Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia Cp38S4fBtG8SCVKDX63kjSR S0066-782X2015000600006 S0066-782X2015000600006 00006 10.5935/abc.20150036 Original Articles APOE and LDLR Gene Polymorphisms and Dyslipidemia Tracking. Rio de Janeiro Study Freitas Rossana Ghessa Andrade de 1 Campana Erika Maria Gonçalves 1 2 Pozzan Roberto 1 2 Brandão Andréa Araujo 1 2 Brandão Ayrton Pires 1 2 Magalhães Maria Eliane Campos 1 2 Silva Dayse Aparecida da 1 3 Universidade do Estado do Rio de Janeiro Rio de Janeiro RJ Brazil Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ – Brazil Universidade do Estado do Rio de Janeiro Hospital Universitário Pedro Ernesto Rio de Janeiro RJ Brazil Hospital Universitário Pedro Ernesto, Rio de Janeiro, RJ – Brazil Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes Rio de Janeiro RJ Brazil Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Rio de Janeiro, RJ – Brazil Mailing address: Rossana Ghessa Andrade de Freitas,Laboratório de Diagnósticos por DNA. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes. Rua São Francisco Xavier, 524, Pavilhão Haroldo Lisboa da Cunha. Postal Code 20550-900, Rio de Janeiro, RJ – Brazil. E-mail: rghessa@yahoo.com.br

Author contributions

Conception and design of the research:Freitas RGA, Campana EMG, Brandão AA, Brandão AP, Magalhães MEC, Silva DA. Acquisition of data: Freitas RGA, Campana EMG, Brandão AP, Silva DA. Analysis and interpretation of the data: Freitas RGA, Pozzan R. Statistical analysis: Pozzan R. Writing of the manuscript: Brandão AA, Magalhães MEC, Silva DA. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Freitas RGA. Supervision / as the major investigador:Magalhães MEC, Silva DA.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 06 2015 05 05 2015 104 6 468 474 27 08 2014 21 01 2015 28 01 2015 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

Studies show an association between changes in apolipoprotein E (ApoE) and LDLR receptor with the occurrence of dyslipidemia.

 Objectives:

To investigate the association between polymorphisms of the APOE (ε2, ε3, ε4) and LDLR (A370T) genes with the persistence of abnormal serum lipid levels in young individuals followed up for 17 years in the Rio de Janeiro Study.

 Methods:

The study included 56 individuals (35 males) who underwent three assessments at different ages: A1 (mean age 13.30 ± 1.53 years), A2 (22.09 ± 1.91 years) and A3 (31.23 ± 1.99 years). Clinical evaluation with measurement of blood pressure (BP) and body mass index (BMI) was conducted at all three assessments. Measurement of waist circumference (WC) and serum lipids, and analysis of genetic polymorphisms by PCR-RFLP were performed at A2 and A3. Based on dyslipidemia tracking, three groups were established: 0 (no abnormal lipid value at A2 and A3), 1 (up to one abnormal lipid value at A2 or A3) and 2 (one or more abnormal lipid values at A2 and A3).

 Results:

Compared with groups 0 and 1, group 2 presented higher mean values of BP, BMI, WC, LDL-c and TG (p < 0.01) and lower mean values of HDL-c (p = 0.001). Across the assessments, all individuals with APOE genotypes ε2/ε4 and ε4/ε4 maintained at least one abnormal lipid variable, whereas those with genotype ε2/ε3 did not show abnormal values (χ2 = 16.848, p = 0.032). For the LDLR genotypes, there was no significant difference among the groups.

 Conclusions:

APOE gene polymorphisms were associated with dyslipidemia in young individuals followed up longitudinally from childhood.

 Polymorphism, Genetic Dyslipidemias Young Adult Epidemiology Apolipoproteins E Introduction

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading causes of death in adults worldwide, contributing to high rates of early morbidity and mortality1,2. In Brazil, CVDs concentrate annually 1/3 of the overall deaths3,4.

Dyslipidemia is one of the risk factors (RF) for development of CVDs5. Given its importance, studies are being conducted to determine the abnormalities associated with plasma lipid changes and their implications on the occurrence of CVDs6,7. In genetics, several gene polymorphisms and mutations have been identified and associated with atherosclerosis and coronary artery disease (CAD)8,9. This is the case of the apolipoprotein E (ApoE), which is essential for the transport and metabolism of cholesterol and structural stability of lipoproteins10,11, and whose gene has three polymorphic alleles (ε2, ε3 and ε4)12. Population studies have shown higher plasma levels of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-c) in carriers of the ε4 allele12, leading to an association of this allele with the occurrence of CVDs13.

Mutations in the LDL receptor gene (LDLR) have also been implicated with dyslipidemias, particularly in primary forms of homozygous or heterozygous hypercholesterolemia such as familial hypercholesterolemia (FH), a condition associated with early severe atherosclerosis and CAD14-16. The LDLR gene encodes a protein with binding domains for apolipoproteins B and E. Among the different polymorphisms found in the LDLR gene, the A370T has been investigated for its association with increased lipid levels and cardiovascular risk17,18.

Dyslipidemias may be present from an early age, and abnormal lipids tend to persist over time (tracking effect) until adulthood. The identification of genetic markers involved with abnormal lipid metabolism may contribute to the recognition at a young age of patterns of genetic susceptibility and guide interventions to correct these abnormalities.

Based on that, the aim of this study was to investigate the distribution pattern of polymorphisms of the APOE and LDLR genes and their associations with the dyslipidemia phenotype, notably on its tracking effect, in a young population followed up for 17 years.

 Method

The sample of this study was retrieved from the Study of Rio de Janeiro (Estudo do Rio de Janeiro, ERJ). This longitudinal cohort study is part of a line of research on blood pressure (BP) and other cardiovascular RFs in young adults developed in 1983 at the Hypertension Unit of the Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) at Universidade do Estado do Rio de Janeiro(UERJ)19.

The ERJ included three different assessments, named A1, A2 and A3. Assessment A1 was conducted between 1987 and 1988 in individuals aged 10-16 years (mean 13.30 ± 1.53 years), A2 was conducted between 1996 and 1999 in individuals aged 18-26 years (mean 22.09 ± 1.91 years) and A3 was conducted between 2004 and 2005 in individuals aged 27‑35 years (mean 31.23±1.99 years)19.

We selected for genetic evaluation 75 individuals from the original ERJ cohort who had undergone all three assessments (A1, A2 and A3). However, laboratory evaluation was not performed in 19 individuals at A2 and these individuals were excluded from the analysis, yielding a study sample of 56 individuals with serum lipid evaluation at assessments A2 and A3, as well as genetic profile evaluation.

Dyslipidemia was considered present when one or more lipid values were increased (total cholesterol [Col-T], LDL-c and triglycerides [TG]) or decreased (high-density lipoprotein cholesterol [HDL-c]), alone or in combination, using as cutoff values those recommended by the V Brazilian Guideline on Dyslipidemias and Atherosclerosis Prevention20. The tracking effect consists of a repeat behavior of these abnormal variables (increase or decrease) at both assessments conducted during young adulthood (A2 and A3).

Three groups were established based on the occurrence of dyslipidemia tracking:

Group 0: No abnormal lipid variables in A2 and A3; n = 11 individuals (10 women) with a mean age of 30.89 ± 1.64 years;

Group 1: At least one abnormal lipid variable in one of the evaluations (A2 or A3); n = 12 individuals (10 men) with a mean age of 31.47 ± 2.35 years;

Group 2: One or more abnormal lipid variables in two evaluations (A2 and A3); n = 33 individuals (24 men) with a mean age of 31.25 ± 1.99 years.

Clinical, anthropometric, laboratory, and genetic evaluations

Both BP and BMI were evaluated at A1, A2 and A3. The A2 and A3 assessments also included measurements of Col-T, HDL-c and TG after a 12-hour fasting, and calculation of LDL-c. Blood collection for genetic testing and measurement of waist circumference (WC) were performed at A3.

Measurement of BP

Measurement of BP was carried out according to the recommendations of the VI Brazilian Guidelines of Hypertension21. The BP was measured on the right arm, with the individual lying down and then seated, using an aneroid mercury sphygmomanometer (Romed) fixed to the wall, and zeroed to the midaxillary line. We selected cuffs with size and width suitable for the circumference and length of the individuals’ arms. We considered as systolic BP (SBP) the appearance of the first Korotkoff sound (Korotkoff phase I), and for diastolic BP (DBP), the disappearance of the sound (Korotkoff phase V). The BP was measured three times with 5-minute intervals between each measurement, and the last measurement was used for the analysis. We considered the BP to be increased in A1 when SBP and/or DBP was ≥ 95th percentile for gender and age, and in A2 and A3 when SBP was ≥ 140 mmHg and/or DBP ≥ 90 mmHg.

 Anthropometric variables

Weight (W) and height (H) were measured on a platform scale (Filizola, São Paulo, Brazil) with a 150-kilogram (kg) capacity and 100-gram precision. Weight was expressed in kg and determined with the individual barefoot and wearing light clothes. Height was expressed in centimeters (cm) and determined from the distance between the vertex of the head to the soles of the feet with the individual in an upright position and barefoot22.

From the measurements of weight and height, we calculated the BMI using the formula BMI = W/H2 and expressed the results in kg/m2.

The WC was measured parallel to the ground with a flexible and inelastic tape measure with precision of 0.1 cm, with the individual in an upright position and the abdomen relaxed. The measurement was determined horizontally on the shortest distance between the lower border of the last rib and the iliac crest, with the tape held firmly but without pressure against the skin22.

 Laboratory variables

Blood was collected by antecubital venipuncture under standard conditions in the morning (before 8:30 am) after a 12-hour fasting.

All samples were placed in siliconized vacuum tubes and processed in up to 30 minutes. Measurements were performed in the serum obtained after centrifugation at a speed of 3,500 rotations per minute for five minutes.

For measurement of serum cholesterol and HDL-c, we used the enzymatic colorimetric method CHOD/PAP and for measurement of TG, we used the enzymatic method GPD/BAP. To calculate the LDL-c levels, we used the Friedewald formula when TG levels were < 400 mg/dl.

 Genetic analysis>

DNA was extracted by the salting-out method using 2-ml aliquots of whole blood23. The analyses of the allelic variants of the APOE gene (ε2, ε3, ε4) were carried out with the technique of polymerase chain reaction (PCR) with the primers APOE F 5'- TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3' and APOE R 5'- ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3' in 35 PCR cycles (95ºC for 60 sec, 63ºC for 60 sec and 72ºC for 120 sec) to amplify a product of 244 base pairs (bp)24. The products of PCR amplification were digested with the enzyme HhaI (Fermentas) and the fragments were visualized in 12% polyacrylamide gel by silver nitrate staining. The fragments representing each genotype are as follows: ε2ε3 (91, 83 and 48 bp), ε3ε4 (91, 72 and 48 bp), ε2ε4 (91, 83, 72 and 48 bp) and ε3ε3 (91 and 48 bp).

To genotype the A370T polymorphism, a region of 150 bp was amplified by PCR using the primers P1: 5’‑GAG TGT CAG GAT CCC GAC ACC TGC GCC-3’ and P2: 5 '-AAG TCG ACC CAC CCG CCT GCC TCC CGT-3' in 35 cycles (95°C for 60 sec, 68°C for 60 sec and 72° C for 120 sec)25. To determine the polymorphism, PCR products were digested with the enzyme HaeIII (Biotech), and fragments were separated on 3.5% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining. The fragments representing A allele were 77, 47 and 26 bp, and those representing the T allele were 124 and 26 bp.

To demonstrate the random genetic distribution of the ERJ cohort, the genotype and allelic frequencies of the polymorphisms analyzed in the study were compared with those observed in a cohort of 75 non-hospitalized individuals (41 men and 34 women) randomly selected from a DNA database of more than 10,000 individuals who underwent parental testing, provided for this study by the Laboratório de Diagnósticos por DNA (LDD) at UERJ. This sample was identified as LDD. It is worth noting that the populations are not required to be phenotypically homogeneous for comparison of genetic distribution.

The study was approved by the Ethics Committee for Research of HUPE under the number 2130-CEP/HUPE, and all participants signed an Informed Consent Form.

 Statistical Analysis

For statistical treatment of the data, we used the software SPSS for Windows version 12.0 (Chicago, Illinois, USA). Gene and haplotype frequencies were estimated according to Saitou and Nei26, using the program Arlequin, version 3.027. Chi-square test (χ2) and analysis of variance (F) were used to compare the pattern of distribution of the polymorphisms with clinical anthropometric and lipid variables, with p < 0.05 results considered significant. The test of homogeneity of variances was applied to evaluate the normal distribution of the studied variables.

 Results

The sample consisted of 56 individuals, 35 (62.5%) of whom were males and 21 (37.5%) females, aged between 27-35 years (mean 31.23 ± 1.99 years). Table 1 presents the clinical, anthropometric and laboratory variables of the studied population at all three assessments (A1, A2 and A3).

Clinical, anthropometric and laboratory variables of the studied population at three assessments<xref ref-type="table-fn" rid="TFN01">*</xref>
Variables Evaluations
A1 (n = 56) A2 (n = 56) A3 (n = 75)
Age (years) 13.30 ± 1.53 22.09 ± 1.91 31.23 ± 1.99
SBP (mmHg) 115.28 ± 14.83 124.35 ± 13.79 125.43 ± 16.67
DBP (mmHg) 63.81 ± 12.84 79.86 ± 10.79 83.20 ± 13.72
BMI (kg/m2) 20.26 ± 3.05 24.04 ± 3.64 26.79 ± 5.53
WC (cm) - - 92.96 ± 14.66
Col-T (mg/dL) - 175.37 ± 34.34 181.44 ± 31.72
TG (mg/dL) - 88.37 ± 42.34 103.71 ± 56.14
HDL-c (mg/dL) - 45.87 ± 13.16 49.05 ± 15.87
LDL-C (mg/dL) - 111.82 ± 27.58 111.23 ± 27.95

Values are expressed as mean ± standard deviation; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; BMI: body mass index; WC: waist circumference; Col-T: total cholesterol; TG: triglycerides; HDL-c: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-c: low-density lipoprotein cholesterol.

Table 2 shows the results of clinical (SBP and DBP), anthropometric (WC and BMI) and laboratory (Col-T, HDL-c, LDL-c and TG) variables at A3 for all three groups (groups 0, 1 and 2) stratified by dyslipidemia tracking. When compared with groups 0 and 1, group 2 presented higher mean values of SBP, BMI, WC, TG and LDL-c and lower mean values of HDL-c.

Clinical, anthropometric and laboratory variables at A3 in the studied groups according to dyslipidemia tracking<xref ref-type="table-fn" rid="TFN02">*</xref>
Variables Groups of dyslipidemia Test F p
0 (n = 11) 1 (n = 12) 2 (n = 33)
Age (years) 30.89 ± 1.64 31.47 ± 2.35 31.25 ± 1.99 0.239 0.788
SBP (mmHg) 114.36 ± 14.58 120.17 ± 13.05 129.76 ± 15.79 5.01 0.01
DBP (mmHg) 76.36 ± 8.66 78.17 ± 13.89 85.27 ± 13.44 2.69 0.07
BMI (kg/m2) 23.81 ± 3.72 24.34 ± 4.02 28.67 ± 5.81 5.43 0.007
WC (cm) 80.50 ± 6.74 86.91 ± 8.72 98.63 ± 14.26 10.86 < 0.001
Col-T (mg/dL) 164.45 ± 18.35 179.58 ± 29.12 187.78 ± 34.50 2.37 0.10
HDL-c (mg/dL) 62.09 ± 9.63 53.0 ± 11.55 43.51 ± 15.99 7.50 0.001
LDL-C (mg/dL) 89.47 ± 13.59 106.56 ± 28.60 119.90 ± 27.55 6.01 0.004
TG (mg/dL) 64.18 ± 31.44 81.33 ± 41.37 125.03 ± 57.68 7.48 0.001
Gender 10 F / 1 M 2 F/ 10 M 9 F/ 24 M - -

Values expressed as mean ± standard deviation; group 0: no abnormal lipid variable at A2 and A3; group 1: one or more abnormal lipid variables at A2 or A3; group 2: one or more abnormal lipid variables at A2 and A3; SBP: systolic blood pressure; DBP: diastolic blood pressure; BMI: body mass index; WC: waist circumference; Col-T: total cholesterol; HDL-c: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-c: low-density lipoprotein cholesterol; TG: triglycerides; F: female; M: male; F-test: analysis of variance.

The genetic analysis of the 56 individuals identified the following genotypes for APOE: ε3ε3 (62.5%), ε3ε4 (25.0%), ε2ε3 (5.4%), ε2ε4 (5.4%) and ε4ε4 (1.8%) (Table 3).

<italic>APOE</italic> genotypes according to dyslipidemia group<xref ref-type="table-fn" rid="TFN03">*</xref>
APOE genotypes  Dyslipidemia group Total
0 1 2 n = 56 (100.0%)
n = 11 (19.6%) n = 12 (21.4%) n = 33 (59.0%)
ε2ε3 n(%) 3 (27.3%) - - 3 (5.4%)
ε3ε3 n(%) 5 (45.5%) 10 (83.3%) 20 (60.6%) 35 (62.5%)
ε3ε4 n(%) 3 (27.3%) 2 (16.7%) 9 (27.3%) 14 (25%)
ε2ε4 n(%) - - 3 (9.1%) 3 (5.4%)
ε4ε4 n(%) - - 1 (3.0%) 1 (1.8%)

Values are expressed as n (%) χ2 = 16.848; p = 0.032;APOE: apolipoprotein E gene; group 0: no abnormal lipid variable at A2 and A3; group 1: one or more abnormal lipid variables at A2 or A3; group 2: one or more abnormal lipid variables at A2 and A3.

As for the distribution of the APOE genotypes in the groups according to the occurrence of dyslipidemia tracking, we observed that in group 0, genotype ε3ε3 affected 45.5% of the individuals, followed by ε2ε3 and ε3ε4, each affecting 27.3% of the individuals. In group 1, the ε3ε3genotype was present in 83.3% of the individuals and the ε3ε4 genotype in 16.7%. Genotypes ε2ε3, ε2ε4 and ε4ε4 were not observed in group 1. In group 2, which featured the greatest genotype diversity in the sample, the distribution was 60.6% for ε3ε3, 27.3% for ε3ε4, 9.1% for ε2ε4 and 3% for ε4ε4. Genotype ε2ε3 was not observed in this group. This distribution had statistical significance (χ2 = 16.848, p = 0.0032) and showed that 39.4% of the individuals in group 2 had genotypes containing the ε4 allele. It should be noted that all subjects with genotypes ε2ε4 and ε4ε4 maintained at least one abnormal lipid value in A2 and A3 (group 2 – one or more abnormal lipid variables in A2 and A3), whereas none of the subjects with genotype ε2ε3 had abnormal lipids (group 0 – no abnormal lipid values in A2 and A3) (Table 3).

We also analyzed the polymorphisms of the LDLR gene and identified the following genotypes: AA in 85.7%, AT in 12.5% and TT in 1.8% of the individuals (Table 4).

<italic>LDLR</italic> genotypes according to dyslipidemia group<xref ref-type="table-fn" rid="TFN04">*</xref>
LDLR genotypes Dyslipidemia group Total
0 1 2 n = 56 (100.0%)
n = 11 (19.6%) n = 12 (21.4%) n = 33 (59.0%)
AA n (%) 9 (81.8%) 10 (83.3%) 29 (87.9%) 48 (85.7%)
AT n (%) 2 (18.2%) 2 (16.7%) 3 (9.1%) 7 (12.5%)
TT n (%) - - 1 (3.0%) 1 (1.8%)

Values expressed as n (%) χ2 = 1.500; p = 0.827; LDLR: low-density lipoprotein receptor gene; group 0: no abnormal lipid variable at A2 and A3; group 1: one or more abnormal lipid variable at A2 or A3; group 2: one or more abnormal lipid variable at A2 and A3.

The analysis of the distribution of LDLR genotypes according to dyslipidemia tracking showed no statistically significant difference between the groups (Table 4).

For comparison purposes, the genotype and allele frequencies of APOEand LDLR gene polymorphisms of the 56 individuals from the ERJ cohort and 75 individuals from the LDD cohort are shown in Table 5. Fisher's exact test showed no significant differences between the allele distributions of the ERJ and LDD cohorts.

Genotype and allele frequencies of <italic>APOE</italic> and <italic>LDLR</italic> gene polymorphisms in the ERJ and LDD cohorts
APOE LDLR
Genotypes Frequency (%) Genotypes Frequency (%)
  ERJ(n = 56) LDD(n = 75)   ERJ(n = 56) LDD(n = 75)
ε2ε3 5.3 4.2 AA 88.0 86.5
ε3ε3 66.7 75.0 AT 10.6 13.5
ε3ε4 22.7 18.0 TT 1.3 -
ε2ε4 4.0 2.8      
ε4ε4 1.3 -      
Alleles Frequency (%) Alleles Frequency (%)
ε2 6.6 3.5 A 93.5 93.3
ε3 79.4 86.0 T 6.5 6.7
ε4 14.0 10.5      
Ho 34.6 25.0 Ho 10.5 13.5
He 34.8 24.8 He 12.3 12.6
HWE p = 0.5098 p = 0.2128 HWE p = 0.2715 p = 1.000
DP = 0.0005 DP = 0.0004 DP = 0.0004 DP = 0.00
Fisher's exact test p = 0.51528 - Fisher's exact test p = 0.990, SD = 0.003 -
DP = 0.001

ERJ: participants of the Rio de Janeiro Study; LDD: cohort from the Laboratório de Diagnósticos por DNA; APO: apolipoprotein E gene; LDLR: low-density lipoprotein receptor gene; He: expected heterozygosity, Ho: observed heterozygosity; HWE: Hardy-Weinberg equilibrium; SD: standard deviation.

 Discussion

Studies have shown an association between APOE and LDLR genotypes with increased levels of lipid macromolecules such as Col-T, TG and LDL-c, decreased levels of HDL-c, and cardiovascular disease, especially CAD11,28.

In the present study, we investigated the distribution pattern of APOEand LDLR gene polymorphisms in a population of adolescents followed up for 17 years, considering the occurrence of dyslipidemia based on change (increase or decrease) of one or more lipid variables and their repetition (tracking) at two different moments (A2 and A3) during young adulthood.

In the analysis of APOE polymorphisms based on dyslipidemia tracking, our study showed that individuals with genotype ε2ε3 were concentrated in group 0, that is, the group in which lipid variables (Col-T, TG, HDL-c and LDL-c) were normal at two evaluations (A2 and A3). These findings are in agreement with those by Ferreira et al.29 who demonstrated in a study with 216 individuals (109 with dyslipidemia and 107 without dyslipidemia) a similar frequency of allele distribution for APOE polymorphisms in both groups. However, in individuals with normal lipid levels in that study, the presence of the ε2 allele was strongly associated with low serum levels of Col-T and LDL-c, which may suggest a possible protective role associated with this allele29,30.

Similarly, Bazzaz et al.31, in a cohort study with 320 individuals in Iran, investigated the association between APOEgene polymorphisms, lipid profile and BMI. The authors observed that the ε2 allele was more frequent in individuals with Col-T < 200 mg/dl (p = 0.01), and found an even greater association of the individuals with normal serum Col-T levels with genotype ε2ε3 when compared with individuals with abnormal levels of Col-T (p = 0.003)31.

As for the ε4 allele, studies in the general population and hypertensive patients have shown an association of this allele with an increase in levels of Col-T and LDL-c. Due to that, the ε4 allele has been associated with higher risk of CAD even in healthy individuals28,32. Fuzikawa et al.30, in a study with 1,406 adults of both genders, observed a high prevalence of hypertension (61.3%) and higher average values of LDL-c in patients with the ε4 allele (p = 0.036) when compared with patients with the ε2 allele (p < 0.001)30. Similarly, Salazar et al.33 showed an association of the ε4 allele with dyslipidemias in a study that investigated APOE gene polymorphism in 150 women with and without CAD. Compared with the control group in that cohort, women with CAD showed significantly higher levels of Col-T, TG and LDL-c and a higher frequency of the ε4 allele and the ε3ε4 genotype33.

In the present study, 18 individuals (32.1%) were carriers of the ε4 allele in different genotype combinations, 13 (72.2%) of whom were in group 2 which aggregated higher values of SBP, BMI and WC and therefore, worse cardiovascular risk profile. It is worth noting that the only individual in the cohort with genotype ε4ε4 was in group 2.

Thus, the evidence seems to point to a possible damaging role for the ε4 allele and a protective role for the ε2 allele. However, the combination of these alleles in different genotypes can render these roles less clear. In this study for example, all subjects with genotype ε2ε4 were in group 2 which had the worse risk profile and one or more abnormal lipid variables at two evaluations. This result seems to suggest that when the ε4allele is present, the protective role of the ε2 allele is either lost or decreased.

In the present study, we also observed a predominance of males in group 2 (n = 24; 72.72%) (Table 2). This group presented the worst cardiovascular risk profile, which is in line with the premise that the male gender is associated with increased cardiovascular risk21.

We found no association between LDLR gene polymorphisms and dyslipidemia tracking in the young individuals of this cohort. Frikke-Schmidt et al.25 also found no significant association between plasma levels of Col-T, LDL-c and individuals with AA genotype compared with those with a TT genotype. However, these authors reported increased risk (3.6 times) of ischemic stroke in homozygous individuals with a TT genotype compared with those with an AA genotype25.

We found five genotypes for the APOE polymorphism in the ERJ cohort. As for the LDLR polymorphism, all three were found in this cohort. The most frequent APOE genotypes were ε3ε3 and the most frequent LDLR genotype was AA.

It is worth noting that the genotype and allele frequencies found in the ERJ cohort for APOE gene polymorphisms were similar to those found in cohorts from other states in Brazil, such as the cohort from Rio Grande do Sul (Porto Alegre)12 and in other cohorts worldwide34. The genotype and allele frequencies of the ERJ cohort for the LDLR polymorphisms were similar to those found in other populations, such as the one from the study of Frikke-Schmidt et al.25. Similarly, the comparison of the genetic distribution in the ERJ cohort with that from a representative sample group randomly selected from the state of Rio de Janeiro (LDD), and the confirmation of the homogeneity of their distributions, suggests that the ERJ cohort has a random profile, suitable for the development of the proposed study.

Despite the limitations of the study, the association between a specific genetic profile with the presence of dyslipidemia in young individuals over time in a small population brings a novel and relatively unknown perspective to the currently available medical literature. Studies with more than 20 years of follow-up, such as the ERJ, have losses associated with the longitudinal tracking of the participants, but have unequivocally contributed to a better understanding of the behavior of cardiovascular risk factors in the Brazilian population.

 Conclusion

A study of APOE gene polymorphisms in participants of the ERJ showed that the presence of the ε4 allele was more prevalent in group 2, which consisted of young individuals with repeatedly abnormal lipid variables during longitudinal follow-up (tracking effect). This group also showed aggregation of worse anthropometric variables (higher BMI and WC) and increased BP, rendering a worse cardiovascular risk profile to these individuals.

This study was partially funded by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Fundação Carlos Chagas de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

Conception and design of the research:Freitas RGA, Campana EMG, Brandão AA, Brandão AP, Magalhães MEC, Silva DA. Acquisition of data: Freitas RGA, Campana EMG, Brandão AP, Silva DA. Analysis and interpretation of the data: Freitas RGA, Pozzan R. Statistical analysis: Pozzan R. Writing of the manuscript: Brandão AA, Magalhães MEC, Silva DA. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Freitas RGA. Supervision / as the major investigador:Magalhães MEC, Silva DA.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

This article is part of the thesis of master submitted by Rossana Ghessa Andrade de Freitas, from Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

This study was funded by CAPES E FAPERJ.

Sources of Funding

This study was funded by CAPES E FAPERJ.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Rossana Ghessa Andrade de Freitas, from Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

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Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa:Freitas RGA, Campana EMG, Brandão AA, Brandão AP, Magalhães MEC, Silva DA. Obtenção de dados: Freitas RGA, Campana EMG, Brandão AP, Silva DA. Análise e interpretação dos dados: Freitas RGA, Pozzan R. Análise estatística: Pozzan R. Obtenção de financiamento: Brandão AA, Magalhães MEC, Silva DA. Redação do manuscrito: Freitas RGA. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante:Magalhães MEC, Silva DA.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

Estudos demonstram a associação de alterações da apolipoproteína E (APOE) e do receptor da RLDL com a ocorrência de dislipidemia.

 Objetivos:

Investigar a associação entre polimorfismos dos genes da APOE(APOE - ε2, ε3, ε4) e do receptor da LDL (RLDL - A370T) com a persistência de alterações dos níveis lipídicos séricos em jovens acompanhados há 17 anos no Estudo do Rio de Janeiro.

 Métodos:

Foram estudados 56 indivíduos (35 masculinos) em três avaliações realizadas em idades distintas: A1 – média de idade: 13,30 ± 1,53 anos; A2 – média de idade: 22,09±1,91 anos e A3 – média de idade: 31,23±1,99 anos. Nas três avaliações foram determinados a pressão arterial (PA) e o índice de massa corporal (IMC). Em A2 e A3 foram obtidos a circunferência abdominal (CA) e os lípides séricos, e analisados os polimorfismos genéticos por PCR-RFLP. Com base no tracking de dislipidemia, três grupos foram constituídos: 0 (nenhum lípide alterado em A2 e A3), 1 (até um lípide alterado em A2 ou A3) e 2 (um ou mais lípides alterados em A2 e A3).

 Resultados:

Em comparação aos grupos 0 e 1, o grupo 2 apresentou maiores médias de PA, IMC, CA, LDL-c e TG (p < 0,01) e menor média de HDL-c (p = 0,001) que os grupos 0 e 1. Todos os indivíduos com genótipo APOE ε2/ε4 e ε4/ε4 mantiveram durante as avaliações pelo menos um lípide alterado, enquanto que aqueles com genótipo ε2/ε3 não apresentaram alterações (χ2=16,848, p = 0,032). Para os genótipos RLDL não houve diferença significativa entre os grupos.

 Conclusões:

O polimorfismo do gene APOE se associou à presença de dislipidemia em indivíduos jovens em acompanhamento longitudinal desde a infância.

 Polimorfismo Genético Dislipidemias Adlto Jovem Epidemiologia Apolipoproteinas E Introdução

As doenças cardiovasculares (DCVs) são as principais causas de morte de indivíduos adultos em todo o mundo, concorrendo ainda para altas taxas de morbidade e mortalidade precoces1,2. No Brasil, as DCVs concentram anualmente 1/3 do total de mortes3,4.

Dentre os fatores de risco (FR) associados ao desenvolvimento das DCVs destaca-se a dislipidemia5. Dada a sua importância, estudos vêm sendo desenvolvidos visando conhecer as alterações que estão relacionadas com as modificações dos níveis lipídicos plasmáticos e suas implicações na gênese das DCV6,7. No campo da genética, polimorfismos e mutações em vários genes já foram identificados e associados à aterosclerose e à doença arterial coronariana (DAC)8,9. Tal é o caso da apolipoproteína E (APOE), essencial no transporte e metabolismo do colesterol (Col) e na estabilidade estrutural de lipoproteínas10,11, cujo gene apresenta três alelos polimórficos (ε2, ε3 e ε4)12. Em estudos populacionais, os níveis plasmáticos do colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL-c) estiveram mais elevados em indivíduos que possuíam o alelo ε412, e por isso, este alelo tem sido associado à ocorrência da DCV13.

Mutações no gene do receptor da LDL (RLDL) também têm sido implicadas com as dislipidemias, notadamente nas formas primárias homozigóticas ou heterozigóticas de hipercolesterolemia, como a hipercolesterolemia familiar (HF), responsável pela presença precoce de aterosclerose grave e DAC14-16. O gene RLDL produz uma proteína com domínios de ligação para as apolipoproteínas B e E. Dentre os diferentes polimorfismos encontrados no gene RLDL, o A370T tem sido investigado pela sua associação com a elevação de lípides e com o risco cardiovascular17,18.

Ocorre que as dislipidemias podem estar presentes já desde idades precoces e as alterações lipídicas costumam persistir ao longo do tempo (efeito tracking) até a idade adulta. Nesse contexto, a identificação de marcadores genéticos implicados com alterações do metabolismo lipídico pode contribuir para o reconhecimento de padrões de susceptibilidade genética desde idades jovens e guiar intervenções para a correção dessas anormalidades.

Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar o padrão de distribuição dos polimorfismos dos genes APOE e RLDL e suas associações com o fenótipo de dislipidemia, notadamente no seu efeito tracking, em uma população jovem, acompanhada por um período de 17 anos.

 Métodos

A amostra do presente estudo é oriunda do Estudo do Rio de Janeiro(ERJ), estudo longitudinal do tipo coorte que faz parte de uma linha de pesquisa sobre pressão arterial (PA) e outros FR cardiovasculares em jovens, desenvolvida em 1983 no setor de Hipertensão Arterial do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ)19.

No ERJ foram realizadas três diferentes avaliações denominadas A1, A2 e A3. A avaliação A1 foi realizada de 1987 a 1988 em indivíduos entre 10-16 anos de idade (média 13,30 ± 1,53 anos), a A2 de 1996 a 1999 em indivíduos entre 18-26 anos de idade (média 22,09 ± 1,91 anos) e a A3 de 2004 a 2005 em indivíduos entre 27-35 anos de idade (média 31,23 ± 1,99 anos)19.

Da amostra original do ERJ, foram selecionados 75 indivíduos que compareceram nas três avaliações (A1, A2 e A3) para avaliação do perfil genético. Entretanto, 19 indivíduos não realizaram os exames laboratoriais em A2 e foram excluídos da análise atual, resultando na amostra do presente estudo em 56 indivíduos que realizaram a avaliação laboratorial dos lípides séricos nos momentos A2 e A3, bem como estudo do painel genético.

A dislipidemia foi considerada presente quando um ou mais lípides estavam aumentados (colesterol total [Col-T], LDL-c e triglicérides [TG]) ou diminuído (colesterol da lipoproteína de alta densidade [HDL-c]), isolados ou em associação, de acordo com os pontos de corte presentes na V Diretriz Brasileira Sobre Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose20. O efeito tracking consiste no comportamento de repetição dessas variáveis alteradas (aumentadas ou diminuídas) nos dois momentos de avaliação (A2 e A3) na fase adulta jovem.

De acordo com o tracking de dislipidemia, três grupos foram constituídos:

Grupo 0: nenhuma variável lipídica alterada em A2 e A3; n = 11 indivíduos (10 mulheres) com média de idade de 30,89 ± 1,64 anos;

Grupo 1: pelo menos uma variável lipídica alterada em uma das avaliações (A2 ou A3); n=12 indivíduos (10 homens), com média de idade de 31,47±2,35 anos;

Grupo 2: uma ou mais variáveis lipídicas alteradas nas duas avaliações (A2 e A3); n = 33 indivíduos (24 homens), com média de idade de 31,25 ± 1,99 anos.

Avaliação clínica, antropométrica, laboratorial e genética

Tanto a PA quanto o IMC foram avaliados em A1, A2 e A3. Em A2 e A3 foram ainda dosados, após jejum de 12 horas, Col-T, HDL-c e TG, e calculado o LDL-c e em A3 foi realizada coleta do sangue para os testes genéticos e medida da circunferência abdominal (CA).

Medida da PA

A medida da PA foi realizada de acordo com as normas das VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão21. A PA foi mensurada no membro superior direito, com o indivíduo deitado e em seguida sentado, utilizando-se esfigmomanômetro de coluna de mercúrio (Romed) fixado à parede, com o ponto zero localizado ao nível da linha axilar média. Foram selecionados manguitos de tamanho e largura apropriados para a circunferência e comprimento dos braços dos indivíduos. Considerou-se para a PA sistólica (PAS) o aparecimento do primeiro ruído dos sons de Korotkoff (fase I de Korotkoff), e para a PA diastólica (PAD), o desaparecimento dos mesmos (fase V de Korotkoff). Foram realizados três registros da PA com intervalos de 5 minutos entre cada medida, sendo o último deles utilizado para a análise. A PA foi considerada aumentada em A1 quando a PAS e/ou PAD estava ≥ do percentil 95 para sexo e idade, e em A2 e A3 quando a PAS estava ≥ 140mmHg e/ou PAD ≥ 90mmHg.

 Variáveis antropométricas

O peso (P) e a altura (A) foram medidos em balança do tipo plataforma da marca Filizola (São Paulo, Brasil), com capacidade de até 150 quilogramas (kg) e precisão de 100 gramas. Os valores de peso foram determinados com os indivíduos sem calçados e com roupas leves e expressos em kg. Para a altura, os valores foram determinados com os indivíduos eretos e sem calçados considerando a distância do ponto vértex à região plantar, e os resultados foram representados em centímetros (cm)22.

O IMC foi calculado a partir das medidas de peso e altura por meio do quociente IMC=P/A2, e os resultados foram representados em kg/m2.

A CA foi medida paralelamente ao solo por meio de fita métrica flexível e inelástica com precisão de 0,1 cm com o avaliado na posição ortostática e com o abdome relaxado. A medida foi realizada horizontalmente na região de menor curvatura localizada entre a borda inferior da última costela e a crista ilíaca, com a fita firme sobre a pele e sem compressão dos tecidos22.

 Variáveis laboratoriais

As amostras de sangue venoso foram coletadas através de punção de veia periférica do braço (cubital) pela manhã antes dsa 8h30min, sob condições-padrão e após um período de jejum de 12 horas.

Todas as amostras foram acondicionadas em tubos a vácuo, siliconizados e processadas em um período máximo de 30 minutos. As dosagens foram realizadas em soro obtido após centrifugação a uma velocidade de 3.500 rotações por minuto por cinco minutos.

Para a dosagem do colesterol sérico e da fração HDL-c foi utilizado o método colorimétrico enzimático CHOD/PAP, enquanto os TG foram dosados por meio do método enzimático GPD/BAP, e o LDL-c calculado pela fórmula de Friedewald quando o valor de TG estava < 400 mg/dl.

 Análise genética

A extração do DNA foi realizada pelo método de salting-oututilizando alíquotas de sangue total (2 ml)23. As análises das variantes alélicas do gene APOE(ε2, ε3, ε4) foram realizadas com a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os iniciadores APOE F 5'- TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3' e APOE R 5'- ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3' em 35 ciclos de PCR (95ºC por 60 seg, 63ºC por 60 seg e 72ºC por 120 seg) para amplificar um produto de 244 pares de base (pb)24. Os produtos da amplificação por PCR foram digeridos com a enzima HhaI (Fermentas) e os fragmentos visualizados em gel de poliacrilamida (12 %), após coloração por nitrato de prata. Os perfis 91, 83 e 48 pb; 91, 72 e 48 pb; 91, 83, 72 e 48 pb; e 91 e 48 pb representaram os genótipos ε2ε3, ε3ε4, ε2ε4 e ε3ε3, respectivamente.

Para a genotipagem do polimorfismo A370T, uma região de 150 pb foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores P1: 5’-GAG TGT CAG GAT CCC GAC ACC TGC GCC-3’ e P2: 5’-AAG TCG ACC CAC CCG CCG CCT TCC CGT-3' em 35 ciclos (95°C por 60 seg, 68°C por 60 seg e 72°C por 120 seg)25. Para a determinação do polimorfismo, os produtos da PCR foram digeridos com a enzima HaeIII (Biotech) e os fragmentos visualizados em gel de agarose (3,5 %) após coloração com brometo de etídeo. O alelo A gerou fragmentos com 77, 47 e 26 pb, enquanto que o alelo T gerou fragmentos com 124 e 26 pb.

Com a finalidade de comprovar a aleatoriedade no padrão de distribuição genética da amostra do ERJ, as frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos estudados foram comparadas com as observadas em uma amostra não hospitalar composta por 75 indivíduos (41 homens e 34 mulheres) selecionados ao acaso de um banco de dados de DNA contendo mais de 10.000 amostras de indivíduos que realizaram exames para fins de determinação de parentesco, cedidas para esse estudo pelo Laboratório de Diagnósticos por DNA (LDD) da UERJ. Tal amostra foi identificada como LDD. Vale destacar que para fins de comparação da análise de distribuição genética as populações não necessitam ser homogêneas quanto às características fenotípicas.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HUPE sob o nº 2130-CEP/HUPE e todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

 Análise Estatística

Para o tratamento estatístico dos dados, utilizou-se o programa SPSS for Windows, versão 12.0 (Chicago, Illinois, USA). As frequências gênicas e haplotípicas foram estimadas de acordo com Saitou e Nei 26, utilizando o programa Arlequin, versão 3.027. O teste do qui-quadrado (χ2) e a análise de variância (F) foram utilizados para a comparação do padrão de distribuição dos polimorfismos com as variáveis clínicas, antropométricas e lipídicas, considerando-se significante quando p<0,05. O teste de homogeneidade das variâncias foi utilizado para caracterizar a distribuição normal das variáveis estudadas.

 Resultados

A amostra foi constituída por 56 indivíduos sendo 35 (62,5%) do sexo masculino e 21 (37,5 %) do feminino, com idades entre 27-35 anos e média de 31,23 ± 1,99 anos. Na Tabela 1 Dados clínicos, antropométricos e laboratoriais da população estudada nos três momentos de avaliação<xref ref-type="table-fn" rid="TFN05">*</xref>
VariáveisAvaliações
A1(n = 56)A2(n = 56)A3(n = 75)
Idade(anos)13,30 ± 1,5322,09 ± 1,9131,23 ± 1,99
PAS (mmHg)115,28 ± 14,83124,35 ± 13,79125,43 ± 16,67
PAD (mmHg)63,81 ± 12,8479,86 ± 10,7983,20 ± 13,72
IMC (kg/m2)20,26 ± 3,0524,04 ± 3,6426,79 ± 5,53
CA (cm)--92,96 ± 14,66
Col-T (mg/dL)-175,37 ± 34,34181,44 ± 31,72
TG (mg/dL)-88,37 ± 42,34103,71 ± 56,14
HDL-c (mg/dL)-45,87 ± 13,1649,05 ± 15,87
LDL-c (mg/dL)-111,82 ± 27,58111,23 ± 27,95

Valores expressos em média±desvio-padrão; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; IMC: índice de massa corporal; CA: circunferência abdominal; Col-T: colesterol total; TG: triglicérides; HDL-c: colesterol da lipoproteína de alta densidade; LDL-c: colesterol da lipoproteína de baixa densidade.

estão apresentadas as variáveis clínicas, antropométricas e laboratoriais da população estudada nos três momentos de avaliação (A1, A2 e A3).

Os dados das variáveis clínicas (pressão arterial sistólica - PAS e pressão arterial diastólica - PAD), antropométricas (CA e IMC) e laboratoriais (Col-T, HDL-c, LDL-c e TG) de A3 para os três grupos (grupos 0, 1 e 2) estratificados pelo tracking de dislipidemia estão apresentados na Tabela 2. Foram observadas maiores médias de PAS, IMC, CA, TG e LDL-c e menor média de HDL-c no grupo 2, quando comparado aos grupos 0 e 1.

Variáveis clínicas, antropométricas e laboratoriais em A3 nos grupos estudados segundo o tracking de dislipidemia<xref ref-type="table-fn" rid="TFN06">*</xref>
Variáveis Grupos de dislipidemia Teste F p
0 (n = 11) 1 (n = 12) 2 (n = 33)
Idade (anos) 30,89 ± 1,64 31,47 ± 2,35 31,25 ± 1,99 0,239 0,788
PAS (mmHg) 114,36 ± 14,58 120,17 ± 13,05 129,76 ± 15,79 5,01 0,01
PAD (mmHg) 76,36 ± 8,66 78,17 ± 13,89 85,27 ± 13,44 2,69 0,07
IMC (kg/m2) 23,81 ± 3,72 24,34 ± 4,02 28,67 ± 5,81 5,43 0,007
CA (cm) 80,50 ± 6,74 86,91 ± 8,72 98,63 ± 14,26 10,86 < 0,001
Col-T (mg/dL) 164,45 ± 18,35 179,58 ± 29,12 187,78 ± 34,50 2,37 0,10
HDL-c (mg/dL) 62,09 ± 9,63 53,0 ± 11,55 43,51 ± 15,99 7,50 0,001
LDL-C (mg/dL) 89,47 ± 13,59 106,56 ± 28,60 119,90 ± 27,55 6,01 0,004
TG (mg/dL) 64,18 ± 31,44 81,33 ± 41,37 125,03 ± 57,68 7,48 0,001
Sexo 10 F / 1 M 2 F/ 10 M 9 F/ 24 M - -

Valores expressos em média ± desvio-padrão; grupo 0: nenhuma variável lipídica alterada em A2 e A3; grupo 1: uma ou mais variáveis lipídicas alteradas em A2 ou em A3; grupo 2: uma ou mais variáveis lipídicas alteradas em A2 e A3; PAS : pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; IMC: índice de massa corporal; CA: circunferência abdominal; Col-T: colesterol total; HDL-c: colesterol da lipoproteína de alta densidade; LDL-c: colesterol da lipoproteína de baixa densidade; TG: triglicérides; F: feminino; M: masculino; Teste F: análise de variância.

A análise genética dos 56 indivíduos identificou os seguintes genótipos APOE: ε3ε3 (62,5 %), ε3ε4 (25,0 %), ε2ε3 (5,4 %), ε2ε4 (5,4 %) e ε4ε4 (1,8 %) (Tabela 3).

Genótipos do gene <italic>APOE</italic> de acordo com os grupos de dislipidemia<xref ref-type="table-fn" rid="TFN07">*</xref>
Genótipos APOE   Grupos de dislipidemia Total
0 1 2 n = 56 (100,0%)
n = 11 (19,6%) n = 12 (21,4%) n = 33 (59,0%)
ε2ε3 n(%) 3 (27,3%) - - 3 (5,4%)
ε3ε3 n(%) 5 (45,5%) 10 (83,3%) 20 (60,6%) 35 (62,5%)
ε3ε4 n(%) 3 (27,3%) 2 (16,7%) 9 (27,3%) 14 (25%)
ε2ε4 n(%) - - 3 (9,1%) 3 (5,4%)
ε4ε4 n(%) - - 1 (3,0%) 1 (1,8%)

Valores expressos em n (%) χ2 = 16,848; p = 0,032; APOE: gene da apolipoproteína E; grupo 0: nenhuma variável lipídica alterada em A2 e A3; grupo 1: uma ou mais variáveis lipídicas alteradas em A2 ou em A3; grupo 2: uma ou mais variáveis lipídicas alteradas em A2 e A3.

Quanto à distribuição dos genótipos APOE nos grupos pelo tracking de dislipidemia, observou-se que no grupo 0, 45,5% dos indivíduos apresentavam o genótipo ε3ε3, seguido do ε2ε3 e ε3ε4, ambos em 27,3% dos indivíduos. No grupo 1, o genótipo ε3ε3 esteve presente em 83,3% dos indivíduos e o genótipo ε3ε4 em 16,7%. Não foram observados os genótipos ε2ε3, ε2ε4 e ε4ε4 no grupo 1. No grupo 2, que apresentou a maior diversidade de genótipos da amostra, 60,6% apresentavam genótipo ε3ε3, 27,3% o genótipo ε3ε4, 9,1% o genótipo ε2ε4 e 3%o genótipo ε4ε4. Não foi observado o genótipo ε2ε3 neste grupo. Essa distribuição apresentou significado estatístico (χ2= 16,848, p = 0,0032) e mostrou que 39,4% dos indivíduos do grupo 2 apresentavam genótipos que continham o alelo ε4. Convém destacar que todos os indivíduos com genótipo ε2ε4 e ε4ε4 mantiveram pelo menos um lípide alterado em A2 e A3 (grupo 2 – uma ou mais variáveis lipídicas alteradas em A2 e A3), enquanto que nenhum indivíduo com genótipo ε2ε3 apresentou lípides alterados nas avaliações (grupo 0 – nenhuma variável lipídica alterada em A2 e A3) (Tabela 3).

A amostra foi também analisada quanto ao polimorfismo do gene RLDL, tendo sido identificados os seguintes genótipos: AA em 85,7%, AT em 12,5% e TT em 1,8% dos indivíduos (Tabela 4).

Genótipos do gene <italic>RLDL</italic> de acordo com os grupos de dislipidemia<xref ref-type="table-fn" rid="TFN08">*</xref>
Genótipos RLDL Grupos de dislipidemia Total
0 1 2 n = 56 (100,0%)
n = 11 (19,6%) n = 12 (21,4%) n = 33 (59,0%)
AA n (%) 9 (81,8%) 10 (83,3%) 29 (87,9%) 48 (85,7%)
AT n (%) 2 (18,2%) 2 (16,7%) 3 (9,1%) 7 (12,5%)
TT n (%) - - 1 (3,0%) 1 (1,8%)

Valores expressos em n (%); χ2 = 1,500; p = 0,827; RLDL: gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade; grupo 0: nenhuma variável lipídica alterada em A2 e A3; grupo 1: uma ou mais variáveis lipídicas alteradas em A2 ou em A3; grupo 2: uma ou mais variáveis lipídicas alteradas em A2 e A3.

A análise da distribuição dos genótipos RLDL de acordo com o tracking de dislipidemia não mostrou diferença estatisticamente significativa entre os grupos (Tabela 4).

Para efeito de comparação, as frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos dos genes APOE e RLDL dos 56 indivíduos do ERJ e dos 75 indivíduos LDD são mostradas na Tabela 5. O teste exato de Fisher indicou não haver diferenças significativas entre as distribuições alélicas das populações do ERJ e LDD.

Frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos dos genes <italic>APOE</italic> e <italic>RLDL</italic> nas amostras do ERJ e do LDD
APOE RLDL
Genótipos Frequência (%) Genótipos Frequência (%)
  ERJ(n = 56) LDD(n = 75)   ERJ(n = 56) LDD(n = 75)
ε2ε3 5,3 4,2 AA 88,0 86,5
ε3ε3 66,7 75,0 AT 10,6 13,5
ε3ε4 22,7 18,0 TT 1,3 -
ε2ε4 4,0 2,8      
ε4ε4 1,3 -      
Alelos Frequência (%) Alelos Frequência (%)
ε2 6,6 3,5 A 93,5 93,3
ε3 79,4 86,0 T 6,5 6,7
ε4 14,0 10,5      
Ho 34,6 25,0 Ho 10,5 13,5
He 34,8 24,8 He 12,3 12,6
HWE p = 0,5098 p = 0,2128 HWE p = 0,2715 p = 1,000
DP = 0,0005 DP = 0,0004 DP = 0,0004 DP = 0,00
Teste Exato de Fisher p = 0,51528 - Teste Exato de Fisher p = 0,990 -
DP = 0,001 DP = 0,003

ERJ: indivíduos oriundos do Estudo do Rio de Janeiro; LDD: indivíduos pertencentes ao banco de dados do Laboratório de Diagnósticos por DNA; APOE: gene da apolipoproteína E; RLDL: gene do receptor da lipoproteína de baixa densidade; He: heterozigosidade esperada, Ho: heterozigosidade observada; HWE: equilíbrio de Hardy-Weinberg; DP: desvio-padrão.

 Discussão

Estudos têm mostrado associação entre os genótipos APOE e RLDL com níveis elevados de macromoléculas lipídicas como o Col-T, TG e LDL-c e diminuídos de HDL-c, bem como com as DCV, especialmente a DAC11,28.

No presente estudo, foi investigado o padrão de distribuição dos polimorfismos dos genes APOE e RLDL em uma população de adolescentes acompanhada ao longo de 17 anos, considerando a ocorrência de dislipidemia com base na alteração (aumento ou diminuição) de uma ou mais variáveis lipídicas e na sua repetição (tracking) em dois momentos distintos (A2 e A3) na fase adulta jovem.

Nesta análise de polimorfismos APOE baseado no tracking de dislipidemia, nosso estudo mostrou que os indivíduos que possuíam o genótipo ε2ε3 estavam concentrados no grupo 0, isto é, o grupo no qual as variáveis lipídicas analisadas (Col-T, TG, HDL-c e LDL-c) se apresentaram normais nas duas avaliações realizadas (A2 e A3). Esses achados estão em concordância com os dados de Ferreira e cols.29 que demonstraram em um estudo envolvendo 216 indivíduos (109 dislipidêmicos e 107 normolipidêmicos), semelhança na distribuição das frequências alélicas dos polimorfismos APOE nos dois grupos. Entretanto, nos normolipidêmicos nesse estudo, a presença do alelo ε2 esteve fortemente associada a baixos níveis séricos de Col-T e LDL-c, o que pode sugerir um possível papel protetor associado a esse alelo29,30.

De forma semelhante, Bazzaz e cols.31, em estudo do tipo coorte realizado com 320 indivíduos da população iraniana, investigaram a associação entre os polimorfismos do gene APOE, o perfil lipídico e o IMC. Os autores observaram que o alelo ε2era mais frequente nos indivíduos que apresentaram Col-T < 200 mg/dL (p = 0,01), e mostraram ainda uma maior associação dos indivíduos com níveis séricos de Col-T normais com o genótipo ε2ε3 quando comparados aos indivíduos com níveis anormais de Col-T (p = 0,003)31.

Já em relação ao alelo ε4, estudos na população geral e em pacientes hipertensos têm demonstrado associação deste alelo com elevação das taxas de Col-T e de LDL-c, sendo por esta razão, associado com maior risco de DAC, mesmo em indivíduos saudáveis28,32. Fuzikawa e cols.30, em estudo envolvendo 1,406 adultos de ambos os sexos, observaram uma alta prevalência de hipertensão (61,3%) e uma maior média de níveis de LDL-c nos portadores do alelo ε4 (p = 0,036) quando comparados aos portadores do alelo ε2 (p < 0,001)30. De forma semelhante, Salazar e cols.33 mostraram associação do alelo ε4 com dislipidemias em um estudo que investigou o polimorfismo do gene APOE em 150 mulheres com e sem DAC. Nessa amostra foi observado que as mulheres com DAC apresentaram taxas significativamente mais elevadas de Col-T, TG e LDL-c e uma frequência maior do alelo ε4 e do genótipo ε3ε4 em relação às do grupo-controle33.

No presente estudo, 18 indivíduos (32,1%) apresentavam o alelo ε4 em diferentes combinações de genótipos e destes, 13 (72,2%) estavam concentrados no grupo 2 onde se observou agregação de maiores valores de PAS, IMC e CA e, como consequência, um pior perfil de risco cardiovascular. Vale destacar ainda que no grupo 2 se encontrava o único indivíduo da amostra com o genótipo ε4ε4.

Assim, as evidências parecem apontar para um possível papel danoso relacionado ao alelo ε4 e protetor do alelo ε2. Entretanto, a combinação desses alelos em diferentes genótipos pode tornar esses papéis menos claros. Como exemplo no presente estudo, todos os indivíduos que possuíam o genótipo ε2ε4 estavam no grupo 2, grupo que apresentou pior perfil de risco e no qual uma ou mais variáveis lipídicas se apresentaram alteradas nas duas avaliações. Este resultado parece sugerir que quando o alelo ε4 está presente, a condição protetora do alelo ε2 diminui ou é perdida.

No presente estudo, foi ainda observado predomínio do sexo masculino no grupo 2 (n = 24; 72,72%) (Tabela 2). Este grupo apresentou o pior perfil de risco cardiovascular, em concordância com a premissa de que o sexo masculino está associado a maior risco cardiovascular21.

Não foram encontradas associações entre os polimorfismos do gene RLDL e o tracking de dislipidemia nos indivíduos jovens da presente amostra. Frikke-Schmidt e cols.25 também não encontraram associação significativa entre os níveis plasmáticos de Col-T, LDL-c e os indivíduos com genótipo AA em relação ao TT, entretanto, relataram aumento do risco para desenvolvimento de isquemia vascular cerebral (3,6 vezes maior) em indivíduos homozigóticos TT em relação aos AA25.

Na população do ERJ foram encontrados cinco genótipos para o polimorfismo APOE. Em relação aos polimorfismos RLDL, os três polimorfismos foram encontrados na população do ERJ. O genótipo APOEmais observado foi o ε3ε3, enquanto que para o genótipo RLDL foi o AA.

Vale destacar ainda que as frequências alélicas e genotípicas encontradas na amostra ERJ para os polimorfismos do gene APOE foram semelhantes às encontradas em amostras de outros estados brasileiros, como à do Rio Grande do Sul (Porto Alegre)12 e outras amostras mundiais 34. As frequências alélicas e genotípicas da amostra do ERJ para os polimorfismos do gene RLDL foram semelhantes às encontradas em outras populações, como as do estudo de Frikke-Schmidt e cols.25. Nessa mesma direção, a comparação dos achados de distribuição genética na amostra do ERJ com um grupo amostral representativo e tomado ao acaso da população do estado do Rio de Janeiro (LDD) e, a constatação de homogeneidade entre suas distribuições, sugere que a amostra do ERJ apresenta perfil de aleatoriedade adequado para o desenvolvimento do estudo proposto.

A despeito das limitações do estudo, a associação de um perfil genético específico com a presença de dislipidemia em jovens ao longo do tempo em uma população de tamanho reduzido traz uma perspectiva nova e pouco conhecida na literatura médica hoje disponível. Estudos com mais de 20 anos de acompanhamento como é o Estudo do Rio de Janeiro apresentam perdas relacionadas ao seguimento longitudinal dos indivíduos estudados, mas têm contribuído de forma inequívoca para o melhor conhecimento do comportamento dos fatores de risco cardiovascular na população brasileira.

 Conclusão

O estudo dos polimorfismos do gene APOE na amostra do ERJ mostrou que a presença do alelo ε4 foi mais prevalente no grupo 2, composto por indivíduos jovens que apresentaram repetição de variáveis lipídicas alteradas em acompanhamento longitudinal (efeito tracking). Nesse grupo foi ainda observada agregação de piores variáveis antropométricas (maiores IMC e CA) e de maior PA, conferindo a esses indivíduos pior perfil de risco cardiovascular.

Este estudo foi parcialmente financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação Carlos Chagas de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Rossana Ghessa Andrade de Freitas pela Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi parcialmente financiado por CAPES E FAPERJ.