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Arq Bras Cardiol

Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Arq. Bras. Cardiol.

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Sociedade Brasileira de Cardiologia

sxhSSncLxMLspPVBbhvffSL

S0066-782X2015000300003

00003

S0066-782X2014005040189

10.5935/abc.20140189

Original Articles

Vascular Response of Ruthenium Tetraamines in Aortic Ring from Normotensive Rats

Conceição-Vertamatti

Ana Gabriela

1 Ramos

Luiz Alberto Ferreira

1 Calandreli

Ivy

2 Chiba

Aline Nunes

2 Franco

Douglas Wagner

3 Tfouni

Elia

2 Grassi-Kassisse

Dora Maria

1 Universidade Estadual de Campinas

São Paulo

Brasil Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), São Paulo, SP - Brasil 2 Universidade de São Paulo

São Paulo

Brasil Universidade de São Paulo (USP), Campus Ribeirão Preto, São Paulo, SP - Brasil 3 Universidade de São Paulo

São Paulo

Brasil Universidade de São Paulo (USP), Campus São Carlos, São Paulo, SP - Brasil

Mailing Address: Dora Maria Grassi Kassisse, Rua Monteiro Lobato, 255, Barão Geraldo. Postal Code 13083-862, Campinas, SP − Brazil. E-mail: doramgk@unicamp.br; doramgk@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Franco DW, Grassi‑Kassisse DM; Acquisition of data and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Conceição-Vertamatti AG, Ramos LAF, Calandreli I, Chiba AN, Franco DW, Tfouni E, Grassi-Kassisse DM; Analysis and interpretation of the data: Conceição-Vertamatti AG, Ramos LAF, Grassi-Kassisse DM; Statistical analysis and Writing of the manuscript: Conceição‑Vertamatti AG, Grassi-Kassisse DM; Obtaining financing: Franco DW, Tfouni E, Grassi-Kassisse DM.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

09 12 2014

06 2015

104 3 185 194 18 07 2014 29 08 2014 15 09 2014

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Background:

Ruthenium (Ru) tetraamines are being increasingly used as nitric oxide (NO) carriers. In this context, pharmacological studies have become highly relevant to better understand the mechanism of action involved.

Objective:

To evaluate the vascular response of the tetraamines trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺, trans-[Ru^II(Cl)(NO) (cyclan)](PF₆)₂, and trans-[Ru^II(NH₃)₄(4-acPy)(NO)]³⁺.

Methods:

Aortic rings were contracted with noradrenaline (10⁻⁶ M). After voltage stabilization, a single concentration (10⁻⁶ M) of the compounds was added to the assay medium. The responses were recorded during 120 min. Vascular integrity was assessed functionally using acetylcholine at 10⁻⁶ M and sodium nitroprusside at 10⁻⁶ M as well as by histological examination.

Results:

Histological analysis confirmed the presence or absence of endothelial cells in those tissues. All tetraamine complexes altered the contractile response induced by norepinephrine, resulting in increased tone followed by relaxation. In rings with endothelium, the inhibition of endothelial NO caused a reduction of the contractile effect caused by pyridine NO. No significant responses were observed in rings with endothelium after treatment with cyclan NO. In contrast, in rings without endothelium, the inhibition of guanylate cyclase significantly reduced the contractile response caused by the pyridine NO and cyclan NO complexes, and both complexes caused a relaxing effect.

Conclusion:

The results indicate that the vascular effect of the evaluated complexes involved a decrease in the vascular tone induced by norepinephrine (10⁻⁶ M) at the end of the incubation period in aortic rings with and without endothelium, indicating the slow release of NO from these complexes and suggesting that the ligands promoted chemical stability to the molecule. Moreover, we demonstrated that the association of Ru with NO is more stable when the ligands pyridine and cyclan are used in the formulation of the compound.

Ruthenium Nitric Oxide Norepinephrine Pyridine Cyclan Aorta Rats

Introduction

The endothelium plays an important role in the vascular system through the production of vasoactive mediators, such as nitric oxide (NO)1^-3 {Furchgott, 1987 # 14}. The impaired vascular function has been the focus of research on vasoactive compounds, particularly antihypertensive compounds, with the aim to restore the amount of NO necessary to achieve hemodynamic balance4. Therefore, complexes capable of delivering NO efficiently and in a controlled manner have been studied not only to understand their chemical nature but also for future medical applications. These studies can significantly contribute to the treatment of vascular diseases.

NO can serve as a ligand for many transition metals, such as iron (Fe), ruthenium (Ru), and chromium (Cr), among others. Metal complexes of Ru (II) have become the focus of research because of its remarkable ability to bind to various compounds. In addition, it is the element that best forms nitrosyl complexes5^,6.

In this respect, the class of tetraamines of Ru (II) trans‑Ru^II(NO)(NH₃)₄(L)]ⁿ⁺, reported in the literature as [Ru^IINO⁺], has significant thermal stability in the Ru–NO bond, ligand L being the guiding element of this stabilization. The disassociation of this bond using a substitution is controlled by the rate constant of NO (K_NO) via monoelectronic reduction, wherein the reductive potential of the ligand should lie between 0.320 V and 0.132 V4^,9.

K_NO is important because it determines the duration of the vascular effect4.The kinetic constant of NO (k_NO) varies between 0.02 s⁻¹ (L = 4-pic) and 4 s⁻¹ (L = imC) at 25ºC and increases in the order: isn ~ pic ~ nic ~ H₂O ~ py ~ pz < L-His ~ imN < P (OEt)₃ < imC8.

Considering the existing medications and aiming at the improvement of clinical applications for treatment of vascular diseases, this system is advantageous because of the possibility of the controlled release of NO to specific biological targets4^,8^,10^,12.Therefore, the present study aimed to investigate the effect of the Ru tetraamines trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺ (PyNO), trans-[Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂ (CyNO), and trans-[Ru^II(NH₃)₄(4-acPy)(NO)]³⁺ (4-acPyNO) on the vascular response.

Methods

The protocols used were approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation of the State University of Campinas (Universidade Estadual de Campinas–UNICAMP) under protocol number 2099-2. The study was conducted in accordance with the standards of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals established in 199313 and with the Ethical Principles of Animal Experimentation of the Brazilian School of Animal Experimentation (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal–COBEA) from 1991 on the use of animals for research and teaching purposes.

Animals

The animals were obtained from the Multidisciplinary Center for Biological Investigation (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica–CEMIB) in the Division for the Study of Laboratory Animals at UNICAMP. The animals were maintained in collective cages (four animals per cage). The room temperature was maintained at 22ºC ± 2ºC in 12/12 h light–dark cycles with the light cycle starting at 6:30 am. We used 42, 12-week-old, male rats of the Wistar strain (Rattus norvegicus albinus, Rodentia, Mammalia), weighing 330 ± 2.45 g.

All normolipidemic animals were fed standard laboratory chow food (Nuvilab CR1; Nuvital Nutrients S.A., Brazil), and food and water were provided daily ad libitum.

Histological analysis

After the completion of the experiment, the aortic rings with endothelium (^E+) and without endothelium (E^–) were isolated and placed in formalin solution (200 mL of distilled water, 50 mL of 40% formaldehyde, and 250 mL of 0.2-M phosphate buffer (pH 7.4) for 24 h. Subsequently, the samples were washed with 70% ethanol and stored in formalin solution until paraffin embedding. For inclusion, dehydration was performed using an ascending series of ethyl alcohol solutions until the absolute concentration, clarification was performed in xylol (alcohol-xylol 1:1 and pure xylol), and inclusion was performed in xylol-paraffin (1:1). Inclusion and embedding were performed at 58ºC in Paraplast Plus® (a mixture of paraffin, plastic polymers, and dimethylsulfoxide). The embedded aortic rings were glued on wooden blocks and cut into 2-mm-thick sections in a 820 Spencer microtome (American Optical Corporation, USA). Approximately three sections were placed on each slide. After deparaffinization, the sections were stained with hematoxylin and eosin. The images were captured with a Nikon Eclipse 80i optical microscope coupled to a computer and video camera (Nikon Express Series, Shinagawa, Tokyo, Japan) and analyzed using NIS-Elements AR 3.0 software at a magnification of 40× and 100×14^,15 .

Measurement of blood pressure

To measure blood pressure, we used 10 rats randomly selected from the experimental groups. The catheterization procedure was performed, in which a cannula (PE 50) was inserted into the right carotid artery and connected to a strain gauge pressure transducer, which in turn was connected to an amplifier (MLS370/7 Blood Pressure Module; ADInstruments, Australia) and to a PowerLab 8/30 data acquisition system (ADInstruments, Australia). For data analysis, the LabChart Pro software (ADInstruments, Australia) was used14^,15.

Analysis of Ru complexes

The complexes were characterized using elemental analysis, electronic spectroscopy in the infrared region, electron paramagnetic resonance (EPR), nuclear magnetic resonance (NMR), and electrochemical techniques (PPD, VC) by the research group of Dr. Elia Tfouni from the University of São Paulo (USP) in Ribeirão Preto.

Preparation of isolated aortic rings

The aortic rings were isolated and prepared according to the protocol established by Zanichelli et al16 The sample size was determined as described by Lenth17 using the Statistica 7.0 software (StatSoft, Inc., USA), and the following parameters were used: minimum test power of 0.80 and alpha value prefixed at 0.05, and optimal number of experiments per experimental protocol equal to six. Based on these parameters, we used 14 experimental groups divided into aorta samples with endothelium (E⁺) and aorta samples without endothelium (E^–), resulting in 28 experimental groups.

The animals were sacrificed under deeper anesthesia. The chest was opened with a midline incision and the thoracic aorta portion was removed and divided into four rings, each with approximately 4 mm.

The endothelium of two rings was removed mechanically from the inner surface of the aorta with the help of a cotton swab whereas the endothelial layer of the other two rings remained intact. Each ring was mounted on two L-shaped stainless steel hooks, and the smaller portion traversed the inside of the ring, after which these hooks were individually placed in a container containing 10 mL of Krebs–Hanseleit physiological solution (115.0 mM of NaCl, 4.6 mM of KCl, 25.0 mM of NaHCO₃, 2.5 mM of MgSO₄.7H₂O, 2.5 mM of CaCl₂.2H₂O, 1.2 mM of KH₂PO₄, 11.0 mM of glucose, and 0.11 mM of ascorbic acid) and coupled to an isometric voltage transducer16. The solution was maintained in a water bath at 37ºC with the aid of an infusion pump and was constantly bubbled with 95% oxygen and 5% carbon dioxide for maintenance of pH. After placing the samples in the container, a voltage of 1.5 g was induced in the transducer and maintained throughout the experiment for both E⁺ and E⁻ rings. For voltage recording, an isometric voltage transducer (BIOPAC System) containing a four‑channel polygraph (MP-100, USA) was used. The rings were stabilized for 50 min and the Krebs–Hanseleit solution was replaced every 20 min.

After the stabilization period, the rings were precontracted with noradrenaline (NA, 10⁻⁶ M) dissolved in 2% ascorbic acid and maintained in the bath throughout the assay. After voltage stabilization, a single concentration of the compound to be studied (10⁻⁶ M) was added to the bath and the recording was made without interruption for 120 min. Immediately after that, a single concentration of acetylcholine (ACh, 10⁻⁶ M) was added to the assay medium to confirm the presence or absence of endothelial cells and stabilize the response. In addition, sodium nitroprusside (SNP) at 10⁻⁶ M was added to verify the integrity of the vascular smooth muscle.

To complement the pharmacological investigation of the mechanism of action involved, i.e., after the first analysis of temporal concentration–effect curves, the involvement of the endogenous NO pathways, their mechanism of action via cyclic guanosine monophosphate (cGMP), and possible interference of endogenous eicosanoids were investigated. For this study, assays were conducted using the complexes cyclan NO (CyNO) and pyridine NO (PyNO) at 10⁻⁶ M using both E⁺ and E⁻ rings, which were previously incubated with the following compounds: 10–30 mM of L-NAME hydrochloride (Enzo Life Sciences International, Inc. Plymouth Meeting, PA, USA)—a NO synthase inhibitor18^,19, 5.6 μM of the cyclooxygenase inhibitor indomethacin (Enzo Life Sciences International, Inc. Plymouth Meeting, PA, USA)18, 3–10 μM of the soluble guanylate cyclase (GC) inhibitor ODQ (Enzo Life Sciences International, Inc. Plymouth Meeting, PA, USA)20, 10–300 μM of the NO sequester carboxy-PTIO (Enzo Life Sciences International (Plymouth Meeting, PA, USA).

To further evaluate the effect caused by these complexes, assays were performed using 10⁻⁶ M PyNO interacting with more than one enzyme inhibitor, e.g ., by the preincubation with L-NAME and indomethacin or with L-NAME, indomethacin, and ODQ, maintaining the specific concentration for each inhibitor.

All salts used for the preparation of the Krebs–Hanseleit solution were of American Chemical Society (ACS) standard. The NA stock solutions were prepared in 2% ascorbic acid and stored at −20ºC for a maximum of 7 days. For the preparation of the indomethacin solution, a 5% sodium bicarbonate buffer was used. The dilutions were made in Krebs–Hanseleit buffer immediately before use and then discarded.

Statistical analysis

The results are presented as mean ± standard error of mean (SEM) of the percentage of response. Normality was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. Student’s t test was used to compare the different experimental protocols for the following variables: response in the presence of vascular tone induced by NA, response before the addition of the compound, and response after different assay periods in the presence and absence of antagonists and enzyme inhibitors. Analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnet test was performed to compare the areas under the curve. In all cases, p values of <5% were accepted as indicating statistically significant differences. The curves were performed using GraphPad Prism software (GraphPad Software, San Diego, California, USA).

Results Blood pressure

The values of blood pressure of the study animals were similar to those previously reported for young adult rats with average weight and following anesthesia: systolic pressure of 119.4 ± 3.862 mmHg, diastolic pressure of 92.75 ± 6.125 mmHg, and mean arterial pressure of 104.5 ± 4.29 mmHg, indicating that these animals were normotensive21^-24.

Histological analysis

Histological analysis confirmed the experimental data, which indicated the presence or absence of endothelial cells (Figure 1).

Figure 1 Photomicrographs of (A) aortic rings with endothelium (E+) and (B) without endothelium (E−) isolated from normotensive rats (100×). The arrows indicate the presence of endothelial cells. Vascular reactivity

Corroborating histological data, the presence of endothelial cells was confirmed by the significant relaxation effect of ACh on E⁺ aortic rings, and the integrity of the smooth muscle was confirmed by observing the relaxation in both E⁺ and E⁻ aortic rings caused by sodium nitroprusside (SNP)18.

In contrast to the results of previous experiments demonstrating the induction of vascular tone only by NA, all tetraamines analyzed caused a significant decrease in the vascular tone (Figure 2).

Figure 2 Effect of tetraamines (A) CyNO−trans-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2, (B) PyNO−trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+, and (C) 4-acPyNO−trans-[RuII(NH3)4(4-acPy) (NO)]3+ 10−6 M in E+ aortic rings (■) and E− aortic rings (□) compared with control assays. *p value of <0.05 using unpaired Student’s test for the values of vascular tone induced by NA (10−6 M). E+: PyNO, p = 0.0036; CyNO, p = 0.0008; 4-acPyNO, p = 0.0026; E–: PyNO, p = 0.0022; CyNO, p = 0.0022; 4-acPyNO, p = 0.0014.

After precontraction was performed with NA, the analyzed complexes caused increased vascular tone within 1 h after treatment, in both E⁺ and E⁻ aortic rings, and decreased vascular tone 90 min after treatment (Figure 3).

Figure 3 Effect of tetraamines (A) CyNO−trans-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2, (B) PyNO−trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+, and (C) 4-acPyNO−trans-[RuII(NH3)4(4-acPy) (NO)]3+ 10−6 M after a single concentration of NA (10−6 M) in E+ aortic rings (■) and E− aortic rings (□). *p value of <0.05 using unpaired Student’s t test for the values obtained immediately after administration of the compounds. E+: PyNO, p = 0.0195; CyNO, p = 00241; 4-acPyNO, p = 0.0116; E–: PyNO, p = 0.0216; CyNO, p = 0.0377; 4-acPyNO, p = 0.0179.

In E⁻ aortic rings, inhibition of GC significantly altered the contractile response induced by CyNO, causing vascular relaxation within 30 min. No significant responses were observed in E⁺ aortic rings (Figure 4).

Figure 4 Effect of trans-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2−CyNO in (A) E+ aortic rings and (B) E− aortic rings after treatment with enzyme inhibitors L-NAME with E+ (▲) and with E− (△), indomethacin with E+ (t) and with E− (♢), ODQ with E+ (x) and with E–(×), C-PTIO with E+ (l) and with E– (¡). *p value of <0.05 using unpaired Student’s t test compared with the values obtained in the absence of antagonists or enzyme inhibitors CyNO vs. ODQ with E–, p = 0.0152.

The contractile response induced by PyNO in E⁺ aortic rings significantly decreased after the inhibition of endothelial NO synthase (eNOS), cyclooxygenase, and GC. The inhibition of GC exerted a reducing effect within the first 60 min whereas the inhibition of eNOS and cyclooxygenase induced a contractile response after 120 min of incubation. In the absence of endothelial cells, only the inhibition of GC exerted a reducing effect (Figure 5).

Figure 5 Effect of PyNO−trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+ on (A) E+ aortic rings and (B) E− aortic rings after treatment with enzyme inhibitors: L-NAME with E+ (▲) and with E− (△), indomethacin with E+ aorta (t) and with E− (♢), ODQ with E+ (x) and with E–(×), C-PTIO with E+ (l) and with E− (¡). *p value of<0.05 using unpaired Student’s t test compared with the values obtained in the absence of antagonists or enzyme inhibitors E+: PyNO vs. L-NAME, p = 0.0056; PyNO vs. indomethacin, p = 0.0459; PyNO vs. ODQ, p = 0.0043; E–: PyNO vs. ODQ, p = 0.0140.

With the aim to better understand the effect of such complexes, assays with the PyNO complex (10⁻⁶ M) were performed in the presence of more than one enzyme inhibitor, e.g., preincubation of aorta samples with L-NAME and indomethacin, with the aim to block the activity of endogenous NO and eicosanoids, such as prostacyclin (PGI₂ and TXA₂). The simultaneous incubation of samples with L-NAME, indomethacin, and ODQ was also performed to eliminate the presence of other compounds in the same assay, including endogenous NO (synthesis and action) and endogenous eicosanoids (PGI₂ and TXA₂).

Therefore, when we blocked the endothelial function by inhibiting eNOS and cyclooxygenase, we observed a significant decrease in vascular tone in E⁺ aortic rings, confirming the direct action of the PyNO complex in smooth muscle. In contrast, no changes were observed in the vascular response using E⁻ aortic rings.

When we blocked potential interferences in the activity of these complexes, i.e., preventing the synthesis of NO by blocking eNOS and preventing the action of eNOS by blocking GC as well as blocking potential interferences in the activity of PGI₂ and TXA₂ by blocking cyclooxygenases, we observed a decreased contractile response in both E⁺ and E⁻ rings, corroborating the effect of PyNO directly on the smooth muscle (Figure 6).

Figure 6 Effect of PyNO–trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+ 10−6 M on (A) E+ aortic rings and (B) E– aortic rings after incubating with the enzyme inhibitors L-NAME, indomethacin, and ODQ. *p value of < 0.05 using unpaired Student’s t test compared with the values obtained in the absence of antagonists or enzyme inhibitors. E+: PyNO vs. PyNO + L-NAME + indomethacin, p = 0.0056, and PyNO vs. PyNO + L-name + indomethacin + and ODQ, p = 0.0454.

The inhibiting effect of PyNO on the contractile function was not significantly different from that caused by the acetylation of 4-acPyNO in both E⁺ and E⁻ aortic rings.

The results were also analyzed by calculating the areas under the curve (AUC). The response induced by PyNO, CyNO, and 4-acPyNO did not significantly differ for E⁺ and E⁻ aortic rings (Table 1). On the other hand, the inhibition of eNOS by L-NAME caused a significant decrease in the response induced by PyNO and CyNO in E⁺ rings but not in E⁻ rings. A similar effect was observed when we inhibited the cyclooxygenase pathway, resulting in a significant decrease in the response in E⁺ rings but not in E⁻ rings. The GC inhibition by ODQ caused a significant decrease in the response induced by PyNO and CyNO in E⁻ rings. Moreover, the sequestration of NO by C-PTIO did not affect the effect of the complexes evaluated.

Table 1 Area under the curve of the Ru tetraamines <italic>trans</italic>-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2, <italic>trans</italic>-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+, and <italic>trans</italic>-[RuII(NH3)4(4-acPy)(NO)]3+ in E+ aorta rings and E− aorta rings isolated from normotensive rats

	trans- [Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂		trans-[Ru(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺		trans-[Ru(NH₃)₄(4-acPy)(NO)]³⁺
	E⁺	E^–	E⁺	E^–	E⁺	E^–
-	1.110,6 ± 225,6	1.068,7 ± 317,5	2.292,2 ± 520,6	1.069,4 ± 317,2	1.949,0 ± 542,4	1.292,9 ± 312,8
L-NAME (10-30 μM)	439,9 ± 75,0*	898,7 ± 250,6	852,4 ± 245,4*	898,6 ± 250,3	-	-
Indomethacin (5,6 μM)	496,3 ± 92,4*	741,1 ± 161,9	796,07 ± 119,1*	740,7 ± 161,9	-	-
ODQ (3-10 μM)	1.424,5 ± 453,1	646,3 ± 149,8	1.109,4 ± 388,4	646,7 ± 149,9	-	-
C-PTIO (10-300 μM)	1.062,7 ± 159,9	646,3 ± 109,6	1.718,9 ± 276,8	1.223,7 ± 327,6	-	-
L-NAME (10-30 μM), indomethacin (5,6μM) and ODQ (3-10μM)	-	-	1.111,850 ± 350,891	1.329,567 ± 510,506	-	-

The area under the curve of Ru tetraamines (AUC) trans-[Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂, trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺, trans-[Ru^II(NH₃)₄(4-acPy)(NO)]³⁺, trans-[Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂, and trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺ are shown in the absence and presence of L-NAME, indomethacin, ODQ, and carboxy-PTIO in E⁺ aortic rings and E⁻ aortic rings.

p value of < 0.05; Analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnet and Student’s t test where appropriate. (−) Indicates the absence of assays with the enzyme inhibitors evaluated; AUC is shown as mean ± SEM as gF/min.

Discussion

The nitrosyl complexes of the class trans-[Ru^II(NH₃)₄(L)(NO)]³⁺ are considered important molecules because of their low toxicity, good solubility in water, and ability to modulate the release of NO as a function of the trans effect played by the choice of ligand L, along with the fact that the reductive potential of NO⁺ is accessible to many reducing agents found in biological processes5^,6. The nature of the ligand L is exactly what controls the strength of the Ru–NO bond so that the higher the binding property of the receptor, the weaker is the strength of the NO bond9. According to Tfouni et al4, the release or retention of NO is selective to the biological target, and a possible alternative would be the immobilization of complexes to silica, which could facilitate the action of reducing agents, possibly forming more stable compounds.

However, it was shown that the immobilization to silica does not modify compound reactivity, indicating that the properties of the Ru–NO bond may change depending on the nature of the ligand4.

A study conducted by Caramoni and Frenking26 indicated that the use of tretraaza macrocyclic ligands, such as trans‑[RuCl(NO)(Cyclan), as equatorial ligands promoted greater stability of the Ru–NO bond and thereby could be used as vasodilating agents9. However, studies in hypertensive rats using the complex trans-[Ru^II(NO⁺)(Cyclan)Cl(PF₆)₂ indicated differences in the relaxation time when activated thermally (595 s) or by light irradiation (50 s)4.

Studies conducted in rat aortas demonstrated that the relaxation induced by the compound trans-[Ru^II(NO⁺)(Cyclan)Cl(PF₆)₂ was inhibited under light irradiation and the amount of NO released was insufficient to affect the biological pathways4^,27. Therefore, it is essential to evaluate the intensity and duration of relaxation, and for this reason, the measurement of K_NO is important when assessing the duration of the vasorelaxant effect4.

Our results indicate that the vascular effect of the complexes tested involved decreased contractile tone followed by a relaxation effect after 90–120 min of incubation, suggesting that the assay time was not sufficient to effectively release NO. In addition, we can consider that the influence of the ligands pyridine and cyclan on the compounds helped to measure K_NO, and consequently, the stabilization of the Ru–NO bond in order to release NO from the metallic complex more rapidly or more slowly.

The relaxation promoted by Ru II appears to be mediated by GC stimulation but has also been associated with the direct activation of K⁺ channels independently of cGMP, which indicates that Ru II is directly involved in the vascular relaxation promoted by NO. NO has a cGMP-dependent and a cGMP-independent signaling pathway, which could directly activate the K⁺ channels28.

Another important factor involved in the onset of vasodilation in smooth muscle is the decreased concentration of cytosolic calcium through inhibition of calcium entry29. Previous studies have indicated that the NO/cGMP pathway can decrease the intracellular calcium concentration and thereby decrease the contractile sensitivity, resulting in smooth muscle relaxation4.

According to a study conducted by Lunardi et al30, confocal microscopy experiments indicated that trans‑[Ru^II(NO⁺)([15]aneN4)Cl]⁺, [Ru^II(NO⁺)(NH₃NHQ)(terpy)]³⁺ and cis‑[Ru^II(NO⁺)(bpy)₂Cl](PF6)₂ decreased calcium concentrations in the vasculature4.

The present study corroborates the occurrence of changes associated with the NO/cGMP pathway, considering that GC inhibition promoted faster vascular relaxation in E⁻ aortic rings by the CyNO complex, and this inhibition was also observed using the PyNO complex, suggesting a strong influence of the NO/cGMP pathway in the vascular effect induced by the compounds analyzed.

NO is the common mediator released from all vasodilator complexes, but its mechanism of action is distinguished by the specificity of activation of GC, which is different for each donor compound30. Considering that NO may also exist in a variety of forms, such as ion, and nitrosyl, and nitronium free radicals, NO released from Ru complexes may differ from NO produced by endothelial cells. This would explain the difference in potency and efficacy of NO donors in the induction of vascular relaxation30.

Conclusion

The results presented herein indicate that the vascular effect of the complexes evaluated involved decreased vascular tone induced by norepinephrine (10⁻⁶ M) at the end of the incubation period in rings with and without endothelium, indicating the slow release of NO from these complexes and suggesting that the ligands promoted chemical stability in the molecule. In addition, we demonstrated that the Ru–NO bond was more stable when pyridine and cyclan ligands were used in the formulation of the compound.

Considering the protocol used, the effect induced by the compounds investigated on the vascular function of aortic rings with endothelium is partially dependent on the cyclooxygenase, guanylate cyclase, and eNOS pathways. On the other hand, only the guanylate cyclase pathway modulated the activity of these compounds on the aortic rings without endothelium.

To date, several Ru complexes have been synthesized and tested for their potential therapeutic use and their effects and mechanisms of action are being intensely studied by different research groups. However, many details remain unknown and will be elucidated using multidisciplinary studies.

Sources of Funding

This study was funded by Fapesp and partially funded by Faepex.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Ana Gabriela Conceição Vertamatti, from Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).

References 1

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Resposta Vascular de Tetra-Aminas de Rutênio em Anéis de Aorta de Ratos Normotensos

Conceição-Vertamatti

Ana Gabriela

1 Ramos

Luiz Alberto Ferreira

1 Calandreli

Ivy

2 Chiba

Aline Nunes

2 Franco

Douglas Wagner

3 Tfouni

Elia

2 Grassi-Kassisse

Dora Maria

1 Universidade Estadual de Campinas

São Paulo

Brasil Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), São Paulo, SP - Brasil 2 Universidade de São Paulo

São Paulo

Brasil Universidade de São Paulo (USP), Campus Ribeirão Preto, São Paulo, SP - Brasil 3 Universidade de São Paulo

São Paulo

Brasil Universidade de São Paulo (USP), Campus São Carlos, São Paulo, SP - Brasil

Correspondência: Dora Maria Grassi Kassisse, Rua Monteiro Lobato, 255, Barão Geraldo. CEP 13083-862, Campinas, SP − Brasil E-mail: doramgk@unicamp.br; doramgk@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Franco DW, Grassi‑Kassisse DM; Obtenção de dados e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Conceição-Vertamatti AG, Ramos LAF, Calandreli I, Chiba AN, Franco DW, Tfouni E, Grassi-Kassisse DM; Análise e interpretação dos dados: Conceição-Vertamatti AG, Ramos LAF, Grassi-Kassisse DM; Análise estatística e Redação do manuscrito: Conceição-Vertamatti AG, Grassi-Kassisse DM; Obtenção de financiamento: Franco DW, Tfouni E, Grassi-Kassisse DM.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes

Fundamento:

As tetra-aminas de rutênio cada vez mais se destacam como carreadoras da molécula de óxido nítrico. Desse modo, estudos farmacológicos tornam-se altamente relevantes, afim de melhor compreender o mecanismo de ação envolvido.

Objetivo:

Avaliar a resposta vascular das tetra-aminas trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺, trans-[Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂ e trans-[RuII(NH₃)₄(4-acPy)(NO)]³⁺.

Métodos:

Anéis de aorta foram pré-contraídos com noradrenalina (10^-6M). Após estabilização da tensão, concentração única (10^-6M) dos compostos foi adicionada ao banho de incubação. As respostas foram registradas ao longo de 120 minutos. A integridade vascular foi avaliada funcionalmente (acetilcolina 10^-6M; nitroprussiato de sódio 10^-6M) e histologicamente

Resultados:

A análise histológica confirmou a presença ou não de células endoteliais nos tecidos analisados. Todos os complexos alteraram a resposta contrátil induzida pela noradrenalina, resultando em aumento de tônus seguido de efeito relaxante. Em anéis com endotélio, a inibição do óxido nítrico endotelial causou redução do efeito contrátil da piridina óxido nítrico. Não foram observadas respostas significativas em anéis com endotélio referente ao composto cyclan óxido nítrico. Por outro lado, em anéis sem endotélio, a inibição da guanilato ciclase reduziu significativamente a resposta contrátil dos complexos piridina óxido nítrico e cyclan óxido nítrico, levando ambos os compostos a um efeito relaxante.

Conclusão:

Os resultados obtidos demonstram que o efeito vascular dos complexos avaliados apresentaram diminuição no tônus vascular induzido pela noradrenalina (10^-6M) ao final do tempo de incubação, em anéis com e sem endotélio, indicando liberação lenta da molécula de óxido nítrico do composto estudado e sugerindo que os ligantes causaram estabilidade química à molécula. Demonstramos que a ligação rutênio óxido nítrico é mais estável quando utilizamos os ligantes piridina e cyclan para a formulação do composto.

Rutênio Óxido Nítrico Norepinefrina Piridina Cyclan Aorta Ratos

Introdução

O endotélio desempenha um papel importante no sistema vascular por meio da produção de mediadores vasoativos, como o Óxido Nítrico (NO)1^-3. A função vascular comprometida é sempre foco para investigação de substâncias vasoativas, principalmente as anti-hipertensivas, com a finalidade de reparar a quantidade de NO necessária ao equilíbrio hemodinâmico4 . Assim, complexos capazes de fornecer NO de forma eficiente e em um ambiente controlado têm sido estudados não somente para a compreensão de suas reações químicas, mas também para futuras aplicações médicas. Os resultados desses estudos podem trazer contribuições relevantes para o tratamento de doenças vasculares.

O NO é uma molécula capaz de servir como ligante para uma variedade de metais de transição como, por exemplo, Ferro (Fe), Rutênio (Ru), Crômio (Cr), entre outros. Complexos metálicos de Ru (II) têm se tornado alvo de estudos, sendo notável sua capacidade de se ligar a diversas substâncias e conhecido por ser o elemento que mais forma complexos nitrosilo5^,6.

Podemos destacar, nesse aspecto, a classe das tetra-aminas de Ru (II) (trans-Ru^II(NO)(NH₃)₄(L)]ⁿ⁺) descritas pela literatura como [Ru^IINO⁺], apresentando importante estabilidade térmica na região de ligação Ru-NO, sendo o ligante L o norteador dessa estabilização. A desassociação dessa ligação, frente a uma substituição, é controlada pela constante de velocidade do NO (K_-no) por meio de redução monoeletrônica, na qual o potencial redutivo do ligante deve se encontrar entre 0,320V e 0,132V4^-9.

A velocidade de ação do composto torna-se foco de investigação, uma vez que a K_-no determina o tempo do efeito vascular4. A velocidade de saída do NO (k_-NO) varia de 0,02 s^-1 (L = 4-pic) a 4 s^-1 (L = imC), em 25ºC, aumentando na ordem: isn ~ pic ~ nic ~ H₂O ~ py ~ pz < L-His ~ imN < P(OEt)3 < imC8.

Considerando os medicamentos já existentes e visando a uma melhoria na aplicabilidade clínica relacionada às doenças vasculares, esse sistema torna-se vantajoso devido à possibilidade de liberação do NO a um alvo biológico específico e com velocidade de liberação controlada4^,8^,10^-12. Dessa maneira, no presente artigo, investigaremos a resposta vascular das seguintes tetra-aminas de Ru: trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py) (NO)]³⁺ (PyNO), trans‑[Ru^II (Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂ (CyNO) e trans‑[Ru^II(NH₃)₄(4‑acPy)(NO)]³⁺ (4-acPyNO).

Métodos

Os protocolos apresentados foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), recebendo número de protocolo 2099-2. A pesquisa esteve de acordo com as normas estabelecidas pelo Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, datada de 199313, e com os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), de 1991, para uso de animais para pesquisa e ensino.

Animais

Os animais utilizados foram provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) na Área da Ciência em Animais de Laboratório da UNICAMP. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas (quatro animais em cada gaiola). A sala foi dotada de controle de temperatura, que foi mantida constante (22 ± 2ºC) e com ciclo claro-escuro de 12/12 horas, com o ciclo claro iniciando-se às 6h30. Utilizamos 42 ratos machos, da linhagem Wistar (Rattus norvegicus, Albino, Rodentia, Mammalia), com peso de 330 ± 2,45 g, todos com 12 semanas de vida.

Todos os animais eram normolipidêmicos, alimentados com ração padrão para laboratório da marca Nuvilab CR1 (Nuvital Nutrientes S/A). Ração e água foram fornecidas diariamente ad libitum.

Análise histológica

Após a realização do experimento, os anéis de aorta Com (CE) e Sem Endotélio (SE) foram isolados e colocados em solução formalina (200 mL de água destilada; 50 mL de formaldeído 40%; e 250 mL de tampão fosfato; 0,2 M; pH 7,4) durante 24 horas. Em seguida, as amostras foram lavadas com álcool 70% e armazenadas nessa solução até o dia da inclusão em parafina. Para a inclusão, foram realizadas a desidratação em série crescente de solução de álcool etílico até o álcool absoluto, a clarificação em xilol (álcool-xilol 1:1 e xilol puro) e a impregnação em xilol-parafina (1:1); finalmente, foram realizadas a inclusão e a emblocagem a 58oC, em Paraplast Plus® (mistura de parafina, polímeros plásticos e dimetilsulfóxido). Os anéis de aorta devidamente incluídos foram colados em blocos de madeira e cortados em espessura de 2 mm em micrótomo do tipo 820 Spencer (American Optical Corporation, EUA). Cerca de três cortes foram colocados em cada lâmina. Após desparafinização, os cortes foram corados com hematoxilina e eosina. As imagens foram capturadas em microscópio óptico Nikon Eclipse 80i acoplado a um computador e videocâmera (Nikon Express Series, Shinagawa, Tóquio, Japão) e analisadas utilizando o software NIS-Elements AR 3.0, com a ampliação de 40 e 100 x14^,15.

Análise de pressão arterial

Utilizamos, para a medida de pressão arterial, uma amostra de dez ratos selecionados aleatoriamente dentro dos grupos experimentais. Foi realizado o procedimento de cateterização, em que uma cânula (PE 50) foi introduzida na artéria carótida direita e conectada a um transdutor de pressão do tipo strain gauge acoplado a um amplificador MLS370/7 Blood Pressure Module (ADInstruments, Austrália) e um sistema de aquisição de dados PowerLab 8/30 (ADInstruments, Austrália). Para análise dos resultados, foi utilizado o software LabChart Pro (ADInstruments, Austrália)14^,15.

Complexos de rutênio

Os complexos foram caracterizados por análise elementar, espectroscopia eletrônica na região do infravermelho, EPR, RMN, e técnicas eletroquímicas (PPD, VC) realizadas pelo grupo de pesquisa do Professor Dr. Elia Tfouni, da Universidade de São Paulo (USP), Campus Ribeirão Preto.

Preparação dos anéis de aorta isolada

Os anéis de aorta foram isolados e preparados de acordo com Zanichelli e cols.16. O tamanho da amostra foi determinado de acordo com Lenth17, utilizando o programa Statistica 7.0 (StatSoft, Inc.. STATISTICA), de tal forma a garantir os seguintes parâmetros: poder do teste mínimo de 0,80 e alfa pré-fixado em 0,05, definindo que o número ideal de experimentos por protocolo experimental deveria ser de seis. Desta forma, utilizamos 14 grupos experimentais, divididos entre aortas CE e aortas SE, resultando em 28 protocolos experimentais.

Os animais foram sacrificados com aprofundamento da anestesia. Logo após, o tórax foi aberto por meio de uma incisão mediana, e a porção torácica da aorta foi removida e dividida em quatro anéis de aproximadamente 4 mm cada.

Destes, dois anéis tiveram o endotélio mecanicamente removido da superfície interna da aorta, tendo o auxílio de uma haste de algodão, e os outros dois anéis restantes permaneceram com a camada endotelial íntegra. Cada anel foi montado em dois ganchos de aço inox em forma de L, com a parte menor atravessando a parte interna do anel, e esses ganchos foram colocados individualmente em uma cuba, localizada em um transdutor isométrico de tensão, contendo 10 mL de solução fisiológica de Krebs-Hanseleit da seguinte composição (em mmol.L^-1): 115,0 de NaCl; 4,6 de KCl; 25,0 de NaHCO₃; 2,5 de MgSO₄.7H₂O; 2,5 de CaCl₂.2H₂O; 1,2 de KH₂PO₄; 11,0 de glicose; e 0,11 de ácido ascórbico16. A solução foi mantida em um banho de 37ºC, tendo o auxílio de uma bomba de perfusão e sendo constantemente borbulhada com oxigênio (95%) e gás carbônico (5%), para a manutenção do pH da solução. Após a instalação do anel de aorta na cuba, foi induzida, no transdutor, uma tensão de 1,5 g, sendo esta mantida durante todo o experimento, tanto nos anéis CE quanto nos anéis SE. Para o registro dessa tensão foi utilizado um transdutor isométrico de tensão BIOPAC System, contendo um polígrafo de quatro canais (MP-100, EUA). Os anéis permaneceram em estabilização por um período de 50 minutos, sendo que a solução de Krebs-Hanseleit foi trocada a cada 20 minutos.

Após o período de estabilização, os anéis foram pré‑contraídos com Noradrenalina (NA; 10^-6 M) dissolvida em ácido ascórbico 2%, que foi mantida no banho ao longo de todo o ensaio. Após estabilização da tensão, uma concentração única (10^-6 M) do composto a ser estudado foi adicionada ao banho e teve o registro efetuado sem interrupções por 120 minutos. Logo após concentração única de Acetilcolina (ACh; 10^-6 M) foi adicionada ao banho, afim de comprovar a presença ou ausência de células endoteliais e estabilização da resposta. Foi adicionado também, em dose única, Nitroprussiato de Sódio (SNP; 10^-6 M), com objetivo de verificar a integridade da musculatura lisa vascular.

A fim de complementar a investigação farmacológica do mecanismo de ação envolvido, ou seja, após a primeira investigação de curvas concentração-efeito temporal, foi investigada a participação das vias de formação de NO endógeno, de seu mecanismo de ação via GMPc, bem como a possível interferência de eicosanoides endógenos. Para tal estudo, foram realizados ensaios com os complexos CyNO e PyNO 10^-6 M em anéis CE e SE, que foram previamente encubados com as seguintes substâncias: L-NAME Hydrochloride, 10 a 30 μM (Enzo Life Sciences International, Inc. 5120 Butler Pike, Plymouth Meeting, PA 19462), um inibidor da enzima NO sintase18^,19; indometacina, 5,6 μM (Enzo Life Sciences International, Inc. 5120 Butler Pike), um inibidor da enzima ciclo-oxigenase18; ODQ, 3 a 10 μM (Enzo Life Sciences International, Inc. 5120 Butler Pike) um inibidor da Guanilato Ciclase (GC) solúvel20 ; carboxy-PTIO, 10 a 300 μM (Enzo Life Sciences International, Inc.5120 Butler Pike), um sequestrador de NO.

Para melhor avaliar o efeito causado por esses complexos, foram realizados ensaios com o PyNO 10^-6 M interagindo com mais de um inibidor enzimático, como, por exemplo, ensaios com pré‑incubação de L-NAME e indometacina, e L-NAME junto a indometacina e ODQ, mantendo a concentração específica utilizada para cada inibidor.

Todos os sais utilizados para o preparo da solução de Krebs-Hanseleit foram de padrão ACS. As soluções estoque de NA foram preparadas em solução de ácido ascórbico a 2% e armazenadas a -20ºC, por, no máximo, 7 dias. Na preparação da solução de indometacina, foi utilizado tampão de bicarbonato de sódio 5%. As diluições foram feitas em solução de Krebs-Hanseleit imediatamente antes do uso e, em seguida, descartadas.

Análise estatística

Os resultados estão apresentados como médias ± Erro Padrão da Média (EPM) da porcentagem de resposta. A normalidade foi comprovada segundo Kolmogorov-Smirnov; por conta disso, para as análises, foi utilizado o teste t de Student, a fim de comparar os diferentes protocolos experimentais em relação à: resposta sob tônus induzido pela presença de NA; e resposta em relação ao momento zero do composto e resposta dos diferentes tempos de ação do composto, na presença e ausência dos antagonistas e inibidores enzimáticos. Análise de Variância (ANOVA), seguida de Dunnet, foi realizada nas análises dos resultados provenientes da área sob a curva. Em todos os casos, valores de p < 5% foram aceitos como indicativos de diferenças estatisticamente significativas. As curvas foram realizadas com auxílio do software Graph-Pad Prism (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA).

Resultados Pressão arterial

Os animais apresentaram valores pressóricos condizentes com a literatura para ratos adultos jovens, de peso médio e anestesiados: pressão sistólica 119,4 ± 3,862 mmHg, pressão diastólica 92,75 ± 6,125 mmHg e pressão arterial média de 104,5 ± 4,29 mmHg, caracterizando-os como normotensos21^-24.

Análise histológica

Análises histológicas confirmaram os dados obtidos experimentalmente, que indicavam a presença ou ausência de células endoteliais (Figura 1).

Figura 1 Fotomicrografias de anéis de aorta com (A) e sem (B) endotélio isoladas de ratos normotensos (100x). Na figura ilustrada, as setas indicam a presença de células endoteliais. Reatividade vascular

Corroborando dados histológicos, a presença de células endoteliais foi comprovada com o efeito relaxante significativo em aortas CE em decorrência da ACh, e a integridade da musculatura lisa foi comprovada com o relaxamento em ambos os anéis de aorta, causado pelo SNP18.

Em comparação aos experimentos com o tônus induzido somente pela presença da NA, todas as tetra-aminas analisadas apresentaram redução significativa do tônus vascular (Figura 2).

Figura 2 Efeito das tetra-aminas (A) CyNO − trans-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2, (B) PyNO − trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+ e (C) 4-acPyNO − trans-[RuII(NH3)4(4-acPy) (NO)]3+ 10-6M, em anéis de aorta isolados de ratos com endotélio – CE (■) e sem endotélio – SE (□), comparadas aos experimentos sem os respectivos compostos. *Valor de p < 0,05, teste t de Student não pareado em relação aos valores obtidos sob tônus induzido na presença de noradrenalina (10-6M). CE: PyNO com p = 0,0036; CyNO com p = 0,0008; 4-acPyNO com p = 0,0026; SE: PyNO com p = 0,0022; CyNO com p = 0,0022; 4-acPyNO com p = 0,0014.

Depois de realizada a pré-contração com NA, os compostos analisados apresentaram, tanto em anéis CE quanto em anéis SE, aumento de tônus durante a primeira hora do ensaio e, somente após 90 minutos, demostraram redução do tônus vascular (Figura 3).

Figura 3 Efeito das tetra-aminas (A) CyNO − trans-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2, (B) PyNO − trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+ e (C) 4-acPyNO − trans-[RuII(NH3)4(4-acPy) (NO)]3+ 10-6 M, após concentração única de noradrenalina 10-6 M, em anéis de aorta isolados de ratos com endotélio – CE (■) e sem endotélio – SE (□). *Valor de p < 0,05, teste t de Student não pareado dos valores obtidos em relação ao tempo zero da administração do composto. CE: PyNO com p = 0,0195; CyNO com p = 0,0241; 4-acPyNO com p = 0,0116; SE: PyNO com p = 0,0216; CyNO com p = 0,0377; 4-acPyNO com p = 0,0179.

Em anéis SE, a inibição da GC alterou significativamente a resposta contrátil induzida pelo CyNO, causando resposta vascular relaxante logo nos primeiros 30 minutos. Não foram observadas respostas significativas em anéis CE (Figura 4).

Figura 4 Efeito de trans-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2 − CyNO, em anéis de aorta (A) com endotélio (CE) e sem endotélio (SE) frente às respostas aos inibidores enzimáticos: L-NAME CE (▲) e SE (△); indometacina CE (t) e SE (♢); ODQ CE (x) e SE (×) e C-PTIO CE (l) e SE (¡). * Valor de p < 0,05, teste t de Student não pareado em relação aos valores obtidos na ausência de antagonista ou inibidor enzimático CyNO vs. ODQ SE com p = 0,0152.

A resposta contrátil induzida pela PyNO em anéis CE foi significativamente reduzida com a inibição da eNOS, da ciclo-oxigenase e da GC. Nos primeiros 60 minutos, apenas a inibição da GC demostrou efeito redutor, ao passo que a inibição da eNOS e da ciclo-oxigenase responderam somente ao final de 120 minutos de incubação. Na ausência de células endoteliais, o efeito redutor foi significativo apenas com a inibição da GC (Figura 5).

Figura 5 Efeito de PyNO − trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+, em anéis de aorta (A) com endotélio (CE) e sem endotélio (SE) frente às respostas aos inibidores enzimáticos: L-NAME CE (▲) e SE (△); indometacina CE (t) e SE (♢); ODQ CE (x) e SE (×) e C-PTIO CE (l) e SE (¡). * Valor de p < 0,05, teste t de Student não pareado em relação aos valores obtidos na ausência de antagonista ou inibidor enzimático CE: PyNO vs. L-NAME, com p = 0,0056; PyNO vs. indometacina, com p = 0,0459; PyNO vs. ODQ, com p = 0,0043; SE: PyNO vs. ODQ, com p = 0,0140.

Com o objetivo de melhor entender o efeito causado por esses complexos, foram realizados ensaios com o complexo PyNO 10^-6 M na presença de mais de um inibidor enzimático como, por exemplo, ensaios com pré-incubação de L-NAME e indometacina, com a intenção de bloquear ação do NO endógeno e, ao mesmo tempo, a ação de eicosanoides, tal como a prostaciclina (PGI₂ e TXA₂). Também foram realizados ensaios com L-NAME, indometacina e ODQ, a fim de eliminarmos as possíveis variáveis como NO endógeno (síntese e ação) e eicosanoides endógenos (PGI₂ e TXA₂) no mesmo ensaio.

Dessa maneira, quando impedimos a função do endotélio bloqueando a eNOS e, ao mesmo tempo, a ciclo-oxigenase, notamos significativa diminuição do tônus vascular em anéis CE, confirmando a ação direta do complexo PyNO na musculatura lisa. Não foram observadas alterações da resposta vascular em anéis SE.

Quando bloqueamos as possíveis interferências sobre o composto, ou seja, impedimos a síntese de NO com o bloqueio da eNOS, além da ação do mesmo pelo bloqueio da GC, assim como a possível interferência da PGI2 ou TXA2 com o impedimento da função da ciclo-oxigenase, ao mesmo tempo observamos redução da resposta contrátil em ambos os anéis, comprovando efetivamente o efeito vascular do complexo PyNO de forma direta na musculatura lisa (Figura 6).

Figura 6 Efeito de PyNO − trans-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+ 10-6M em resposta aos inibidores enzimáticos L-NAME, indometacina e ODQ simultaneamente em anéis de aorta (A) com endotélio (CE) e (B) sem endotélio (SE). * Valor de p < 0,05, teste t de Student não pareado em relação aos valores obtidos na ausência de antagonista ou inibidor enzimático. CE: PyNO vs. PyNO +L-NAME e indometacina, com p = 0,0056, e PyNO vs. PyNO +L-name, indometacina e ODQ, com p = 0,0454.

Quando comparados os efeitos do complexo PyNO em relação à acetilação do complexo 4-acPyNO, não houve diferença significativas relacionadas à diminuição do efeito contrátil, tanto em anéis CE quanto em anéis SE.

Os resultados foram também analisados em Área sob a Curva (AUC, sigla do inglês Area Under the Curve). Observamos que a resposta induzida pelos compostos PyNO, CyNO e 4-acPyNO não diferiram entre si quando avaliadas em anéis CE e nem em anéis SE (Tabela 1). Por outro lado, a inibição da eNOS pelo L-NAME causou diminuição significativa na resposta induzida pela PyNO e pelo CyNO em anéis CE, fato não observado em anéis SE. O mesmo efeito foi observado quando inibimos a via da ciclo-oxigenase, ou seja, houve redução significativa na resposta em anéis CE e sem alteração em anéis SE. A inibição da GC, causada pelo ODQ, levou à redução na resposta induzida pela PyNO e do CyNO em anéis SE. O sequestro da molécula de NO pelo C-PTIO não alterou a resposta dos compostos avaliados.

Tabela 1 Área sob a curva das tetra-aminas de rutênio <italic>trans</italic>-[RuII(Cl)(NO)(Cyclan)](PF6)2, <italic>trans</italic>-[RuII(NH3)4(Py)(NO)]3+, e <italic>trans</italic>-[RuII(NH3)4(4-acPy)(NO)]3+ em anéis de aorta com (CE) e sem endotélio (SE), isoladas de ratos normotensos

	trans- [Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂		trans-[Ru(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺		trans-[Ru(NH₃)₄(4-acPy)(NO)]³⁺
	CE	SE	CE	SE	CE	SE
-	1.110,6 ± 225,6	1.068,7 ± 317,5	2.292,2 ± 520,6	1.069,4 ± 317,2	1.949,0 ± 542,4	1.292,9 ± 312,8
L-NAME (10-30 μM)	439,9 ± 75,0*	898,7 ± 250,6	852,4 ± 245,4*	898,6 ± 250,3	-	-
Indometacina (5,6 μM)	496,3 ± 92,4*	741,1 ± 161,9	796,07 ± 119,1*	740,7 ± 161,9	-	-
ODQ (3-10 μM)	1.424,5 ± 453,1	646,3 ± 149,8	1.109,4 ± 388,4	646,7 ± 149,9	-	-
C-PTIO (10-300 μM)	1.062,7 ± 159,9	646,3 ± 109,6	1.718,9 ± 276,8	1.223,7 ± 327,6	-	-
L-NAME (10-30 μM), indometacina (5,6μM) e ODQ (3-10μM)	-	-	1.111,850 ± 350,891	1.329,567 ± 510,506	-	-

Área sob a curva das tetra-aminas de rutênio (ASC)) trans-[Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂, trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺ e trans-[Ru^II(NH₃)₄(4-acPy)(NO)]³⁺; trans-[Ru^II(Cl)(NO)(Cyclan)](PF₆)₂ e trans-[Ru^II(NH₃)₄(Py)(NO)]³⁺estão apresentadas na ausência e na presença de L-NAME, indometacina, ODQ e carboxy-PTO em anéis de aorta com (CE) e sem (SE) endotélio.

Valor de p <0,05; Análise de Variância (ANOVA) seguida de Dunnet e teste t de Student quando adequado. (-) indica ausência de ensaios com os inibidores enzimáticos analisados; ASC é demostrada média ± erro padrão da média em gF/minutos.

Discussão

Os nitrosilo complexos de classe trans-[Ru^II(NH₃)₄(L)(NO)]³⁺ são considerados moléculas especialmente interessantes devido à sua baixa toxidade, sua boa solubilidade em água e, principalmente, por demostrarem capacidade de modulação da liberação do óxido em função do efeito trans desempenhado pela escolha do ligante L, concomitante ao fato do potencial de redução do NO⁺ ser acessível a diversos redutores encontrados em meio biológico5^,6. É exatamente a natureza do ligante L que controla a força da ligação Ru-NO, pois quanto maior for a propriedade receptora do ligante, mais fraca é a do NO9. De acordo com Tfouni e cols.4, a liberação ou retenção de NO é seletiva ao alvo biológico, e uma possível alternativa seria a imobilização dos complexos em sílica, o que, dessa maneira, facilitaria a ação de agentes redutores, formando provavelmente materiais mais estáveis.

Entretanto, foi demostrado que o ancoramento em sílica não modifica a reatividade do composto, comprovando que as propriedades na ligação Ru-NO se modulam em alteração conforme a natureza do ligante4.

Em estudo realizado por Caramoni e Frenking26, observou‑se que a utilização de tretra-azomacrociclos como, por exemplo, trans-[RuCl(NO)(Cyclan) como ligantes equatoriais promove maior estabilidade da ligação Ru-NO, sendo, com isso, utilizado como agentes vasodilatadores9. Entretanto, estudos em ratos hipertensos com o complexo trans-[Ru^II(NO⁺)(Cyclan) Cl(PF₆)₂ demostraram diferenças no tempo de relaxamento em quando ativado termicamente (595 segundos) ou pela irradiação por luz (50 segundos)4.

Estudos realizados em aorta de ratos demostraram que o relaxamento do composto trans-[Ru^II(NO⁺)(Cyclan)Cl(PF₆)₂ foi prejudicado sob a irradiação de luz, sendo a quantidade de NO liberada insuficiente para atingir as vias biológicas4^,27. Portanto, torna-se importante avaliar a intensidade e o tempo em que o relaxamento acontece e, consequente a isso, a K-NO torna-se determinante no tempo do efeito vasorrelaxante4.

Nossos resultados demostraram que o efeito vascular dos complexos avaliados apresentou diminuição no tônus contrátil seguido de efeito relaxante de 90 a 120 minutos de incubação, sugerindo que o tempo decorrido durante o ensaio não foi suficiente para a eficaz liberação de NO do composto. Simultaneamente, podemos considerar que a influência do ligante piridina ou cyclan sobre o composto tenha determinado a K-NO e, consequentemente, a estabilização da ligação Ru-NO, de forma a liberar mais rapidamente ou mais lentamente o NO do conjunto metálico.

O relaxamento promovido pelo Ru II parece ser mediado também pelo estímulo da GCs, mas também tem sido relacionado à ativação direta de canais de K⁺ independente de GMPc, o que o envolve diretamente no processo de relaxamento vascular promovido pelo NO. O NO tem duas vias de sinalização, uma cGMP-dependente e uma independente de cGMP, o que poderia ativar diretamente os canais de K⁺28.

Outro fator importante para o desencadeamento da vasodilatação na musculatura lisa é a diminuição da concentração do cálcio citosólico, por meio da inibição da entrada de cálcio29. Estudos indicam que a via NO/GMPc pode diminuir a concentração de cálcio intracelular e reduzir, dessa forma, a sensibilidade contrátil, resultando no relaxamento da musculatura lisa4.

Segundo pesquisas realizadas por Lunardi e cols.30, ensaios de microscopia confocal em trans-[Ru^II(NO⁺)([15]aneN4)Cl]⁺, [Ru^II(NO⁺)(NH₃NHQ)(terpy)]³⁺ e cis-[Ru^II(NO⁺)(bpy)₂Cl](PF6)₂ diminuíram as concentrações de cálcio no meio vascular4.

Outro estudo demonstrou que o relaxamento dos complexos trans-[Ru^II(NO⁺)(cyclan)Cl]³⁺ e trans-[Ru^II(NO⁺) (NH₃)₄P(OEt)₃]³⁺ foi completamente bloqueado com a utilização de um sequestrador de NO e inibidores da GCs, sugerindo que o mecanismo de ação estaria relacionado a via NO-GMPc4.

Nossos estudos apresentam alterações relacionadas a via NO/GMPc, visto que, com o complexo CyNO, a inibição da GC promoveu o relaxamento vascular mais rapidamente em anéis SE, o que também pode ser observado referente ao complexo PyNO, sugerindo forte interferência da via NO/GMPc no efeito vascular dos compostos analisados.

O NO é o mediador comum liberado de todos os complexos vasodilatadores, porém o que difere o mecanismo de ação é a especificidade da ativação da GCs, sendo esta diferente para cada doador30. Sabendo que o NO pode também existir em uma variedade de formas como íon, ou mesmo radical livre nitrosilo ou nitrônio, o NO liberado dos complexos de Ru pode ser diferente daquele produzido pelas células endoteliais. Isso explicaria a diferença de potência e a eficácia que os doadores de NO apresentam na indução ao relaxamento vascular30.

Conclusão

Os resultados obtidos demonstram que o efeito vascular dos complexos avaliados apresentaram diminuição no tônus vascular induzido pela noradrenalina (10^-6M) ao final do tempo de incubação, em anéis com e sem endotélio, indicando a liberação lenta da molécula de óxido nítrico do composto estudado e sugerindo que os ligantes causaram estabilidade química à molécula. Demonstramos que a ligação Ru-NO é mais estável quando utilizamos os ligantes piridina e cyclan para a formulação do composto.

Considerando o protocolo utilizado, as respostas vasculares induzidas pelos compostos estudados nos anéis de aorta com endotélio dependem parcialmente das vias da ciclo-oxigenase, guanilato ciclase e eNOS. Por outro lado, somente a via da guanilato ciclase modula a resposta vascular desses compostos em anéis de aorta sem endotélio.

Até o presente momento, um grande número de complexos de rutênio foi sintetizado e testado para possível utilização terapêutica. Os efeitos e seus mecanismos de ação estão sendo intensamente estudados por diferentes grupos de pesquisa. Porém, muitos detalhes ainda são desconhecidos, permanecendo, assim, o desafio para as pesquisas interdiciplinares.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela Fapesp e parcialmente financiado pela Faepex.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Ana Gabriela Conceição Vertamatti pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).