Background:

Arq Bras Cardiol

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

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Sociedade Brasileira de Cardiologia

RSZM66fX4Y5SBvfKqkPrNFp

S0066-782X2015000300008

00008

10.5935/abc.20140207

S0074-0276130323

Original Articles

Chronic Stress Improves NO- and Ca2+ Flux-Dependent Vascular Function: A Pharmacological Study

Bruder-Nascimento

Thiago

1 2 Campos

Dijon Henrique Salome

2 Cicogna

Antônio Carlose

1 Universidade do Estado de São Paulo Instituto de Biociências de Botucatu Departamento de Farmacologia

Botucatu

São Paulo

Brazil Departamento de Farmacologia - Instituto de Biociências de Botucatu - Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, São Paulo - Brazil 1 Universidade do Estado de São Paulo Faculdade de Medicina de Botucatu Departamento de Clínica Médica

Botucatu

São Paulo

Brazil Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, São Paulo - Brazil

Mailing Address: Thiago Bruder do Nascimento, Av. Bandeirantes, 3900, Monte Alegre. Postal Code 14049-900, Ribeirão Preto, SP – Brazil. Email: bruderthiago@usp.br; bruderthiago@yahoo.com.br

Author contributions

Conception and design of the research, Statistical analysis and Obtaining financing: Bruder-Nascimento T, Cicogna AC, Cordellini S; Acquisition of data: Bruder-Nascimento T, Campos DHS; Analysis and interpretation of the data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Bruder-Nascimento T, Campos DHS, Cicogna AC, Cordellini S; Writing of the manuscript: Bruder-Nascimento T.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

23 01 2015

03 2015

104 3 226 233 07 03 2014 29 08 2014 09 09 2014

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Background:

Stress is associated with cardiovascular diseases.

Objective:

This study aimed at assessing whether chronic stress induces vascular alterations, and whether these modulations are nitric oxide (NO) and Ca2+ dependent.

Methods:

Wistar rats, 30 days of age, were separated into 2 groups: control (C) and Stress (St). Chronic stress consisted of immobilization for 1 hour/day, 5 days/week, 15 weeks. Systolic blood pressure was assessed. Vascular studies on aortic rings were performed. Concentration-effect curves were built for noradrenaline, in the presence of L-NAME or prazosin, acetylcholine, sodium nitroprusside and KCl. In addition, Ca²⁺ flux was also evaluated.

Results:

Chronic stress induced hypertension, decreased the vascular response to KCl and to noradrenaline, and increased the vascular response to acetylcholine. L-NAME blunted the difference observed in noradrenaline curves. Furthermore, contractile response to Ca²⁺ was decreased in the aorta of stressed rats.

Conclusion:

Our data suggest that the vascular response to chronic stress is an adaptation to its deleterious effects, such as hypertension. In addition, this adaptation is NO- and Ca²⁺-dependent. These data help to clarify the contribution of stress to cardiovascular abnormalities. However, further studies are necessary to better elucidate the mechanisms involved in the cardiovascular dysfunction associated with stressors. (Arq Bras Cardiol. 2014; [online].ahead print, PP.0-0)

Stress, Physiological / physiopatology Hypertension Nitric Oxide / physiology Rats Vasoconstrictor Agents / pharmacology

Fapesp

2009/03771-2

This study was funded by Fapesp add the process number 2009/03771-2.

Introduction

Stress is known as a complex and multidimensional condition1. The responses to stressor agents depend on the intensity, frequency, duration, and type of stressor agent. Hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis and sympathetic nervous system (SNS) are the major responsible systems that modulate the organism to stressor agents2. When stimulated, HPA and SNS release glucocorticoid hormone, such as cortisol, and biogenic amines, such as adrenaline and noradrenaline, respectively3.

Stress triggers different dysfunctions and pathologies including asthma, allergy, depression, anxiety, ulcer, metabolism dysfunction and cardiovascular diseases, such as stroke, hypertension and infarction2^,4^-8.

The literature and previous data from our laboratory have shown that stress induces cardiac alterations, such as fibrosis, systolic and diastolic left ventricle (LV) dysfunction and Ca²⁺ transit alteration6^,9^-13. Moreover, cardiovascular changes are not restricted only to the heart, some evidence implicates that different types of acute stress induce modulated vascular response to different agonists, such as increased acetylcholine response and decreased contractile effect of noradrenaline, which are nitric oxide (NO) and endothelium-dependent7^,14^-16. However, more studies are necessary to elucidate the mechanisms involved in modulated stress-induced responses.

Given that information, the aim of the present study was to assess whether chronic stress induces vascular alterations, and whether these modulations are NO- and Ca²⁺-dependent, in addition, the real involvement of a1-adrereceptor also was analyzed.. Our hypothesis was that chronic stress promotes adaptive vascular NO- and Ca²⁺-dependent responses and desensitization of α1-adrenoreceptor. To understand the involvement of mediators and of α1-adrenoreceptor, pharmacological tools were used.

Methods Animals

Thirty-day-old male Wistar rats (70-100 g) obtained from the Animal Center of Botucatu Medical School (Botucatu, São Paulo, Brazil) were housed in individual cages. The environment was controlled in terms of light (12-hour light/dark cycle starting at 6 AM), clean-air, room temperature (23 ± 3°C), and relative humidity (60% ± 5%). After 7 days of acclimatization, the rats were distributed into two groups: control (C, n = 8) and chronic stress (St, n = 8). All experiments and procedures were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, published by the National Research Council (1996), and were approved by the Ethics Committee of the Instituto de Biociências UNESP-Botucatu (protocol nº 95/08-CEEA).

Chronic stress

The stress characteristics taken into consideration were quality, frequency, type, physical or emotional, as well as the animal species being studied17. Immobilization stress is a model of emotional stress and one of the most used in research18. After 37 days of age, the St group animals were immobilized individually in metal capsules at room temperature (25°C) for 1 hour per day, five days a week, for 15 weeks.

During the stress session, the C group animals remained in cage at room temperature (25°C), receiving neither food nor water. Then, the St group animals were returned to their cages. Forty-eight hours after the last stress session, the animals were subjected to experimental protocols.

Cardiac and adrenal hypertrophy test

The animals were sacrificed, and hypertrophy of adrenals glands and LV was assessed. The glands and LV were removed, dissected and weighed. Cardiac hypertrophy was assessed by using the LV/tibia (mm) ratio and, on echocardiography, the LV (g)/final body weight (FBW) ratio, according to our previous study7^,8^,13.

Systolic blood pressure (SBP)

Systolic blood pressure was assessed at the end of stress exposure by use of the non-invasive tail-cuff method with a Narco BioSystems^® Electro-Sphygmomanometer (International Biomedical, Austin, TX, USA). The mean of two SBP readings was recorded for each animal.

Corticosterone level

Animals were submitted to a 12-15-hour fasting, anesthetized with sodium pentobarbital (50 mg/kg i.p.), and sacrificed by use of decapitation. Blood samples were collected in heparinized tubes, centrifuged at 3000 X g for 15 minutes at 4°C, and the serum was separated and stored at −80°C for further analysis. Corticosterone level was measured by using a specific radioimmunoassay kit (Coat-A-Count Rat Corticosterone - Diagnostic Products Corporation).

Vascular function

After 15 weeks of stress exposure, the rats were decapitated. The descending thoracic aorta was excised and trimmed free of adhering fat and connective tissue. Two transverse rings of the same artery, measuring 4 mm in length each, were cut and mounted at the optimal length for isometric tension recording in organ chambers. One ring served as control, while the endothelium was mechanically removed from the others by gently rubbing the luminal surface. The preparations were mounted in organ baths containing 7 mL of Krebs-Henseleit solution, whose composition in mM was as follows: NaCl 113.0; KCl 4.7; CaCl₂ 2.5; KH₂PO₄ 1.2; MgSO₄ 1.1; NaHCO₃ 25.0; glucose 11.0; ascorbic acid 0.11. The bathing fluid, kept at 37.0 ± 0.5 °C, was saturated with a gas mixture of 95% O₂ and 5% CO₂, and the pH was 7.4. The preparations were allowed to equilibrate for at least 1 h under a resting tension of 1.5 g, which is ideal for inducing maximum contraction. Tension was recorded by use of a myograph (Ugo Basile).

Cumulative concentration-effect (CCE) curves were constructed from the tissue response to potassium chloride (KCl) and to noradrenaline. Cumulative concentration-effect curves to noradrenaline were constructed in the absence and presence of L-NAME (3 x 10^-4 M, inhibitor of NO synthase - NOS) or prazosin (10^-8 M, α1-adrenoreceptor antagonist) (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA).

In another set of experiments, CCE curves were constructed for acetylcholine, in intact aortic rings (+E), and for sodium nitroprusside (SNP), in endothelium denuded aortic rings (-E) (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA).

Contribution of intracellular and extracellular Ca2+ in the decreased response of endothelium-free aortic rings to noradrenaline

Adapted from Tirapelli et al19, we investigated the contribution of intracellular Ca²⁺ release on the decreased vascular function to noradrenaline, contractile response to this agonist was obtained in Krebs' solution without Ca²⁺. The rings were exposed to this solution for 1 minute, then stimulated with 10^-7 and 10^-6 M noradrenaline, and then the tension was assessed. Furthermore, the role of extracellular Ca²⁺ mobilization was investigated by using CaCl₂-induced contraction in the presence of noradrenaline. In Ca²⁺-free solution containing EDTA (1 mM), endothelium-free aortic rings were contracted with noradrenaline (10^-4 M) to deplete the intracellular Ca²⁺ stores and then rinsed in Krebs solution without Ca²⁺ and EDTA and containing noradrenaline (0.1 mM). The process was repeated several times until the extinction of noradrenaline-induced contraction, when we considered that Ca²⁺ was completely depleted.

Statistical analysis

Data are reported as means ± standard error of the mean (SEM). The cardiac mass and adrenal hypertrophy, corticosterone levels and final SBP of the groups were compared by using t-test and post hoc Tukey-test with the GraphPad Prism 6.04 software. Individual concentration-effect curves were fitted into a curve by use of non-linear regression analysis. The negative logarithm of EC50 values (pD2) and the maximal response were compared by use of Student t test or ANOVA, when appropriate. The significance level of 5% was adopted.

Results

Chronic stress did not increase cardiac mass as follows: LV (g)/tibia (mm) values in the C and St groups were 0.15 ± 0.02 vs 0.16 ± 0.03, respectively; and the results of the echocardiography test [LV (g)/FBW (g)] in the C and St groups were 1.45 ± 0.16 vs 1.52 ± 0.11, respectively. However, chronic stress increased the wet adrenal weight (C = 0.57 ± 0.08 vs St = 0.76 ± 0.05). In addition, animals exposed to chronic stress developed high blood pressure [C = 118.3 ± 12.3 vs St = 148.8 ± 9.43* (mmHg)] and had increased corticosterone levels in plasma [C = 48.3 ± 10.2 vs St = 97.2 ± 16.3* (ng/mL)] *p < 0.05.

Chronic stress promoted decreased maximal response to KCl in aortic rings with or without endothelium [+E (C: 2.65 ± 0.48 vs St: 2.06 ± 0.26*); -E (C: 2.62 ± 0.64 vs St: 2.18 ± 0.62*)]. Moreover, no pD₂ difference was observed in rings with and without endothelium [(C: 3.47 ± 0.10 vs St: 3.36 ± 0.09) and (C: 11.51 ± 2.80 vs St: 11.17 ± 2.81)] (Figure 1) *p < 0.05.

Figure 1 Concentration-effect curves for KCl obtained with two rings, one with (A) and the other without (B) endothelium, of the same thoracic aorta from control (empty symbol) and stressed (solid symbol) rats. Data are reported as means ± SEM (n = 6) *p < 0.05.

Similarly to the KCl response, aortic rings with or without endothelium from stressed rats also had decreased maximal response to noradrenaline. Pre-incubation with L-NAME blunted these changes. No pD₂ difference was observed in the experimental groups without L-NAME pre-incubation. L-NAME pre-incubation increased the sensitivity to noradrenaline in both rings, endothelium-intact and denuded (Figure 2 and Table 1).

Figure 2 Concentration-effect curves for noradrenaline obtained in intact endothelium (E+) (A and C) and in denuded endothelium (E-) aortic rings (B and D), in presence (C and D) or absence (A and B) of L-NAME (3x10-4 M), from control (empty symbol) and stressed (solid symbol) rats. Data are reported as means ± SEM (n = 5-7) *p < 0.05.

Table 1 Vascular reactivity to noradrenaline In presence or absence of L-NAME

Groups	Agonist	Parameters
		Maximal response		pD₂
		+E	-E	+E	-E
C	Nor	2.65 ± 0.21	4.58 ± 0.64#	6.33 ± 0.07	7.60 ± 0.23#
C	Nor/L-NAME	4.62 ± 0.70$	4.40 ± 0.63#	7.05 ± 0.29$	7.47 ± 0.52
St	Nor	1.20 ± 0.40*	3.87 ± 0.58*#	6.49 ± 0.32	7.27 ± 0.21#
St	Nor/L-NAME	4.64 ± 0.55$	4.16 ± 0.78$#	7.08 ± 0.38$	7.03 ± 0.44

Effects of chronic stress on maximal response and pD2 (negative logarithm of the EC50) for noradrenaline (Nor) in aortic rings from Wistar rats, in L-NAME presence or absence (3x10^-4 M). Concentration-effect curves (CCE) were constructed in intact endothelium (E+) and denuded endothelium (E-) aortic rings. Results are shown as means ± SEM of 5-7 rats in each experimental group.

p < 0.05 C vs St *p < 0.05 C vs St;

p < 0.05 L-NAME vs Nor;

p < 0.05 -E vs +E; C: control group; St: Stress group.

Prazosin, α₁ competitive antagonist, was used to assess the real α₁ adrenoreceptor involvement. It shifted the noradrenaline response to the right in endothelium-free aortic rings; however, there was no pD₂ difference between the C and St groups (C = 7.82 ± 0.08; St = 7.81 ± 0.09; C/Prazosin = 6.02 ± 0.05*; St/Prazosin = 6.14 ± 0.06*) *p < 0.05 (Figure 3).

Figure 3 Concentration-effect curves for noradrenaline in denuded endothelium (E-) aortic rings, in presence (solid line) or absence (dotted line) of prazosin (10-8 M) from control (empty symbol) and stressed (solid symbol) rats. Data are reported as means ± SEM (n = 6) *p < 0.05.

Chronic stress enhanced the maximal response to acetylcholine in aortic rings with endothelium, as well as its sensitivity (Figure 4.A and Table 2). Moreover, endothelium-denudedaortic rings from stressed rats showed shift to the left for NO donor, SNP, and no difference was observed in the maximal response parameter (Figure 4.B and Table 2).

Figure 4 Concentration-effect curves for acetylcholine (A) obtained in intact endothelium (E+) aortic rings and sodium nitroprusside (B) obtained in denuded endothelium (E-) aortic rings from control (empty symbol) and stressed (solid symbol) rats. Data are reported as means ± SEM (n = 5-7) *p < 0.05.

Table 2 Vascular reactivity to acetylcholine

Groups	Agonist	Parameters
		Maximal response	pD₂
		+E
C	ACh (%)	62.4 ± 8.63	7.27 ± 0.47
St	ACh (%)	95.3 ± 16.2*	8.37 ± 0.63*
		-E
C	SNP (%)	101 ± 5.4	8.38 ± 0.10
St	SNP (%)	103 ± 5.7	9.58 ± 0.22*

Effects of chronic stress on maximal response and pD2 (negative logarithm of the EC50) for acetylcholine (ACh) in intact endothelium (E+) aortic rings and sodium nitroprusside (SNP) in denuded endothelium (E-) aortic rings from Wistar rats. Concentration-effect curves (CCE) were constructed. Results are shown as means ± SEM of 5-7rats in each experimental group.

p < 0.05 C vs St; C: control group; St: Stress group.

Stressed rats had decreased contractile response to noradrenaline in Krebs solution without Ca²⁺. Furthermore, CCE curves for CaCl₂, in presence of noradrenaline, in endothelium-free aortic rings from chronically stressed rats also had decreased maximal response. No difference was observed in pD₂ (Figure 5 and Table 3).

Figure 5 Contractile response for noradrenaline in denuded endothelium (E-) aortic rings from control (empty bar) and stressed (solid bar) rats in Krebs solution without Ca2+ (A). Concentration- effect curves for CaCl2 in aortic rings without endothelium from control (empty symbol) and stressed (solid symbol) rats. Data are reported as means ± SEM (n = 5-7) *p < 0.05.

Table 3 Vascular reactivity to CaCl2

Groups	Agonist	Parameters
		Maximal response	pD₂
		-E
C	CaCl₂	2.76 ± 0.13	8.81 ± 0.34
St	CaCl₂	2.03 ± 0.10*	8.97 ± 0.37

Effects of chronic stress on maximal response and pD2 (negative logarithm of the EC50) for CaCl₂ in aortic rings from Wistar rats. Concentration-effect curves (CCE) were constructed in denuded endothelium (E-) aortic rings. Results are shown means ± SEM of 5-7 rats in each experimental group.

p < 0.05 C vs St; C: control group; St: Stress group.

Discussion

In the present study, chronic stress increased adrenal wet weight and plasma corticosterone levels, which suggest increased HPA axis activity, and corroborate the literature that shows these same effects in different stress models17^,20^,21. Stress can lead to hypertension through the production of several mediators or hyperactivation of some systems, including renin-angiotensin-aldosterone, and vasoactive amines, such as adrenaline, that are associated with blood pressure regulation22^-24. Our stress model led to high blood pressure that might be associated with adrenaline release by adrenal glands, because we found increased adrenal mass, which indicates SNS hyperactivation, corroborating findings from literature13^,22.

Stress, in acute or chronic models, improves vascular function to different agonists7^,14^,16^,25. Our results corroborate these data, in which increased responses to noradrenaline and acetylcholine were observed. In addition, we can suggest that these responses are NO-dependent for two reasons: i) the previous incubation with NOS inhibitor abolished the decreased maximal response to noradrenaline in aortic rings from stressed rats compared with that of the control group; ii) we found that acetylcholine-induced relaxation was higher in aortic rings from the St group than from the C group. Acetylcholine, an endothelium-dependent agonist, is able to release NO when it binds to a muscarinic receptor located in endothelial cells, leading to vascular relaxation26.

Another interesting finding from our study shows that vascular smooth muscle from stressed rats is more sensitive to NO than that from the non-stressed group, because the NO donor, SNP, induced shift to the left in endothelium-free aortic rings. We did not assess pathways associated with NO production, such as AKT (protein kinase B), which is able to phosphorylate NO synthase27, but we can confirm that both NO releasing and sensitivity to NO are involved in the modulated vascular response to chronic stress.

We assessed whether α1-adrenoreceptor participates in the vascular function of stressed rats by using a competitive α₁-adrenoreceptor antagonist. We concluded that α1-adrenoreceptor activity does not change in the aorta of stressed rats, and the decreased maximal response observed in the experimental group might be linked to downstream events to α1-adrenoreceptor, such as NO release and sensitivity28, or NO release might be associated with α2-adrenoreceptor activation by noradrenaline29.

Similarly to noradrenaline response, KCl, a contractile agonist not receptor-dependent, also had decreased maximal response in aorta rings of the St group. These data, together with prazosin and noradrenaline, strengthen that some intracellular mediator is involved in stress vascular response, NO being a strong candidate, since the KCl-induced vascular contraction does not depend on a specific receptor, but on action potential.

Ca2+ plays a crucial role in vascular homeostasis, modulating vascular function and structure, the intracellular Ca2+ and uptake being essential for perfect operation30. We examined whether intracellular Ca2+ and uptake are involved in the attenuated vascular contraction to noradrenaline in stressed rats. Attenuated vascular response to single concentrations of noradrenaline was observed in this study. So, we could suggest that intracellular Ca2+ release, which occurs in the endoplasmic reticulum (ER) after interaction of inositol trisphosphate (IP3) with its receptor located in the ER membrane31^,32, or the low Ca2+ concentration in the ER could participate in this modulation. Moreover, Ca2+ uptake by some channel, such as L-type calcium channels32^,33, might have low activity to uptake Ca2+ in the vasculature from the St group, because the CCE curve for Ca2+, in a Ca2+-free medium in presence of noradrenaline, was attenuated in endothelium-free aortic rings of stressed rats.

Conclusion

Our study advances the understanding and identifies new mediators involved in the attenuated vascular response to noradrenaline in stressed rats. Nitric oxide and Ca2+ fluxes are the possible mediators. We believe these mediators are positively activated to counterbalance the deleterious cardiovascular effects caused by stressful conditions. However, more studies are necessary to better elucidate the adaptive response to chronic stress.

Sources of Funding

This study was funded by Fapesp add the process number 2009/03771-2.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Thiago Bruder do Nascimento, from Universidade do Estado de São Paulo.

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Estresse Crônico Melhora a Função Vascular Dependente de NO e Fluxo De Ca2+: Um Estudo Farmacológico

Bruder-Nascimento

Thiago

1 2 Campos

Dijon Henrique Salome

2 Cicogna

Antônio Carlos

2 Cordellini

Sandra

1 Universidade do Estado de São Paulo Instituto de Biociências de Botucatu Departamento de Farmacologia

Botucatu

São Paulo

Brasil Departamento de Farmacologia - Instituto de Biociências de Botucatu - Universidade do Estado de São Paulo (UNESP); Botucatu, São Paulo - Brasil 2 Universidade do Estado de São Paulo Faculdade de Medicina de Botucatu Departamento de Clínica Médica

Botucatu

São Paulo

Brasil Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade do Estado de São Paulo (UNESP), Botucatu, São Paulo - Brasil

Thiago Bruder do Nascimento, Av. Bandeirantes, 3900, Monte Alegre. CEP 14049-900, Ribeirão Preto, SP – Brasil Email: bruderthiago@usp.br; bruderthiago@yahoo.com.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, Análise estatística e Obtenção de financiamento: Bruder-Nascimento T, Cicogna AC, Cordellini S; Obtenção de dados: Bruder-Nascimento T, Campos DHS; Análise e interpretação dos dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Bruder-Nascimento T, Campos DHS, Cicogna AC, Cordellini S; Redação do manuscrito: Bruder-Nascimento T.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fundamento:

Estresse está associado com complicações cardiovasculares.

Objetivos:

O objetivo do presente estudo foi avaliar se o estresse crônico induz alterações vasculares, e se essas alterações são dependentes de óxido nítrico (NO) e Ca²⁺.

Métodos:

Ratos machos Wistar com 30 dias de idade foram separados em 2 grupos: controle (C) e Estresse (St). Utilizou-se estresse crônico de imobilização por 1 hora/dia, 5 dias/semana, 15 semanas. Pressão arterial sistólica foi avaliada. A função vascular foi avaliada em anéis aórticos. Curvas de concentração-efeito foram realizadas para noradrenalina, na presença de L-NAME ou prazosina, cloreto de potássio (KCl), acetilcolina e nitroprussiato de sódio. Também foi efetuado um estudo para avaliação para fluxo de Ca²⁺.

Resultados:

Estresse crônico induziu hipertensão e resposta vascular diminuída para noradrenalina e KCl e aumentada para acetilcolina. A pré-incubação com L-NAME eliminou a diferença para noradrenalina. A resposta contrátil vascular para Ca²⁺ foi reduzida em animais estressados.

Conclusão:

Nossos dados sugerem que a resposta vascular ao estresse crônico seria uma adaptação aos efeitos deletérios do estresse, incluindo a hipertensão. Além disso, esses mecanismos adaptativos dependem de liberação de NO e fluxo de Ca²⁺. Esses resultados ajudam a esclarecer os mecanismos envolvidos nas alterações cardiovasculares associadas ao estresse. Entretanto, mais estudos são necessários para a melhor compreensão desses mecanismos.

Estresse Fisiológico / fisiopatologia Hipertensão Óxido Nítrico / fisiologia Ratos Vasoconstritores / farmacologia.

Fapesp

2009/03771-2

O presente estudo foi financiado pela Fapesp processo: 2009/03771-2.

Introdução

O estresse é conhecido como uma condição complexa e multidimensional1. As respostas aos agentes estressores dependem da intensidade, da frequência, da duração e do tipo desses agentes. O eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) e o sistema nervoso simpático (SNS) são os principais responsáveis pela modulação do organismo ao agente estressor2. Quando esses sistemas são estimulados, hormônio glicocorticoide, como o cortisol, e aminas biogênicas, como adrenalina e noradrenalina, são liberados através do eixo HHA e do SNS, respectivamente3.

O estresse desencadeia diferentes disfunções e patologias, como asma, alergia, depressão, ansiedade, úlcera, disfunção metabólica e doenças cardiovasculares, como acidente vascular cerebral, hipertensão e infarto2,4^-8.

Dados da literatura e de nosso laboratório mostraram que o estresse induz alterações cardíacas, como fibrose, disfunção sistólica e diastólica do ventrículo esquerdo (VE) e alteração do trânsito de Ca²⁺ 6^,9^-13. Além disso, as alterações cardiovasculares não estão restritas apenas ao coração, havendo evidência de que diferentes tipos de estresse agudo modulam a resposta vascular a diferentes agonistas, como elevação da resposta a acetilcolina e diminuição do efeito contrátil da noradrenalina, que são dependentes do óxido nítrico (NO) e do endotélio7^,14^-16. No entanto, mais estudos são necessários para melhor entender os mecanismos envolvidos nas respostas moduladas induzidas por estresse.

Portanto, este estudo teve por objetivo avaliar se o estresse crônico induz alterações vasculares, se tais modulações são dependentes de NO- e Ca²⁺, e o real envolvimento do receptor adrenérgico α₁. Nossa hipótese é que o estresse crônico promova respostas adaptativas vasculares dependentes de NO e Ca²⁺, assim como a dessensibilização do receptor adrenérgico α₁. Para a compreensão do envolvimento dos mediadores e do receptor adrenérgico α₁mencionados acima, utilizaram-se ferramentas farmacológicas.

Métodos Animais

Ratos machos Wistar de 30 dias de idade (70-100 g) provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina de Botucatu (Botucatu, São Paulo, Brasil) foram mantidos em gaiolas individuais. Foram mantidos constantes no ambiente a luz (ciclos de claro/escuro de 12 horas, começando às 6 h), o ar limpo, a temperatura (23 ± 3ºC) e a umidade relativa (60% ± 5%). Após sete dias de aclimatação, os ratos foram distribuídos em dois grupos: controle (C, n = 8) e estresse crônico (St, n = 8). Todos os experimentos e os procedimentos foram realizados conforme o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo Conselho Nacional de Pesquisa (1996) e aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Biociências da UNESP-Botucatu (protocolo nº 95/08-CEEA).

Estresse crônico

As características do estresse a serem consideradas qualidade, frequência, tipo, físico ou emocional, assim como a espécie animal estudada17. A imobilização é um modelo de estresse emocional, sendo um dos mais usados em pesquisa18. A partir dos 37 dias de idade, os animais do grupo St foram imobilizados individualmente em cápsulas de metal em temperatura ambiente (25ºC) por uma hora ao dia, cinco dias por semana e por 15 semanas.

Durante a sessão de estresse, os animais do grupo C permaneceram nas gaiolas em temperatura ambiente (25 ºC) sem receber alimento nem água. Então, os animais do grupo St foram recolocados em suas gaiolas. Após 48 horas da última sessão de estresse, os animais foram submetidos aos protocolos experimentais.

Teste de hipertrofia cardíaca e adrenal

Os animais foram sacrificados e avaliados quanto a hipertrofia de glândulas adrenais e de VE. Essas glândulas e o VE foram removidos, dissecados e pesados. A hipertrofia cardíaca foi avaliada através da relação VE/tíbia (mm) e, na ecocardiografia, pela relação VE/peso corporal final (PCF), conforme nosso estudo prévio7^,8^,13.

Pressão arterial sistólica (PAS)

A PAS foi avaliada ao final da exposição ao estresse usando-se o método não invasivo de pletismografia de cauda (Narco BioSistemas^®, International Biomedical, Austin, TX, EUA). A média de duas medidas de PAS foi considerada para cada animal.

Nível de corticosterona

Os animais foram submetidos a jejum de 12-15 horas, anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) e sacrificados por decapitação. As amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados, centrifugadas a 3000 X g por 15 minutos a 4ºC, e o soro separado e estocado a -80ºC para análise posterior. O nível de corticosterona foi medido com um kit específico de radioimunoensaio (Coat-A-Count Rat Costicosterone - Diagnostic Products Corporation).

Função vascular

Após exposição ao estresse por 15 semanas, os ratos foram sacrificadas. A aorta torácica descendente foi excisada e dela retirados a gordura e o tecido conjuntivo aderidos. Dois anéis transversais da mesma artéria, medindo cerca de 4 mm de comprimento, foram cortados e montados no comprimento ideal para o registro da tensão isométrica em câmara de órgãos. Um anel serviu como controle, tendo o endotélio sido mecanicamente removido dos demais por fricção suave na superfície luminal. As preparações foram montadas em banhos de órgão contendo 7 ml de solução de Krebs-Henseleit, com a seguinte composição em mM: NaCl 113,0; KCl 4,7; CaCl₂ 2,5; KH₂PO₄ 1,2; MgSO₄ 1,1; NaHCO₃ 25,0; glicose 11,0; ácido ascórbico 0,11. O fluido de banho, mantido a 37,0 ± 0,5 ºC, foi saturado com mistura gasosa de O₂ (95%) e CO₂ (5%), sendo 7,4 o pH. Deixou-se que as preparações entrassem em equilíbrio por pelo menos uma hora, sob uma tensão de repouso de 1,5 g, ideal para induzir contração máxima. A tensão foi registrada com um miógrafo (Ugo Basile).

Construíram-se curvas de concentração-efeito (CCE) a partir da resposta do tecido ao cloreto de potássio (KCl) e à noradrenalina. As CCE à noradrenalina foram construídas na ausência e na presença de L-NAME [3 x 10^-4 M, inibidor de NO sintase (NOS)] ou prazosina (10^-8M, antagonista do receptor adrenérgico α₁) (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, EUA).

Em outro conjunto de experimentos, construíram-se as CCE para a acetilcolina em anéis aórticos intactos (+E) e para nitroprussiato de sódio (NPS) em anéis aórticos sem endotélio (-E) (Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, EUA).

Contribuição do Ca2+ intracelular e extracelular para a reduzida resposta à noradrenalina dos anéis aórticos sem endotélio

A partir de adaptação de Tirapelli e cols.¹⁹, investigamos a contribuição da liberação de Ca²⁺ intracelular na diminuição da resposta vascular à noradrenalina, obtendo-se resposta contrátil a esse agonista na solução de Krebs sem Ca²⁺. Os anéis foram expostos a essa solução por 1 minuto e então estimulados com 10^-7 e 10^-6 M de noradrenalina, avaliando-se então a tensão. Além disso, o papel da mobilização do Ca²⁺ extracelular foi investigado usando-se contração induzida por CaCl₂na presença de noradrenalina. Em solução sem Ca²⁺ e contendo EDTA (1 mM), os anéis aórticos desnudados foram contraídos com noradrenalina (10^-4 M) para esgotar os estoques de Ca²⁺ intracelular e, então, enxaguados em solução de Krebs sem Ca²⁺ e EDTA e contendo noradrenalina (0,1 mM). O processo foi repetido várias vezes até a extinção da contração induzida por noradrenalina, quando se considerou que o Ca²⁺ foi completamente esgotado.

Análise estatística

Os dados foram apresentados como médias ± erro padrão da média (EPM). A massa cardíaca e a hipertrofia adrenal, os níveis de corticosterona e a PAS final dos grupos foram comparados usando-se o teste t e o teste de Tukey post hoc com o software GraphPad Prism 6.04. As curvas de concentração-efeito individuais foram submetidas a análise de regressão não-linear. Os valores do algoritmo negativo de EC50 (pD2) e a resposta máxima foram comparados usando-se o teste t de Student ou ANOVA, quando apropriado. Adotou-se o nível de significância de 5%.

Resultados

O estresse crônico não aumentou a massa cardíaca: os valores de LV (g)/tíbia (mm) nos grupos C e St foram 0,15 ± 0,02 vs 0,16 ± 0,03, respectivamente; e os resultados da ecocardiografia [LV (g)/PCF (g)] nos grupos C e St foram 1,45 ± 0,16 vs 1,52 ± 0,11, respectivamente. No entanto, o estresse crônico aumentou o peso seco da adrenal (grupo C = 0,57 ± 0,08 vs grupo St = 0,76 ± 0,05). Além disso, os animais expostos a estresse crônico desenvolveram hipertensão [C = 118,3 ± 12,3 vs St = 148,8 ± 9,43* (mmHg)] e apresentaram elevação dos níveis plasmáticos de corticosterona [C = 48,3 ± 10,2 vs St = 97,2 ± 16,3* (ng/mL)] *p < 0,05.

O estresse crônico promoveu diminuição da resposta máxima ao KCl nos anéis aórticos com ou sem endotélio [+E (C: 2,65 ± 0,48 vs St: 2,06 ± 0,26*); -E (C: 2,62 ± 0,64 vs St: 2,18 ± 0,62*)]. Além disso, não houve diferença na pD₂ dos anéis com e sem endotélio [(C: 3,47 ± 0,10 vs St: 3,36 ± 0,09) e (C: 11,51 ± 2,80 vs St: 11,17 ± 2,81)] (Figura 1) *p < 0,05.

Figura 1 Curvas de concentração-efeito para KCl obtidas com dois anéis, um com endotélio (A) e outro sem (B), da mesma aorta torácica em ratos dos grupos controle (C - círculos vazios) e estresse (St - círculos cheios). Dados apresentados como média ± EPM (n = 6) *p < 0,05.

À semelhança da resposta ao KCl, os anéis aórticos com ou sem endotélio dos ratos submetidos ao estresse também apresentaram redução da resposta máxima à noradrenalina. Pré-incubação com L-NAME obscureceu essas alterações. Não houve diferença nos parâmetros pD₂ nos grupos sem pré-incubação com L-NAME. A pré-incubação com L-NAME elevou a sensibilidade à noradrenalina nos anéis com e sem endotélio (Figura 2 e Tabela 1).

Figura 2 Curvas de concentração-efeito para noradrenalina obtidas em anéis aórticos com endotélio intacto (E+) (A e C) e desnudado (E-) (B e D), na presença (C e D) ou ausência (A e B) de L-NAME (3x10-4 M), em ratos dos grupos controle (C - círculos vazios) e estresse (St - círculos cheios). Dados apresentados como média ± EPM (n = 5-7) *p < 0,05.

Tabela 1 Reatividade vascular à noradrenalina na presença ou ausência de L-NAME

Grupos	Agonistas	Parâmetros
		Resposta máxima		pD₂
		+E	-E	+E	-E
C	Nor	2,65 ± 0,21	4,58 ± 0,64#	6,33 ± 0,07	7,60 ± 0,23#
C	Nor/L-NAME	4,62 ± 0,70$	4,40 ± 0,63#	7,05 ± 0,29$	7,47 ± 0,52
St	Nor	1,20 ± 0,40*	3,87 ± 0,58* #	6,49 ± 0,32	7,27 ± 0,21*
St	Nor/L-NAME	4,64 ± 0,55$	4,16 ± 0,78$ #	7,08 ± 0,38$	7,03 ± 0,44

C: grupo controle; St: grupo estresse. Efeitos do estresse crônico na resposta máxima e pD2 (logaritmo negativo de EC50) para noradrenalina (Nor) em anéis aórticos de ratos Wistar, na presença ou ausência de L-NAME (3x10^-4M). Curvas de concentração-efeito (CCE) foram construídas em anéis aórticos com endotélio intacto (E+) e endotélio desnudado (E-). Resultados apresentados como média ± EPM de 5-7 ratos em cada grupo experimental.

p < 0,05 C vs St * p < 0,05 C vs St;

p < 0,05 L-NAME vs Nor;

p < 0,05 -E vs +E

A prazosina, antagonista α₁ competitivo, foi usada para avaliar o real envolvimento do receptor adrenérgico α₁. Ela desviou para a direita a resposta à noradrenalina em anéis aórticos sem endotélio, mas não houve diferença entre os grupos C e St quanto ao parâmetro pD₂ (C = 7,82 ± 0,08; St = 7,81 ± 0,09; C/Prazosina = 6,02 ± 0,05*; St/Prazosina = 6,14 ± 0,06*) *p < 0,05 (Figura 3).

Figura 3 Curvas de concentração-efeito para noradrenalina em anéis aórticos com endotélio desnudado (E-), na presença (linha sólida) ou ausência (linha tracejada) de prazosina (10-8 M), em ratos dos grupos controle (C - círculos vazios) e estresse (St - círculos cheios). Dados apresentados como média ± EPM (n = 6) *p < 0,05.

O estresse crônico aumentou a resposta máxima à acetilcolina em anéis aórticos com endotélio, assim como sua sensibilidade (Figura 4.A e Tabela 2). Além disso, anéis aórticos sem endotélio dos ratos submetidos ao estresse apresentaram desvio para a esquerda para o doador de NO, NPS, e não houve diferença na resposta máxima (Figura 4.B e Tabela 2).

Figura 4 Curvas de concentração-efeito para acetilcolina (A), obtidas em anéis aórticos com endotélio intacto (E+), e para nitroprussiato de sódio (B), obtidas em anéis aórticos com endotélio desnudado (E-), em ratos dos grupos controle (C - círculos vazios) e estresse (St - círculos cheios). Dados apresentados como média ± EPM (n = 5-7) *p < 0,05.

Tabela 2 Reatividade vascular à acetilcolina

Grupos	Agonistas	Parâmetros
		Resposta máxima	pD₂
		+E
C	ACh (%)	62,4 ± 8,63	7,27 ± 0,47
St	ACh (%)	95,3 ± 16,2*	8,37 ± 0,63*
		-E
C	NPS (%)	101 ± 5,4	8,38 ± 0,10
St	NPS (%)	103 ± 5,7	9,58 ± 0,22*

C: grupo controle; St: grupo estresse

Efeitos do estresse crônico na resposta máxima e pD2 (logaritmo negativo de EC50) para acetilcolina (ACh) em anéis aórticos com endotélio intacto (E+) e para nitroprussiato de sódio (NPS) em anéis aórticos com endotélio desnudado (E-) de ratos Wistar. Curvas de concentração-efeito (CCE) foram construídas. Resultados apresentados como média ± EPM de 5-7ratos em cada grupo experimental.

p < 0,05 C vs St.

Os ratos submetidos a estresse apresentaram diminuição da resposta contrátil à noradrenalina na solução de Krebs sem Ca²⁺. Além disso, as CCE para CaCl₂, na presença de noradrenalina, em anéis aórticos sem endotélio de ratos submetidos a estresse crônico também apresentaram diminuição da resposta máxima. Não se observou diferença em pD₂ (Figura 5 e Tabela 3).

Figura 5 Resposta contrátil à noradrenalina em anéis aórticos com endotélio desnudado (E-) de ratos dos grupos controle (barra vazia) e estresse (barra sólida) em solução de Krebs sem Ca2+ (A). Curvas de concentração-efeito para CaCl2 em anéis aórticos com endotélio desnudado de ratos dos grupos controle (C - círculos vazios) e estresse (St - círculos cheios). Dados apresentados como média ± EPM (n = 5-7) *p < 0,05.

Tabela 3 Reatividade vascular ao CaCl2

Grupos	Agonistas	Parâmetros
		Resposta máxima	pD₂
		-E
C	CaCL₂	2,76 ± 0,13	8,81 ± 0,34
St	CaCL₂	2,03 ± 0,10*	8,97 ± 0,37

C: grupo controle; St: grupo estresse. Efeitos do estresse crônico na resposta máxima e pD2 (logaritmo negativo de EC50) para CaCl₂ em anéis aórticos de ratos Wistar. Curvas de concentração-efeito (CCE) foram construídas em anéis aórticos com endotélio desnudado. Resultados apresentados como média ± EPM de 5-7 ratos em cada grupo experimental.

p < 0,05 C vs St

Discussão

No presente estudo, o estresse crônico aumentou o peso seco da adrenal e os níveis plasmáticos de corticosterona, o que sugere aumento da atividade do eixo HHA, corroborando achados da literatura, que mostram esses mesmos efeitos em diferentes modelos de estresse17^,20^,21. O estresse pode levar a hipertensão através da produção de vários mediadores ou hiperatividade de alguns sistemas, como renina-angiotensina-aldosterona, e aminas vasoativas, como adrenalina, associadas com regulação da pressão arterial22^-24. Nosso modelo de estresse levou a hipertensão, que pode estar associada com liberação de adrenalina pelas adrenais, uma vez que encontramos aumento da massa adrenal, que indica hiperatividade do SNS, corroborando achados da literatura13^,22.

Estresse, em modelos agudo ou crônico, melhora a função vascular para diferentes agonistas7^,14^,16^,25. Nossos resultados corroboram tais dados, observando-se respostas aumentadas para noradrenalina e acetilcolina. Além disso, podemos sugerir que tais respostas sejam dependentes de NO por duas razões: i) a incubação prévia com inibidor de NOS aboliu a redução da resposta máxima à noradrenalina nos anéis aórticos de ratos submetidos ao estresse em comparação com aqueles do grupo controle; ii) descobrimos que a resposta à acetilcolina foi maior nos anéis aórticos do grupo St do que naqueles do grupo C. Acetilcolina, um agonista endotélio-dependente, pode liberar NO ao se ligar a receptor muscarínico localizado em células endoteliais, levando a relaxamento vascular26.

Outro achado interessante de nosso estudo mostra que o músculo liso vascular dos ratos submetidos a estresse é mais sensível ao NO do que aquele do grupo não submetido ao estresse, pois o doador de NO, NPS, induziu desvio para a esquerda nos anéis aórticos sem endotélio. Não avaliamos as vias associadas com a produção de NO, como AKT (proteína quinase B), que pode fosforilar NO sintase27, mas podemos confirmar que tanto liberação de NO quanto sensibilidade a ele estão envolvidas na modulação da resposta vascular ao estresse crônico.

Avaliamos se o receptor adrenérgico α1 participa da função vascular de ratos submetidos ao estresse, usando um antagonista competitivo para o receptor adrenérgico α1. Concluímos que a atividade do receptor adrenérgico α1 não se altera na aorta de ratos submetidos ao estresse, e que a redução da resposta máxima observada no grupo deve estar ligada aos eventos downstream do receptor adrenérgico α1, como liberação de NO e sensibilidade a ele28, ou a liberação de NO deve estar associada à ativação do receptor adrenérgico α1 por noradrenalina29.

À semelhança da resposta à noradrenalina, o KCl, um agonista contrátil não dependente de receptor, também apresentou diminuição da resposta máxima em anéis aórticos do grupo St. Tais dados, juntamente com prazosina e noradrenalina, reforçam o envolvimento de um mediador intracelular na resposta vascular ao estresse, o NO sendo um forte candidato, pois a contração vascular induzida por KCl não depende de um receptor específico, mas de potencial de ação.

O Ca²⁺ tem papel crucial na homeostase vascular, modulando a função e a estrutura vasculares, o Ca²⁺ intracelular e a sua captação sendo essenciais para uma operação perfeita30. Analisamos se o Ca²⁺ intracelular e a sua captação estão envolvidos na atenuação da vasoconstrição à noradrenalina em ratos submetidos ao estresse. Observou-se atenuação da resposta vascular a concentrações isoladas de noradrenalina no presente estudo. Portanto, podemos sugerir que a liberação intracelular de Ca²⁺, que ocorre no retículo endoplasmático após interação do inositol trisfosfato (IP3) com seu receptor localizado na membrana do retículo endoplasmático31^,32, ou a baixa concentração de Ca²⁺ no retículo endoplasmático poderia participar dessa modulação. Além disso, a captação de Ca²⁺ por algum canal, como o canal de cálcio do tipo L32^,33, poderia ser baixa na vasculatura do grupo St, uma vez que a CCE para Ca²⁺, em um meio sem Ca²⁺ e na presença de noradrenalina, mostrou-se atenuada nos anéis aórticos sem endotélio de ratos submetidos a estresse.

Conclusão

Nosso estudo auxilia a compreensão e identifica novos mediadores envolvidos na resposta vascular atenuada à noradrenalina em ratos submetidos ao estresse, sendo a liberação de NO e o fluxo de Ca²⁺ possíveis mediadores. Acreditamos que esses mediadores sejam positivamente ativados para contrabalançar os deletérios efeitos cardiovasculares causados por situações estressantes. No entanto, mais estudos são necessários para melhor entendermos a resposta adaptativa ao estresse crônico.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela Fapesp processo: 2009/03771-2.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Thiago Bruder do Nascimento pela Universidade do Estado de São Paulo.