Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia StZzcKN5FpCZk8CTcXYh9Rr S0066-782X2015000300010 00010 10.5935/abc.20150010 Brief Communication Electrical Properties of Isolated Cardiomyocytes in a Rat Model of Thiamine Deficiency Santos-Miranda Artur 2 Cruz Jader Santos 2 Roman-Campos Danilo 1 Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brazil Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Universidade Federal de São Paulo Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais MG Brazil Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, MG - Brazil Universidade Federal de Minas Gerais Mailing Address: Danilo Roman Campos, Rua Botucatu 862, Edifício de Ciências Biomédicas. Vila Clementino, Postal Code 04023-062. São Paulo, SP – Brazil Email: drcampos@unifesp.br; drcbio@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Santos-Miranda A, Cruz JS, Roman-Campos D. Acquisition of data: Santos- Miranda A. Analysis and interpretation of the data: Santos- Miranda A, Roman-Campos D. Statistical analysis: Santos- Miranda A. Obtaining financing:Cruz JS, Roman-Campos D. Writing of the manuscript: Santos-Miranda A, Cruz JS, Roman-Campos D. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Santos-Miranda A, Roman-Campos D.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 03 2015 104 3 242 245 10 10 2014 24 12 2014 24 12 2014 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution NonCommercial License which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium provided the original work is properly cited.

In modern society, thiamine deficiency (TD) remains an important medical condition linked to altered cardiac function. There have been contradictory reports about the impact of TD on heart physiology, especially in the context of cardiac excitability. In order to address this particular question, we used a TD rat model and patch-clamp technique to investigate the electrical properties of isolated cardiomyocytes from epicardium and endocardium. Neither cell type showed substantial differences on the action potential waveform and transient outward potassium current. Based on our results we can conclude that TD does not induce major electrical remodeling in isolated cardiac myocytes in either endocardium or epicardium cells.

 Myocytes, Cardiac Electric Stimulation Thiamine Deficiency/ physiopathology Action Potentials Rats, Heart Failure 03 2015 Introduction

Thiamine is a pivotal cofactor involved in distinct biochemical reactions. Its deprivation causes significant changes in physiology, especially in neurons and cardiac tissue1. In the industrialized world, thiamine deficiency (TD) is particularly related to chronic alcohol consumption and administration of loop diuretics, such as furosemide1. In both cases, some degree of heart remodeling is reported, such as high-output heart failure, the most common clinical manifestation of TD2. In some cases, patients with TD may develop heart failure in association with cardiac electrical remodeling2,3. Based on previous data from the literature and using animal models, our group and others have determined electrical remodeling of cardiomyocytes. However, there are conflicting results in the literature1. In the present study, we determined whether TD leads to electrical remodeling of isolated myocytes from the endocardium (ENDO) and epicardium (EPI) of rats.

Methods Experimental group

Male Wistar rats (250 g) were fed a control (containing thiamine) or a thiamine-free diet for 35 days as previously described by our group4-6.

Cell isolation

ENDO and EPI cells of the left ventricle from age-matched control and TD rats were enzymatically dissociated as previously reported4.

 Electrophysiological recordings

All records were obtained using methods and solutions as previously described5. Cells were maintained at a holding potential of -80mV. Action potentials (APs) were elicited by short pulses (3-5 ms) of 1nA current at 1 Hz frequency for 3 minutes. During K current records, cells were perfused with a modified Tyrode’s solution, replacing NaCl by N-metyl-D-glucamine (NMDG) (to abolish sodium current), and 100µM CdCl2 (to block L-type calcium current). A junction potential of -20mV was measured and should be applied to every tested potential.

 Statistical analysis

All results are expressed as mean ± standard error of the mean. For statistical analysis, we used One-way anova followed by Tukey’s post-hoc test. P < 0.05 was set as significant level.

 Results

In the present study we evaluated the electrical properties of isolated myocytes from ENDO and EPI cells. Our results showed that control myocyte have longer action potential duration (APD) in ENDO cells when compared to EPI cells (Figure 1). This phenomenon is connected to larger outward potassium current in EPI when compared to ENDO cells (Figure 2), corroborating previous data from the literature. To our surprise, TD had minor impact on electrical properties of isolated cardiomyocytes. When compared the repolarization time (RT) at 90% of EPI CTR to EPI TD, it was 26.33 ± 1.56 ms, n = 26 vs. 30.35 ± 2.49 ms, n = 22, respectively. ENDO cells showed similar results. For instance, RT at 90% was 38.93 ± 2.96ms, n = 18 vs. 46.40 ± 6.11 ms, n = 20 for CTR vs. TD cells (Figure 1). In line with these results, peak outward and inward potassium current was similar, when comparing EPI CT to EPI TD. For example at +80 mV it was (A/F) 23.01 ± 1.77, n = 18 and 20.62 ± 1.50, n = 15, respectively. Similar profile was observed for ENDO cells (Figure 2). Finally, in line with previous results, TD myocytes showed smaller capacitance when compared to CTR cells (data not shown).

Action potentials in isolated cardiac myocytes. Top panels show representative recordings for (A) epicardium (EPI) cells (left) and (B) Endocardium (ENDO) cells (right), considering control (CT) (green line) and thiamine-deficient (TD) (blue line) groups. Bottom panels show average time required for the action potential repolarization to occur at 10%, 50% and 90% of the repolarization in control (green bars) and TD (blue bars) groups for EPI- CT (n = 26), EPI-DT (n = 22) (left) and ENDO-CT (n = 18), ENDO-TD (n = 20) (right). Whole-cell potassium current. Currents were elicited upon stimulation steps ranging from -140 to +80mV (for 4s) from a holding potential of -70 mV in steps of 20 mV, every 15s. Top (CTR) and middle (TD) panels show representative recordings for (A) epicardium (EPI) and (B) endocardium (ENDO) cells. Insets represent the initial 500 ms of recordings. Bottom panels represent the current x voltage for maximum potassium current. Green and blue squares represent CTR and TD groups, for EPI (A) and ENDO (B) cells. Discussion

In previous studies, using a rat model, our group showed that TD is able to induce cardiomyocyte contractility dysfunction7. Such changes were attributed to altered calcium handling, with reduced sarcoplasmatic reticulum calcium content8. Additionally, an increased production of reactive oxygen species (ROS) was observed, which may have contributed to the reduced heart mass observed in this model4. Together, these results are able to explain the reduced heart and myocyte function during TD.

In the context of electrical alteration, it is more difficult to draw a more conclusive idea. There have been many reports in the literature showing distinct alterations in the electrocardiogram of humans and animals during TD, including tachycardia, ST elevation and depression, altered T wave morphology with prolonged QT interval, accompanied by A-V block and QRS prolongation2,9. In the context of animal models, it seems that cardiomyocytes from young rats are more prone to develop electrical disturbances than adult rats (the latter were used in the present study)1.

However, it is intriguing that TD is not able to induce robust electrical remodeling in cardiomyocytes, especially in the context of increased ROS production4. It is well know that ROS is able reduce outward potassium current in myocytes, due to reduced expression of Kv4.3, which is responsible for the transient outward potassium current10. Thus, it is possible to speculate that there are endogenous systems and/or aging factors that modulate the electrical remodeling of myocytes in the setting of TD.

 Conclusion

Thiamine deficiency leads to minor changes in the electrical properties of isolated cardiac myocytes in both endocardium and epicardium cells. This study was supported by FAPEMIG, CNPq and CAPES.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq, Capes e FAPEMIG.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 References Roman-Campos D, Cruz JS. Current aspects of thiamine deficiency on heart function. Life Sci.2014;98(1):1-5. Roman-Campos D Cruz JS Current aspects of thiamine deficiency on heart function Life Sci 2014 98 1 1 5 Kawano H, Koide Y, Toda G, Yano K. ST-segment elevation of electrocardiogram in a patient with Shoshin beriberi. Intern Med.2005;44(6):578-85. Kawano H Koide Y Toda G Yano K ST-segment elevation of electrocardiogram in a patient with Shoshin beriberi Intern Med 2005 44 6 578 585 Loma-Osorio P, Penafiel P, Doltra A, Sionis A, Bosch X. Shoshin beriberi mimicking a high-risk non-ST-segment elevation acute coronary syndrome with cardiogenic shock: when the arteries are not guilty. J Emerg Med.2011;41(4):e73-7. Loma-Osorio P Penafiel P Doltra A Sionis A Bosch X Shoshin beriberi mimicking a high-risk non-ST-segment elevation acute coronary syndrome with cardiogenic shock: when the arteries are not guilty J Emerg Med 2011 41 4 e73 e77 Gioda CR, de Oliveira Barreto T, Primola-Gomes TN, de Lima DC, Campos PP, Capettini L dos S, et al. Cardiac oxidative stress is involved in heart failure induced by thiamine deprivation in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol.2010;298(6):H2039-45. Gioda CR de Oliveira Barreto T Primola-Gomes TN de Lima DC Campos PP Capettini L dos S Cardiac oxidative stress is involved in heart failure induced by thiamine deprivation in rats Am J Physiol Heart Circ Physiol 2010 298 6 H2039 H2045 Roman-Campos D, Campos AC, Gioda CR, Campos PP, Medeiros MA, Cruz JS. Cardiac structural changes and electrical remodeling in a thiamine-deficiency model in rats. Life Sci.2009;84(23-24):817-24. Roman-Campos D Campos AC Gioda CR Campos PP Medeiros MA Cruz JS Cardiac structural changes and electrical remodeling in a thiamine-deficiency model in rats Life Sci 2009 84 23-24 817 824 Oliveira FA, Galan DT, Ribeiro AM, Santos Cruz J. Thiamine deficiency during pregnancy leads to cerebellar neuronal death in rat offspring: role of voltage-dependent K+ channels. Brain Res.2007;1134(1):79-86. Oliveira FA Galan DT Ribeiro AM Santos Cruz J Thiamine deficiency during pregnancy leads to cerebellar neuronal death in rat offspring: role of voltage-dependent K+ channels Brain Res 2007 1134 1 79 86 Gioda CR, Roman-Campos D, Carneiro-Junior MA, da Silva KA, de Souza MO, Mendes LJ, et al. Impaired cellular contractile function in thiamine-deficient rat cardiomyocytes. Eur J Heart Fail. 2009;11(12):1126-8. Gioda CR Roman-Campos D Carneiro-Junior MA da Silva KA de Souza MO Mendes LJ Impaired cellular contractile function in thiamine-deficient rat cardiomyocytes Eur J Heart Fail 2009 11 12 1126 1128 Oliveira FA, Guatimosim S, Castro CH, Galan DT, Lauton-Santos S, Ribeiro AM, et al. Abolition of reperfusion-induced arrhythmias in hearts from thiamine-deficient rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol.2007;293(1):H394-401. Oliveira FA Guatimosim S Castro CH Galan DT Lauton-Santos S Ribeiro AM Abolition of reperfusion-induced arrhythmias in hearts from thiamine-deficient rats Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007 293 1 H394 H401 Rapuzzi G, Rindi G. Inluence of increasing heart rate on the alterations of the cardiac ventricular fibre-cells action potentials induced by thiamine deficiency. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci.1967;52(3):277-84. Rapuzzi G Rindi G Inluence of increasing heart rate on the alterations of the cardiac ventricular fibre-cells action potentials induced by thiamine deficiency Q J Exp Physiol Cogn Med Sci 1967 52 3 277 284 Zhou C, Ziegler C, Birder LA, Stewart AF, Levitan ES. Angiotensin II and stretch activate NADPH oxidase to destabilize cardiac Kv4.3 channel mRNA. Circ Res.2006;98(8):1040-7. Zhou C Ziegler C Birder LA Stewart AF Levitan ES Angiotensin II and stretch activate NADPH oxidase to destabilize cardiac Kv4.3 channel mRNA Circ Res 2006 98 8 1040 1047 Comunicação Breve Propriedades Elétricas de Cardiomiócitos Isolados em um Modelo Animal em Ratos com Deficiência de Tiamina Santos-Miranda Artur 2 Cruz Jader Santos 2 Roman-Campos Danilo 1 Universidade Federal de São Paulo São Paulo SP Brasil Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil Universidade Federal de São Paulo Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais MG Brasil Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, MG - Brasil Universidade Federal de Minas Gerais Correspondência: Danilo Roman Campos, Rua Botucatu 862, Edifício de Ciências Biomédicas. Vila Clementino. CEP 04023-062, São Paulo, SP – Brasil Email: drcampos@unifesp.br; drcbio@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Santos-Miranda A, Cruz JS, Roman-Campos D. Obtenção de dados: Santos‑Miranda A. Análise e interpretação dos dados: Santos‑Miranda A, Roman‑Campos D. Análise estatística: Santos-Miranda A. Obtenção de financiamento: Cruz JS, Roman-Campos D. Redação do manuscrito: Santos-Miranda A, Cruz JS, Roman‑Campos D. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Santos-Miranda A, Roman-Campos D.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Na sociedade moderna, a deficiência de tiamina (DT) ainda é uma condição médica importante ligada à função cardíaca alterada. Há relatos contraditórios sobre o impacto da DT sobre a fisiologia do coração, especialmente no contexto da excitabilidade cardíaca. A fim de resolver essa questão em particular, nós utilizamos de um modelo de DT para investigar as propriedades elétricas de cardiomiócitos isolados das diferentes sub-regiões do miocárdio de ratos, epicárdio e endocárdio, por meio da técnica de “patch clamp”. Nenhum dos dois tipos de célula estudados apresentou diferenças significativas na morfologia do potencial de ação e corrente transitória rápida de saída de potássio. Com base em nossos resultados, podemos concluir que a DT não induz grande remodelamento elétrico em miócitos cardíacos isolados tanto nas células do endocárdio quanto nas do epicárdio.

 Miócitos Cardíacos Estimulação Elétrica Deficiência de Tiamina/fisiopatologia Potenciais de Ação Ratos Insuficiência Cardíaca Introdução

A tiamina é um importante cofator envolvido em reações bioquímicas diversas. A sua privação gera alterações significativas na fisiologia, especialmente em neurônios e tecido cardíaco1. No mundo industrializado, a deficiência de tiamina (DT) está particularmente associada ao consumo crônico de álcool e administração de diuréticos de alça, como a furosemida1. Em ambos os casos, foi relatado algum grau de remodelamento cardíaco, tal como a insuficiência cardíaca de alto débito, a manifestação clínica mais comum da DT2. Em alguns casos, os pacientes com DT podem desenvolver insuficiência cardíaca em associação com remodelamento elétrico do coração2,3. Baseado em dados prévios da literatura e usando modelos animais, nosso grupo e outros determinaram o remodelamento elétrico dos cardiomiócitos. No entanto, há resultados conflitantes na literatura1. No presente estudo, determinamos se a DT leva ao remodelamento elétrico de miócitos isolados do endocárdio (ENDO) e do epicárdio (EPI) de ratos.

 Métodos Grupo Experimental

Ratos machos Wistar (250 g) foram alimentados com uma dieta controle (contendo tiamina) ou uma dieta livre de tiamina durante 35 dias, tal como descrito anteriormente pelo nosso grupo4-6.

 Isolamento celular

Células do ENDO e EPI do ventrículo esquerdo de ratos do grupo controle pareados por idade e ratos com DT foram enzimaticamente dissociadas como relatado anteriormente4.

 Registros Eletrofisiológicos

Todos os registros foram obtidos utilizando métodos e soluções como descrito anteriormente5. As células foram mantidas em um potencial de holding de -80 mV. Os potenciais de ação (PA) foram induzidos por pulsos curtos (3-5 ms) de corrente de 1nA a 1 Hz de frequência durante 3 minutos. Durante os registros das correntes de potássio, as células foram perfundidas com uma solução de Tyrode modificada, substituindo NaCl por N-metyl‑D‑glucamina (NMDG) (para abolir a corrente de sódio), e 100 µM de CdCl2 (para bloquear a corrente de cálcio tipo L). Um potencial de junção de -20 mV foi medido e deve ser aplicado a todos os potenciais testados.

 Análise estatística

Todos os resultados são expressos como média ± erro padrão da média. Para a análise estatística, utilizou-se o teste One-way anova, seguido pelo teste post-hoc de Tukey. P < 0,05 foi estabelecido como nível de significância.

 Resultados

No presente estudo, foram avaliadas as propriedades elétricas dos miócitos isolados das células do ENDO e EPI. Os nossos resultados mostraram que o miócito controle apresenta maior duração do potencial de ação (DPA) em células do ENDO quando comparadas com as células do EPI (Figura 1). Esse fenômeno está associado à maior corrente de potássio de saída presentes nas células do EPI quando comparada com as células do ENDO (Figura 2), corroborando dados anteriores da literatura. Para nossa surpresa, a DT teve um impacto não significativo sobre as propriedades elétricas dos cardiomiócitos isolados. Quando comparado o tempo necessário para 90% da repolarização (TR)do PA das células de EPI CTR com EPI DT, esse foi de 26,33 ± 1.56 ms, n = 26 vs. 30,35 ± 2,49 ms, n = 22, respectivamente. As células do ENDO apresentaram resultados semelhantes. Por exemplo, o TR a 90% foi 38,93 ± 2.96 ms, n = 18 vs. 46,40 ± 6.11 ms, n = 20 para células CTR vs. com DT (Figura 1). Em concordância com esses resultados, o pico de corrente de saída e de entrada de potássio foi semelhante, ao comparar EPI CT ao EPI DT. Por exemplo, a +80 mV foi (A/F) 23,01 ± 1,77, n = 18, e 20,62 ± 1,50, n = 15, respectivamente. Perfil semelhante foi observado para as células do ENDO (Figura 2). Por fim, em conformidade com resultados anteriores, os miócitos com DT apresentam capacitâncias menores quando comparados com as células CTR (dados não mostrados).

Potenciais de ação em miócitos cardíacos isolados. Os painéis superiores mostram os registros representativos para (A) células do epicárdio (EPI) (à esquerda) e (B) células do endocárdio (ENDO) (à direita), considerando-se os grupos controle (CT) (linha verde) e de deficiência de tiamina (DT) (linha azul). Os painéis inferiores mostram o tempo médio requerido para que ocorra a repolarização do potencial de ação em diferentes estágios, 10% ,50% e 90% da repolarização, nos grupos controle (barras verdes) e de DT (barras azuis) para EPI-CT (n = 26), EPI-DT (n = 22) (à esquerda) e ENDO-CT (n = 18), ENDO-DT (n = 20) (à direita). Corrente de potássio. As correntes foram obtidas aplicando-se pulsos quadrados que variaram entre -140 a +80 mV, com duração de 4s e com incrementos de 20mV entre eles, a partir de um potencial de holding de -70mV e com intervalos de 15s entre um pulso e outo. Os painéis superior (CTR) e do meio (DT) mostram registros representativos para (A) células do epicárdio (EPI) e (B) células do endocárdio (ENDO). As inserções representam os 500 ms iniciais dos registros. Os painéis inferiores representam a corrente x voltagem para a corrente máxima de potássio. Os quadrados verdes e azuis representam os grupos CTR e DT, para as células do EPI (A) e ENDO (B). Discussão

Em estudos anteriores, utilizando um modelo animal com ratos, o nosso grupo mostrou que a DT é capaz de induzir a disfunção da capacidade contrátil dos cardiomiócitos7. Tais mudanças foram atribuídas à alterações no manejo intracelular de cálcio,com redução do conteúdo de cálcio no retículo sarcoplasmático8. Além disso, observou-se um aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem ter contribuído para a redução da massa cardíaca observada nesse modelo4. Juntos, esses resultados são capazes de explicar a redução da função cardíaca e dos miócitos durante a DT.

No contexto da alteração elétrica, é mais difícil obter uma ideia mais conclusiva. Há muitos relatos na literatura que mostram diferentes alterações no eletrocardiograma de humanos e animais durante a DT, incluindo taquicardia, elevação e depressão do segmento ST, morfologia alterada da onda T com prolongamento do intervalo QT, acompanhadas de bloqueio AV e prolongamento do QRS2,9. No contexto dos modelos animais, parece que os cardiomiócitos de ratos jovens são mais propensos a desenvolver distúrbios elétricos quando comparados a ratos adultos (os últimos foram utilizados no presente estudo)1.

No entanto, é intrigante que a DT não seja capaz de induzir um remodelamento elétrico significativo em cardiomiócitos, especialmente no contexto do aumento da produção de ROS4. Sabe-se que as ROS são capazes de reduzir a corrente de potássio de saída em miócitos, devido à expressão reduzida de Kv3.4, que é responsável pela corrente transitória de saída de potássio10. Assim, é possível especular que existem sistemas endógenos e/ou fatores do envelhecimento que são moduladores da remodelamento elétrico de miócitos na presença de DT.

 Conclusão

A deficiência de tiamina não desencadeia mudanças significativas nas propriedades elétricas de miócitos cardíacos isolados tanto nas células do endocárdio quanto nas células do epicárdio. Este estudo foi financiado pela FAPEMIG, CNPq e CAPES.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por CNPq, Capes e FAPEMIG.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós‑graduação.