Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia QNffMTM8QfhR78Xr5Yr9YRL S0066-782X2015000300004 00004 S0066-782X2014005040192 10.5935/abc.20140192 Original Articles Role of microRNAs 221/222 on Statin Induced Nitric Oxide Release in Human Endothelial Cells Cerda Alvaro 1 2 Fajardo Cristina Moreno 1 Basso Rodrigo Gouveia 1 Hirata Mario Hiroyuki 1 Hirata Rosario Dominguez Crespo 1 Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas SP Brasil Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Universidade de São Paulo, SP - Brasil Universidade de La Frontera Centro de Excelencia en Estudios Genéticos e Inmunológicos Centro de Biología Molecular y Farmacogenética Temuco Chile Centro de Biología Molecular y Farmacogenética - Centro de Excelencia en Estudios Genéticos e Inmunológicos - Universidade de La Frontera, Temuco - Chile Mailing Address: Alvaro Cerda, Av. Prof. Lineu Prestes 580 Bl 17, Butantã. Postal Code 05508-000, São Paulo, SP – Brazil. Email: alvarocerda@usp.br; tmalvarocerda@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research, analysis and interpretation of the data and critical revision of the manuscript for intellectual content: Cerda A, Hirata MH, Hirata RDC; acquisition of data: Cerda A, Moreno FC, Basso RG; statistical analysis and writing of the manuscript: Cerda A; obtaining financing: Cerda A, Hirata RDC.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 16 12 2014 03 2015 104 3 195 201 09 07 2014 01 09 2014 18 09 2014 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

Nitric oxide (NO) has been largely associated with cardiovascular protection through improvement of endothelial function. Recently, new evidence about modulation of NO release by microRNAs (miRs) has been reported, which could be involved with statin-dependent pleiotropic effects, including anti-inflammatory properties related to vascular endothelium function.

 Objective:

To evaluate the effects of cholesterol-lowering drugs including the inhibitors of cholesterol synthesis, atorvastatin and simvastatin, and the inhibitor of cholesterol absorption ezetimibe on NO release, NOS3 mRNA expression and miRs potentially involved in NO bioavailability.

 Methods:

Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were exposed to atorvastatin, simvastatin or ezetimibe (0 to 5.0 μM). Cells were submitted to total RNA extraction and relative quantification of NOS3 mRNA and miRs -221, -222 and -1303 by qPCR. NO release was measured in supernatants by ozone-chemiluminescence.

 Results:

Both statins increased NO levels and NOS3 mRNA expression but no influence was observed for ezetimibe treatment. Atorvastatin, simvastatin and ezetimibe down-regulated the expression of miR-221, whereas miR-222 was reduced only after the atorvastatin treatment. The magnitude of the reduction of miR-221 and miR-222 after treatment with statins correlated with the increment in NOS3 mRNA levels. No influence was observed on the miR-1303 expression after treatments.

 Conclusion:

NO release in endothelial cells is increased by statins but not by the inhibitor of cholesterol absorption, ezetimibe. Our results provide new evidence about the participation of regulatory miRs 221/222 on NO release induction mediated by statins. Although ezetimibe did not modulate NO levels, the down-regulation of miR-221 could involve potential effects on endothelial function.

 Nitric Oxide Cholesterol Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase Inhibitors Endothelial Cells microRNAs São Paulo Research Foundation 2010/15353-8 CAPES-Brazil CNPq-Brazil The present study was supported by the grant # 2010/15353-8, São Paulo Research Foundation (FAPESP), São Paulo, Brazil. A. Cerda is a recipient of a fellowship from CAPES-Brazil. R.G. Basso, M.H. Hirata and R.D.C. Hirata are recipients of fellowships from CNPq-Brazil. Introduction

Dyslipidemia is a key factor in the pathogenesis of atherosclerosis through the relationship of cholesterol excess with the lipid-composition of the plaque. Cholesterol contents are associated with the inflammatory process by modulating inflammatory cytokines, adhesion molecules and other molecules related to the endothelial function in early atherosclerosis1.

Nitric oxide (NO) has been largely associated with cardiovascular protection through improvement of the endothelial function2,3. Several mechanisms have been described to regulate the expression of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and NO release in the endothelium, including transcriptional and post-transcriptional regulation of the gene encoding eNOS (NOS3), as well as post-translational modifications4,5. Post-transcriptional regulation mediated by non-coding small RNAs has also demonstrated participation in this process and, in this way, new evidence about modulation of NO release by microRNAs (miRs) has been reported. An example of the miR-mediated regulation of NO release is observed for miRs-221/222 which have been related to lower NOS3 mRNA and reduced NO release in endothelial cells6.

Cholesterol-lowering therapies have been largely related with a reduced risk of cardiovascular diseases. Among them, statins are recognized as the main cholesterol-lowering drugs by reducing the cholesterol contents through the inhibition of the 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coA reductase (HMGCR), an enzyme with a key function in the endogenous biosynthesis of the cholesterol7. On the other hand, ezetimibe also reduces cholesterol contents by interacting with the Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), which results in a decreased cholesterol absorption8. In addition, a number of pleiotropic effects have been described for statin therapy, including anti-inflammatory properties related to the vascular endothelium function9. Molecular mechanisms involved in statin-related anti‑inflammatory effects and whether or not this depends on intracellular cholesterol reduction remains controversial.

Here, we analyzed the effects of cholesterol-lowering drugs including the inhibitors of cholesterol synthesis, atorvastatin and simvastatin, and the inhibitor of cholesterol absorption ezetimibe on NO release, NOS3 mRNA expression and their effects on the expression of miRs related to NOS3 mRNA modulation: miR-221, miR-222 as well as the miR-1303, a miR predicted to interact with NOS3 mRNA by bioinformatics tools.

 Methods Cell culture, treatments and cell viability analysis

Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 44 mmol/L sodium bicarbonate, 100 µg/mL streptomycin and 100 U/mL penicillin. Cells were grown at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2.

Cells at passage 4-8 were treated with atorvastatin (kindly provided by Pfizer Pharmaceuticals Ltd., Guarulhos, SP, Brazil), simvastatin (Sigma, St. Louis, MO, USA) or ezetimibe (kindly provided by Merck/Schering-Plough, NJ, USA). Atorvastatin was dissolved in methanol whereas simvastatin and ezetimibe were dissolved in ethanol. Simvastatin was activated by incubation with 0.1N NaOH solution at 50°C for 2 h, followed by neutralization at pH 7.0 and adjustment of the concentration to 5.6 mM. The final concentration of methanol or ethanol in the culture medium did not exceed 0.1% and 0.2%, respectively.

Toxicity of the drugs was evaluated by measuring the percentage of cells with a loss of membrane integrity and DNA fragmentation. Regarding membrane integrity, cells (5 x 105) were treated with each drug and the percentage of viable cells was determined by flow cytometry using propidium iodide solution (50 mg/mL in phosphate buffer saline), which intercalates with DNA and is unable to pass through intact membranes. For the DNA fragmentation assay, the percentage of fragmented DNA was detected by flow cytometry after cells (5 x 105) were incubated for 2 h with a hypotonic solution (0.1% sodium citrate and 0.1% Triton X-100) containing 50 mg/mL of propidium iodide.

Cells (numbering 10,000) were analysed in a FACSCanto II flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Red (propidium iodide) fluorescence was evaluated using a585 nm filter. Data were acquired and analyzed using the FACS/Cell Quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

HUVEC (1.0 x 106 cells/mL) were treated with atorvastatin, simvastatin or ezetimibe for 24 h. Cells were incubated for 6 h (18 h after starting drug treatment) with 10 ng/mL of human TNFα (Invitrogen – Life Technologies, CA, USA) in order to stimulate an inflammatory response simulating the chronic inflammation observed in early atherosclerosis. After incubations, supernatants of cell cultures were separated and cells were submitted to RNA extraction.

 Nitric oxide measurement

NO concentration in supernatants from HUVEC treated with cholesterol-lowering drugs was determined by ozone-chemiluminescence using the Sievers NO Analyzer 280 (GE Analytical instruments, CO, USA).

 Total RNA isolation

RNA extraction from HUVEC was performed using the mirVvana miRNA isolation kit (Ambion Inc., TX, USA), which separates total RNA including miRNA fraction, following the manufacturer's suggested protocol. RNA concentration was measured by spectrophotometry using NanoDrop ® (NanoDrop Technologies INC., DE, USA) and RNA integrity was further evaluated using the Bioanalyzer®2100 (Agilent Technologies, CA, USA). Samples with RNA integrity number (RIN) lower than 5 were not used for mRNA experiments.

<italic>NOS3</italic> mRNA quantification

cDNA for NOS3 (NM_000603.4) relative quantification was produced from 1 μg of total RNA with Superscript™ II Reverse Transcriptase (Life Technologies, CA, USA). NOS3 mRNA expression was measured by quantitative real-time PCR (qPCR) using the SYBR® Green system. The sequences of primers for NOS3 transcript are described as follows: forward, 5'-TCCCCGGGTCCTGTGTATG-3'; and reverse, 5'-TCCATCAGGGCAGCTGCAAA-3'. The qPCR assays were carried out in 96-well plates using a 7500 Fast Real-Time PCR system (Life Technologies, CA, USA).

Six reference genes [ubiquitin C (UBC), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD), beta-2-microglobulin (B2M), hypoxanthine phosphoribosyl-transferase I (HPRTI), succinate dehydrogenase complex, subunit A (SDHA) and hydroxymethyl-bilane synthase (HMBS)] were tested and analyzed using the geNorm software10, in order to choose the gene with lower variability for our cellular model under each experimental condition.The most stable gene in experimental conditions was HMBS, and the sequences of primers used for this endogenous gene are described as follows: forward, 5'-GGCAATGCGGCTGCAA-3'; and reverse, 5'-GGGTACCCACGCGAATCAC-3'.

All samples were assayed in duplicate. The relative quantification of gene expression was analyzed using the comparative Ct method using the formula 2-ΔΔCt 11 using cells treated with the vehicle stimulated for 6 h of TNFα (10 ng/mL) as a calibrator.

 microRNA analysis

miR-221 and miR-222 (MI00000298 and MI00000299, respectively) were selected from previous reports from the literature whereas miR-1303 (MI0006370) was chosen using bioinformatics tools. Predictive analysis using TargetScan (www.targetscan.org) showed that miR-1303 is a conserved miR with a high score for mRNA-miR interaction (context score percentile: 99) and this prediction was further confirmed using the miRNA target prediction databases miRDB (www.mirdb.org) and Target Miner (www.isical.ac.in/~bioinfo_miu).

miR relative quantification was performed by stem loop TaqMan® RT-qPCR (Life Technologies, CA, USA). Specific stem loop primers were used to synthetize the cDNA from 10 ng of total RNA using the micro-RNA transcription kit (Life Technologies, CA, USA). Predesigned assays were purchased from Life Technologies to perform the relative quantification using the RNU24 as an endogenous reference. RNU24 was selected as the most stable endogenous reference among 4 small nucleolar RNAs (RNU24, RNU6B, RNU58, RNU44), which were evaluated by using the geNorm software10.

 Statistical analysis

Statistical analyses were performed using Prism v.5.0 for Windows (Graph Pad Software Inc., CA, USA) and SPSS v.15 for Windows (SPSS Inc., Madrid, Spain). Data are presented as mean ± SEM and differences among means were tested by one-way ANOVA followed by the Tukey post-test comparing each treatment with control. Statistical significance was set for p < 0.05.

 Results

After 24h of treatment with statins, HUVEC had increased loss of membrane integrity (11% and 12% for atorvastatin and simvastatin, respectively) and increased DNA fragmentation (31% and 28% for atorvastatin and simvastatin, respectively) when using concentrations equal or higher than 10 µM. Cell viability was not affected by any treatment – atorvastatin, simvastatin or ezetimibe – after 24 h exposure with up to 5 µM of each drug (data not shown).

Stimulation of inflammatory response by TNFα did not modify NOS3 mRNA expression or NO release in endothelial cells, as observed in Figures 1 and 2, respectively. Atorvastatin and simvastatin increased NOS3 mRNA at 5 µM after 24h (p < 0.05), whereas no effect on NOS3 mRNA was observed for ezetimibe (Figure 1). Both statins induced the release of NO from HUVEC when incubated for 24 h with 5 µM (p < 0.05) whereas ezetimibe did not modify the NO concentration in supernatants (Figure 2).

Influence of atorvastatin, simvastatin and ezetimibe on NOS3 mRNA expression in HUVEC. Columns and error bars represents mean and SEM and were compared with the vehicle control stimulated with TNFα [(0 tnf); dotted line)] by one-way ANOVA followed by Tukey post-test. HUVEC were treated for 24 h and stimulated with human TNFα (10 ng/mL) 6 h before RNA extraction. Data were obtained from 4-6 independent experiments and mRNA expression was calculated using the comparative Ct method using the HMBS as endogenous reference. (*), p < 0.05. Influence of atorvastatin, simvastatin and ezetimibe on nitric oxide release in HUVEC. Columns and error bars represent mean and SEM and were compared by one-way ANOVA followed by Tukey post-test. HUVEC cells were treated for 24 h and stimulated with human TNFα [10 ng/mL; 0(tnf)] 6 h before supernatant isolation for NO measurements. Data were obtained from 5 independent experiments and NO was measured by ozone-chemiluminescence. (*), p < 0.05.

The effects of atorvastatin, simvastatin and ezetimibe on the expression of miR-221, miR-222 and the miR-1303 are shown in Figure 3. Atorvastatin reduced the expression of miR-221 at 1 and 5 µM and the expression of the miR-222 at 5 µM. Simvastatin down-regulated only miR-221 at 5 µM after 24 h of treatment whereas ezetimibe also reduced the expression of miR-221 at 5 µM. Moreover, the variation of miR-221 after 5 µM treatment with atorvastatin and simvastatin correlated negatively with NOS3 mRNA expression (r2: -0.989 and 0.915 for atorvastatin and simvastatin, respectively; p < 0.05; data not shown). The magnitude of the variation of NOS3 also correlated negatively with miR-222 change after statin treatment (r2: -0.992 and 0.890 for atorvastatin and simvastatin, respectively; p < 0.05; data not shown). On the other hand, miR-1303 did not show statistical differences after any treatment.

Influence of atorvastatin, simvastatin and ezetimibe on expressions of miR-221, miR-222 and miR-1303 in HUVEC. Columns and error bars represent mean and SEM and were compared with the vehicle control stimulated with TNFα (0 tnf; dotted line) by one-way ANOVA followed by Tukey post-test. HUVEC were treated for 24 h and stimulated with human TNFα (10 ng/mL) 6 h before RNA extraction. Data were obtained from 4 independent experiments and mRNA expression was calculated using the comparative Ct method using the RNU24 as endogenous reference. (*), p < 0.05.< Discussion

In this study, the inhibition of cholesterol synthesis by statins, but not the inhibition of cholesterol absorption by ezetimibe, modulated the NO release in endothelial cells. Our results showed a correlation between NOS3 mRNA expression and NO release in HUVEC treated with statins, as previously observed in cultured endothelial cells exposed to fluvastatin treatment12. Moreover, previous works have also suggested that the regulation of eNOS and the NO release by statins is also dependent on posttranslational modifications. For example, Aoki et al. reported that, besides the NOS3 mRNA up-regulation, fluvastatin also modified the phosphorylation pattern of endothelial cells12. A similar posttranslational modification was observed in isolated rat arteries treated with simvastatin13, which also caused an enhanced phosphorylation of eNOS at the Ser 1177 through regulation of the PKB/Akt, a process that leads to a higher enzyme activity and increased NO release14.

The modulation of NO by statins has been proposed as a central mechanism by which these drugs can exert their anti‑inflammatory effects on the vascular endothelium. Due to this hypothesis, previous works using an animal model knockout for NOS3 have been performed to evaluate whether pleiotropic effects of statins are dependent on eNOS modulation. Atorvastatin did not reduce NFκB activation or infarct size in eNOS-/- mice undergoing coronary artery occlusion as compared with wild-type mice15. Similarly, rosuvastatin failed to attenuate the leucocyte-endothelium interactions in peri-intestinal venules of eNOS-/- mice16. These data suggest that anti-inflammatory effects observed for statins require the release of NO by the vascular endothelium; however recent data have shown that anti-inflammatory effects of statins were also present in eNOS deficient animals, as in eNOS-/- mice treated with atorvastatin that had similar platelet activation compared with wild-type mice17.

Despite the controversial results about the role of eNOS in statins-induced anti-inflammatory effects, it is indubitable that an increased release of NO in the vascular endothelium by these or other treatments will be beneficial in reducing the risk of cardiovascular diseases. The emergence of new molecular mechanisms regulating the gene expression of NOS3 and the release of NO, as the posttranscriptional regulation by miRs, are very interesting for the understanding of this process and for exploring new therapeutic targets.

Here, we evaluated the effect of statins – atorvastatin and simvastatin – as well as the effect of the cholesterol absorption inhibitor ezetimibe on the expression of miR‑221, miR-222 and miR-1303. Atorvastatin reduced the expression of miR‑221 and miR-222, whereas simvastatin down-regulated only miR-221. Interestingly, ezetimibe also reduced the expression of miR-221 showing that the expression of this miR could be dependent on the regulation of intracellular cholesterol, regardless of the mechanism by which cholesterol content is modulated. On the other hand, none of the treatments modified the expression of the miR-1303, demonstrating that the modulation of NOS3 and release of NO by statins are not dependent on this miR, although a miR:mRNA interaction was predicted by bioinformatics tools. A limitation of our study is that we focused only on the effects of cholesterol-lowering therapies on the proposed miRNA‑mediated NO modulation and we did not evaluate the effects of the drugs on eNOS protein level or its posttranscriptional modifications. Here, we propose a mechanism by which statins contribute to the modulation of NO release in vascular endothelium. However, this mechanism should be considered one of a number of actions mediated by statins to improve endothelial function.

The miRs -221 and -222 have demonstrated their participation in the progression of cardiovascular diseases18, as observed in rat carotid artery lesions after angioplasty in which their expression was increased19. In the same way, miR-221 and miR-222 were increased in endothelial progenitor cells from patients with coronary artery disease (CAD) and in those patients, 12 months of treatment with atorvastatin, but not with pravastatin, diminished the expression of miRs-221/22220. Those results are in agreement with the reduction of these miRs mediated by statins in our study.

Endothelial cells transfected with miRs-221/222 showed a reduction in both eNOS protein level and release of NO21. However, the direct mechanism by which these miRs may exert that effect is unknown because there is no target region for miRs-221/222 in the NOS3 mRNA molecule generating a mRNA:miR interaction according to the predictive analysis by bioinformatics tools. Therefore, it is important to highlight that the modulation of eNOS by miRs-221/222 lacks a molecular explanation, although it was demonstrated empirically. On the other hand, Liu et al. proposed that miRs-221/222 might modulate the proliferation of smooth muscle cells in the endothelium by targeting p27 (Kip1) and p57 (Kip2)19 However, no relation of miRs-221/222 with NOS3 modulation and NO release was related in that work.

An important extension of our work was the evaluation of the effect on the expression of the studied miRs of a non‑statin cholesterol-lowering drug, the ezetimibe. Although most beneficial effects of ezetimibe in humans relate to its capacity to reduce cholesterol absorption in the intestine, the influence of this drug in other tissues, as the vascular endothelium, is an important issue to be investigated. In this way, the reduction of the expression of miR-221 could be considered an important indicator of possible pleiotropic effects of the ezetimibe therapy. A recent study also evaluated the effect of ezetimibe in an extra‑intestinal tissue and showed that the ezetimibe inhibited the PMA-induced monocyte to macrophage differentiation, and the authors suggested that one of the mechanisms involved in the process could be the regulation of the miRs -155, -222, -424 and -503 by the ezetimibe in that cellular model22. Although miR-222 expression was not modified by ezetimibe in our work, the differences in the cellular models should be considered in this divergence. Moreover, the reduction of isoprenoids synthesis by statins – described as the main mechanism by which these drugs could exert their anti-inflammatory effects9 - could also influence the differences observed between inhibitors of synthesis and absorption of cholesterol on endothelial NO modulation observed in this study. On the other hand, the observed reduction of miR-221 without an increment of NO release by ezetimibe led us to think that the reduction of this miR is not necessarily the only mechanism modulating the NO pathway. However, it is feasible to propose that using ezetimibe in a combination therapy with a statin could result in more benefits regarding endothelial function; however other studies are needed to elucidate this hypothesis.

 Conclusion

Statin-induced down-regulation of miRs-221/222 is a new potential pathway by which the cholesterol-lowering treatment may exert its beneficial effects on NO release in human endothelium. Moreover, the observed reduction of miR-221 by ezetimibe should be investigated in the future as a potential contribution of this drug in endothelial function when used in a combination therapy.

Sources of Funding

This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Alvaro Cerda, from Universidade de São Paulo.

 Acknowledgements

The present study was supported by the grant # 2010/15353-8, São Paulo Research Foundation (FAPESP), São Paulo, Brazil. A. Cerda is a recipient of a fellowship from CAPES-Brazil. R.G. Basso, M.H. Hirata and R.D.C. Hirata are recipients of fellowships from CNPq-Brazil.

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Muñoz-Pacheco P Ortega-Hernández A Miana M Cachofeiro V Fernández-Cruz A Gómez-Garre D Ezetimibe inhibits PMAinduced monocyte/macrophage differentiation by altering microRNA expression: a novel anti-atherosclerotic mechanism Pharmacol Res 2012 66 6 536 543 Papel dos microRNAs 221/222 na Liberação de Óxido Nítrico Induzida por Estatinas em Células Endoteliais Humanas Cerda Alvaro 1 2 Fajardo Cristina Moreno 1 Basso Rodrigo Gouveia 1 Hirata Mario Hiroyuki 1 Hirata Rosario Dominguez Crespo 1 Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas SP Brasil Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - Universidade de São Paulo, SP - Brasil Universidade de La Frontera Centro de Excelencia en Estudios Genéticos e Inmunológicos Biología Molecular y Farmacogenética Temuco Chile Biología Molecular y Farmacogenética - Centro de Excelencia en Estudios Genéticos e Inmunológicos - Universidade de La Frontera, Temuco - Chile Correspondência: Alvaro Cerda, Av. Prof. Lineu Prestes, 580 Bl. 17, Butantã. CEP 05508-000, São Paulo, SP – Brasil. E-mail: alvarocerda@usp.br; tmalvarocerda@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa, análise e interpretação dos dados e revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Cerda A, Hirata MH, Hirata RDC; obtenção de dados: Cerda A, Moreno FC, Basso RG; Análise estatística e redação do manuscrito: Cerda A; obtenção de financiamento: Cerda A, Hirata RDC.

Potencial conflito de interesse

Não há potenciais conflitos de interesse relevantes reportados para este artigo.

 Fundamento:

O óxido nítrico (NO) tem sido amplamente associado com proteção cardiovascular através de melhoria da função endotelial. Recentemente, novas evidências sobre a modulação do NO na liberação de microRNAs (miRs) têm sido relatadas, o que poderia estar envolvido com efeitos pleiotrópicos dependentes de estatinas, incluindo propriedades anti-inflamatórias relacionadas com a função do endotélio vascular.

 Objetivo:

Avaliar os efeitos dos medicamentos redutores de colesterol, incluindo os inibidores da síntese de colesterol, atorvastatina e sinvastatina, e o inibidor da absorção de colesterol, ezetimiba, na liberação de NO, expressão do mRNA do NOS3 e miRs potencialmente envolvidos na biodisponibilidade do NO.

 Métodos:

Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram expostas à atorvastatina, sinvastatina ou ezetimiba (0 a 5,0 μM). As células foram submetidas à extração do RNA total e quantificação relativa de mRNA do NOS3 e dos miRs-221,-222 e -1303 por qPCR. A liberação de NO foi medida em sobrenadantes por ozônio-quimioluminescência.

 Resultados:

Ambas as estatinas aumentaram os níveis de NO e a expressão do mRNA do NOS3, mas nenhum efeito foi observado em relação ao tratamento com ezetimiba. A atorvastatina, sinvastatina e ezetimiba regularam negativamente a expressão do miR-221, enquanto que o miR-222 reduziu somente após o tratamento com atorvastatina. A magnitude da redução de miR-221 e miR-222 após tratamento com estatinas correlacionou com o incremento nos níveis de mRNA do NOS3. Nenhuma influência foi observada sobre a expressão do miR-1303 após os tratamentos.

 Conclusão:

A liberação de NO pelas células endoteliais é aumentada por estatinas, mas não pelo inibidor da absorção de colesterol ezetimiba. Nossos resultados fornecem novas evidências sobre a participação dos miRs regulatórios 221/222 na liberação de NO mediada por estatinas. Embora a ezetimiba não tenha modulado os níveis de NO, a regulação negativa do miR-221 poderia envolver efeitos potenciais sobre a função endotelial.

 Óxido Nítrico Colesterol Inibidores de Hidroximetilglutaril-CoA Redutases Células Endoteliais microRNAs Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 15353/2010-8 CAPES-Brasil CNPq-Brasil O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Projeto no. 15353/2010-8), São Paulo, Brasil. A. Cerda é beneficiário de uma bolsa da CAPES-Brasil. R.G. Basso, M.H. Hirata e R.D.C. Hirata são beneficiários de bolsas do CNPq-Brasil. Introdução

A dislipidemia é um fator-chave na patogênese da aterosclerose através da relação entre o excesso de colesterol e a composição de lipídios da placa. O conteúdo de colesterol está associado com o processo inflamatório através da modulação de citocinas inflamatórias, moléculas de adesão e outras moléculas relacionadas com a função endotelial na aterosclerose precoce1.

O óxido nítrico (NO) tem sido amplamente associado com proteção cardiovascular através da melhoria da função endotelial2,3. Vários mecanismos têm sido descritos como reguladores da expressão da sintase do oxido nítrico endoletial (eNOS) e liberação de NO no endotélio, incluindo a regulação transcricional e pós-transcricional do gene que codifica a eNOS (NOS3), assim como modificações pós‑translacionais4,5. A regulação pós-transcricional mediada por pequenos RNAs não codificantes demonstrou também ter participação neste processo e, desta forma, novas evidências sobre a modulação do NO por micro-RNAs (miRs) têm sido relatadas. Um exemplo de regulação de NO mediada por miRs é observado com os miRs-221/222 que foram relacionados à redução do mRNA do NOS3 e redução da liberação do NO pelas células endoteliais6.

Terapias para reduzir o colesterol têm sido em grande parte relacionadas com redução do risco de doenças cardiovasculares. Entre elas, as estatinas são reconhecidas como os principais medicamentos para reduzir o colesterol, diminuindo o conteúdo de colesterol através da inibição da 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA redutase (HMG-CoA redutase), uma enzima com função-chave na biossíntese do colesterol endógeno7. Por outro lado, a ezetimiba também reduz o conteúdo de colesterol interagindo com o Niemann‑Pick C1–like 1 (NPC1L1), o que resulta em uma absorção reduzida de colesterol8. Além disto, uma série de efeitos pleiotrópicos foram descritos com a terapia com estatina, incluindo propriedades anti-inflamatórias relacionadas com a função do endotélio vascular9. Os mecanismos moleculares envolvidos nos efeitos anti-inflamatórios da estatina, e se estes são dependentes da redução do colesterol intracelular, são fatos ainda controversos.

Neste estudo, nós analisamos os efeitos dos medicamentos redutores de colesterol, incluindo os inibidores da síntese do colesterol, atorvastatina e sinvastatina, e do inibidor da absorção do colesterol ezetimiba na liberação de NO, expressão do mRNA do NOS3 e seus efeitos sobre a expressão de miRs relacionados com a modulação do mRNA do NOS3: miR-221, miR-222, bem como o miR-1303, um miR previsto por ferramentas de que tem interação com o mRNA do NOS3.

 Métodos Cultura de células, tratamentos e análise da viabilidade celular

Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 44 mmol/L de bicarbonato de sódio, 100 µg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina. As células foram cultivadas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.

Entre a quarta e a oitava passagem, as células foram tratadas com atorvastatina (gentilmente fornecida pela Pfizer Pharmaceuticals Ltd., Guarulhos, SP, Brasil), sinvastatina (Sigma, St Louis, MO, EUA) ou ezetimiba (gentilmente cedida pela Merck/Schering-Plough, NJ, EUA). A atorvastatina foi dissolvida em metanol, enquanto que a sinvastatina e a ezetimiba foram dissolvidas em etanol. A sinvastatina foi ativada pela incubação com 0.1N de solução de NaOH a 50°C durante 2 h, seguida de neutralização em pH 7,0 e ajuste da concentração para 5,6 mM. A concentração final de metanol ou etanol no meio de cultura não excedeu 0,1% e 0,2%, respectivamente.

A toxicidade dos medicamentos foi avaliada pela medida da porcentagem de células com perda de integridade de membrana e fragmentação de DNA. Sobre a integridade de membrana, as células (5 x 105) foram tratadas com cada medicamento e a porcentagem de células viáveis foi determinada por citometria de fluxo utilizando solução de iodeto de propídio (50 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato), que intercala com o DNA e é incapaz de passar através de membranas intactas. Para o ensaio de fragmentação de DNA, a porcentagem de DNA fragmentado foi detectada por citometria de fluxo após as células (5 x 105) serem incubadas durante 2 h com uma solução hipotônica (citrato de sódio a 0,1% e Triton X-100 a 0,1%) contendo 50 mg/mL de iodeto de propídio.

Células (em número de 10.000) foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCanto II, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). A fluorescência vermelha (iodeto de propídio) foi avaliada usando filtro a585 nm. Os dados foram adquiridos e analisados com o software FACS/Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA).

HUVEC (1,0 x 106 células/mL) foram tratadas com atorvastatina, sinvastatina ou ezetimiba por 24 h. As células foram incubadas durante 6 h (18 h após o início do tratamento com os medicamentos) com 10 ng/mL de TNFα humano (Invitrogen – Life Technologies, CA, EUA) para estimular uma resposta inflamatória, simulando a inflamação crônica observada na aterosclerose precoce. Após incubações, sobrenadantes das culturas celulares foram separados e as células foram submetidas à extração do RNA.

 Medição do óxido nítrico

A concentração de NO no sobrenadante de HUVEC tratadas com medicamentos para redução do colesterol foi determinada por ozônio-quimioluminescência usando o Sievers NO Analyzer 280 (GE Analytical Instruments, CO, EUA).

 Isolamento de RNA total

A extração do RNA das HUVEC foi realizada utilizando o kit de isolamento mirVana miRNA (Ambion Inc., TX, EUA), que separa o RNA total, incluindo a fração de miRNA, de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A concentração de RNA foi medida por espectrofotometria usando NanoDrop® (NanoDrop Technologies Inc., DE, EUA) e a integridade do RNA foi ainda avaliada usando o Bioanalyzer®2100 (Agilent Technologies, CA, EUA). Amostras com número de integridade do RNA (NIR) inferior a 5 não foram utilizadas para os experimentos com mRNA.

 Quantificação do mRNA do <italic>NOS3</italic>

O cDNA para a quantificação relativa do NOS3 (NM_000603.4) foi produzido a partir de 1 μg de RNA total com Superscript™ II Reverse Transcriptase (Life Technologies, CA, EUA). A expressão do mRNA do NOS3 foi medida por PCR quantitativo (qPCR) em tempo real usando o sistema SYBR® Green. As sequências de iniciadores para transcrição de NOS3 são descritos da seguinte forma: direto, 5'-TCCCCGGGTCCTGTGTATG-3'; e reverso, 5'-TCCATCAGGGCAGCTGCAAA-3'. Os ensaios de qPCR foram realizados em placas de 96 poços com o 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies, CA, EUA).

Seis genes de referência [ubiquitina C (UBC), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPD), beta-2-microglobulina (B2M), hipoxantina fosforibosil transferase I (HPRTI), subunidade A do complexo desidrogenase succinato (SDHA) e hidroximetilbilano sintase (HMBS)] foram testados e analisados com o software geNorm10 para a escolha do gene com menor variabilidade para nosso modelo celular sob cada condição experimental. O gene mais estável nas condições experimentais foi o HMBS, e as sequências de primers utilizadas para este gene endógeno foram as seguintes: direto, 5'-GGCAATGCGGCTGCAA-3'; e reverso, 5'-GGGTACCCACGCGAATCAC-3'.

Todas as amostras foram analisadas em duplicata. A quantificação relativa da expressão gênica foi analisada com o método comparativo Ct usando a fórmula 2-ΔΔCt 11 em células tratadas com o veículo estimulado por 6 horas com TNFα (10 ng/mL) como calibrador.

 Análise dos microRNAs

Os miR-221 e miR-222 (MI00000298 e MI00000299, respectivamente) foram selecionados de relatos anteriores da literatura, enquanto que o miR-1303 (MI0006370) foi escolhido usando ferramentas de bioinformática. A análise preditiva usando TargetScan (www.targetscan.org) mostrou que o miR-1303 é um miR conservado com um elevado score para a interação mRNA-miR (percentil do context score: 99) e esta previsão foi adicionalmente confirmada usando os bancos de dados para predição do miRNA alvo, miRDB (www.mirdb.org) e Target Miner (www.isical.ac.in/~bioinfo_miu).

A quantificação relativa de miR foi realizada por stem loop TaqMan ® RT-qPCR (Life Technologies, CA, EUA). Primers stem loop específicos foram utilizados para sintetizar o cDNA a partir de 10 ng de RNA total utilizando o kit de transcrição de micro-RNA (Life Technologies, CA, EUA). Ensaios pré-desenhados foram adquiridos da Life Technologies para realizar a quantificação relativa usando o RNU24 como referência endógena. O RNU24 foi selecionado como a referência endógena mais estável entre 4 pequenos RNAs nucleolares (RNU24, RNU6B, RNU58, RNU44), que foram avaliados usando o software geNorm10.

 Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas com a utilização do Prism v5.0 para Windows (Graph Pad Software Inc., CA, EUA) e SPSS v. 15 para Windows (SPSS Inc., Madrid, Espanha). Os dados são apresentados como média ± EPM, e as diferenças entre as médias foram testadas por ANOVA unidirecional seguida pelo pós-teste de Tukey comparando cada tratamento com controle. O nível de significância estatística foi definido para p < 0,05.

 Resultados

Após 24 horas de tratamento com estatinas, as HUVEC apresentaram aumento na perda de integridade da membrana (11% e 12% para a atorvastatina e sinvastatina, respectivamente) e aumento na fragmentação de DNA (31% e 28% para a atorvastatina e sinvastatina, respectivamente) em concentrações iguais ou acima de 10 µM. A viabilidade celular não foi afetada por qualquer tratamento – atorvastatina, sinvastatina ou ezetimiba – após a exposição por 24 h de até 5 µM de cada medicamento (dados não mostrados).

A estimulação da resposta inflamatória pelo TNFα não modificou a expressão do mRNA do NOS3 ou a liberação de NO pelas células endoteliais, como observado nas Figuras 1 e 2, respectivamente. A atorvastatina e a sinvastatina aumentaram o mRNA do NOS3 a 5 µM após 24 h (p < 0,05), enquanto que nenhum efeito no mRNA do NOS3 foi observado para a ezetimiba (Figura 1). Ambas as estatinas induziram a liberação de NO das HUVEC quando incubadas durante 24 h com 5 µM (p < 0,05), enquanto que a ezetimiba não modificou a concentração de NO no sobrenadante (Figura 2).

Influência da atorvastatina, sinvastatina e ezetimiba na expressão do mRNA do NOS3 em HUVEC. As colunas e barras de erro representam a média e o EPM e foram comparadas com o veículo de controle estimulado com TNFα [(0 tnf); linha pontilhada)] por ANOVA unidirecional seguida do pós-teste de Tukey. As HUVEC foram tratadas durante 24 h e estimuladas com TNFα humano (10 ng/mL) 6 h antes da extração do RNA. Os dados foram obtidos de 4-6 experimentos independentes e a expressão do mRNA foi calculada usando o método do Ct comparativo utilizando-se o HMBS como referência endógena. (*), p < 0,05. Influência da atorvastatina, sinvastatina e ezetimiba na liberação de NO em HUVEC. As colunas e barras de erro representam a média e EPM e foram comparadas por ANOVA unidirecional seguida do pós-teste de Tukey. As células HUVEC foram tratadas durante 24 h e estimuladas com TNFα humano [10 ng/mL; 0(tnf)] 6 h antes do isolamento do sobrenadante para medida do NO. Os dados foram obtidos a partir de 5 experimentos independentes e o NO foi medido por ozônio-quimioluminescência. (*), p < 0,05.

Os efeitos da atorvastatina, sinvastatina e ezetimiba na expressão de miR-221, miR-222 e miR-1303 são mostrados na Figura 3. A atorvastatina reduziu a expressão do miR-221 em concentrações de 1 e 5 µM e a expressão do miR-222 a 5 µM. A sinvastatina regulou negativamente somente o miR-221 a 5 µM após 24 h de tratamento, enquanto que a ezetimiba também reduziu a expressão do miR-221 a 5 µM. Além disto, a variação do miR-221 após o tratamento com 5 µM de atorvastatina e sinvastatina correlacionou negativamente com a expressão do mRNA do NOS3 (r2: -0,989 e 0,915 para atorvastatina e sinvastatina, respectivamente; p < 0,05; dados não apresentados). A magnitude da variação do NOS3 também correlacionou negativamente com a mudança do miR-222 após tratamento com estatina (r2: -0,992 e 0,890 para atorvastatina e sinvastatina, respectivamente; p < 0,05; dados não apresentados). Por outro lado, o miR-1303 não mostrou diferenças estatísticas após qualquer um dos tratamentos.

Influência da atorvastatina, sinvastatina e ezetimiba na expressão do miR-221, miR-222 e miR-1303 em HUVEC. As colunas e barras de erro representam a média e o EPM e foram comparadas com o veículo de controle estimulado com TNFα (0 tnf; linha pontilhada) por ANOVA unidirecional seguida do pós-teste de Tukey. As HUVEC foram tratadas durante 24 h e estimuladas com TNFα humano (10 ng/mL) 6 h antes da extração do RNA. Os dados foram obtidos a partir de 4 experimentos independentes e a expressão do mRNA foi calculada com o método do Ct comparativo utilizando-se o RNU24 como referência endógena. (*), p < 0,05. Discussão

Neste estudo, a inibição da síntese do colesterol por estatinas, mas não a inibição da absorção do colesterol pela ezetimiba, modulou a liberação de NO pelas células endoteliais. Os nossos resultados mostram uma correlação entre a expressão do mRNA do NOS3 e a liberação de NO por HUVEC tratadas com estatinas, como observado anteriormente em culturas de células endoteliais expostas ao tratamento com fluvastatina12. Além disto, estudos anteriores também sugeriram que a regulação da eNOS e a liberação de NO por estatinas também são dependentes de modificações pós-translacionais. Por exemplo, Aoki e cols.12 mostraram que além da regulação positiva do mRNA do NOS3, a fluvastatina também modifica o padrão de fosforilação das células endoteliais. Uma modificação pós-translacional semelhante foi observada em artérias isoladas de ratos tratados com sinvastatina13, o que também causou um aumento na fosforilação da eNOS na Ser 1177 através da regulação da PKB/Akt, processo que leva a um aumento na atividade enzimática e aumento na liberação de NO14.

A modulação do NO por estatinas foi proposta como um mecanismo central pelo qual estes medicamentos podem exercer seus efeitos anti-inflamatórios no endotélio vascular. Devido a esta hipótese, estudos anteriores usando um modelo animal nocaute para o NOS3 foram realizados para avaliar se os efeitos pleiotrópicos das estatinas são dependentes da modulação da eNOS. A atorvastatina não reduziu a ativação NFκB ou o tamanho do infarto em camundongos eNOS-/- submetidos à oclusão da artéria coronária em comparação a camundongos do tipo selvagem15. De maneira semelhante, a rosuvastatina não atenuou as interações leucócito-endotélio em vênulas peri-intestinais de camundongos eNOS-/- 16. Estes dados sugerem que os efeitos anti-inflamatórios observados com as estatinas exigem a liberação de NO pelo endotélio vascular; no entanto, dados recentes mostraram que os efeitos anti-inflamatórios das estatinas estavam também presentes em animais eNOS deficientes, assim como em camundongos eNOS-/- tratados com atorvastatina que apresentaram ativação plaquetária semelhante à de camundongos do tipo selvagem17.

Apesar dos resultados controversos sobre o papel da eNOS nos efeitos anti-inflamatórios induzidos por estatinas, é indubitável que uma liberação aumentada de NO no endotélio vascular por estes ou outros tratamentos é benéfica na redução do risco de doenças cardiovasculares. O surgimento de novos mecanismos moleculares de regulação da expressão de mRNA do NOS3 e a liberação do NO, como a regulação pós-transcricional por miRs, são muito interessantes para a compreensão deste processo e exploração de novos alvos terapêuticos.

Neste estudo, nós avaliamos o efeito das estatinas – atorvastatina e sinvastatina – bem como do inibidor de absorção de colesterol ezetimiba sobre a expressão de miR-221, miR-222 e miR-1303. A atorvastatina reduziu a expressão do miR-221 e miR-222, enquanto que a sinvastatina regulou negativamente somente o miR-221. Curiosamente, a ezetimiba também reduziu a expressão do miR-221, mostrando que a expressão deste miR poderia ser dependente da regulação do colesterol intracelular, independentemente do mecanismo pelo qual o conteúdo de colesterol é modulado. Por outro lado, nenhum dos tratamentos modificou a expressão do miR-1303, demonstrando que a modulação do NOS3 e liberação de NO por estatinas não são dependentes deste miR, embora uma interação miR:mRNA tenha sido prevista pelas ferramentas de bioinformática. Uma limitação do nosso estudo é que nós focamos apenas sobre os efeitos das terapias para redução do colesterol na modulação do NO mediada por miRNA e não avaliamos os efeitos dos medicamentos sobre o nível de proteína eNOS ou suas modificações pós‑transcricionais. Propomos aqui um mecanismo pelo qual as estatinas contribuem para a modulação da liberação do NO no endotélio vascular. No entanto, este mecanismo deve ser considerado um de uma série de ações mediadas por estatinas para melhorar a função endotelial.

Os miRs-221 e -222 têm demonstrado participação na progressão das doenças cardiovasculares18, como observado em lesões da artéria carótida de rato após angioplastia nas quais sua expressão aumentou19. Da mesma forma, os miRs‑221/222 aumentaram em células progenitoras endoteliais de pacientes com doença arterial coronariana (DAC), e em pacientes com 12 meses de tratamento com atorvastatina mas não com pravastatina, diminuiu a expressão de miRs-221/22220. Estes resultados estão de acordo com a redução destes miRs mediada por estatinas em nosso estudo.

Células endoteliais transfectadas com miRs-221/222 mostraram uma redução no nível de proteína eNOS e liberação de NO21. No entanto, o mecanismo direto pelo qual estes miRs podem exercer este efeito é desconhecido, porque não há nenhuma região-alvo para miRs-221/222 na molécula de mRNA do NOS3, gerando uma interação de mRNA:miR de acordo com a análise preditiva pela ferramentas de bioinformática. Portanto, é importante destacar que a modulação da eNOS pelos miRs-221/222 carece de uma explicação molecular, embora tenha sido demonstrada empiricamente. Por outro lado, Liu e cols. propuseram que os miRs-221/222 poderiam modular a proliferação de células de músculo liso no endotélio por visar a p27 (Kip1) e a p57 (Kip2)19. No entanto, nenhuma relação entre os miRs-221/222 com a modulação do NOS3 e liberação de NO foi relatada naquele estudo.

Uma importante extensão do nosso trabalho foi a avaliação do efeito sobre a expressão dos miRs estudados por um medicamento redutor de colesterol não estatina, a ezetimiba. Embora a maioria dos efeitos benéficos da ezetimiba em humanos se relacionem à sua capacidade de reduzir a absorção de colesterol no intestino, a influência desta droga em outros tecidos como o endotélio vascular é uma questão importante a ser investigada. Desta forma, a redução da expressão do miR-221 poderia ser considerada um importante indicador de possíveis efeitos pleiotrópicos da terapia com ezetimiba. Um estudo recente também avaliou o efeito da ezetimiba em um tecido extra-intestinal e mostrou que a ezetimiba inibe a diferenciação de monócito a macrófago induzida por PMA, e os autores sugeriram que um dos mecanismos envolvidos neste processo poderia ser a regulação dos miRs -155,-222,-424 e-503 pela ezetimiba neste modelo celular22. Embora a expressão do miR-222 não tenha sido modificada pela ezetimiba em nosso trabalho, as diferenças nos modelos celulares devem ser consideradas nesta divergência. Além disto, a redução da síntese de isoprenoides por estatinas – descritas como o principal mecanismo pelo qual estes medicamentos poderiam exercer seus efeitos anti-inflamatórios9 – poderia também influenciar as diferenças observadas entre os inibidores da síntese e absorção de colesterol na modulação do NO endotelial observada neste estudo. Por outro lado, a redução observada do miR-221 sem um incremento na liberação de NO pela ezetimiba levou-nos a pensar que a redução deste miR não é necessariamente o único mecanismo de modulação da via do NO. No entanto, é possível propor que o uso da ezetimiba em uma terapia de combinação com uma estatina poderia resultar em mais benefícios sobre a função endotelial; no entanto, outros estudos são necessários para elucidar esta hipótese.

 Conclusão

A regulação negativa dos miRs-221/222 induzida por estatina é um nova via potencial pela qual o tratamento para redução do colesterol poderia exercer seus efeitos benéficos na liberação de NO pelo endotélio humano. Além disto, a redução observada do miR-221 pela ezetemiba deve ser investigada no futuro como uma contribuição potencial deste fármaco na função endotelial, quando usado em uma terapia de combinação.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Alvaro Cerda pela Universidade de São Paulo.

 Agradecimentos

O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Projeto no. 15353/2010-8), São Paulo, Brasil. A. Cerda é beneficiário de uma bolsa da CAPES-Brasil. R.G. Basso, M.H. Hirata e R.D.C. Hirata são beneficiários de bolsas do CNPq-Brasil.