohol consumption (Moderate/No consumption, %) 7/31 9/36 3/14 0.503
Medications (Yes/No, %) 5/31 8/37 3/16 0.903
Occupational or labor physical activity index 2.75 (1.00) 2.75 (0.87) 2.87 (0.62) 0.493
Free time physical exercise index 2.00 (1.00) 2.00 (1.25) 2.00 (1.50) 0.913
Free time and locomotion activity index 2.50 (1.00) 2.50 (1.00) 2.50 (1.00) 0.998

(n): number of individuals or as shown below; BMI: body mass index; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol; VLDL-C: very low-density lipoprotein cholesterol; Apo: apoliprotein; hsCRP: high-sensitivity C reactive protein; CETP: cholesteryl ester transfer protein; PLTP: phospholipid transfer protein; FC: free cholesterol; PON1: paraoxonase 1; CAD: coronary artery disease; cIMT: carotid intima-media thickness: RR (119), RQ (132),QQ (66). Normal and non-normal data are presented as mean ± standard deviation and median (interquartile range), respectively P values - ANOVA or Kruskal-Wallis, adjusted with ANCOVA for age, gender and BMI; significant differences (p ≤ 0.05) by Bonferroni's were indicated by

RR≠RQ;

RR≠QQ;

QQ≠RQ.

Plasma PON1 activity was influenced only by QQ (R2 = 39%) and RQ (R2 = 19%) genotypes, as demonstrated in table 2; thus, other non-studied factors have an influence of 42%.

Stepwise regression analysis for PON1 activity in the studied population
Parameters R2 Cumulative R2 F p
QQ 0.3876 0.3876 193.7 < 0.0001
RQ 0.1918 0.5794 210.1 < 0.0001
Non-studied factors 0.4206      

R2: coefficient of determination. Variables analyzed following the stepwise criteria are age, gender (female x male), body mass index, total cholesterol, HDL-C, HDL particle size, CETP, PLTP and p.Q192R SNP. The RR genotype was used as reference group.

Univariate linear regression analysis demonstrated that the studied parameters, including p.Q192R SNP, were not associated with mean cIMT, as demonstrated in table 3. As a result, in the multiple regression analysis no variables were selected with 5% significance. In addition, for the logistic regression analysis the studied parameters were not associated with the presence of plaques, as demonstrated in table 4.

Univariate and multiple linear regression analysis for cIMT In the studied population
  Univariate linear regression (n = 310)
Parameters Estimate SE p R2
p.Q192R (RR x QQ) 0.55 8.86 0.951 0.001
p.Q192R (QQ x RQ) -17.26 10.57 0.104 0.005
HDL-C 0.04 0.21 0.845 < 0.0001
Apo A-I 0.08 0.12 0.482 < 0.0001
HDL particle size 0.92 6.96 0.895 < 0.0001
hsCRP 0.52 0.87 0.554 < 0.0001
PON1 activity -0.08 0.14 0.548 < 0.0001
Multiple linear regression analysis (n = 310)        
Independent variable Dependent Variable Estimate p R2
Mean cIMT - - - -

The variables were transformed into ranks due the absence of Normal distribution and the analyses were controlled for age, gender and BMI. SE: standard error; R2: coefficient of determination; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; apo: apolipoprotein; hsCRP: high sensitivity C reactive protein; PON1: paraoxonase 1.

 Logistic regression analysis for the presence of carotid atherosclerotic plaques in the studied population
  Univariate logistic regression (n= 308)
Parameters Estimate SE p OR 95%CI
p.Q192R (RR x QQ) 0.270 0.471 0.567 1.310 0.520; 3.303
p.Q192R (QQ x RQ) 0.266 0.464 0.566 1.305 0.526; 3.241
HDL-C -0.002 0.009 0.777 0.997 0.980; 1.015
Apo A-I 0.003 0.004 0.486 1.003 0.994; 1.012
HDL particle size -0.370 0.299 0.216 0.691 0.384; 1.241
hsCRP -0.032 0.040 0.418 0.968 0.895; 1.047
PON1 activity -0.005 0.005 0.334 0.994 0.983; 1.006
Multiple logistic analyses (n = 308)         95%CI
Independent variable Dependent variable Estimate p OR CI95%
Carotid plaques - - - - -

The variables were transformed into ranks due the absence of Normal distribution and the analyses were controlled for age, gender and BMI. SE: standard error; OR: odds ratio; CI: confidence interval; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; apo: apolipoprotein; hsCRP: high sensitivity C reactive protein; PON1: paraoxonase 1.

 Discussion

Studies conducted in different ethnic groups have reported diverse distribution of the p.192Q and p.192R variants. The p.192Q variant has been described as being more frequent in Caucasians28, and p.192R, in Japanese, Chinese and Hispanic populations29 - 31. In addition, the frequencies have been previously explored in a Brazilian population sample, in which significant differences between genotypes regarding European descendants and Afro-Brazilians were demonstrated15. In our study, the p.192R variant represents 59% of the total sample, and p.192Q, 41%, similar to the frequencies observed in the Afro-Brazilian population15.

Several SNPs in different regions of PON1 have been identified, including the amino acid 192, which is one of the most frequently studied in order to identify the influence on enzyme activity and cardiovascular disease32. In the present study, we demonstrated that the p.192Q variant significantly modulates PON1 activity and the levels of apo A-1, cholesterol and HDL-C.

Genetic variations have a major impact on PON1 catalytic activity; indeed, amino acid 192 is an important active-site of the enzyme and constitutes part of HDL surface anchoring33. Studies regarding the impact of p.Q192R on the hydrolytic activity demonstrated that the p.192R variant shows higher activity towards paraoxon and phenylacetate, compared to p.192Q8. Despite that, in this study, p.192Q was associated with increased activity towards paraoxon and the stepwise regression analysis suggests that 58% of PON1 activity was determined by this variant.

There has been evidence associating higher PON1 activity with increased HDL-C levels3. Indeed, Blatter Garin et al.34 observed positive correlations between PON1 activity, HDL-C and apo A-1 levels in a population with confirmed coronary artery disease as well as in control individuals. However, the p.Q192R SNP of PON1 was not associated with apo A-1 and HDL-C levels in any of the groups. On the other hand, our study demonstrated that the p.192Q variant is a significant predictor of increased apo A-1 and HDL-C levels in normolipidemic and asymptomatic individuals.

Low plasma PON1 activity has been positively associated with increased CVD risk regardless of age and ethnicity, as reported by numerous studies, including meta-analyses6 , 7. In this context, multiple clinical reports focused on the role of PON1 polymorphisms that directly affect PON1 activity on CVD35 - 37. In a meta-analysis including 88 studies, Wang et al.35 demonstrated that subjects with the p.192R variant presented a higher CVD risk than those with the p.192Q variant ofPON1 ; however, other studies still show controversies regarding the role of these alleles35. Indeed, there was one strong association correlating the p.192R variant with ischemic stroke, but the risk was confined to Caucasians36; furthermore, Birjmohun et al.37 demonstrated that p.Q192R SNP of PON1 did not predict the CVD risk in individuals from the EPIC-Norfolk cohort study37.

The impact of p.Q192R SNP was also explored in Brazilian population samples. Rios et al.16 studied both p.Q192R and p.M55L SNPs of PON1 in 712 patients, of whom 437 were Caucasians and 275 Afro-Brazilians with established CAD (obstructive lesions higher than 50%). The p.Q192R SNP was not associated with CAD; however, only in Caucasian men did the RR genotype lead to a decrease in HDL-C levels. Oliveira et al.17 also determined the influence of p.Q192R and p.M55L SNPs on 352 patients with angiographically defined CAD and 380 matched controls for age and gender at a high risk for CAD. Similarly, no significant associations were found between the p.Q192R SNP and CAD. In addition, Voetsh et al.18 evaluated the association of p.Q192R and p.M55L SNPs with the risk of arterial ischemic stroke in 118 patients (with a first nonfatal stroke occurring before 45 years of age) and 118 age- and sex-matched controls. The RR genotype was more frequent in patients with ischemic stroke and was independently associated with the disease risk. In this context, the Brazilian population presents controversial relationships regarding the p.Q192R SNP and cardiovascular disease.

In addition to the reports involving the role of p.Q192R SNP of PON1on cardiovascular disease, previous studies conducted in disease states (mainly diabetes and/or hypercholesterolemia) showed inconsistent results regarding the associations between p.Q192R SNP and cIMT38 - 40, a surrogate marker of coronary atherosclerosis41.

Regarding the association of cIMT with p.Q192R in healthy individuals Dessi et al.19 observed an increase, although not significant, of cIMT in the p.192R variant among genotypes. Additionally, Karvonen et al.42 did not observe significant differences regarding cIMT in a large cohort of hypertensive and control individuals. Similarly, there is a lack of associations of p.Q192R with cIMT and carotid atherosclerotic plaques in our study, strongly suggesting that this SNP, in low-risk individuals, is not a major parameter associated with carotid atherosclerosis.

The results should be carefully interpreted since there are limitations that must be addressed, such as the relatively small sample size given the study design, especially its rigorous inclusion and exclusion criteria. In addition, the number of volunteers who underwent the carotid IMT exam was not enough to reach the minimum statistical power (80%) for the logistic regression analysis, since the predicted sample size to meet this condition was 480 individuals. Furthermore, the low compliance to a second visit for cIMT measurements limited our conclusions and the regression analysis could not provide evidences of a causal relationship betweenPON1 polymorphism and carotid plaques.

 Conclusion

Despite the absence of associations of p.Q192R SNP with cIMT and carotid plaques, there is evidence in our study that the p.192Q variant exerts important beneficial influences on the plasma lipid profile. However, larger studies are needed to further establish the association of p.Q192R SNP with CVD in low cardiovascular risk individuals.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq (processo 159980/2012-7) and FAPESP (processo 471380/2008-13).

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 Acknowledgments

This work was supported by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq), grant number 159980/2012-7, and by the State of São Paulo Research Foundation (Fapesp), grant number 471380/2008-13.

 References Sorenson RC, Bisgaier CL, Aviram M, Hsu C, Billecke S, La Du BN. Human serum paraoxonase/arylesterase's retained hydrophobic N-terminal leader sequence associates with HDLs by binding phospholipids: apolipoprotein A-I stabilizes activity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999;19(9):2214-25. Sorenson RC Bisgaier CL Aviram M Hsu C Billecke S La Du BN Human serum paraoxonase/arylesterase's retained hydrophobic N-terminal leader sequence associates with HDLs by binding phospholipids: apolipoprotein A-I stabilizes activity Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999 19 9 2214 2225 Aviram M, Kaplan M, Rosenblat M, Fuhrman B. Dietary antioxidants and paraoxonases against LDL oxidation and atherosclerosis development. Handb Exp Pharmacol. 2005;(170):263-300. Aviram M Kaplan M Rosenblat M Fuhrman B Dietary antioxidants and paraoxonases against LDL oxidation and atherosclerosis development Handb Exp Pharmacol 2005 170 263 300 van Himbergen TM, Roest M, de Graaf J, Jansen EH, Hattori H, Kastelein JJ, et al. Indications that paraoxonase-1 contributes to plasma high density lipoprotein levels in familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 2005;46(3):445-51. van Himbergen TM Roest M de Graaf J Jansen EH Hattori H Kastelein JJ Indications that paraoxonase-1 contributes to plasma high density lipoprotein levels in familial hypercholesterolemia J Lipid Res 2005 46 3 445 451 Kontush A, Chantepie S, Chapman MJ. Small, dense HDL particles exert potent protection of atherogenic LDL against oxidative stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23(10):1881-8. Kontush A Chantepie S Chapman MJ Small, dense HDL particles exert potent protection of atherogenic LDL against oxidative stress Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003 23 10 1881 1888 Razavi AE, Ani M, Pourfarzam M, Naderi GA. Associations between high density lipoprotein mean particle size and serum paraoxonase-1 activity. J Res Med Sci. 2012;17(11):1020-6. Razavi AE Ani M Pourfarzam M Naderi GA Associations between high density lipoprotein mean particle size and serum paraoxonase-1 activity J Res Med Sci 2012 17 11 1020 1026 Wang M, Lang X, Cui S, Zou L, Cao J, Wang S, et al. Quantitative assessment of the influence of paraoxonase 1 activity and coronary heart disease risk. DNA Cell Biol. 2012;31(6):975-82. Wang M Lang X Cui S Zou L Cao J Wang S Quantitative assessment of the influence of paraoxonase 1 activity and coronary heart disease risk DNA Cell Biol 2012 31 6 975 982 Zhao Y, Ma Y, Fang Y, Liu L, Wu S, Fu D, et al. Association between PON1 activity and coronary heart disease risk: a meta-analysis based on 43 studies. Mol Genet Metab. 2012;105(1):141-8. Zhao Y Ma Y Fang Y Liu L Wu S Fu D Association between PON1 activity and coronary heart disease risk: a meta-analysis based on 43 studies Mol Genet Metab 2012 105 1 141 148 Schrader C, Rimbach G. Determinants of paraoxonase 1 status: genes, drugs and nutrition. Curr Med Chem. 2011;18(36):5624-43. Schrader C Rimbach G Determinants of paraoxonase 1 status: genes, drugs and nutrition Curr Med Chem 2011 18 36 5624 5643 Humbert R, Adler DA, Disteche CM, Hassett C, Omiecinski CJ, Furlong CE. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism. Nat Genet. 1993;3(1):73-6. Humbert R Adler DA Disteche CM Hassett C Omiecinski CJ Furlong CE The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism Nat Genet 1993 3 1 73 76 Imai Y, Morita H, Kurihara H, Sugiyama T, Kato N, Ebihara A, et al. Evidence for association between paraoxonase gene polymorphisms and atherosclerotic diseases. Atherosclerosis. 2000;149(2):435-42. Imai Y Morita H Kurihara H Sugiyama T Kato N Ebihara A Evidence for association between paraoxonase gene polymorphisms and atherosclerotic diseases Atherosclerosis 2000 149 2 435 442 Zama T, Murata M, Matsubara Y, Kawano K, Aoki N, Yoshino H, et al. A 192Arg variant of the human paraoxonase (HUMPONA) gene polymorphism is associated with an increased risk for coronary artery disease in the Japanese. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997;17(12):3565-9. Zama T Murata M Matsubara Y Kawano K Aoki N Yoshino H A 192Arg variant of the human paraoxonase (HUMPONA) gene polymorphism is associated with an increased risk for coronary artery disease in the Japanese Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997 17 12 3565 3569 Pfohl M, Koch M, Enderle MD, Kuhn R, Fullhase J, Karsch KR, et al. Paraoxonase 192 Gln/Arg gene polymorphism, coronary artery disease, and myocardial infarction in type 2 diabetes. Diabetes. 1999;48(3):623-7. Pfohl M Koch M Enderle MD Kuhn R Fullhase J Karsch KR Paraoxonase 192 Gln/Arg gene polymorphism, coronary artery disease, and myocardial infarction in type 2 diabetes Diabetes 1999 48 3 623 627 Bayrak A, Bayrak T, Tokgozoglu SL, Volkan-Salanci B, Deniz A, Yavuz B, et al. Serum PON-1 activity but not Q192R polymorphism is related to the extent of atherosclerosis. J Atheroscler Thromb. 2012;19(4):376-84. Bayrak A Bayrak T Tokgozoglu SL Volkan-Salanci B Deniz A Yavuz B Serum PON-1 activity but not Q192R polymorphism is related to the extent of atherosclerosis J Atheroscler Thromb 2012 19 4 376 384 Antikainen M, Murtomaki S, Syvanne M, Pahlman R, Tahvanainen E, Jauhiainen M, et al. The Gln-Arg191 polymorphism of the human paraoxonase gene (HUMPONA) is not associated with the risk of coronary artery disease in Finns. J Clin Invest. 1996;98(4):883-5. Antikainen M Murtomaki S Syvanne M Pahlman R Tahvanainen E Jauhiainen M The Gln-Arg191 polymorphism of the human paraoxonase gene (HUMPONA) is not associated with the risk of coronary artery disease in Finns J Clin Invest 1996 98 4 883 885 Allebrandt KV, Souza RL, Chautard-Freire-Maia EA. Variability of the paraoxonase gene (PON1) in Euro- and Afro-Brazilians. Toxicol Appl Pharmacol. 2002;180(3):151-6. Allebrandt KV Souza RL Chautard-Freire-Maia EA Variability of the paraoxonase gene (PON1) in Euro- and Afro-Brazilians Toxicol Appl Pharmacol 2002 180 3 151 156 Rios DL, D'Onofrio LO, Cerqueira CC, Bonfim-Silva R, Carvalho HG, Santos-Filho A, et al. Paraoxonase 1 gene polymorphisms in angiographically assessed coronary artery disease: evidence for gender interaction among Brazilians. Clin Chem Lab Med. 2007;45(7):874-8. Rios DL D'Onofrio LO Cerqueira CC Bonfim-Silva R Carvalho HG Santos-Filho A Paraoxonase 1 gene polymorphisms in angiographically assessed coronary artery disease: evidence for gender interaction among Brazilians Clin Chem Lab Med 2007 45 7 874 878 Oliveira SA, Mansur AP, Ribeiro CC, Ramires JA, Annichino-Bizzacchi JM. PON1 M/L55 mutation protects high-risk patients against coronary artery disease. Int J Cardiol. 2004;94(1):73-7. Oliveira SA Mansur AP Ribeiro CC Ramires JA Annichino-Bizzacchi JM PON1 M/L55 mutation protects high-risk patients against coronary artery disease Int J Cardiol 2004 94 1 73 77 Voetsch B, Benke KS, Damasceno BP, Siqueira LH, Loscalzo J. Paraoxonase 192 Gln-->Arg polymorphism: an independent risk factor for nonfatal arterial ischemic stroke among young adults. Stroke. 2002;33(6):1459-64. Voetsch B Benke KS Damasceno BP Siqueira LH Loscalzo J Paraoxonase 192 Gln-->Arg polymorphism: an independent risk factor for nonfatal arterial ischemic stroke among young adults Stroke 2002 33 6 1459 1464 Dessi M, Gnasso A, Motti C, Pujia A, Irace C, Casciani S, et al. Influence of the human paraoxonase polymorphism (PON1 192) on the carotid-wall thickening in a healthy population. Coron Artery Dis. 1999;10(8):595-9. Dessi M Gnasso A Motti C Pujia A Irace C Casciani S Influence of the human paraoxonase polymorphism (PON1 192) on the carotid-wall thickening in a healthy population Coron Artery Dis 1999 10 8 595 599 Parra ES, Zago VH, Panzoldo NB, Alexandre F, Vendrame F, Virginio VW, et al. Development of a clinical laboratory data base of hyper and hypo alpha lipoproteins in Campinas-SP and neighboring region. J Bras Patol Med Lab. 2013;49(1):26-33. Parra ES Zago VH Panzoldo NB Alexandre F Vendrame F Virginio VW Development of a clinical laboratory data base of hyper and hypo alpha lipoproteins in Campinas-SP and neighboring region J Bras Patol Med Lab 2013 49 1 26 33 Baecke JA, Burema J, Frijters JE. A short questionnaire for the measurement of habitual physical activity in epidemiological studies. Am J Clin Nutr. 1982;36(5):936-42. Baecke JA Burema J Frijters JE A short questionnaire for the measurement of habitual physical activity in epidemiological studies Am J Clin Nutr 1982 36 5 936 942 Furlan-Viebig R, Pastor-Valero M. [Development of a food frequency questionnaire to study diet and non-communicable diseases in adult population]. Rev Saude Publica. 2004;38(4):581-4. Furlan-Viebig R Pastor-Valero M Development of a food frequency questionnaire to study diet and non-communicable diseases in adult population Rev Saude Publica 2004 38 4 581 584 Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem. 1972;18(6):499-502. Friedewald WT Levy RI Fredrickson DS Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge Clin Chem 1972 18 6 499 502 Lima ES, Maranhao RC. Rapid, simple laser-light-scattering method for HDL particle sizing in whole plasma. Clin Chem. 2004;50(6):1086-8. Lima ES Maranhao RC Rapid, simple laser-light-scattering method for HDL particle sizing in whole plasma Clin Chem 2004 50 6 1086 1088 Lagrost L. Determination of the mass concentration and the activity of the plasma cholesteryl ester transfer protein (CETP). Methods Mol Biol. 1998;110:231-41. Lagrost L Determination of the mass concentration and the activity of the plasma cholesteryl ester transfer protein (CETP) Methods Mol Biol 1998 110 231 241 Jauhiainen M, Ehnholm C. Determination of human plasma phospholipid transfer protein mass and activity. Methods. 2005;36(2):97-101. Jauhiainen M Ehnholm C Determination of human plasma phospholipid transfer protein mass and activity Methods 2005 36 2 97 101 Kleemola P, Freese R, Jauhiainen M, Pahlman R, Alfthan G, Mutanen M. Dietary determinants of serum paraoxonase activity in healthy humans. Atherosclerosis. 2002;160(2):425-32. Kleemola P Freese R Jauhiainen M Pahlman R Alfthan G Mutanen M Dietary determinants of serum paraoxonase activity in healthy humans Atherosclerosis 2002 160 2 425 432 Chen J, Kumar M, Chan W, Berkowitz G, Wetmur JG. Increased influence of genetic variation on PON1 activity in neonates. Environ Health Perspect. 2003;111(11):1403-9. Chen J Kumar M Chan W Berkowitz G Wetmur JG Increased influence of genetic variation on PON1 activity in neonates Environ Health Perspect 2003 111 11 1403 1409 Rojas-Garcia AE, Solis-Heredia MJ, Pina-Guzman B, Vega L, Lopez-Carrillo L, Quintanilla-Vega B. Genetic polymorphisms and activity of PON1 in a Mexican population. Toxicol Appl Pharmacol. 2005;205(3):282-9. Rojas-Garcia AE Solis-Heredia MJ Pina-Guzman B Vega L Lopez-Carrillo L Quintanilla-Vega B Genetic polymorphisms and activity of PON1 in a Mexican population Toxicol Appl Pharmacol 2005 205 3 282 289 Wang X, Fan Z, Huang J, Su S, Yu Q, Zhao J, et al. Extensive association analysis between polymorphisms of PON gene cluster with coronary heart disease in Chinese Han population. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23(2):328-34. Wang X Fan Z Huang J Su S Yu Q Zhao J Extensive association analysis between polymorphisms of PON gene cluster with coronary heart disease in Chinese Han population Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003 23 2 328 334 Suehiro T, Nakamura T, Inoue M, Shiinoki T, Ikeda Y, Kumon Y, et al. A polymorphism upstream from the human paraoxonase (PON1) gene and its association with PON1 expression. Atherosclerosis. 2000;150(2):295-8. Suehiro T Nakamura T Inoue M Shiinoki T Ikeda Y Kumon Y A polymorphism upstream from the human paraoxonase (PON1) gene and its association with PON1 expression Atherosclerosis 2000 150 2 295 298 Lawlor DA, Day IN, Gaunt TR, Hinks LJ, Briggs PJ, Kiessling M, et al. The association of the PON1 Q192R polymorphism with coronary heart disease: findings from the British Women's Heart and Health cohort study and a meta-analysis. BMC Genet. 2004;5:17. Lawlor DA Day IN Gaunt TR Hinks LJ Briggs PJ Kiessling M The association of the PON1 Q192R polymorphism with coronary heart disease: findings from the British Women's Heart and Health cohort study and a meta-analysis BMC Genet 2004 5 17 17 Gaidukov L, Rosenblat M, Aviram M, Tawfik DS. The 192R/Q polymorphs of serum paraoxonase PON1 differ in HDL binding, lipolactonase stimulation, and cholesterol efflux. J Lipid Res. 2006;47(11):2492-502. Gaidukov L Rosenblat M Aviram M Tawfik DS The 192R/Q polymorphs of serum paraoxonase PON1 differ in HDL binding, lipolactonase stimulation, and cholesterol efflux J Lipid Res 2006 47 11 2492 2502 Blatter Garin MC, Moren X, James RW. Paraoxonase-1 and serum concentrations of HDL-cholesterol and apoA-I. J Lipid Res. 2006;47(3):515-20. Blatter Garin MC Moren X James RW Paraoxonase-1 and serum concentrations of HDL-cholesterol and apoA-I J Lipid Res 2006 47 3 515 520 Wang M, Lang X, Zou L, Huang S, Xu Z. Four genetic polymorphisms of paraoxonase gene and risk of coronary heart disease: a meta-analysis based on 88 case-control studies. Atherosclerosis. 2011;214(2):377-85. Wang M Lang X Zou L Huang S Xu Z Four genetic polymorphisms of paraoxonase gene and risk of coronary heart disease: a meta-analysis based on 88 case-control studies Atherosclerosis 2011 214 2 377 385 Dahabreh IJ, Kitsios GD, Kent DM, Trikalinos TA. Paraoxonase 1 polymorphisms and ischemic stroke risk: a systematic review and meta-analysis. Genet Med. 2010;12(10):606-15. Dahabreh IJ Kitsios GD Kent DM Trikalinos TA Paraoxonase 1 polymorphisms and ischemic stroke risk: a systematic review and meta-analysis Genet Med 2010 12 10 606 615 Birjmohun RS, Vergeer M, Stroes ES, Sandhu MS, Ricketts SL, Tanck MW, et al. Both paraoxonase-1 genotype and activity do not predict the risk of future coronary artery disease; the EPIC-Norfolk Prospective Population Study. PLoS One. 2009;4(8):e6809. Birjmohun RS Vergeer M Stroes ES Sandhu MS Ricketts SL Tanck MW Both paraoxonase-1 genotype and activity do not predict the risk of future coronary artery disease; the EPIC-Norfolk Prospective Population Study PLoS One 2009 4 8 e6809 Gnasso A, Motti C, Irace C, Di Gennaro I, Pujia A, Leto E, et al. The Arg allele in position 192 of PON1 is associated with carotid atherosclerosis in subjects with elevated HDLs. Atherosclerosis. 2002;164(2):289-95. Gnasso A Motti C Irace C Di Gennaro I Pujia A Leto E The Arg allele in position 192 of PON1 is associated with carotid atherosclerosis in subjects with elevated HDLs Atherosclerosis 2002 164 2 289 295 Cao H, Girard-Globa A, Serusclat A, Bernard S, Bondon P, Picard S, et al. Lack of association between carotid intima-media thickness and paraoxonase gene polymorphism in non-insulin dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis. 1998;138(2):361-6. Cao H Girard-Globa A Serusclat A Bernard S Bondon P Picard S Lack of association between carotid intima-media thickness and paraoxonase gene polymorphism in non-insulin dependent diabetes mellitus Atherosclerosis 1998 138 2 361 366 Leus FR, Wittekoek ME, Prins J, Kastelein JJ, Voorbij HA. Paraoxonase gene polymorphisms are associated with carotid arterial wall thickness in subjects with familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis. 2000;149(2):371-7. Leus FR Wittekoek ME Prins J Kastelein JJ Voorbij HA Paraoxonase gene polymorphisms are associated with carotid arterial wall thickness in subjects with familial hypercholesterolemia Atherosclerosis 2000 149 2 371 377 Hodis HN, Mack WJ, LaBree L, Selzer RH, Liu CR, Liu CH, et al. The role of carotid arterial intima-media thickness in predicting clinical coronary events. Ann Intern Med. 1998;128(4):262-9. Hodis HN Mack WJ LaBree L Selzer RH Liu CR Liu CH The role of carotid arterial intima-media thickness in predicting clinical coronary events Ann Intern Med 1998 128 4 262 269 Karvonen J, Kauma H, Paivansalo M, Kesaniemi YA. Paraoxonase-1 gene Leu-Met55 and Gln-Arg192 polymorphisms are not associated with carotid artery atherosclerosis in a population-based cohort. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil. 2004;11(6):511-2. Karvonen J Kauma H Paivansalo M Kesaniemi YA Paraoxonase-1 gene Leu-Met55 and Gln-Arg192 polymorphisms are not associated with carotid artery atherosclerosis in a population-based cohort Eur J Cardiovasc Prev Rehabil 2004 11 6 511 512 O SNP p.Q192R da PON1 não Parece Associar-se a Fatores de Risco para a Aterosclerose Carotídea em Amostra de População Brasileira Normolipidêmica e Assintomática Scherrer Daniel Zanetti 1 Zago Vanessa Helena de Souza 1 Vieira Isabela Calanca 1 Parra Eliane Soler 1 Panzoldo Natália Baratella 1 Alexandre Fernanda 1 Secolin Rodrigo 2 Baracat Jamal 3 Quintão Eder Carlos Rocha 4 Faria Eliana Cotta de 1 Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Patologia Clínica São Paulo SP Brasil Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Patologia Clínica, São Paulo, SP - Brasil Universidade Estadual de Campinas Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Genética Médica São Paulo SP Brasil Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Genética Médica, São Paulo, SP - Brasil Universidade Estadual de Campinas Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Ciências Médicas Departamento de Radiologia São Paulo SP Brasil Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas - Departamento de Radiologia, São Paulo, SP - Brasil Universidade Estadual de Campinas Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Médicas Laboratório de Lípides São Paulo SP Brasil Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Médicas - Laboratório de Lípides (LIM10), São Paulo, SP - Brasil Universidade de São Paulo Correspondência: Daniel Zanetti Scherrer, R. Tessália Vieira de Camargo, 126. Cidade Universitária “Zeferino Vaz”, CEP 13083-887. Campinas, SP - Brasil. E-mail: zanettis@hotmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa:Scherrer DZ, Quintão ECR, Faria EC. Obtenção de dados: Scherrer DZ, Zago VHS, Vieira IC, Parra ES, Panzoldo NB, Alexandre F, Baracat J. Análise e interpretação dos dados: Scherrer DZ, Zago VHS, Vieira IC, Secolin R, Baracat J, Faria EC. Análise estatística: Scherrer DZ, Zago VHS, Secolin R. Obtenção de financiamento: Quintão ECR, Faria EC. Redação do manuscrito: Scherrer DZ, Zago VHS, Faria EC. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante:Scherrer DZ, Zago VHS, Vieira IC, Parra ES, Panzoldo NB, Alexandre F, Secolin R, Quintão ECR, Faria EC.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamentos:

Evidências sugerem que a paroxonase 1 (PON1) confere importantes propriedades antioxidantes e antiinflamatórias quando associada à lipoproteína de alta densidade (HDL).

 Objetivo:

Investigar as relações entre o SNP p.Q192R da PON1, parâmetros bioquímicos e aterosclerose carotídea em uma amostra populacional brasileira assintomática e normolipidêmica.

 Métodos:

Foram estudados 584 voluntários (mulheres, n = 326; homens, n = 258; idade entre 19-75 anos). Foi extraído DNA genômico total e o SNP foi detectado na plataforma de genotipagem TaqMan® SNP OpenArray®(Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram dosadas lipoproteínas e apolipoproteínas plasmáticas, e a atividade da PON1 foi medida utilizando-se paraoxon como substrato. Foi utilizada ultrassonografia bidimensional de alta resolução para determinar a espessura íntimo‑medial das artérias carótidas (EIMc) e a presença de placas ateroscleróticas carotídeas em um subgrupo de indivíduos (n = 317).

 Resultados:

A presença de p.192Q esteve associada a um aumento significativo da atividade da PON1 (RR = 12,30 (11,38); RQ = 46,96 (22,35); QQ = 85,35 (24.83) μmol/min; p < 0,0001), HDL-C (RR = 45 (37); RQ = 62 (39); QQ= 69 (29) mg/dL; p < 0,001) e apo A-1 (RR = 140,76 ± 36,39; RQ = 147,62 ± 36,92; QQ = 147,49 ± 36,65 mg/dL; p = 0,019). A análise de regressãostepwise mostrou que heterozigotos e portadores de p.192Q influenciaram 58% da atividade da PON1 em relação ao paraoxon. A análise de regressão linear univariada demonstrou que não houve associação entre o SNP p.Q192R e a EIMc média; como resultado, na análise de regressão múltipla nenhuma variável foi selecionada com 5% de significância. Os parâmetros estudados não se associaram à presença de placas carotídeas na análise de regressão logística.

 Conclusão:

Em indivíduos de baixo risco, a presença da variante p.192Q daPON1 mostrou-se associada a um perfil lipídico plasmático benéfico e à ausência de aterosclerose de carótida.

 Paraoxonase-1 / genética Polimorfismo Genético Doenças das Artérias Carótidas / fisiopatologia Lipoproteínas HDL Introdução

A paraoxonase 1 (PON1-OMIM 168820) humana é uma esterase sérica cálcio-dependente composta de 354 aminoácidos, com peso molecular de 43kDa e codificada no cromossomo 7q21. A PON1 liga-se à lipoproteína de alta densidade (HDL) por meio da interação do N-terminal hidrofóbico com fosfolípides e a apolipoproteína A-1 (apo A-1)1, conferindo importantes propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias à HDL2.

Estudos anteriores sugerem que a atividade da PON1 pode influenciar a concentração de HDL-C, provavelmente devido ao envolvimento da PON1 na proteção contra oxidação da HDL3. Além disso, a PON1 está presente em partículas de HDL pequenas e densas4, indicando que há uma relação entre a atividade de PON1 e o tamanho do HDL5.

A relação entre a atividade da PON1 e o risco de doença arterial coronariana (DAC) em humanos tem sido documentada entre várias etnias populacionais; assim, duas meta-análises confirmaram a associação de uma menor atividade da PON1 com aumento do risco de DAC, independentemente da idade e da etnia6 , 7.

A atividade da PON1 está sob regulação genética e ambiental, havendo ampla variação entre indivíduos e populações8. O SNP rs662 encontrado na região codificadora leva a uma substituição da glutamina (CAA) por arginina (CGA) na posição 192 (p.Q192R)9. Além de seus efeitos sobre a atividade enzimática, foram realizados vários estudos para elucidar a relação entre SNP e doença cardiovascular (DCV) estabelecida em diferentes populações. A frequência da variante p.192R mostrou-se aumentada em grupos com DCV de populações de japoneses, brancos e asiáticos-indianos10 - 12. No entanto, essas associações não foram encontradas em populações de turcos e finlandeses13 , 14.

Na população brasileira, a distribuição do SNP p.Q192R varia entre grupos étnicos15; além disso, há controvérsias acerca do impacto da variante p.192R sobre DCV estabelecida16 - 18. Ademais, não há estudos em nossa população correlacionando SNP ao risco de DCV em indivíduos assintomáticos; de fato, são raros os estudos associando o polimorfismo a aterosclerose carotídea em indivíduos saudáveis19.

Frente aos resultados obtidos em estudos realizados em diferentes grupos étnicos e à escassez de estudos em populações de baixo risco, investigamos as relações do SNP p.Q192R da PON1 com parâmetros bioquímicos e aterosclerose carotídea em uma população brasileira assintomática e normolipidêmica.

 Métodos População do estudo

Este estudo incluiu 584 indivíduos selecionados entre 1536 voluntários normolipidêmicos e assintomáticos de ambos os sexos, com idade de 19 a 75 anos que haviam sido submetidos a check-ups de saúde gratuitos em centros de atendimento primário à saúde entre 2008 e 2012 nas cidades de Campinas e Americana (Estado de São Paulo, Brasil), como anteriormente descrito por Parra e cols.20. À admissão, os indivíduos foram submetidos a uma avaliação clínica completa e responderam a um questionário detalhado para fornecer dados sobre antecedentes familiares de doença arterial coronariana precoce (definida como a ocorrência de eventos agudos e/ou óbito em parentes de primeiro grau), estado de saúde pregresso e atual, hábitos alimentares e de atividades físicas, consumo de álcool e cigarro, e medicações. Os hábitos de atividades físicas foram avaliados por meio de um questionário adaptado de Baecke e cols.21, consistindo de 16 perguntas que incluem 3 índices de atividades físicas habituais nos últimos 12 meses, definidas como (i) índice de atividade física ocupacional ou laboral; (ii) índice de exercício físico no tempo livre; e (iii) índice de atividade física no tempo livre e de locomoção. Além disso, os hábitos alimentares foram avaliados através de um questionário de frequência alimentar (classificada como diária, semanal ou mensal/nenhum consumo) adaptado de Furlan-Viebig e Pastor-Valero22, das 10 seguintes classes de alimentos: (i) leite e derivados; (ii) carne, peixe e ovos; (iii) legumes; (iv) frutas; (v) sucos naturais; (vi) pães, cereais e tuberosas; (vii) óleos e gorduras; (viii) doces, lanches e guloseimas; (ix) bebidas não alcoólicas e (x) preparações e outros.

Os critérios de exclusão foram o uso regular de medicamentos, especialmente aqueles que interferem com o metabolismo dos lipídeos, como as estatinas, terapia de reposição hormonal e contraceptivos. As medicações permitidas no protocolo incluíram: (1) vitaminas, suplementos nutricionais e homeopatia; (2) antidepressivos; (3) analgésicos (uso esporádico); (4) antialérgicos e inibidores de bomba de prótons e (5) duas ou mais das medicações mencionadas associadas. Foram também excluídos os voluntários portadores de disfunção de tireoide, dislipidemia, diabetes mellitus, síndrome metabólica, obesidade, gravidez, hipertensão arterial, doenças do fígado, pulmões ou rins, uso abusivo de álcool (> 14g/dia) e tabagistas.

Foram coletadas amostras de sangue venoso após um período de 12 horas de jejum para separação de soro e plasma EDTA por centrifugação (4°C, 1000 xg , 10 minutos), com posterior armazenamento a -80°C até a análise. Em outra consulta, os voluntários foram submetidos a ultrassonografia de carótidas.

O Comitê de Ética em Ciências Médicas da Universidade de Campinas aprovou o estudo e todos os voluntários assinaram o termo de consentimento.

 Análise bioquímica

Foram analisadas amostras frescas de soro para colesterol total, HDL-C, triglicérides e glicose no aparelho Modular Analytics® EVO (Roche Diagnostics, Burgess Hill, West Sussex, Reino Unido) utiizando-se reagentes da Roche Diagnostics® (Mannheim, Alemanha). As apolipoproteínas A-1 e B foram dosadas por nefelometria no sistema automatizado BN II (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Alemanha) por meio de ensaios disponíveis comercialmente (Dade-Boehringer®, Deerfield, Illinois, EUA). O colesterol lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) foi calculado pela fórmula de Friedewald23, enquanto que o colesterol da lipoproteína de muito baixa densidade foi calculado pela fórmula triglicérides/521.

A proteína C reativa (PCR) por dosada por imunoturbidimetria com método ultrassensível (PCR-us), através do ensaio comercialmente disponível Tina-quant CRP (Látex) HS-Roche (Roche Diagnostics®, Mannheim, Alemanha).

O tamanho das partículas de HDL foi medido pela técnica de dinamic light scattering (DLS) após precipitação química das lipoproteínas contendo apo B em amostras de plasma, utilizando-se polietilenoglicol (PEG) 8000 (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA)24. As medidas foram feitas três vezes no equipamento Nanotrac Particle Size Analyzer (Microtrac, North Largo, Florida, EUA), sendo utilizada como padrão uma nanopartícula polimérica de 100nm; uma amostra controle obtida do mesmo indivíduo foi utilizada em todas as medidas.

Foi determinada a atividade plasmática da proteína de transferência de colesterol esterificado (CETP) e da proteína de transferência de fosfolipídios (PLTP) por ensaios radiométricos utilizando substratos exógenos25 , 26. Além disso, mediu-se a atividade da PON-1 usando o paraoxon (dietil-p-nitrofenilfosfato, Sigma, St. Louis, MO, EUA) como substrato27.

 Genotipagem do SNP

Foi extraído o DNA genômico total de células mononucleares de sangue periférico, de acordo com a técnica padrão fenol/clorofórmio. Foram analisadas a qualidade, integridade e concentração das amostras de DNA, tendo sido essas amostras armazenadas a -20 °C antes de serem utilizadas.

Foi feita análise genotípica para SNP p.Q192R da PON1 na plataforma OpenArray® Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA), conforme o protocolo padrão do fabricante. Os genótipos foram determinados através do software TaqMan®Genotyper 1.0.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os indivíduos com genótipo GG foram designados como RR (homozigotos p.192R), enquanto os com genótipo AA foram denominados QQ (homozigotos p.192Q), e os com genótipo GA (heterozigotos) foram chamados de RQ.

 Medidas da espessura íntimo-medial das artérias carótidas (EIMc)

Todos os voluntários foram convidados a serem submetidos a medidas da “espessura da íntimo-medial das artérias carótidas, tendo o exame sido realizado em um subgrupo de 316 indivíduos. A ultrassonografia de carótida foi realizada por apenas um ultrassonografista treinado, que desconhecia os sujeitos do estudo. Foi realizada ultrassonografia bidimensional de alta resolução através de um sistema de imagens de ultrassom com matriz linear de 6-9 MHz (Sistema de Ultrassom ATL HDI 1500 e 3500, Advanced Technology Laboratories Ultrasound, Bothell, EUA) sendo feitas medidas longitudinais de segmentos das artérias carótidas comuns na parede distal e a 1 cm da bifurcação. A EIMc média foi calculada com base na média de 5 medidas dos lados direito e esquerdo e expressa em milímetros (mm), sendo também determinada a presença de placas nas carótidas.

 Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas nos softwares SPSS 16.0 (SPSS Inc., EUA) e R (R Development Core Team, Viena, Áustria). Determinou-se a normalidade de distribuição das variáveis pelo teste de Kolmogorov‑Smirnov. Os dados normais foram representados como média ± desvio padrão e, os não‑normais, como mediana (intervalo interquartil).

As comparações entre os genótipos foram realizadas através da ANOVA ou do teste de Kruskal-Wallis seguido do teste de Bonferroni para dados normais e não normais, respectivamente. Além disso, foi realizado o teste do qui quadrado para variáveis categóricas. Quando necessário, as comparações foram ajustadas para idade, sexo e índice de massa corpórea (IMC) através da ANCOVA.

Foram feitas análises de regressão stepwise para verificar os principais determinantes da atividade da PON1, tendo sido incluídas as variáveis idade, sexo, IMC, tamanho da partícula do HDL, CETP, PLTP e SNP p.Q192R da PON1 .

Análises de regressão linear univariada e multivariada controladas para idade, sexo e IMC foram feitas para avaliar a influência do HDL-C, apo A-1, tamanho da partícula do HDL, PCR-us, atividade da PON1 e do SNP p.Q192R sobre a EIMc média. Além disso, a análise de regressão logística determinou a razão das chances (RC) para a presença de placas carotídeas de acordo com HDL-C, apo A-1, tamanho da partícula de HDL, PCR-us, atividade da PON1 e SNP p.Q192R, também controlada por idade, sexo e IMC. Foi utilizado o software G* Power para avaliar se a amostra tinha poder estatístico para detectar associações, de acordo com os seguintes parâmetros: RC = 1,5; nível de significância α = 0,008 (ajustado para múltiplas comparações); bicaudal; poder estatístico 1-β = 80%. Desta forma, a amostra apresentou, respectivamente, 99,9% e 54,98% de poder estatístico para regressão linear múltipla e análise de regressão logística.

Valores de p < 0,05 (corrigidos por Bonferroni para testes múltiplos) foram considerados estatisticamente significantes.

 Resultados

A população do estudo foi composta de 56% de mulheres e 44% de homens, e a frequência genotípica foi de 37%, 45% e 19% para os grupos RR, RQ e QQ, respectivamente. O SNP p.Q192R mostrou-se em equilíbrio de Hardy–Weinberg. Ademais, todos os voluntários eram assintomáticos, não fumantes, sem relatos atuais ou pregressos de disfunção de tiroide, dislipidemias, diabetes mellitus ou outras endocrinopatias; não apresentavam gravidez, obesidade, síndrome metabólica, hipertensão arterial, nem doenças do fígado, pulmões ou rins.

As características clínicas e bioquímicas foram descritas e comparadas entre os genótipos, como mostrado na Tabela 1. Os voluntários do grupo QQ apresentaram aumento importante da atividade da PON 1, do colesterol total, HDL-C e apo A-1 em comparação com os dos grupos RQ e RR. Não foram observadas diferenças significantes em relação a todos os outros parâmetros bioquímicos, EIMc média, presença de placas, antecedente familiar de DAC precoce, consumo de álcool, uso de medicações e índices de atividade física. Além disso, as frequências (diária, semanal e mensal/nenhum consumo) das 10 classes de alimentos estudadas não foram significativamente diferentes entre os genótipos, como mostram os dados a seguir: leite e derivados (p = 0,716); carne, peixe e ovos (p = 0,269); legumes (p = 0,766); frutas (p = 0,198); sucos naturais (0,412); pães, cereais e tuberosas (0,136); óleos e gorduras (p = 0,435); doces, lanches e guloseimas (p = 0,545); bebidas não alcoólicas (p = 0,454) e preparações e outros (p = 0,874).

Análises descritiva e comparativa dos parâmetros clínicos, antropométricos e bioquímicos entre os genotipos da p.Q192R da PON1
Parâmetros RR (n = 215) RQ (n = 260) QQ (n = 109) p
Sexo (Feminino/Masculino) 112/103 153/107 61/48 -
Idade (anos) 45 (23) 44 (27) 46 (17) -
IMC (kg/m2) 23,6 ± 2,8 23,4 ± 2,9 24,5 ± 2,9 -
Circunferência da cintura (cm) 78 (15) 76 (13) 74 (10) 0,413
PAS (mmHg) 120 (15) 120 (20) 120 (20) 0,334
PAD (mmHg) 80 (10) 80 (14) 80 (8) 0,260
Colesterol total (mg/dL) 170 ± 32 174 ± 29 176 ± 30 0,044 †
HDL-C (mg/dL) 45 (37) 62 (39) 69 (29) < 0,001 † ‡
Tamanho do HDL (nm) 7,85 (0,91) 8,00 (1,02) 8,06 (0,88) 0,467
Triglicérides (mg/dL) 77 (43) 74 (45) 64 (33) 0,054
LDL-C (mg/dL) 100 ± 26 101 ± 23 101 ± 22 0,550
VLDL-C (mg/dL) 15 (8) 15 (9) 13 (7) 0,069
Apo A-1 (mg/dL) 140,76 ± 36,39 147,62 ± 36,92 147,49 ± 36,65 0,019 †
Apo B (mg/dL) 76,37 ± 19,64 76,80 ± 17,11 75,54 ± 18,72 0,472
CETP(%) 13,55 ± 5,45 13,38 ± 5,92 13,20 ± 5,24 0,616
PLTP (nmolesCL/mL/h) 6321 (3074) 6086 (2253) 6088 (2393) 0,414
PON1 (pmol/min) 12,30 (5,90) 46,95 (22,35) 85,35 (21,18) < 0,001 * † ‡
Glicose (mg/dL) 84 (12) 83 (10) 84 (9) 0,499
PCR-us (mg/L) 0,80 (1,00) 0,80 (1,13) 0,90 (1,65) 0,231
EIMc média (mm) 0,60 (0,20) 0,60 (0,30) 0,58 (0,15) 0,207
Placas carotídeas (Sim/Não, %) 19/81 18/82 11/89 0,712
Antecedente familiar de DAC precoce (Sim/Não, %) 7/30 6/39 6/15 0,659
Consumo de álcool (Moderado/Nenhum, %) 7/31 9/36 3/14 0,503
Medicações (Sim/Não, %) 5/31 8/37 3/16 0,903
Índice de atividade física ocupacional ou laboral 2,75 (1,00) 2,75 (0,87) 2,87 (0,62) 0,493
Índice de atividade física no tempo livre 2,00 (1,00) 2,00 (1,25) 2,00 (1,50) 0,913
Índice de atividade no tempo livre e locomoção 2,50 (1,00) 2,50 (1,00) 2,50 (1,00) 0,998

(n): número de indivíduos ou como mostrado abaixo; IMC: índice de massa corpórea; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; HDL-C: colesterol da lipoproteína de alta densidade; LDL-C: colesterol da lipoproteína de baixa densidade; VLDL-C: colesterol da lipoproteína de muito baixa densidade; Apo: apolipoproteína; PCRus: proteína C reativa ultrassensível; CETP: proteína de transferência de colesterol esterificado; PLTP: proteína de transferência de fosfolipídios; CL: colesterol livre; PON1: paraoxonase 1; DAC: doença arterial coronariana; EIMc: espessura íntimo-medial de artérias carótidas: RR (119), RQ (132),QQ (66). Dados normais e não normais são apresentado como média ± desvio padrão e mediana (intervalo interquartil), respectivamente. Valores de p - ANOVA ou Kruskal-Wallis, ajustados por ANCOVA para idade, sexo e IMC; diferenças significantes (p ≤ 0,05) por teste de Bonferroni foram marcadas com

RR≠RQ;

RR≠QQ;

QQ≠RQ.

A atividade da PON1 plasmática foi influenciada apenas pelos genótipos QQ (R2= 39%) e RQ (R2= 19%), como mostra a Tabela 2. Portanto, outros fatores não estudados têm uma influência de 42%.

Análise de regressão <italic>stepwise</italic>para atividade de PON1 na população do estudo
Parâmetros R2 R2acumulado F p
QQ 0,3876 0,3876 193,7 < 0,0001
RQ 0,1918 0,5794 210,1 < 0,0001
Fatores não estudados 0,4206      

R2: coeficiente de determinaçao. As variaveis analisadas seguindo os critérios stepwise são idade, sexo (feminino x masculino), índice de massa corpórea, colesterol total, HDL-C, tamanho da partícula de HDL, CETP, PLTPe SNPp.Q192R. O genótipo RR foi usado como grupo de referência.

A análise de regressão linear univariada demonstrou que os parâmetros estudados, incluindo o SNP p.Q192R, não se associaram à EIMc média, como mostra a Tabela 3. Assim, não foram selecionadas variáveis com 5% de significância na análise de regressão múltipla. Ademais, os parâmetros estudados não se associaram à presença de placas pela análise de regressão logística, como mostra a Tabela 4.

Análise de regressão múltipla univariada para EIMc na população do estudo
  Regressão linear univariada (n = 310)
Parâmetros Estimativa EP p R2
p.Q192R (RR x QQ) 0,55 8,86 0,951 0,001
p.Q192R (QQ x RQ) -17,26 10,57 0,104 0,005
HDL-C 0,04 0,21 0,845 < 0,0001
Apo A-1 0,08 0,12 0,482 < 0,0001
Tamanho da partícula de HDL 0,92 6,96 0,895 < 0,0001
PCRus 0,52 0,87 0,554 < 0,0001
Atividade da PON1 -0,08 0,14 0,548 < 0,0001
Análise de regressão linear múltipla (n = 310)        
Variável independente Variável dependente Estimativa p R2
EIMc média - - - -

As variáveis foram transformadas em ranks, devido à ausência de distribuição normal e as análises foram controladas para idade, sexo e IMC. EP: erro padrão; R2: coeficiente de determinação; HDL-C: colesterol lipoproteína de alta densidade; apo: apolipoproteína; PCRus: proteína C reativa ultrassensível; PON1: paraoxonase 1.

 Análise de regressão logística para a presença de placas ateroscleróticas carotídeas na população do estudo
  Regressão logística univariada (n= 308)
Parâmetros Estimativa EP p RC IC 95%
p.Q192R (RR x QQ) 0,270 0,471 0,567 1,310 0,520; 3,303
p.Q192R (QQ x RQ) 0,266 0,464 0,566 1,305 0,526; 3,241
HDL-C -0,002 0,009 0,777 0,997 0,980; 1,015
Apo A-1 0,003 0,004 0,486 1,003 0,994; 1,012
Tamanho da partícula de HDL -0,370 0,299 0,216 0,691 0,384; 1,241
PCRus -0,032 0,040 0,418 0,968 0,895; 1,047
Atividade da PON1 -0,005 0,005 0,334 0,994 0,983; 1,006
Análises logísticas múltiplas (n = 308)         IC 95%
Variável independente Variável dependente Estimativa p RC IC 95%
Placas de carótida - - - - -

As variáveis foram transformadas em ranks devido à ausência de distribuição normal e as análises foram controladas para idade, sexo e IMC. EP: erro padrão; RC: razão das chances; IC: intervalo de confiança; HDL-C: colesterol lipoproteína de alta densidade; apo: apolipoproteína; PCRus: proteína C reativa ultrassensível; PON1: paraoxonase 1.

 Discussão

Estudos realizados em diferentes grupos étnicos têm relatado diferentes distribuições das variantes p.192Q e p.192R. A variante p.192Q tem sido descrita com maior frequência em brancos28 e a p.192R, em populações de japoneses, chineses e hispânicos29 - 31. Além disso, as frequências já foram exploradas anteriormente em uma amostra populacional brasileira na qual foram demonstradas diferenças significantes entre os genótipos relacionados a descendentes de europeus e afro-brasileiros15. Em nosso estudo, a variante p.192R representa 59% do total da amostra e a p.192Q, 41%, semelhante às frequências observadas na população afro-brasileira15.

Foram identificados vários SNPs em diferentes regiões da PON1 , incluindo o aminoácido 192, que é um dos mais frequentemente estudados para identificar a influência sobre a atividade enzimática e doença cardiovascular32. No presente estudo, demonstramos que a variante p.192Q modula significativamente a atividade da PON1 e os níveis de apo A-1, colesterol e HDL-C.

Variações genéticas causam impacto importante na atividade catalítica da PON1. De fato, o aminoácido 192 é um sítio ativo importante da enzima, constituindo parte da superfície de ancoragem à HDL33. Estudos sobre o impacto de p.Q192R na atividade hidrolítica demonstraram que a variante p.192R tem maior atividade em relação ao paraoxon e ao fenilacetato em comparação com p.192Q8. Apesar disso, neste estudo, a p.192Q mostrou-se associada à atividade aumentada em relação ao paraoxon, sendo que a análise de regressão stepwise sugere que 58% da atividade da PON1 foi determinada por esta variante.

Há evidências da associação de maior atividade da PON1 com níveis aumentados de HDL-C3. De fato, Blatter Garin e cols.34 observaram correlações positivas entre a atividade da PON1 e níveis de HDL-C e apo A-1 em uma população com doença arterial coronariana confirmada e em indivíduos controles. No entanto, o SNP p.Q192R da PON1 não se associou às concentrações apo A-1 e HDL-C nos dois grupos. Por outro lado, nosso estudo mostrou que a variante p.192Q é um fator preditivo significativo de níveis aumentados de apo A-1 e HDL-C em indivíduos assintomáticos e normolipidêmicos.

Atividade de PON1 plasmática diminuída tem sido positivamente associada a um risco aumentado de DCV, independentemente da idade e etnia, como relatado por vários estudos, incluindo meta-análises6 , 7. Neste contexto, vários relatos clínicos se concentraram no papel dos polimorfismos da PON1 que afetam diretamente a atividade da PON1 nas DCV35 - 37. Em uma meta-análise incluindo 88 estudos, Wang e cols.35 demonstraram que indivíduos portadores da variante p.192R apresentavam um risco de DCV maior do que aqueles portadores da variante p.192Q da PON1 ; no entanto, outros estudos ainda mostram controvérsias sobre o papel desses alelos. De fato, houve uma forte associação entre a variante p.192R e acidente vascular cerebral isquêmico, mas o risco se restringiu aos indivíduos da cor branca36; além disso, Birjmohun e cols.37 demonstraram que o SNP p.Q192R daPON1 não previu o risco de DCV em indivíduos do estudo de coorte EPIC-Norfolk.

O impacto do SNP p.Q192R também foi investigado em amostras populacionais brasileiras. Rios e cols.16 estudaram ambos os SNPs p.Q192R e p.M55L da PON1 em 712 pacientes, sendo 437 brancos e 275 afro-brasileiros com DAC estabelecida (lesões obstrutivas maiores que 50%). O SNP p.Q192R não se associou à DAC; no entanto, apenas em homens brancos o genótipo RR levou a uma queda nos níveis de HDL-C. Oliveira e cols.17 também determinaram a influência dos SNPs p.Q192R e p.M55L em 352 pacientes com DAC definida angiograficamente e em 380 controles com alto risco de DAC pareados por idade e sexo. De forma semelhante, não foram encontradas associações significantes entre o SNP p.Q192R e DAC. Além disso, Voetsh e cols.18 avaliaram a associação dos SNPs p.Q192R e p.M55L com o risco de acidente vascular cerebral (AVC) isquêmico em 118 pacientes (com um primeiro AVC não fatal ocorrendo antes dos 45 anos de idade) e 118 controles pareados por idade e sexo. O genótipo RR foi mais frequente nos pacientes com AVC isquêmico e mostrou-se independentemente associado ao risco da doença. Neste contexto, a população brasileira apresenta relações controversas relacionadas ao SNP p.Q192R e doença cardiovascular.

Além dos relatos envolvendo o papel da p.Q192R da PON1 na doença cardiovascular, estudos anteriores realizados em estados patológicos (especialmente diabetes e/ou hipercolesterolemia) mostraram resultados inconsistentes em relação às associações entre SNP p.Q192R e EIMc38 - 40, um marcador substituto de aterosclerose coronariana41.

Em relação à associação da EIMc com p.Q192R em indivíduos hígidos, Dessi e cols.19 observaram um aumento da EIMc na variante p.192R, embora não significativo entre os genótipos. Ademais, Karvonen e cols.42 não observaram diferenças significativas em relação à EIMc em uma grande coorte de indivíduos hipertensos e controles. De forma análoga, em nosso estudo, há uma falta de associações de p.Q192R com EIMc e placas ateroscleróticas de carótida, o que sugere fortemente que este SNP, em indivíduos de baixo risco, não é um parâmetro importante associado à aterosclerose de carótidas.

Os resultados devem ser interpretados com cautela, uma vez que há limitações a serem abordadas, tais como o tamanho amostral relativamente pequeno devido ao desenho do estudo, especialmente em relação aos rigorosos critérios de inclusão e exclusão. Além disso, o número de voluntários que compareceram ao exame de EIM da carótida não foi suficiente para atingir um poder estatístico mínimo (80%) para a análise de regressão logística, uma vez que o tamanho amostral previsto para atender a esta condição era de 480 indivíduos. Ademais, a baixa adesão à segunda consulta para as medidas de EIMc limitou nossas conclusões e a análise de regressão não pode fornecer evidências de uma relação causal entre o polimorfismo da PON1 e placas carotídeas.

 Conclusão

Apesar da ausência de associações do SNP p.Q192R com EIMc e placas carotídeas, há evidências em nosso estudo de que a variante p.192Q exerça influências benéficas importantes no perfil lipídico plasmático. No entanto, estudos maiores são necessários para estabelecer a associação entre o SNP p.Q192R e DCV em indivíduos com baixo risco cardiovascular.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por CNPq (processo 159980/2012-7) e FAPESP (processo 471380/2008-13).

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós‑graduação.

 Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa número 159980/2012-7, e pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), bolsa número 471380/2008-13.