Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia QqyXrZtt6jCFSn6XqDWsfpJ S0066-782X2015000200008 00008 S0066-782X2014005040190 10.5935/abc.20140190 Original Articles Neural Mechanisms and Delayed Gastric Emptying of Liquid Induced Through Acute Myocardial Infarction in Rats Nunez Wilson Ranu Ramirez Ozaki Michiko Regina Vinagre Adriana Mendes Collares Edgard Ferro Almeida Eros Antonio de Universidade Estadual de Campinas Campinas SP Brasil Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP - Brasil Mailing Address: Eros Antonio de Almeida, Professor Jorge Nogueira Ferraz, Jardim Chapadão, Postal Code 13070-120, Campinas, SP – Brazil. Email: erosaa@cardiol.br; eros@fcm.unicamp.br

Author contributions

Conception and design of the research: Nunes WRR, Collares EF, Almeida EA; Acquisition of data: Nunes WRR, Ozaki MR, Vinagre AM, Collares EF; Analysis and interpretation of the data: Nunes WRR, Ozaki MR, Collares EF, Almeida EA; Statistical analysis: Nunes WRR, Vinagre AM; Writing of the manuscript: Nunes WRR; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Ozaki MR, Collares EF, Almeida EA.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 02 2015 09 12 2014 104 2 144 151 04 06 2014 28 08 2014 02 09 2014 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

In pathological situations, such as acute myocardial infarction, disorders of motility of the proximal gut can trigger symptoms like nausea and vomiting. Acute myocardial infarction delays gastric emptying (GE) of liquid in rats.

 Objective:

Investigate the involvement of the vagus nerve, α 1-adrenoceptors, central nervous system GABAB receptors and also participation of paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus in GE and gastric compliance (GC) in infarcted rats.

 Methods:

Wistar rats, N = 8-15 in each group, were divided as INF group and sham (SH) group and subdivided. The infarction was performed through ligation of the left anterior descending coronary artery. GC was estimated with pressure-volume curves. Vagotomy was performed by sectioning the dorsal and ventral branches. To verify the action of GABAB receptors, baclofen was injected via icv (intracerebroventricular). Intravenous prazosin was used to produce chemical sympathectomy. The lesion in the PVN of the hypothalamus was performed using a 1mA/10s electrical current and GE was determined by measuring the percentage of gastric retention (% GR) of a saline meal.

 Results:

No significant differences were observed regarding GC between groups; vagotomy significantly reduced % GR in INF group; icv treatment with baclofen significantly reduced %GR. GABAB receptors were not conclusively involved in delaying GE; intravenous treatment with prazosin significantly reduced GR% in INF group. PVN lesion abolished the effect of myocardial infarction on GE.

 Conclusion:

Gastric emptying of liquids induced through acute myocardial infarction in rats showed the involvement of the vagus nerve, alpha1- adrenergic receptors and PVN.

 Rats Gastric Emptying Myocardial Infarction Midline Thalamic Nuclei Receptors GABA Gastrointestinal Motility Introduction

The gastric emptying (GE) process results from mechanism actions that inhibit or stimulate the motor activity of the stomach, pylorus and duodenum. The central nervous system connects itself with the enteric nervous system through the vagus nerve and sympathetic nervous system, participating in GE control1.The vagus nerve controls food movement throughout the digestive tract. If this mechanism is impaired, the stomach muscles and intestines do not function normally and food transportation slows down or stops completely. The dorsal vagal complex consists of the solitary tract nucleus with neurons that receive afferent information, area postrema and the dorsal nucleus of the vagus, where stimulatory and inhibitory motoneurons are located, with the axons being efferent pathways of the vagus nerve2. The dorsal vagal complex is more influenced by higher structures, such as the paraventricular nucleus of hypothalamus, which under certain conditions can modify gastric motility and GE2-4. In rats, GABAB receptors are located in the presynaptic afferent endings of the vagus that project into the solitary tract nucleus5. Presynaptic GABAB receptors are involved in regulation of neurotransmitter release, as the effect of (an agonist for these receptors) is to reduce the release of stimulatory and inhibitory synaptic transmitters6,7. In pathological situations, such as acute myocardial infarction, disorders of motility of the proximal gut can trigger symptoms like nausea and vomiting8.

Experimental studies on the association of myocardial infarction and gastric emptying9,10 are very rare, and one study10 considered that delayed gastric emptying may be due to stress caused by ischemia. However, the underlying mechanisms of delayed gastric emptying were not addressed. Therefore, the present study aimed to determine the involvement of neural mechanisms related to delayed gastric emptying.

 Methods

Male Wistar rats (n = 8-15) were used to perform this experiment, weighing 220 to 300 g, supplied by the Central Animal Facility of Universidade Estadual de Campinas. The study protocol was approved by SBCAL (Brazilian Society of Laboratory Animal Sciences) (www.ib.unicamp.br/ceea/principios) (Protocol Nº. 1021-2).

Rats had an adjustment period of four weeks to laboratory conditions with controlled temperature (22 - 26ºC) and artificial light cycle of 12 hours and were given water ad libitum. In surgical procedures such as vagotomy or implantation of cannula into the lateral brain ventricle or electrolytic lesion of the paraventricular nucleus, the rats were previously sedated with intra-peritoneal (ip) injection of thiopental 75mg/Kg. After the procedures or the study, the animals were kept in individual cages, receiving water and food ad libitum. In order to study GC, the animals were anesthetized with ip administration of ketamine (85mg/kg) + xylazine (10mg/kg).

The drugs prazosin (PRA) and baclofen (BAC) (both from Sigma, USA) were diluted at the time of the study, using sterile saline as vehicle (V).

Myocardial infarction

Myocardial infarction was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery, according to the technique recommended by Johns & Olson11. The rats were anesthetized with ether and thoracotomy was performed. Through gentle pressure applied to the right hemithorax, the heart was exposed and a ligature was performed around the proximal left coronary artery in its proximal segment, between the pulmonary artery cone and the left atrial apex. Only the animals with major infarction, i.e., involving 40% or more of the entire area of the left ventricle, were considered for the study. Twenty-four hours after the surgical procedure, studies were performed by measuring gastric compliance (GC), vagotomy, intracerebroventricular injection with GABAB, intravenous treatment with prazosin and electrolytic paraventricular nucleus lesions.

In order to measure GC, rats were divided into three groups twenty-four hours before: rats were submitted to myocardial infarction (INF), and also to simulated infarction (SH) and naive (NA). Only the INF and SH groups were used to determine GE. Rats in all groups were fasted and GE or GC were evaluated twenty-four hours after these groups were formed, between 2:00 pm and 5:00 pm, and access to water was cancelled an hour before the test.

 Gastric Complacence

The technique described by Bustorff-Silva et al12 was used to measure GC. In brief, anesthetized rats were submitted to the following procedures: tracheotomy, abdominal incision, pylorus ligation, fixation of distal esophagus with an orogastric polyethylene tube filled with saline solution and connected through a three-way stopcock to an infusion pump (model LF 2001 Lifemed, Brazil) and a pressure monitor (Biomotor 7.0, BESE, Belo Horizonte - Brazil). Thirty minutes after these procedures, saline solution at 37 ºC was infused into the stomach of each animal, at a rate of 1.5 mL/100g weight/ min intermittently, every 20 seconds (s) at 1-minute intervals. Every 20s (1/3 the volume) the infusion was stopped and the system was balanced for 50s, while recording intragastric pressure (IGP). Intragastric pressure corresponding to 1/3, 2/3 and the total volume were recorded. The procedure was repeated twice with 30-min intervals. The results of each animal corresponded to the mean of three measurements at each point of IGP. To estimate the GC, curves of volume/ pressure were constructed and calculated through the following formula:

Compliance (mL/mmHg) = V1 – V0 / P1 – P0,

Where V0= initial volume and V1= final volume;

P0= initial IGP and P1 = final IGP.

 Gastric emptying

A saline solution containing phenol red (6mg/dl) with a volume of 1.5 mL/100g bodyweight was used as a test meal in the GE study. Gastric emptying was assessed indirectly in awaken rats, to determine the percentage of gastric retention (% GR) of test meal, after ten minutes of the orogastric administration, using a standardized technique13.

The rats were placed vertically and the test meal infused by gavage to reach the stomach. After the administration, the animals remained in the cage for 8 min and 30 sec. After being anesthetized with ether, the orogastric tube was introduced, keeping the animals anesthetized by ether inhalation. The abdomen was opened longitudinally and the pylorus clamped, exactly 10 minutes after orogastric infusion. All steps were timed. The gastric residue was aspirated and then five washes were performed with 2 mL of distilled water at each time, taking care to always aspirate using the same syringe. Complete emptying was confirmed by direct visualization of the viscera. The probe was then removed and negative pressure was applied to the euthanized animal. The gastric residue obtained plus the washings were transferred to a 25 mL graduated cylinder, and the aspiration tools (probe and syringe) were washed three times with one mL of water each time, and the volume was added to the beaker.

To determine the percentage of gastric retention (GR%) 2.0 mL were taken from the total volume recovered, and transferred in duplicate to 10 mL volumetric flasks, to which 5.0 mL of a trisodium phosphate solution were added at a concentration of 27.5 g/L. The same procedure was performed with one mL of the test meal. The final volume was completed to 10 mL with distilled water. The readings were made in a spectrophotometer (Spectrophotometer B 382, Micronal) at a wavelength of 560 nM. GR was calculated using the following formula:

GR = vrg × arg ÷ vrp × arp and the result was multiplied by 100.

Where: vrg = volume of gastric residue; arg = gastric residue absorbance; vrp = volume of the test meal; arp = absorbance of the test meal.

 Vagotomy

Two weeks before the vagotomy study, rats underwent subdiaphragmatic vagotomy (VGX), in which the dorsal and ventral branches of vagus nerve were sectioned, while other animals were submitted to sham procedure (VGS), constituting the controls. Twenty-four hours before the procedure of GE, animals VGX and VGS, were submitted to surgical infarction, while others were submitted to the same simulated surgery.

 Intracerebroventricular baclofen injection

To study the involvement of GABAB receptors in the central nervous system eight days before the GE study, each animal, underwent implantation of a cannula (21G) in the right lateral ventricle, using techniques and coordinates related to bregma14, as previously described15. Twenty-four hours prior to the GE study, rats were submitted to surgical infarction (INF), while others were submitted to the same simulated surgery (SH). Ten minutes before GE assessment, the two groups were treated with an intracerebroventricular (icv) injection of 10μL of saline solution (V) or an equal volume of solution containing 1µg of BAC. The dose of BAC used was based on the literature16. GE was evaluated ten minutes after the end of the injection.

 Involvement of alpha1-adrenergic receptors

To study the involvement of alpha-1adrenergic receptors, both INF and SH animals , were treated intravenously (iv) through a tail vein, with saline as vehicle (V) or prazosin at a dose of 1mg/kg, 24 hours after the surgery, and dose given was based on the literature17. GE was evaluated fifteen minutes after the injection.

 Paraventricular nucleus of the hypothalamus lesion

To evaluate the involvement of the paraventricular nucleus, ten days prior to the GE study , the animals were submitted to a restricted PVN lesion (group PVNX) at two points, bilaterally, with passage of a 1 mA/10 s electrical current injury , using nickel and chromium electrodes with 0.25 mm in diameter. The coordinates in relation to the bregma, were the following: anterior-posterior (AP) -1.2 and -1.5 mm, lateral ± 0.5 mm, vertical 7.8 mm and 8.0 points corresponding to AP, as shown in another study15. In rats with sham lesion (PVNS), the same coordinates were used, except the vertical one, in which the depth was 7.5 mm, without the passage of an electrical current.

Twenty-four hours before the GE procedure, PVNX and PVNS animals were divided into INF and SH groups. After the experiments, all rats were euthanized. In the INF group, the hearts were removed, sectioned in the sagittal plane, using the left auricle, the interventricular sulcus and left ventricular outflow tract as reference points. Then, the two halves were fixed in 10% formalin and embedded in paraffin. The histological sections stained with hematoxylin-eosin were used to determine % of infarction area in relation to the entire area of the left ventricle, using a standard technique18.

In the PVNX group, the brains were removed, fixed, embedded in paraffin and histological sections were stained with toluidine blue. To confirm the site of injury, the sections, under microscopic view, were compared to the Paxinos & Watson19 atlas in another study performed in the same laboratory15.

In animals with implantation of a cannula into the lateral ventricle, the assessment was made with an icv injection of 10μL of an Evans Blue solution at 1% at the end of the GE study. In this group, after euthanization, the brains were removed and fixed in 10% formalin, and coronal sections were obtained and confirmed when the dye injected icv was found in the fourth ventricle.

 Statistical Analysis

The SAS (Statistical Analysis System) for Windows software, version 9.2 (SAS Institute Inc., 2002-2008, Cary, NC, USA) was used in the statistical analysis.

The results of GC and GR are presented as mean ± SEM. Statistical analysis was performed using ANOVA, followed by Tukey test when necessary. It was established the value of α = 0.05 for both tests.

 Results

There were no significant differences in GC in the comparison between groups (mean ± SEM of group INF = 0.16 ± 0.03 mL / mmHg, N = 9, group SH = 0.17 ± 0.03 mL/mmHg N = 9, group NA = 0.16 ± 0.01 mL / mmHg, N = 8). The percentage of infarcted area of left ventricle, mean ± SEM, in rats of INF group was 47.8 ± 2.7%.

The results of the study prior to the vagotomy are shown in Figure 1. There were significant differences between GR% of the animals in the VGS+SH vs. VGS+INF groups (mean ± SEM = 36.6 ± 2.0%, N = 10; and 48.0 ± 2.3%, N = 15, respectively), which indicated that infarction determined delayed GE in animals with sham vagotomy when compared to their controls. Moreover, the VGX+INF subgroup presented significantly lower GR% (28.7 ± 2.8%, N = 11) than the VGS + INF group and it did not differ from the VGX + SH group (25.9 ± 1.5%, N = 10). However, the previous vagotomy also significantly reduced GR% in SH group (VGX + SH) when compared to the VGS group (VGS + SH). Therefore, the reduction in GR% caused by vagotomy in INF group was 40% higher. In this study, the infarcted area of left ventricle, mean ± SEM, in VGS + INF animals was 51.7 ± 2.3% and in VGX + INF animals was 50.2 ± 2%.

Results of gastric retention (%) in groups of rats with myocardial infarction (INF) and vagotomy (Vg) * p < 0.05.

Intracerebroventricular treatment with BAC (Figure 2) significantly reduced GR% in the control group (SH+BAC = 17,8 ± 2,6%, N = 11) when compared to treatment with V (SH + V = 32,0 ± 2,9%, N = 9), as well as in the INF +BAC group when compared to INF+V (26.0 ± 3.3%, N = 11 and 40.2 ± 2 1%, N = 10, respectively). Although myocardial infarction increased the GR% in the group of rats treated with vehicle (INF + V), this result did not significantly differ from its control group (SH + V). Additionally, it was found that the mean reduction in GR% determined by BAC was 25% higher in the SH groups than that observed in the INF groups. The infarcted area of the left ventricle, mean ± SEM, in INF + V animals was 51.2 ± 2.7% and 52,2 ± 3 % in INF + BAC animals.

Results of gastric retention (%) in groups of rats with myocardial infarction and inserted metal probe, with baclofen (BAC) or saline (V) injected into the lateral ventricle of the brain * p <0.05.

Figure 3 shows results from the iv treatment with PRA, which significantly reduced GR% in infarcted group (INF + PRA = 22.0 ± 1.5%, 10) when compared to the vehicle-treated group (INF + V = 42.1 ± 2.4%, 10). The same phenomenon occurred among animals from the SH group (SH + PRA = 22.3 ± 1.8%, N = 12 vs SH + V = 30.5 ± 1.3%, N = 11); however, GR% reduction was 77% higher in the INF group. The infarcted area of the left ventricle, in mean ± SEM, in INF + V animals was 55.1 ± 1.2% and 55.2 ± 1.2% in INF + PRA animals.

Results of gastric retention (%) in groups of rats with myocardial infarction that received prazosin (PRA) or Saline (V) injection * p < 0.05.

Figure 4 shows the results of the lesion seen in the paraventricular nucleus in a prior study. Rats with electrolytic PVN lesion and infarction showed a significantly lower GR% (PVNX + INF = 25.0 ± 3.0%, N = 8) compared to animals with sham lesion (PVNS) and infarction (PVNS+INF = 41,2 ±1,7%,N=8). The same lesion did not reduce GR% in control animals (PVNX + SH = 28.5 ± 2.9%, N = 8 vs. PVNS + SH = 32.1 ± 1.9%, N = 10). The infarcted area of the left ventricle, in mean ± SEM, in PVNS + INF animals was 52.2 ± 0.4% and 55.4 ± 0.8% in PVNX + INF animals. As for the histological assessment of the brains after the PVN lesion, only lesions involving 100% of the paraventricular region were considered for this study.

Results of gastric retention (%) in groups of rats with myocardial infarction and lesions of the paraventricular nucleus * p < 0.05. Discussion

Decrease in gastric tone determines slower GE of liquid20. Therefore, under the experimental conditions of this study, acute myocardial infarction did not induce changes in gastric tone in rats. However, as GE is a coordinated action of the stomach, pylorus and duodenum21, it is possible that the determinant factor of delayed GE in myocardial infarction did not act directly on the stomach. Camurça et al9 detected that the transit of liquid in the small intestine is slower in acute myocardial infarction, in addition to delayed GE. It was unclear whether the two disorders are dependent on the same phenomenon or if the effect on GE is a consequence of what occurs after the stomach. As no changes were observed in GC, an alternative speculation to explain delayed GE of liquid in myocardial infarction would be an increase the resistance, of unknown nature, to the meal flow into the small intestine.

Intracerebroventricular treatment with Baclofen significantly reduced GR% in control group (SH) when compared to controls treated with saline and, similarly, in the infarcted group (INF) (Figure 1). In comparative terms, it was surprising that the largest reduction occurred in the control groups. As a result, it was not verified the involvement of GABAB receptors in delayed GE through INF. Baclofen in the central nervous system increases GE of liquids through its capacity to block the dorsal vagal complex, mechanical inhibitory stimuli that act on proximal stomach, conveyed through the afferent vagus nerve fibers22-25. As a result, there is an increased tone in this segment of functional stomach, leading to faster GE of a saline meal. What was expected, considering that the infarction did not modify gastric compliance and may have resulted in an increased tone with the same intensity in controls and infarcted groups, overcoming the condition that determined the delayed GE in infarction.

The previous sub-diaphragmatic section of the ventral and dorsal branches of the vagus nerve significantly reduced GR in infarcted animals and also in SH animals (Figure 3). The result observed between sham animals was expected, as this type of vagotomy can increase gastric emptying of liquid increasing the tone of the proximal stomach26. However, GR% reduction through vagotomy in infarcted animals was higher (approximately 40%), when compared to the mean reductions of GR% between the two groups.

Vagotomy modifies the motor activity of the stomach by blocking the arrival of inhibitory afferent stimuli to the solitary tract and abolishes the efferent stimuli, which originate in the dorsal vagal nucleus1,27,28. Afferent fibers of the vagus nerve carry sensory information from other regions of the gastrointestinal tract and the efferent pathways innervate from the gastric fundus to the descending colon29-30.

Thus, regarding the procedure employed in this study, it is unknown whether we are blocking afferent or efferent stimuli and in which part of the gastrointestinal tract. However, results suggest the participation, at least partially, of the vagus nerve in delayed GE induced by myocardial infarction.

The role of alpha1-adrenoceptors as stimulatory receptors particularly involves smooth muscle contraction, especially the contraction of vascular smooth muscle fibers, determining local vasoconstriction and acting on blood pressure control31. Prazosin is a peripheral antagonist that binds to these receptors in vessels32,33 and has no significant influence on gastric tone and phasic contractions in the stomach34.

Intravenous treatment with Prazosin significantly reduced the effect of myocardial infarction on GE (Figure 3). This fact is related to the one proposed by Camurça et al9, that delayed GE in myocardial infarction would result of increased sympathetic activity as it was observed in the present study, with a possible involvement of the vascular system.

In addition, it was also found that there was a significant GR reduction in SH group, although the reason for this effect remains unknown. In a previous study, carried out in the same laboratory, on the effect of myocardial infarction on GE10, it was found that sham animals showed a non-significant GR increase, when compared with the naive group. This fact was attributed to the combined effect of anesthesia + surgery; these procedures were performed twenty-four hours before the sham group was created. This combined effect, if confirmed in this study, might be less intense at vascular level in the SH group than in the INF group and it can also explain the results of treatment with prazosin. Nevertheless, GR reduction induced through Prazosin was 77% higher in infarcted animals, suggesting involvement of alpha1- adrenoceptors in this condition.

The paraventricular nucleus (PVN) is a major integrative region of the hypothalamus that maintains homeostasis. Practically, PVN is involved in food intake, response to stress and it also modulates metabolic rate and thermoregulation, and participates in regulation of cardiovascular function and the autonomic nervous system35. This hypothalamic structure participates in cardiovascular autonomic regulation36,37. Heart failure has been associated with changes in specific brain areas, as well as the activation of neurons in PVN, which are related to abnormalities in the production of vasopressin, blood volume regulation and sympathetic stimulation (excitation)38.

In this study, infarcted animals with electrolytic lesion of the PVN showed significantly lower GR when compared to infarcted animals with sham lesion. This type of lesion does not reduce GR% in control animals (Figure 4). These results indicate that the PVN lesion abolished the effect of recent myocardial infarction on GE in rats. This finding is an evidence of the important participation of PVN in GE delay in myocardial infarction. It is possible that the partial results obtained with vagotomy and alpha1-adrenergic blockade occurred due to the fact that each one of these procedures affected only one part of the set of changes under PVN effect, determining delayed GE in myocardial infarction.

 Conclusion

The results of this study suggest the involvement of the vagus nerve, the alpha1-adrenergic receptors and the PVN in the delayed GE induced by recent myocardial infarction in rats.

Financial Support

Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Sources of Funding

This study was funded by CAPES.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Wilson Ranu Ramirez Nunes, from Universidade Estadual de Campinas.

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Patel KP Role of paraventricular nucleus in mediating sympathetic outflow in heart failure Heart Fail Rev 2000 5 1 73 86 Artigos Originais Mecanismos Neurais e Retardo do Esvaziamento Gástrico de Liquido Induzido no Infarto Agudo do Miocárdio em Ratos Nunez Wilson Ranu Ramirez Ozaki Michiko Regina Vinagre Adriana Mendes Collares Edgard Ferro Almeida Eros Antonio de Universidade Estadual de Campinas Campinas SP Brazil Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP - Brazil Correspondência: Eros Antonio de Almeida, Professor Jorge Nogueira Ferraz, Jardim Chapadão. CEP 13070-120, Campinas, SP – Brasil. E-mail: erosaa@cardiol.br; eros@fcm.unicamp.br

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Nunes WRR, Collares EF, Almeida EA; Obtenção de dados: Nunes WRR, Ozaki MR, Vinagre AM, Collares EF; Análise e interpretação dos dados: Nunes WRR, Ozaki MR, Collares EF, Almeida EA; Análise estatística: Nunes WRR, Vinagre AM; Redação do manuscrito: Nunes WRR; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Ozaki MR, Collares EF, Almeida EA.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

Distúrbios da motilidade do intestino proximal no infarto agudo do miocárdio podem desencadear sintomas digestivos como náuseas e vômitos. O infarto do miocárdio ocasiona retardo do esvaziamento gástrico (EG) de líquido em ratos.

 Objetivo:

Investigar se existe a influência do nervo vago (VGX), adrenoreceptores α-1, receptores GABAB do sistema nervoso central e participação do núcleo paraventricular (NPV) do hipotálamo no esvaziamento gástrico (EG) e complacência gástrica (CG) em ratos infartados.

 Métodos:

Ratos Wistar (n = 8-15) foram divididos em: grupo infarto (INF), sham (SH) e subdivididos. O infarto foi realizado por ligadura da artéria coronária descendente anterior. A complacência gástrica foi estimada com curvas pressão-volume. Realizada vagotomia por secção dos ramos dorsal e ventral. Para verificar a ação dos receptores GABAB foi injetado baclofeno por via intra ventrículo-cerebral. Simpatectomia química foi realizada com prazosina intravenosa (iv), e na lesão do núcleo paraventricular do hipotálamo foi utilizada corrente elétrica de 1mA/10s, com esvaziamento gástrico determinado por medição da retenção gástrica (% RG) de uma refeição salina.

 Resultados:

Não houve diferença significativa na CG. A vagotomia (VGX) reduziu significativamente a %RG; no grupo INF, o tratamento intra ventrículo-cerebral (ivc) com baclofeno reduziu significativamente a % RG; não houve conclusivamente envolvimento dos receptores GABAB em retardar o EG; o tratamento intravenoso com prazosina reduziu significativamente a %RG no grupo INF. A lesão do NPV aboliu o efeito do infarto do miocárdio no EG.

 Conclusão:

O nervo vago, receptores α-adrenérgicos e núcleo paraventricular estão envolvidos no retardo do esvaziamento gástrico no infarto agudo do miocárdio em ratos.

 Ratos Esvaziamento Gástrico Infarto do Miocárdio Núcleos da Linha Média do Tálamo Receptores de GABA Motilidade Gastrointestinal Introdução

O processo de esvaziamento gástrico (EG) resulta da ação dos mecanismos que inibem ou estimulam a atividade motora do estômago, do piloro e do duodeno. O sistema nervoso central conecta-se com o sistema nervoso entérico através do nervo vago e do sistema nervoso simpático, que participam no controle do EG1. O nervo vago controla o movimento do alimento através do trato digestivo. Se este estiver danificado, os músculos do estômago e intestinos não funcionam normalmente e o transporte de alimentos é retardado ou para completamente.

O complexo vagal dorsal é formado pelo núcleo do trato solitário com neurônios que recebem informações aferentes, área postrema e núcleo dorsal do vago, onde os neurônios motores estimuladores e inibidores estão localizados, sendo os axônios eferentes as vias do nervo vago2. O complexo vagal dorsal é mais influenciado por estruturas superiores, tais como o núcleo paraventricular (NPV) do hipotálamo o qual, sob certas condições, podem modificar a motilidade gástrica e o EG2-4. Em ratos, os receptores GABAB estão localizados nas terminações aferentes pré-sinápticas do vago que se projeta para o núcleo do trato solitário5.

Os receptores GABAB pré-sinápticos estão envolvidos na regulação da liberação de neurotransmissores, uma vez que o efeito de (um agonista desses receptores) é o de reduzir a liberação de transmissores sinápticos estimuladores e inibidores6,7. Em situações patológicas, como infarto agudo do miocárdio, distúrbios da motilidade do intestino proximal podem desencadear sintomas como náusea e vômito8

Estudos experimentais sobre a associação entre infarto do miocárdio e esvaziamento gástrico9,10 são muito raros, e um estudo10 considerou que o retardo do esvaziamento gástrico pode ser devido ao estresse causado pela isquemia. No entanto, os mecanismos subjacentes de esvaziamento gástrico retardado não foram abordados. Portanto, o presente estudo teve como objetivo determinar o envolvimento de mecanismos neurais relacionados ao retardo do esvaziamento gástrico.

 Métodos

Ratos Wistar machos (n = 8-15) foram utilizados para realizar essa experiência, pesando 220-300 g, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual de Campinas.

O protocolo do estudo foi aprovado pelo SBCAL (Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório) (www.ib.unicamp.br/ceea/principios) (Protocolo n º 1021-2).

Os ratos tiveram um período de adaptação de quatro semanas para as condições de laboratório com temperatura controlada (22-26ºC) e ciclo de luz artificial de 12 horas e água fornecida ad libitum. Em procedimentos cirúrgicos como uma vagotomia ou implantação de cânula no ventrículo lateral do cérebro ou lesão eletrolítica do núcleo paraventricular, os ratos foram sedados previamente com injeção intraperitoneal (ip) de 75 mg tiopental/kg. Após os procedimentos ou o estudo, os animais foram mantidos em gaiolas individuais e também receberam água e ração ad libitum. A fim de estudar a CG, os animais foram anestesiados com administração ip de cetamina (85 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg).

As drogas prazosina (PRA) e baclofeno (BAC) (ambos Sigma, EUA) foram diluídas no momento do estudo, utilizando solução salina estéril como veículo (V).

Infarto do miocárdio

O infarto do miocárdio foi induzido por ligadura da artéria coronária descendente anterior, de acordo com a técnica recomendada por Johns e Olson11. Os ratos foram anestesiados com éter e uma toracotomia foi executada. Através de uma leve pressão aplicada ao hemitórax direito, o coração foi exposto e uma ligadura foi colocada ao redor da artéria coronária esquerda proximal em seu segmento proximal, entre o cone da artéria pulmonar e o ápice do átrio esquerdo. Apenas os animais com grande área de infarto foram considerados para o estudo, afetando 40% ou mais de toda a área do ventrículo esquerdo. Vinte e quatro horas após o procedimento cirúrgico foram realizados estudos de avaliação da complacência gástrica (CG), vagotomia, intra ventrículo-cerebral com GABAB, tratamento intravenoso com prazosina e lesões eletrolíticas do núcleo paraventricular.

A fim de medir a CG, os ratos foram divididos em três grupos 24 horas antes: os ratos foram submetidos ao infarto do miocárdio (INF), e também ao infarto simulado ou sham (SH) e sem tratamento (NA). Apenas os grupos INF e o SH foram usados para determinar o EG. Os ratos em todos os grupos foram submetidos a jejum e o EG ou a CG foram avaliados 24 horas após a formação desses grupos, entre as 14:00-17:00 horas, com acesso a água interrompido uma hora antes do teste.

 Complacência gástrica

Com o objetivo de medir a CG, foi utilizada a técnica descrita por Bustorff-Silva e cols.12. Em resumo, foram realizados os seguintes procedimentos em ratos anestesiados: traqueostomia, incisão abdominal, a ligadura do piloro, fixação do esôfago distal de um tubo orogástrico de polietileno preenchido com solução salina e conectado através de um registro de três vias a uma bomba de infusão (modelo LF 2001 Lifemed, Brasil) e um monitor de pressão (Biomotor 7.0, BESE, Belo Horizonte - Brasil). Trinta minutos após esses procedimentos foi infundida no estômago de cada animal uma solução salina a 37 º C, a uma taxa de 1,5 mL /100 g de peso/min, intermitentemente a cada 20 segundos (s) em intervalos de 1 min. A cada 20 s (1/3 do volume) a infusão era interrompida e o sistema balanceado para 50 s, com um registro de pressão intragástrica (PIG). Foram registadas (pressões intragástricas correspondentes a 1/3, 2/3 e o volume total. O procedimento foi repetido duas vezes com intervalos de 30 min. O resultado de cada animal correspondeu à média de três medições em cada ponto da PIG. Foram construídas curvas de volume/pressão para estimar a CG, calculadas através da seguinte fórmula:

Complacência (mL/mmHg) = V1 - V0 / P1 - P0,

Onde V0 = volume inicial e V1 = volume final

PO = PIG inicial e P1 = PIG final.

 Esvaziamento gástrico

Uma solução salina contendo vermelho fenol (6 mg/dL) no volume de 1,5 mL/100 g de peso corporal foi utilizada como refeição teste no estudo de EG. O esvaziamento gástrico foi avaliado indiretamente em ratos acordados, para determinar o percentual de retenção gástrica (% GR) da refeição teste, após 10 minutos da administração orogástrica, usando uma técnica padronizada13.

Os ratos foram colocados na vertical e a refeição teste administrada por sonda esofágica para atingir o estômago. Após a administração, os animais permaneceram na gaiola durante 8 min e 30 seg. Depois de anestesiados com éter, foi introduzido o tubo orogástrico, mantendo os ratos anestesiados com inalação de éter. O abdômen foi aberto longitudinalmente e o piloro pinçado exatamente 10 minutos após a infusão orogástrica. Todas as etapas foram cronometradas. O resíduo gástrico foi aspirado e, em seguida, foram realizadas cinco lavagens com 2 mL de água destilada de cada vez, tendo o cuidado de aspirar sempre com a mesma seringa. O esvaziamento completo foi confirmado através da visualização direta das vísceras. A sonda foi então removida e a pressão negativa aplicada no animal sacrificado. O resíduo gástrico obtido mais as lavagens foram transferidos para um cilindro graduado de 25 mL, e os instrumentos de aspiração (sonda e seringa), foram lavados três vezes com um mL de água de cada vez, e o volume adicionado ao béquer.

Para determinar a porcentagem de retenção gástrica (RG%) foi tomado 2,0 mL do volume total recuperado de e transferido, em duplicata, para balões volumétricos de 10 mL, aos quais foram adicionados 5,0 mL de uma solução de fosfato de trisódio na concentração de 27,5 g/L. O mesmo procedimento foi realizado com 1 mL da refeição teste. O volume final foi completado até 10 mL com água destilada. As leituras foram feitas em um espectrofotômetro (espectrofotômetro B 382, Micronal) no comprimento de onda de 560 nm. Para calcular a RG foi utilizada a seguinte fórmula:

RG = vrg × arg ÷ vrp × arp e o resultado multiplicado por 100.

Onde: vrg = volume de resíduo gástrico; arg = absorbância do resíduo gástrico; vrp = volume da refeição teste; arp = absorbância da refeição teste.

 Vagotomia

Duas semanas antes do estudo da vagotomia, os ratos foram submetidos à vagotomia subdiafragmática (VGX), na qual foram seccionados os ramos dorsal e ventral do nervo vago, enquanto outros animais foram submetidos a uma cirurgia simulada (VGS), os quais foram considerados os controles. Vinte e quatro horas antes do procedimento de EG, os animais VGX e VGS foram submetidos à infarto cirúrgico (INF), enquanto os outros foram submetidos à mesma cirurgia simulada (SH).

 Injeção intra ventrículo-cerebral de baclofen

Para estudar o envolvimento de receptores GABAB no sistema nervoso central de cada animal, oito dias antes do estudo de EG os ratos foram submetidos a implante no ventrículo lateral direito de uma cânula (21G), utilizando técnicas e as coordenadas relacionadas ao bregma14, conforme descrito anteriormente15. Vinte e quatro horas antes do estudo de EG os ratos foram submetidos a cirurgia de infarto e os outros para a mesma cirurgia simulada. Dez minutos antes da determinação do EG, os dois grupos foram tratados com injeção intra ventrículo-cerebral (ivc) de 10 μL de solução salina (V) ou um volume igual de uma solução contendo 1 µg de BAC. A dose de BAC utilizada foi baseada na literatura16. Dez minutos após a injeção, o EG foi avaliado.

 Envolvimento dos receptores adrenérgicos alfa-1

Para estudar o envolvimento de receptores adrenérgicos alfa-1 nos grupos INF e SH, 24 horas após a cirurgia, os grupos foram tratados por via intravenosa (iv) através de uma veia da cauda, com solução salina como veículo (V) ou prazosina na dose de 1 mg/ kg, e a dose dada foi baseada no literatura17. O EG foi avaliado quinze minutos após a injeção.

 Lesão do núcleo paraventricular do hipotálamo

Para avaliar o envolvimento do núcleo paraventricular, 10 dias antes do estudo de EG, os animais foram submetidos a uma lesão limitada do núcleo paraventricular (grupo PVNX) em dois pontos, bilateralmente, com passagem de uma corrente eléctrica de lesão de 1 mA/10 s, utilizando-se eletrodo de níquel e cromo de 0,25 milímetros de diâmetro. As coordenadas em relação à bregma foram as seguintes: anteroposterior (AP) -1,2 e -1,5 mm, lateral ± 0,5 mm, vertical 7,8 milímetros e 8,0 pontos correspondentes à AP, já vista em outro estudo15. Em ratos com lesão simulada (PVNS), foram utilizadas as mesmas coordenadas, exceto a vertical, na qual a profundidade foi de 7,5 mm, sem a passagem de uma corrente elétrica.

Vinte e quatro horas antes do procedimento de EG, os animais PVNX e PVNS foram divididos em grupos INF e SH. Após os experimentos, todos os ratos foram sacrificados. No grupo INF, os corações foram removidos, seccionados no plano sagital, utilizando como pontos de referência a aurícula esquerda, o sulco interventricular e via de saída do ventrículo esquerdo. Em seguida, as duas metades foram fixadas em formalina a 10% e embebidos em parafina. Os cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina, foram usados para determinar a % da área infartada em relação à área total do ventrículo esquerdo usando uma técnica padronizada18.

No grupo PVNX, os cérebros foram removidos, fixados, embebidos em parafina e os cortes histológicos foram corados com azul de toluidina. Para confirmar o local da lesão, as imagens dos cortes da lesão foram comparados, utilizando microscópio, com imagens no atlas de Paxinos e Watson19 em outro estudo realizado no mesmo laboratório15.

Nos animais com implantação de cânula no ventrículo lateral, a avaliação foi feita com uma injeção intra ventrículo‑cerebral de 10 μL de uma solução de Azul de Evans a 1%, no final do estudo de EG. Nesse grupo, após o sacrifício, os cérebros foram removidos e fixados em formalina a 10%, cortes coronais foram feitos e confirmados quando o corante injetado via icv foi encontrado no quarto ventrículo.

 Análise Estatística

O software SAS (Statistical Analysis System) para Windows, versão 9.2 (SAS Institute Inc., 2002-2008, Cary, NC, EUA) foi usado na análise estatística. Os resultados da CG e RG são apresentados como média ± EPM. A análise estatística foi realizada utilizando-se ANOVA, seguida pelo teste de Tukey quando necessário. Foi estabelecido o valor de α = 0,05 para ambos os testes.

 Resultados

Não houve diferenças significantes de CG, na comparação entre os grupos (média ± EPM do grupo INF = 0,16 ± 0,03 mL / mm Hg, N = 9; grupo SH = 0,17 ± 0,03 mL / mmHg N = 9; grupo NA = 0,16 ± 0,01 mL / mm Hg, N = 8). A porcentagem de área infartada do ventrículo esquerdo, em média ± EPM, em ratos do grupo INF foi de 47,8 ± 2,7%.

Os resultados do estudo antes da vagotomia são mostrados na Figura 1. Houve diferenças significantes entre %RG dos animais com VGS + SH vs. VGS + INF (média ± EPM = 36, 6 ± 2,0%, N = 10; e 48,0 ± 2,3%, N = 15, respectivamente), e isso indicou que o infarto resultou em atraso do EG em animais com vagotomia sham em relação aos controles. Além disso, o subgrupo VGX + INF apresentou RG% (28,7 ± 2,8%, N = 11) significativamente mais baixa do que o grupo VGS + INF e não diferiu do grupo VGX + SH (25,9 ± 1,5%, N = 10). No entanto, a vagotomia anterior também reduziu significativamente RG% no grupo SH (VGX + SH) em comparação com VGS (VGS + SH). Portanto, a redução da RG% por vagotomia no grupo INF foi 40% mais elevada. Nesse estudo, a área infartada do ventrículo esquerdo, média ± EPM, em animais VGS + INF foi de 51,7 ± 2,3% e em animais VGX + INF foi de 50,2 ± 2%.

Resultados de retenção gástrica (%) em grupos de ratos com infarto do miocárdio (INF) e vagotomia (Vg); * p < 0,05.

O tratamento intra ventrículo-cerebral com BAC (Figura 2) reduziu significativamente RG% no grupo controle (SH + BAC = 17,8 ± 2,6%, N = 11) em comparação com o tratamento com V (SH + V = 32,0 ± 2,9%, N = 9), bem como nos grupos INF + BAC em comparação com INF + V (26,0 ± 3,3%, N = 11 e 40,2 ± 2,1%, N = 10, respectivamente). Embora o infarto do miocárdio tenha aumentado a RG% no grupo de ratos tratados com veículo (INF + V), esse não diferiu significativamente do grupo de controle (SH + V). Além disso, verificou-se que a redução média de RG% determinada por BAC foi 25% mais elevada entre os grupos SH do que a observada entre os grupos INF. A área infartada do ventrículo esquerdo, média ± EPM, em animais INF + V foi de 51,2 ± 2,7% e em animais INF + BAC foi de 52,2 ± 3%.

Resultados de retenção gástrica (%) em grupos de ratos com infarto do miocárdio e inserção de sonda metálica e que receberam injeção de baclofeno (BAC) ou Solução Salina (V) no ventrículo lateral do cérebro; * p < 0,05.

A Figura 3 mostra os resultados do tratamento por via i.v. com PRA, o que reduziu significativamente RG% no grupo infarto (INF + PRA = 22,0 ± 1,5%, 10) em comparação com o tratado com veículo (INF + V = 42,1 ± 2,4%, 10). Entre os animais do grupo SH, o mesmo fenômeno ocorreu (SH + PRA = 22,3 ± 1,8%, n = 12 vs. SH + V = 30,5 ± 1,3%, n = 11); no entanto, a redução de RG% foi 77% superior no grupo INF. A área infartada do ventrículo esquerdo, em média ± EPM, em animais INF + V foi de 55,1 ± 1,2% e em animais INF + PRA foi de 55,2 ± 1,2%.

Resultados de retenção gástrica (%) em grupos de ratos com infarto do miocárdio e que receberam injeção de prazosina (PRA) ou Solução Salina (V); * p < 0,05.

Na Figura 4, os resultados da lesão foram vistos em um estudo prévio do núcleo paraventricular. Os ratos com lesão eletrolítica do núcleo e infartados apresentaram uma RG% significativamente menor (PVNX + INF = 25,0 ± 3,0%, N = 8) em comparação com os animais com lesão sham (PVNS) e infartados (PVNS + INF = 41,2 ± 1,7%, N = 8). A mesma lesão não reduziu RG% em animais controle (PVNX + SH = 28,5 ± 2,9%, N = 8 vs. PVNS + SH = 32,1 ± 1,9%, N = 10). A área infartada do ventrículo esquerdo, em média ± EPM, em animais PVNS + INF foi de 52,2 ± 0,4% e em animais PVNX + INF foi de 55,4 ± 0,8%. Nos resultados da análise histológica feita nos cérebros após lesão do núcleo paraventricular, apenas lesões com 100% da região paraventricular foram consideradas para esse estudo.

Resultados de retenção gástrica (%) em grupos de ratos com infarto do miocárdio e lesões do núcleo paraventricular; * p < 0,05. Discussão

A diminuição do tônus gástrico determina um EG mais lento de líquidos20. Portanto, nas condições experimentais desse estudo, o infarto agudo do miocárdio não induziu alterações no tônus gástrico de ratos. No entanto, como o EG é uma ação coordenada do estômago, piloro e duodeno21, é possível que o fator determinante do retarde do EG no infarto do miocárdio não tenha agido diretamente no estômago. Camurça e cols.9 detectaram em infarto agudo do miocárdio, além de retardo no EG, que o trânsito de líquidos no intestino delgado é mais lento. Não ficou claro se os dois transtornos são dependentes de um mesmo fenômeno, ou se o efeito sobre o EG é uma consequência do que ocorre após o estômago. Uma vez que não foi observada alteração na CG, uma alternativa para explicar o retardo do EG de líquidos no infarto do miocárdio seria o aumento da resistência, de natureza desconhecida, do fluxo de alimentos para o intestino delgado.

Tratamento intra ventrículo-cerebral com Baclofen reduziu de maneira significativa a RG% no grupo controle (SH), em comparação com o controle tratado com solução salina e, similarmente, no grupo infartado (INF) (Figura 1). Em termos comparativos, foi surpreendente observar que a maior redução ocorreu nos grupos de controle. Como resultado, não foi concluído o envolvimento dos receptores GABAB no EG retardado através do INF. O Baclofen no sistema nervoso central aumenta o EG de líquidos através de sua capacidade de bloquear o complexo vagal dorsal, estímulos mecânicos inibitórios que atuam no estômago proximal, transmitidos através das fibras aferentes do nervo vago22-25.

Como resultado, há um aumento do tônus desse segmento funcional do estômago, o que leva ao EG mais rápido de uma refeição salina. O que era esperado, considerando que o infarto não alterou a complacência gástrica e pode ter resultado em um aumento do tônus com a mesma intensidade em grupos controle e infartados, superando a condição de que determinou a retardo do GE no infarto.

A secção sub-diafragmática anterior de ramos ventrais e dorsais do nervo vago, reduziu significativamente a RG em animais infartados e também em animais SH (Figura 3). O resultado observado entre os animais sham era esperado, uma vez que esse tipo de vagotomia pode aumentar o esvaziamento gástrico de líquido, aumentando o tônus do estômago proximal26. No entanto, a redução de RG% através da vagotomia em animais infartados foi mais elevada (aproximadamente 40%), quando comparada com as reduções médias de RG% entre os dois grupos.

A vagotomia modifica a atividade motora do estômago através do bloqueio da chegada de estímulos aferentes inibitórios para o trato solitário e abole os estímulos eferentes, que se originam no núcleo dorsal vagal1,27,28. As fibras aferentes do nervo vago transmitem informações sensoriais de outras regiões do trato gastrointestinal e as vias eferentes inervam do fundo gástrico até o cólon descendente29,30.

Assim, no processo utilizado nesse estudo, não se sabe se estamos bloqueando estímulos aferentes ou eferentes e em que parte do trato gastrointestinal. No entanto, os resultados sugerem a participação, pelo menos parcialmente, do nervo vago no retardo do EG induzido por infarto do miocárdio.

O papel dos alfa1-adrenoceptores como receptores estimuladores envolve particularmente a contração do músculo liso, especialmente a contração das fibras musculares lisas vasculares, determinando vasoconstrição local e atuando sobre o controle da pressão arterial31. A prazosina é um antagonista periférico que se liga a esses receptores nos vasos32,33 e não tem influência significativa sobre o tônus gástrico e contrações fásicas no estômago34.

O tratamento intravenoso com Prazosin reduziu significativamente o efeito do infarto do miocárdio no EG (Figura 3). Esse fato está relacionado com o proposto por Camurça e cols.9, que o retardo do EG no infarto do miocárdio resultaria do aumento da atividade simpática, como foi observado no presente estudo, com o possível envolvimento do sistema vascular.

Além disso, verificou-se também que houve uma redução significativa de RG no grupo SH, embora a razão para esse efeito ainda seja desconhecida. Em um estudo anterior feito no mesmo laboratório sobre o efeito de infarto do miocárdio no EG10, verificou-se que os animais sham mostravam um aumento não significativo de RG, em comparação com o grupo sem tratamento. Esse fato foi atribuído ao efeito combinado de anestesia + cirurgia; esses procedimentos foram realizados 24 horas antes do grupo sham ter sido criado. Esse efeito combinado, se confirmado nesse estudo, pode ser menos intenso a nível vascular no grupo SH do que no grupo INF e também pode explicar os resultados do tratamento com prazosin. De qualquer forma, a redução da RG induzida por Prazosin foi 77% maior nos animais infartados, sugerindo o envolvimento de alfa 1-adrenoceptores nessa condição.

O núcleo paraventricular (NPV) é uma grande região integrativa de hipotálamo, que atua para manter a homeostase. Praticamente, o núcleo paraventricular está envolvido na ingestão de alimentos, resposta ao stress e também modula a taxa metabólica e termorregulação e participa na regulação da função cardiovascular e do sistema nervoso autônomo35. Essa estrutura hipotalâmica participa na regulação autonômica cardiovascular36,37. A insuficiência cardíaca tem sido associada a alterações em áreas específicas do cérebro, bem como a ativação de neurônios no NPV, que estão relacionadas a anormalidades na produção de vasopressina, a regulação do volume sanguíneo e estimulação simpática (excitação)38.

Nesse estudo, os animais infartados com lesão eletrolítica do NPV mostraram RG significativamente menor em relação aos animais infartados com lesão simulada.

Esse tipo de lesão não reduziu a RG% em animais do grupo controle (Figura 4). Esses resultados indicam que a lesão no NPV aboliu o efeito de infarto do miocárdio recente no EG em ratos. Essa descoberta é uma evidência da participação importante do NPV no EG retardado no infarto. É possível que os resultados parciais obtidos com vagotomia e bloqueio dos receptores adrenérgicos alfa-1 tenham ocorrido por que cada um desses procedimentos afetou apenas uma parte do conjunto de mudanças causadas pelo NPV, determinando retardo do EG no infarto do miocárdio.

 Conclusão

Os resultados desse estudo sugerem o envolvimento do nervo vago, dos receptores adrenérgicos alfa-1 e do NPV no EG retardado induzido por infarto do miocárdio recente em ratos.

Fontes de Suporte Financeiro

Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela CAPES.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Wilson Ranu Ramirez Nunes pela Universidade Estadual de Campinas.