Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia HsnJV6jRNNVxJmx4ddJYqnv S0066-782X2015000200007 00007 S0066-782X2014005040181 10.5935/abc.20140181 Original Articles Effects of Ischemic Postconditioning on the Hemodynamic Parameters and Heart Nitric Oxide Levels of Hypothyroid Rats Jeddi Sajad 1 2 Zaman Jalal 1 2 Ghasemi Asghar 1 2 Shahid Beheshti University of Medical Sciences Research Institute for Endocrine Sciences Endocrine Physiology Research Center Tehran Iran Endocrine Physiology Research Center - Research Institute for Endocrine Sciences - Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran Shahid Beheshti University of Medical Sciences Research Institute for Endocrine Sciences Endocrine Research Center Tehran Iran Endocrine Research Center - Research Institute for Endocrine Sciences - Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran Mailing Address: Asghar Ghasemi, Endocrine Physiology Research Center,Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Nº 24, Parvaneh Street,Velenjak. Tehran–Iran. Email: ghasemi@endocrine.ac.ir; ghasemi.asghar@gmail.com

Author contributions

Conception and design of the research: Jeddi S, Ghasemi A; Acquisition of data: Jeddi S, Zaman J; Analysis and interpretation of the data: Jeddi S; Statistical analysis and Writing of the manuscript: Jeddi S, Zaman J, Ghasemi A; Obtaining financing: Ghasemi A; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Ghasemi A.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 02 2015 28 11 2014 104 2 136 143 18 05 2014 21 07 2014 08 08 2014 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

Ischemic postconditioning (IPost) is a method of protecting the heart against ischemia-reperfusion (IR) injury. However, the effectiveness of IPost in cases of ischemic heart disease accompanied by co-morbidities such as hypothyroidism remains unclear.

 Objective:

The aim of this study was to determine the effect of IPost on myocardial IR injury in hypothyroid male rats.

 Methods:

Propylthiouracil in drinking water (500 mg/L) was administered to male rats for 21 days to induce hypothyroidism. The hearts from control and hypothyroid rats were perfused in a Langendorff apparatus and exposed to 30 min of global ischemia, followed by 120 min of reperfusion. IPost was induced immediately following ischemia.

 Results:

Hypothyroidism and IPost significantly improved the left ventricular developed pressure (LVDP) and peak rates of positive and negative changes in left ventricular pressure (±dp/dt) during reperfusion in control rats (p < 0.05). However, IPost had no add-on effect on the recovery of LVDP and ±dp/dt in hypothyroid rats. Furthermore, hypothyroidism significantly decreased the basal NO metabolite (NOx) levels of the serum (72.5 ± 4.2 vs. 102.8 ± 3.7 μmol/L; p < 0.05) and heart (7.9 ± 1.6 vs. 18.8 ± 3.2 μmol/L; p < 0.05). Heart NOx concentration in the hypothyroid groups did not change after IR and IPost, whereas these were significantly (p < 0.05) higher and lower after IR and IPost, respectively, in the control groups.

 Conclusion:

Hypothyroidism protects the heart from IR injury, which may be due to a decrease in basal nitric oxide (NO) levels in the serum and heart and a decrease in NO after IR. IPost did not decrease the NO level and did not provide further cardioprotection in the hypothyroid group.

 Ischemic Postconditioning Reperfusion Hypothyroidism Nitric Oxide Rats Introduction

Acute myocardial infarction (AMI) is the principle cause of human mortality worldwide1,2, and its prevalence is increasing because of aging and co-morbid diseases such as obesity, diabetes, and thyroid disorders1-3. AMI is often induced by the partial occlusion of coronary arteries at the site of a ruptured atherosclerotic plaque1,4. Although reperfusion can rescue the ischemic myocardium from unavoidable death, it can also induce side effects, known as ischemia-reperfusion (IR) injuries4. The myocardial response to ischemia can be modulated by different interventions such as ischemic postconditioning (IPost)3,5. IPost is an effective mechanism of protecting the myocardium from IR injuries and is induced by cycles of brief IR periods that are immediately performed upon initiation of reperfusion after prolonged coronary artery occlusion3,4. Although IPost has various clinical applications, most investigations currently conducted on IPost involve healthy myocardium. Coronary artery disease frequently co-exists with other morbidities5; therefore, further research on the pathological condition before the use of the IPost in clinical conditions is necessary5.

Hypothyroidism is a major thyroid gland disease that also affects the heart and has been implicated in an increase in morbidity6. Low thyroid hormone levels could affect the response of the heart to IR injuries6. It is therefore essential to determine the clinical utility of cardioprotective interventions such as IPost in hypothyroid states to design future management strategies.

Nitric oxide (NO) is mainly synthesized by NO synthase enzymes in the heart and plays an important role in cardiac functions. Ischemia of the heart leads to an increase in NO production that might contribute to IR injury. However, no studies have examined the changes in NO content in the hearts of hypothyroid rats. Therefore, the aim of this study was to determine the response of the heart to IPost in a propylthiouracil-induced hypothyroidism rat model. In addition, changes in NO metabolites (NOx) following IR injury and IPost were also assessed.

 Methods Animals

Forty-eight 2-month-old male Wistar rats were obtained from the laboratory animal house of the Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences. We set a 2-sided α of 0.05 and a power of 90%, and the sample size of each group was calculated to be 8 using the formula7: where μ1, S12 and μ2, S22 are the means and variances of the two groups, respectively, and d2 = (μ1 – μ2)2. Rats were housed in an animal room with a temperature of 22 ± 3°C and a relative humidity of 50 ± 6% and given free access to standard rat chow (Pars Co., Tehran) and tap water during the study. The animals were adapted to an inverse 12:12 h light/dark cycle. All experimental procedures employed, as well as rat care and handling, were in accordance with guidelines provided by the local ethics committee of the Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences. Hypothyroidism was induced by adding propylthiouracil (PTU) (500 mg/L) to the drinking water for 21 days5,6. To determine the efficacy of the PTU treatment, changes in serum total T4, T3, and TSH levels and citrate synthase (CS) activity in the soleus muscle (Srere et al8 method8) were assessed in two study groups (control and hypothyroid). After the establishment of the hypothyroid model, animals in the control and hypothyroid groups were further divided into three subgroups [i.e., control, control-IR (C-IR), and control-IPost (C-IPost), and hypothyroid, hypothyroid-IR (H-IR), and hypothyroid-IPost (H-IPost)] for in vitro experiments. Serum total T4, total T3, and TSH levels were measured at end of the treatment period using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. Inter-assay coefficients of variation were 3.2% for total T4, total T3, and TSH levels.

 Experimental protocol

All rats were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine/xylazine (50 mg/kg and 10 mg/kg, respectively). The hearts of the control and hypothyroid rats were immediately isolated and placed in an ice-cold perfusion buffer; after aorta cannulation, the hearts were perfused in the Langendorff apparatus using Krebs–Henseleit buffer [containing 118 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, and 11 mM glucose at a constant pressure (75 mmHg) and a pH level of 7.4], and the Krebs solution was oxygenated with 95% O2 and 5% CO2. The hearts were stabilized for 20 min to obtain the baseline data. In the C-IR and H-IR groups, after 20 min of stabilization, the hearts were subjected to 30 min of global ischemia, followed by 120 min of reperfusion. IPost was induced by 6 cycles of 10-s reperfusion-10-s ischemia immediately following the 30-min global ischemia; a latex balloon was inserted into the left ventricle to measure various hemodynamic parameters, including left ventricular developed pressure (LVDP) as an index of systolic function, the peak rates of positive changes in the left ventricular pressure (+dP/dt) as an index of contraction, negative changes in the left ventricular pressure (−dp/dt) as an index of relaxation, and left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) as an index of contracture. Initially, the average LVEDP was adjusted to 5–10 mmHg in all hearts by filling the latex balloon with water; LVEDP, LVDP, and ± dp/dt were digitalized by a data acquisition system (PowerLab, AD Instruments, Australia). Post-ischemic hemodynamic parameters were assessed by the recovery of LVEDP, LVDP, and ± dp/dt and expressed in relation to their baseline values.

 Measurement of NOx

Serum and heart NOx were measured using the Griess method. Briefly, after 2 h of reperfusion, myocardial samples from the left ventricle (LV) of the hearts were rinsed, homogenized in PBS (1:5, w/v), and centrifuged at 15,000 g for 20 min. The supernatant was deproteinized by adding zinc sulfate (15 mg/mL). The serum samples were also deproteinized by zinc sulfate (15 mg/mL) and centrifuged at 10,000 g for 10 min. A 100-μL aliquot of the supernatant or serum sample was transferred to a microplate well and 100 μL of vanadium (III) chloride (8 mg/mL) was added to each well to reduce nitrate to nitrite. Afterwards, 50 μL of sulfanilamide (2%) and 50 μL of N-1-(naphthyl) ethylenediamine (0.1%) were added to the samples and incubated for 30 min at 37°C; absorbance was read at a wavelength of 540 nm using an ELISA reader (BioTek, Powerwave XS2,). NOx concentrations were determined from the linear standard curve established using 0–100 μM sodium nitrate. Serum and tissue NOx levels were expressed as μmol/L. Inter-assay coefficient of variation was 4.1%.

 Statistical analysis

All values were expressed as the mean ± SEM. Statistical analysis was performed using the SPSS software (SPSS, Chicago, IL, USA; version 20); repeated measurement ANOVA was used to compare hemodynamic parameters at various time points. One-way ANOVA with Tukey’s post-hoc test was used to compare heart NOx levels among different groups. The student’s sample t-test was used to compare serum NOx levels, T3, T4, TSH, and CS activity between control and hypothyroid groups. Two-sided p-values < 0.05 were considered statistically significant.

 Results

Serum thyroid hormone levels and soleus muscle CS activity significantly decreased, whereas serum TSH significantly increased in hypothyroid rats. In addition, weight changes were significantly lower in hypothyroid rats (Table 1).

Characteristics of control and hypothyroid rats
  Controls (n = 8) Hypothyroid rats (n = 8)
Weight change (g) 20.3 ± 3.2 8.1 ± 3.5 *
T3 (nmol/L) 0.76 ± 0.06 0.20 ± 0.04 *
T4 (nmol/L) 49.43 ± 2.34 17.65 ± 3.42 *
TSH (ng/mL) 6.8 ± 0.6 29.62 ± 3.7 *
Citrate synthase activity (µmol/mL/min) 1.2 ± 0.3 0.45 ± 0.01 *

Data are expressed as mean ± SEM.;

p < 0.05.

Basal hemodynamic parameters were significantly lower in the hypothyroid group than in the controls (Table 2). When ischemia was induced by pausing coronary perfusion, the LVDP, ± dp/dt, and heart rate rapidly decreased and ceased in the isolated hearts.

Baseline cardiac function
  Controls (n = 8) Hypothyroid rats (n = 8)
LVEDP (mmHg) 8.5 ± 2.2 8.8 ± 2.8
LVDP (mmHg) 96.8 ± 7.6 74.0 ± 6.3 *
+dp/dt (mmHg/s) 3135 ± 211 2352 ± 434 *
–dp/dt (mmHg/s) 2215 ± 185 1684 ± 124 *
Heart rate (pulse/min) 283.3 ± 10.4 170.2 ± 11.3 *

Data are expressed as the mean ± SEM. LVEDP: Left ventricular end diastolic pressure; LVDP: Left ventricular developed pressure: and the peak rates of positive and negative changes in left ventricular pressure (±dp/dt);

p < 0.05.

The hearts from the H-IR group showed significant recovery in post-ischemic LVDP and ± dp/dt after 30 min of ischemia and 120 min of reperfusion compared to those from the C-IR group. IPost significantly improved the LVDP and ± dp/dt during reperfusion in the C-IPost group. In contrast, IPost failed to increase recovery of LVDP and ± dp/dt in the H-IPost group (Figure 1). During the 30-min ischemia, the hypothyroid group displayed a significant decrease in LVEDP, compared to the controls. IPost significantly prevented the reperfusion-induced increase in LVEDP in the C-IPost group (Figure 2).

Recovery of cardiac function after IR injury; A. Left ventricular developed pressure (LVDP); B. Peak rates of positive changes in left ventricular pressure (+dp/dt); C. Peak rates of negative changes in left ventricular pressure (−dp/dt); D. Heart rate; Control-IR, C-IR; Control-IPost, C-IPost; Hypothyroid-IR, H-IR; Hypothyroid-IPost, H-IPost; values are expressed as the mean ± SEM; (n = 8 rats); *p < 0.05 as compared to the C-IR group. Change in LVEDP (ischemic contracture) during the experiment; left ventricular end diastolic pressure (LVEDP); values are expressed as mean ± SEM;(n = 8 rats); *p < 0.05 as compared to the C-IR group. Control-IR, C-IR; Control-IPost, C-IPost; Hypothyroid-IR, H-IR; Hypothyroid-IPost, H-IPost;

Serum and heart NOx levels were significantly lower in the hypothyroid group, compared to the control. IR and IPost had no effect on heart NOx levels in the hypothyroid group, whereas in the control group, IR induced a marked increase in heart NOx levels and IPost significantly decreased the IR-induced increase in heart NOx levels (Figure 3).

Change in NOx levels in the control and hypothyroidism groups in the heart (above) and serum (below). Control-IR, C-IR; Control-IPost, C-IPost; Hypothyroid-IR, H-IR; Hypothyroid-IPost, H-IPost; values are expressed as the mean ± SEM; (n = 8 rats); *p <0.05 as compared to the control group. # p < 0.05 as compared to the C-IR group. Discussion

Our findings indicate that hypothyroidism decreases injuries induced by IR in the rat heart, which may be due to the reduction in NO. IPost provides protection against IR injury in control rats, whereas no add-on effect was observed in hypothyroid rats.

The decrease in weight change and CS activity in the soleus muscle and the decrease in the level of circulating thyroid hormone with elevated TSH levels all indicate that hypothyroidism has been successfully induced.

Baseline LVEDP, LVDP, and ± dp/dt were lower in the hypothyroid groups, compared to the controls, and these results were similar to those of previous studies5,6,9,10. Several changes, including upregulation of phospholamban and V3 isomyosin and downregulation of SR Ca2+-ATPase and ryanodine receptor occur in the heart of hypothyroid rats; therefore, cardiac dysfunction is a frequent consequence of hypothyroidism5,6,9,10. In response to IR, the hypothyroid group showed an increased recovery of LVEDP, LVDP and ± dp/dt, which indicates that hypothyroidism can protect the heart from IR injury. These findings are supported by previous studies6,11.

The protective mechanisms against IR in the hearts of the hypothyroid group have not been entirely elucidated and might be due to changes in metabolism6,11,12. Previous studies have shown that in hypothyroid rats, ATP, oxygen, and glycogen levels slowly decrease during ischemia and are higher at the start of reperfusion6,11-13. On the other hand, the hearts of hyperthyroid rats, despite having a high metabolism, were protected from IR injury; therefore, tolerance of the hypothyroid group to IR injury cannot be solely explained by the low metabolism during ischemia14.

Different molecular pathways, including total c-jun NH2-terminal kinases, mitogen-activated protein kinases, and NO play an essential role in the response of the heart to IR injury6,15,16. Our results showed that the baseline serum and heart levels of NOx were lower in the hypothyroid groups; NOx levels increased after IR in control group, whereas no change was observed in hypothyroid group. A decrease in heart NOx levels in fetal hypothyroid rats has been previously reported17, suggesting that low levels of NOx during the experimental period might be a significant element of hypothyroid-induced cardioprotection.

The function of NO in myocardial IR injury has not been clearly demonstrated and is a very complex issue. Some studies have described the protective role of NO, whereas others have reported a detrimental role18-20. Recent experimental studies have indicated that the NO level of heart tissues is within a low range at baseline and increases during ischemia because it triggers the enzymatic (through NO synthase 3) and non-enzymatic (tissue acidosis) production of NO. Although a small increase in NO content may be cardioprotective, a large increase appears to be detrimental19,21-25; the detrimental effect of NO in the heart in response to IR is mediated by peroxynitrite18. At high levels, NO reacts with superoxide and produces peroxynitrite, which is a highly toxic agent that could induce apoptosis in heart cells. Thus, it could be hypothesized that hypothyroidism protects the heart from ischemia by decreasing NO production and subsequently reducing the levels of nitro-oxidative stress18,20,24-28.

In the present study, IPost protected the heart against IR injury in the C-IPost group through the recovery of LVEDP, LVDP and ± dp/dt, whereas no significant effects on the hearts in the H-IPost group were observed, indicating that IPost might have lost its efficacy in a hypothyroid group. Our findings were similar to the results of previous studies on diabetic rats, which show that preconditioning and IPost lose their protective effects against IR injuries in the hearts of diabetic rats4,29.

The mechanism behind the effect of IPost in the unhealthy myocardium has not been established. Several studies have indicated that IPost and preconditioning protect the hearts of healthy rats from IR injury by decreasing its NO content during ischemia18,24,30,31. Similarly, in the present study, the application of six cycles of IPost significantly decreased the heart NOx levels after a 30-min ischemia in the C-Ipost group. However, this reduction was not observed in the H-IPost group, and the application of Ipost did not result in an additional decrease in the NOx level in the hearts of hypothyroid group. These results demonstrate the inefficiency of IPost in providing additional protective effects against IR injury in the hypothyroid group. Both IPost and hypothyroidism reduced the levels of NOx in response to IR and protected the heart from IR injury, indicating that NOx is a critical component of the protection response.

With regard to the limitations of this study, we did not measure NO synthase activity, which might play a role in the cardioprotective effects of IPost on hypothyroid rats18,32. In addition, our results were limited to male rats, whereas hypothyroidism is more prevalent among females33.

 Conclusion

Hypothyroidism increased the recovery of LVEDP, LVDP, and ± dp/dt following IR in the rat heart, which might be due to a decrease in the basal levels of NOx and NOx after the IR period. Although IPost imparted protective effects, these were not related to further decreases in NOx levels. The abolished protective effect of IPost in the hypothyroid group could be attributable to the impairment of the NO pathway.

Sources of Funding

This study was funded by Endocrine Research Center - Research Institute for Endocrine Sciences - Shahid Beheshti University of Medical Sciences.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Sajad Jeddi, from Shahid Beheshti University of Medical Sciences.

 References Hausenloy DJ. Signalling pathways in ischaemic postconditioning. Thromb Haemost.2009;10(4)1:626-34. Hausenloy DJ Signalling pathways in ischaemic postconditioning Thromb Haemost 2009 10 4 1 626 634 Hu S, Huang M, Li Z, Jia F, Ghosh Z, Lijkwan MA, et al. MicroRNA-210 as a novel therapy for treatment of ischemic heart disease. Circulation. 2010;122(11 Suppl):S124-31. Hu S Huang M Li Z Jia F Ghosh Z Lijkwan MA et al MicroRNA-210 as a novel therapy for treatment of ischemic heart disease Circulation 2010 122 11 Suppl S124 131 Silvestri P, Di Russo C, Rigattieri S, Fedele S, Todaro D, Ferraiuolo G, et al. MicroRNAs and ischemic heart disease: towards a better comprehension of pathogenesis, new diagnostic tools and new therapeutic targets. Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2009;4(2):109-18. Silvestri P Di Russo C Rigattieri S Todaro D Ferraiuolo G et al MicroRNAs and ischemic heart disease: towards a better comprehension of pathogenesis, new diagnostic tools and new therapeutic targets Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2009 4 2 109 118 Yin X, Zheng Y, Zhai X, Zhao X, Cai L. Diabetic inhibition of preconditioning-and postconditioning-mediated myocardial protection against ischemia/ reperfusion injury. Exp Diabetes Res. 2012;2012:198048. Yin X Zheng Y Zhao X Cai L Diabetic inhibition of preconditioning-and postconditioning-mediated myocardial protection against ischemia/ reperfusion injury Exp Diabetes Res 2012 2012 198048 Mourouzis I, Dimopoulos A, Saranteas T, Tsinarakis N, Livadarou E, Spanou D, et al. Ischemic preconditioning fails to confer additional protection against ischemia-reperfusion injury in the hypothyroid rat heart. Physiol Res. 2009;58(1):29-38. Mourouzis I Dimopoulos A Saranteas T Tsinarakis N Livadarou E Spanou D et al Ischemic preconditioning fails to confer additional protection against ischemia-reperfusion injury in the hypothyroid rat heart Physiol Res 2009 58 1 29 38 Pantos C, Malliopoulou V, Mourouzis I, Sfakianoudis K, Tzeis S, Doumba P, et al. Propylthiouracil-induced hypothyroidism is associated with increased tolerance of the isolated rat heart to ischaemia-reperfusion. J Endocrinol. 2003;178(3):427-35. Pantos c Malliopoulou V Mourouzis I Sfakianoudis K Tzeis S Doumba P et al Propylthiouracil-induced hypothyroidism is associated with increased tolerance of the isolated rat heart to ischaemia-reperfusion J Endocrinol 2003 178 3 427 435 Rosner B. Fundamentals of biostatistics. 6th ed. Boston : Brooks/Cole; 2005. Rosner B Fundamentals of biostatistics 6th ed Boston Brooks/Cole 2005 Siu PM, Donley DA, Bryner RW, Alway SE. Citrate synthase expression and enzyme activity after endurance training in cardiac and skeletal muscles. J Appl Physiol (1985). 2003;94(2):555-60. Siu PM Donley DA Bryner RW Alway SE Citrate synthase expression and enzyme activity after endurance training in cardiac and skeletal muscles J Appl Physiol (1985) 2003 94 2 555 560 Ohga Y, Sakata S, Takenaka C, Abe T, Tsuji T, Taniguchi S, et al. Cardiac dysfunction in terms of left ventricular mechanical work and energetics in hypothyroid rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002;283(2):H631-41. Ohga Y Sakata S Takenaka C Abe T Tsuji T Taniguchi S et al Cardiac dysfunction in terms of left ventricular mechanical work and energetics in hypothyroid rats Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002 283 2 H631 641 Shenoy R, Klein I, Ojamaa K. Differential regulation of SR calcium transporters by thyroid hormone in rat atria and ventricles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;281(4):H1690-6. Shenoy R Klein I Ojamaa K Differential regulation of SR calcium transporters by thyroid hormone in rat atria and ventricles Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001 281 4 H1690 H1696 Eynan M, Knubuvetz T, Meiri U, Navon G, Gerstenblith G, Bromberg Z, et al. Heat acclimation-induced elevated glycogen, glycolysis, and low thyroxine improve heart ischemic tolerance. J Appl Physiol (1985.) 2002;93(6):2095-104. Eynan M Knubuvetz T Meiri U Navon G Gerstenblith G Bromberg Z et al Heat acclimation-induced elevated glycogen, glycolysis, and low thyroxine improve heart ischemic tolerance J Appl Physiol (1985) 2002 93 6 2095 2104 Abe M, Obata H, Tanaka H. Functional and metabolic responses to ischemia in the isolated perfused hypothyroid rat heart. Jpn Circ J. 1992;56:671-80. Abe M Obata H Tanaka H Functional and metabolic responses to ischemia in the isolated perfused hypothyroid rat heart Jpn Circ J 1992 56 671 680 Pantos C, Mourouzis I, Malliopoulou V, Paizis I, Tzeis S, Moraitis P, et al. Dronedarone administration prevents body weight gain and increases tolerance of the heart to ischemic stress: a possible involvement of thyroid hormone receptor alpha1. Thyroid. 2005;15(1):16-23. Pantos C Mourouzis I Malliopoulou V Paizis I Tzeis S Moraitis P et al Dronedarone administration prevents body weight gain and increases tolerance of the heart to ischemic stress: a possible involvement of thyroid hormone receptor alpha1 Thyroid 2005 15 1 16 23 Pantos C, Mourouzis I, Delbruyere M, Malliopoulou V, Tzeis S, Cokkinos DD, et al. Effects of dronedarone and amiodarone on plasma thyroid hormones and on the basal and postischemic performance of the isolated rat heart. Eur J Pharmacol. 2002;444(3):191-6. Pantos C Mourouzis I Delbruyere M Malliopoulou V Tzeis S Cokkinos DD et al Effects of dronedarone and amiodarone on plasma thyroid hormones and on the basal and postischemic performance of the isolated rat heart Eur J Pharmacol 2002 444 3 191 196 Ravingerova T, Barancik M, Strniskova M. Mitogen-activated protein kinases: a new therapeutic target in cardiac pathology. Mol Cell Biochem. 2003;247(1-2):127-38. Ravingerova T Barancik M Strniskova M Mitogen-activated protein kinases: a new therapeutic target in cardiac pathology Mol Cell Biochem 2003 247 1-2 127 138 Pantos C, Malliopoulou V, Varonos DD, Cokkinos DV. Thyroid hormone and phenotypes of cardioprotection. Basic Res Cardiol. 2004;99(2):101-20. Pantos C Malliopoulou V Varonos DD Cokkinos DV Thyroid hormone and phenotypes of cardioprotection Basic Res Cardiol 2004 99 2 101 120 Ghasemi A, Mehrazin F, Zahediasl S. Effect of nitrate and L-arginine therapy on nitric oxide levels in serum, heart, and aorta of fetal hypothyroid rats. J Physiol Biochem. 2013;69(4):751-9. Ghasemi A Mehrazin F Zahediasl S Effect of nitrate and L-arginine therapy on nitric oxide levels in serum, heart, and aorta of fetal hypothyroid rats J Physiol Biochem 2013 69 4 751 759 Fan Q, Yang XC, Liu Y, Wang LF, Liu SH, Ge YG, et al. Postconditioning attenuates myocardial injury by reducing nitro-oxidative stress in vivo in rats and in humans. Clin Sci (Lond). 2011;120(6):251-61. Fan Q Yang XC Liu Y Wang LF Liu SH Ge YG et al Postconditioning attenuates myocardial injury by reducing nitro-oxidative stress in vivo in rats and in humans Clin Sci (Lond) 2011 120 6 251 261 Ding HL, Zhu HF, Dong JW, Zhu WZ, Yang WW, Yang HT, et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to intermittent hypoxia against ischemia/ reperfusion injury. Acta Pharmacol Sin. 2005;26(3):315-22. Ding HL Zhu HF Dong JW Zhu WZ Yang WW Yang HT et al Inducible nitric oxide synthase contributes to intermittent hypoxia against ischemia/ reperfusion injury Acta Pharmacol Sin 2005 26 3 315 322 Tao L, Gao E, Hu A, Coletti C, Wang Y, Christopher TA, et al. Thioredoxin reduces post-ischemic myocardial apoptosis by reducing oxidative/nitrative stress. Br J Pharmacol. 2006;14(3)9:311-8. Tao L Gao E Hu A Coletti C Wang Y Christopher TA et al Thioredoxin reduces post-ischemic myocardial apoptosis by reducing oxidative/nitrative stress Br J Pharmacol 2006 14 3 311 318 Baker JE, Holman P, Kalyanaraman B, Griffith OW, Pritchard KA, Jr. Adaptation to chronic hypoxia confers tolerance to subsequent myocardial ischemia by increased nitric oxide production. Ann N Y Acad Sci. 1999;874:236-53. Baker JE Holman P Kalyanaraman B Griffith OW Pritchard KA Jr Adaptation to chronic hypoxia confers tolerance to subsequent myocardial ischemia by increased nitric oxide production Ann N Y Acad Sci 1999 874 236 253 Node K, Kitakaze M, Kosaka H, Komamura K, Minamino T, Inoue M, et al. Increased release of NO during ischemia reduces myocardial contractility and improves metabolic dysfunction. Circulation. 1996;93(2):356-64. Node K Kitakaze M Kosaka H Komamura K Minamino T Inoue M et al Increased release of NO during ischemia reduces myocardial contractility and improves metabolic dysfunction Circulation 1996 93 2 356 364 Brunner F, Maier R, Andrew P, Wolkart G, Zechner R, Mayer B. Attenuation of myocardial ischemia/reperfusion injury in mice with myocyte-specific overexpression of endothelial nitric oxide synthase. Cardiovasc Res. 2003;57(1):55-62. Brunner F Maier R Andrew P Wolkart G Zechner R Mayer B Attenuation of myocardial ischemia/reperfusion injury in mice with myocyte-specific overexpression of endothelial nitric oxide synthase Cardiovasc Res 2003 57 1 55 62 Ferdinandy P, Schulz R. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury and preconditioning. Br J Pharmacol .2003;138(4):532-43. Ferdinandy P Schulz R Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury and preconditioning Br J Pharmacol 2003 138 4 532 543 Schulz R, Kelm M, Heusch G. Nitric oxide in myocardial ischemia/ reperfusion injury. Cardiovasc Res. 2004;61(3):402-13. Schulz R Kelm M Heusch G Nitric oxide in myocardial ischemia/ reperfusion injury Cardiovasc Res 2004 61 3 402 413 Yasmin W, Strynadka KD, Schulz R. Generation of peroxynitrite contributes to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts. Cardiovasc Res. 1997;33(2):422-32. Yasmin W Strynadka KD Schulz R Generation of peroxynitrite contributes to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts Cardiovasc Res 1997 33 2 422 432 Wang P, Zweier JL. Measurement of nitric oxide and peroxynitrite generation in the postischemic heart. Evidence for peroxynitrite-mediated reperfusion injury. J Biol Chem. 1996;271(46):29223-30. Wang P Zweier JL Measurement of nitric oxide and peroxynitrite generation in the postischemic heart. Evidence for peroxynitrite-mediated reperfusion injury J Biol Chem 1996 271 46 29223 29230 Levrand S, Vannay-Bouchiche C, Pesse B, Pacher P, Feihl F, Waeber B, et al. Peroxynitrite is a major trigger of cardiomyocyte apoptosis in vitro and in vivo. Free Radic Biol Med. 2006;41(6):886-95. Levrand S Vannay-Bouchiche C Pesse B Pacher P Feihl F Waeber B et al Peroxynitrite is a major trigger of cardiomyocyte apoptosis in vitro and in vivo Free Radic Biol Med 2006 41 6 886 895 Badalzadeh R, Mohammadi M, Najafi M, Ahmadiasl N, Farajnia S, Ebrahimi H. The additive effects of ischemic postconditioning and cyclosporine-A on nitric oxide activity and functions of diabetic myocardium injured by ischemia/reperfusion. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2012;17(2):181-9. Badalzadeh R Mohammadi M Najafi M Ahmadiasl N Farajnia S Ebrahimi H The additive effects of ischemic postconditioning and cyclosporine-A on nitric oxide activity and functions of diabetic myocardium injured by ischemia/reperfusion J Cardiovasc Pharmacol Ther 2012 17 2 181 189 Gao Q, Hu JF, Yu Y, Jiang CR, Guan SD, Li ZH. [The role of nitric oxide in ethanol postconditioning induced cardioprotection]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2012;28(1):9-13. Gao Q Hu JF Yu Y Jiang CR Guan SD Li ZH The role of nitric oxide in ethanol postconditioning induced cardioprotection Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi 2012 28 1 9 13 Csonka C, Szilvassy Z, Fulop F, Pali T, Blasig IE, Tosaki A, et al. Classic preconditioning decreases the harmful accumulation of nitric oxide during ischemia and reperfusion in rat hearts. Circulation. 1999;100(22):2260-6. Csonka C Szilvassy Z Fulop F Pali T Blasig IE Tosaki A et al Classic preconditioning decreases the harmful accumulation of nitric oxide during ischemia and reperfusion in rat hearts Circulation 1999 100 22 2260 2266 Quesada A, Sainz J, Wangensteen R, Rodriguez-Gomez I, Vargas F, Osuna A. Nitric oxide synthase activity in hyperthyroid and hypothyroid rats. Eur J Endocrinol. 2002;147(1):117-22. Quesada A Sainz J Wangensteen R Rodriguez-Gomez I Vargas F Osuna A Nitric oxide synthase activity in hyperthyroid and hypothyroid rats Eur J Endocrinol 2002 147 1 117 122 Roberts CG, Ladenson PW. Hypothyroidism. Lancet. 2004;363(9411):793-803. Roberts CG Ladenson PW Hypothyroidism Lancet 2004 363 9411 793 803 Artigos Originais Efeito do Pós-Condicionamento Isquêmico na Hemodinâmica e nos Níveis Cardíacos de Óxido Nítrico em Ratos com Hipotireoidismo Jeddi Sajad 1 2 Zaman Jalal 1 2 Ghasemi Asghar 1 2 Shahid Beheshti University of Medical Sciences Research Institute for Endocrine Sciences Endocrine Physiology Research Center Tehran Iran Endocrine Physiology Research Center - Research Institute for Endocrine Sciences - Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran Shahid Beheshti University of Medical Sciences Research Institute for Endocrine Sciences Endocrine Research Center Tehran Iran Endocrine Research Center - Research Institute for Endocrine Sciences - Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran Correspondência: Asghar Ghasemi, Endocrine Physiology Research Center, Research Institute for Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Nº 24, Parvaneh Street, Velenjak. Tehran – Iran. Email: ghasemi@endocrine.ac.ir; ghasemi.asghar@gmail.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Jeddi S, Ghasemi A; Obtenção de dados: Jeddi S, Zaman J; Análise e interpretação dos dados: Jeddi S; Análise estatística e Redação do manuscrito: Jeddi S, Zaman J, Ghasemi A; Obtenção de financiamento: Ghasemi A; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Ghasemi A.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

O pós-condicionamento isquêmico (PCI) é um método potente utilizado para proteger o coração contra a lesão de isquemia-reperfusão (I/R). Não está claro se o PCI é eficaz quando a doença cardíaca isquêmica é acompanhada de comorbidades, tais como hipotireoidismo.

 Objetivo:

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito do PCI sobre a lesão de I/R do miocárdio em ratos machos com hipotireoidismo.

 Métodos:

O hipotireoidismo foi induzido pela administração de propiltiouracila em água potável na concentração de 500 mg/L durante 21 dias. Os corações de ratos controle e com hipotireoidismo foram perfundidos utilizando o aparelho de Langendorff e expostos a isquemia global por 30 minutos, seguido de reperfusão por 120 minutos. O PCI foi iniciado imediatamente após a isquemia.

 Resultados:

O hipotireoidismo e PCI aumentaram significativamente a pressão ventricular esquerda desenvolvida (PVED) e as taxas máximas de variação positiva (+dp/dt) e negativa (–dp/dt) da pressão ventricular esquerda durante a reperfusão em ratos controle (p < 0,05). No entanto, o PCI não teve efeito aditivo no restabelecimento da PVED e das ±dp/dt em ratos com hipotireoidismo. Além disso, o hipotireoidismo diminuiu significativamente os níveis basais séricos (72,5 ± 4,2 vs. 102,8 ± 3,7 μmol/L; p < 0,05) e cardíacos (7,9 ± 1,6 vs. 18,8 ± 3,2 μmol/L; p < 0,05) de NOx. Os níveis cardíacos de NOx não se alteraram no grupo com hipotireoidismo após I/R e PCI mas foram significativamente maiores e menores (p < 0,05) nos grupos controle após I/R e PCI, respectivamente.

 Conclusão:

O hipotireoidismo protegeu o coração da lesão de I/R, o que pode ser devido à diminuição dos níveis séricos e cardíacos basais de óxido nítrico (NO) e à diminuição dos níveis de NO após I/R. No entanto, o PCI não diminuiu os níveis de NO e não conferiu proteção adicional ao grupo com hipotireoidismo.

 Pós Condicionamento Isquêmico Reperfusão Hipotireoidismo Óxido Nítrico Ratos Introdução

O infarto agudo do miocárdio (IAM) é a principal causa de mortalidade humana em todo o mundo1,2, e sua prevalência está aumentando devido ao envelhecimento da população e à presença de comorbidades, tais como obesidade, diabetes, e distúrbios da tireóide1-3. IAM é frequentemente induzido por oclusão parcial da artéria coronária no local de rompimento da placa aterosclerótica1,4. A reperfusão é capaz de impedir a morte do miocárdio isquêmico mas também pode gerar efeitos colaterais, que são denominados de lesões de isquemia-reperfusão (I/R)4. A resposta do miocárdio à isquemia pode ser modulada por diferentes intervenções, tais como o pós-condicionamento isquêmico (PCI)3,5. O PCI é um potente mecanismo de proteção do miocárdio contra lesões de I/R e é induzido por ciclos de períodos curtos de I/R realizados no início da reperfusão após a oclusão prolongada da artéria coronária3,4. Embora o PCI possa ter aplicações clínicas, atualmente a maioria dos estudos sobre PCI tem utilizado miocárdio saudável. A doença arterial coronariana frequentemente coexiste com outras morbidades5. Portanto, mais investigações em condições patológicas são necessárias antes da aplicação clínica do PCI5

O hipotireoidismo é a principal doença da glândula tireoide, afeta o coração de diferentes maneiras e também pode levar ao aumento da morbidade6. De fato, os baixos níveis dos hormônios da tireoide podem afetar a resposta do coração as lesões de I/R6. Desta forma, as intervenções cardioprotetoras, incluindo o PCI, quando usadas nos estados de hipotireoidismo, poderão ter importância clínica em estratégias futuras de monitoramento.

O óxido nítrico (NO) é produzido principalmente pela enzima NO sintase no coração saudável e desempenha um papel importante em funções cardíacas. A isquemia do coração leva a um aumento da produção de NO, o que pode contribuir para a formação de lesões de I/R. No entanto, nenhum estudo investigou as alterações nos níveis de NO em corações de ratos com hipotireoidismo. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a resposta do coração ao PCI em um modelo experimental de hipotireoidismo induzido por propiltiouracila (PTU) em ratos. Além disso, alterações nos níveis dos metabólitos de NO (NOx) após lesão de I/R e PCI também foram avaliadas.

 Métodos

Quarenta e oito ratos Wistar machos de 2 meses de idade foram obtidos do biotério do Instituto de Investigação em Ciências Endócrinas da Universidade de Ciências Medicas Shahid Beheshti. Foi estabelecido um valor α de 0,05 com duas caudas de distribuição e poder de 90%, e o tamanho da amostra em cada grupo foi calculado como sendo de 8 de acordo com a fórmula7: onde, μ1, S12 e μ2, S22 representam médias e variâncias dos dois grupos, respectivamente e d2 = (μ1 – μ2)2. Os ratos foram mantidos à temperatura de 22 ± 3 °C, umidade relativa de 50 ± 6% e acesso livre à ração (Pars Co., Teerã) e água corrente durante o período do estudo, e adaptados a um ciclo invertido de claro/escuro de 12h/12h. Todos os procedimentos experimentais empregados, assim como o manuseio dos animais, foram realizados de acordo com as orientações fornecidas pelo comitê de ética local do Instituto de Investigação em Ciências Endócrinas, Universidade de Ciências Médicas Shahid Beheshti. O hipotireoidismo foi induzido pela administração de PTU a 500 mg/L em água potável por 21 dias5,6. Para a determinação da eficácia do tratamento com PTU, as alterações nos níveis séricos totais de T4, T3, TSH e na atividade de citrato sintase (CS) no músculo sóleo (método descrito por Srere e cols.8), foram avaliadas em dois grupos de animais (controle e com hipotireoidismo). Depois de confirmar a ocorrência de hipotireoidismo, animais do grupo controle e com hipotireoidismo foram divididos em três subgrupos (controle, controle-I/R (C-I/R), e controle-PCI(C-PCI), e grupo com hipotireoidismo, hipotireoidismo-I/R (H-I/R), e hipotireoidismo-PCI (H-PCI)) para experimentos in vitro. Os níveis séricos totais de T4, T3, e TSH foram medidos no final do período de tratamento utilizando a técnica de ELISA. Os coeficientes de variação inter-ensaio foram de 3,2% para T4 total, T3 total, e TSH.

Todos os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal utilizando cetamina/xilazina (50 mg/kg e 10 mg/kg). Os corações de ratos controle e com hipotireoidismo foram removidos e mantidos em tampão de perfusão gelado. Após a canulação da aorta, os corações foram perfundidos no aparelho de Langendorff usando tampão de Krebs-Henseleit (118 mM de NaCl, 25 mM de NaHCO3, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM de MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM de KH2PO4, e 11 mM de glicose) em pressão constante de 75 mmHg e pH 7,4, e a solução de Krebs-Henseleit foi oxigenada com 95% de O2 e 5% de CO2. Os corações foram estabilizados durante 20 minutos para a obtenção dos valores basais. Nos grupos C-I/R e H-I/R, após o período de estabilização, os corações foram expostos a isquemia global por 30 minutos seguido de reperfusão por 120 minutos. O PCI foi induzido utilizando seis ciclos de reperfusão por 10 segundos e isquemia por 10 segundos imediatamente apos isquemia global de 30 minutos. Um balão de látex foi inserido no ventrículo esquerdo para permitir a medição de parâmetros hemodinâmicos, incluindo a pressão ventricular esquerda desenvolvida (PVED) como índice de função sistólica, as taxas máximas de variação positiva na pressão ventricular esquerda (+dp/dt) como índice de contração, e de variação negativa na pressão ventricular esquerda (–dp/dt) como índice de relaxamento, além da pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE) como índice de contratura. Inicialmente, a PDFVE média foi ajustada a 5-10 mmHg em todas as amostras cardíacas através da adição de água no balão de látex. A PDFVE, PVED, e ±dp/dt foram digitalizadas através de um sistema de aquisição de dados (Power Lab, AD instrument, Austrália). Os parâmetros hemodinâmicos pós-isquemia foram avaliados pelo restabelecimento da PDFVE, PVED, e ±dp/dt e expressos em porcentagens dos valores iniciais.

Medição de NO<sub>x</sub>

Os níveis séricos e cardíacos de NOx foram medidos pelo método de Griess. Resumidamente, depois de 2 horas de reperfusão, as amostras do miocárdio do ventrículo esquerdo (VE) foram lavadas e homogeneizados em PBS (1:5, peso/volume) e centrifugadas a 15.000 g durante 20 min. O sobrenadante foi desproteinizado pela adição de sulfato de zinco (15 mg/mL). As amostras séricas também foram desproteinizadas com sulfato de zinco (15 mg/mL) e centrifugadas a 10.000 g durante 10 min. Uma alíquota de 100 μL do sobrenadante ou soro foi transferida para uma microplaca e 100 μL de cloreto de vanádio (III) (8 mg/mL) foi adicionado a cada poço da microplaca para reduzir o nitrato a nitrito, após o qual 50 μL de sulfanilamida a 2% e 50 μL de N-1-(naftil)etilenodiamina a 0,1% foram adicionados, e as microplacas foram incubadas a 37 °C durante 30 min. A absorbância foi lida a 540 nm usando um leitor de ELISA (BioTek, Powerwave XS2). A concentração de NOx foi determinada a partir do estabelecimento de uma curva padrão linear utilizando 0 a 100 μM de nitrato de sódio. Os níveis séricos e teciduais de NOx foram expressos em µmol/L. O coeficiente inter-ensaio de variação foi de 4,1%.

 Análise estatística

Todos os valores foram expressos como média ± EPM A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS versão 20 (SPSS, Chicago, IL, EUA). A análise de variância das medidas (ANOVA) foi utilizada para comparar os parâmetros hemodinâmicos em diferentes tempos. O teste ANOVA para um fator, juntamente com o teste post-hoc de Tukey, foi utilizado para comparar os níveis cardíacos de NOx nos diferentes grupos. O test t de Student foi utilizado para comparar os níveis séricos de NOx, T3, T4, e TSH, e a atividade de CS entre os grupos controle e com hipotireoidismo. Os valores de p < 0,05 de duas caudas foram considerados significativos.

 Resultados

Os níveis séricos de hormônios tireoidianos e a atividade de CS no músculo sóleo foram significativamente menores, ao passo que as concentrações de TSH foram significativamente maiores em ratos com hipotireoidismo. Além disso, as variações de peso foram significativamente menores nos ratos com hipotireoidismo (Tabela 1).

Características de ratos controle e com hipotireoidismo
  Controle (n = 8) Ratos com hipotireoidismo (n = 8)
Variação de peso (g) 20.3 ± 3.2 8.1 ± 3.5 *
T3 (nmol/L) 0.76 ± 0.06 0.20 ± 0.04 *
T4 (nmol/L) 49.43 ± 2.34 17.65 ± 3.42 *
TSH (ng/mL) 6.8 ± 0.6 29.62 ± 3.7 *
Atividade de citrato sintase (µmol/ml/min) 1.2 ± 0.3 0.45 ± 0.01 *

Os dados representam média ± EPM .

p < 0.05.

Os parâmetros hemodinâmicos basais foram significativamente menores no grupo com hipotireoidismo em comparação ao grupo controle (Tabela 2). Após a indução isquêmica pela interrupção da perfusão coronária, PVED, ±dp/dt, e a frequência cardíaca rapidamente diminuíram e atingiram níveis basais nos corações isolados.

Função cardíaca no período de estabilização (dados basais)
  Controle (n = 8) Ratos com hipotireoidismo (n = 8)
PDFVE (mmHg) 8.5 ± 2.2 8.8 ± 2.8
PVED (mmHg) 96.8 ± 7.6 74.0 ± 6.3 *
+dp/dt (mmHg/s) 3135 ± 211 2352 ± 434 *
–dp/dt (mmHg/s) 2215 ± 185 1684 ± 124 *
Frequência cardíaca (pulso/min) 283.3 ± 10.4 170.2 ± 11.3 *

Média ± ERM. PDFVE: Pressão diastólica final do ventrículo esquerdo; PVED: Pressão ventricular esquerda desenvolvida: Taxas máximas de variação positiva e negativa na pressão ventricular esquerda (±dp/dt);

p < 0.05.

A PVED e ±dp/dt se restabeleceram significativamente no grupo H-I/R em comparação com o grupo C-I/R após isquemia de 30 min e reperfusão de 120 min. O PCI aumentou significativamente a PVED e ±dp/dt durante a reperfusão no grupo C-PCI mas não melhorou o restabelecimento destes dois parâmetros no grupo H-PCI (Figura 1). Durante a isquemia de 30 minutos, o grupo com hipotireoidismo apresentou uma diminuição significativa da PDFVE, em comparação ao grupo controle. Além disso, o PCI preveniu significativamente o aumento na PDFVE induzido pela reperfusão no grupo C-PCI (Figura 2).

Recuperação da função cardíaca após a lesão de I/R. A) Pressão ventricular esquerda desenvolvida (PVED); B) Taxas máximas de variações positivas na pressão ventricular esquerda (+dp/dt); C) Taxas máximas de variações negativas na pressão ventricular esquerda (-dp/dt); D) Frequência cardíaca; Controle-I/R, C-I/R; Controle-PCI, C-PCI; Hipotireoidismo-I/R, H-I/R; Hipotireoidismo PCI, H-PCI. Os valores representam média ± EPM; (N = 8 animais). *p < 0,05 quando comparado ao grupo C-I/R. Variação de PDFVE (contratura isquêmica) durante o experimento. Pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (PDFVE). Os valores representam média ± EPM, (N = 8 animais); *p < 0,05 quando comparado ao grupo C-I/R. Controle-I/R, C-I/R; Controle-PCI, C-PCI; Hipotireoidismo-I/R, H-I/R; Hipotireoidismo PCI, H-PCI. Os valores representam média ± EPM, (N = 8 animais); *p < 0,05 quando comparado ao grupo C-I/R.

Os níveis séricos e cardíacos de NOx foram significativamente menores no grupo com hipotireoidismo, em comparação ao grupo controle. I/R e PCI não tiveram efeito sobre os níveis cardíacos de NOx no grupo com hipotireoidismo, ao passo que I/R induziu um aumento acentuado nos níveis cardíacos de NOx e PCI retardou significativamente o aumento nos níveis cardíacos de NOx induzido por I/R no grupo controle (Figura 3).

Variação nos níveis cardíacos (acima) e séricos (abaixo) de NOx nos grupos controle e com hipotireoidismo. Controle-I/R, C-I/R; Controle-PCI, C-PCI; Hipotireoidismo-I/R, H-I/R; Hipotireoidismo-PCI, H-PCI. Os valores representam média ± EPM, (N = 8 animais); *p < 0,05 quando comparado ao grupo controle. #p < 0,05 em comparação ao grupo C-I/R. Discussão

Nossos resultados indicaram que o hipotireoidismo é capaz de reduzir as lesões induzidas por I/R no coração de ratos, o que pode ser devido à diminuição nos níveis de NO. O PCI teve efeitos protetores contra a lesão de I/R em ratos controle mas não teve nenhum efeito aditivo em ratos com hipotireoidismo.

A diminuição na variação de peso e na atividade de CS no músculo sóleo, e a diminuição dos níveis séricos dos hormônios da tireoide e aumento dos níveis de TSH, indicaram que a indução do hipotireoidismo foi realizada com sucesso.

Os valores basais da PDFVE, PVED, e ±dp/dt foram menores no grupo com hipotireoidismo, em comparação com o grupo controle, e estes resultados são compatíveis com os de estudos anteriores5,6,9,10. Várias alterações, incluindo o aumento da expressão de fosfolamban e isomiosina V3 e a diminuição na expressão de Ca2+ ATPase no retículo sarcoplasmático e do receptor de rianodina, ocorrem no coração de ratos com hipotireoidismo e, portanto, o hipotireoidismo frequentemente resulta em disfunções cardíacas5,6,9,10. Em resposta ao I/R, o grupo com hipotireoidismo recuperou a PDFVE, PVED, e ±dp/dt, um resultado que demonstra que o hipotireoidismo pode proteger o coração contra lesões de I/R, e este resultado é suportado por outros estudos6,11.

Os mecanismos de proteção cardíaca contra I/R no hipotireoidismo não foram totalmente elucidados e esta proteção pode ser devido a alterações metabólicas6,12. Já foi relatado que os níveis de ATP, oxigênio, e glicogênio em ratos com hipotireoidismo diminuem lentamente durante a isquemia e aumentam no início da reperfusão6,11-13. Por outro lado, foi mostrado que os corações de ratos com hipertireoidismo, apesar de apresentarem metabolismo elevado, podem ser protegidos contra lesões de I/R, e assim a tolerância conferida pelo hipotireoidismo às lesões de I/R não pode ser explicada apenas com base na diminuição do metabolismo durante a isquemia14.

As diferentes vias moleculares, incluindo proteínas quinases c-Jun N-terminal, proteínas quinases ativadas por mitógeno, e NO podem desempenhar um papel essencial na resposta do coração à lesões de I/R6,15,16. Nossos resultados mostraram que o níveis séricos e cardíacos basais de NOx foram menores nos grupos com hipotireoidismo. Além disso, os níveis de NOx aumentaram após I/R no grupo controle mas não no grupo com hipotireoidismo. A diminuição nos níveis de NOx no coração de fetos de ratos com hipotireoidismo foi previamente relatada17, com base na qual aparentemente os baixos níveis de NOx durante o período experimental podem ter sido um importante fator de cardioproteção induzida pelo hipotireoidismo.

A função do NO em lesão miocárdica de I/R não foi completamente elucidada e é uma questão muito complexa. Alguns estudos têm demonstrado um papel protetor do NO, enquanto outros relataram um efeito prejudicial18-20. Estudos experimentais recentes indicaram que os níveis de NO são próximos aos níveis basais em tecido cardíaco mas aumentam durante a isquemia porque a síntese enzimática de NO (através da NO sintase 3) e não enzimática (através da acidose tecidual) aumenta durante a isquemia. Apesar de um pequeno aumento nos níveis de NO poder ser cardioprotetor, um aumento maior pode ser prejudicial19,21-25. O efeito prejudicial de NO no coração em resposta a I/R é mediada por peroxinitrito18. Quando os seus níveis aumentam, o NO reage com o superóxido e produz peroxinitrito, que é mais tóxico e pode provocar apoptose em células cardíacas. Desta forma, pode-se supor que o hipotireoidismo protege o coração isquêmico através da diminuição da produção de NO e consequente diminuição do estresse nitro-oxidativo18-28.

Em nosso estudo, o PCI protegeu o coração contra a lesão de I/R no grupo C-PCI através do restabelecimento da PDFVE, PVED, e ±dp/dt, mas não teve efeito significativo no grupo H-PCI, o que demonstra que o PCI pode perder a sua eficácia no grupo com hipotireoidismo. Os resultados do presente estudo foram semelhantes aos de estudos anteriores utilizando ratos diabéticos, que mostraram que o pré-condicionamento e PCI perderam seus efeitos protetores contra as lesões de I/R nos corações destes ratos4,29.

A possibilidade dos mecanismos subjacentes ao PCI não estarem operantes no miocárdio não saudável ainda precisa ser esclarecida. Estudos anteriores têm indicado que o PCI e o pré-condicionamento protegem o coração de ratos saudáveis de lesões de I/R pela diminuição dos níveis cardíacos de NO após o período de isquemia18,31. Da mesma forma, no nosso estudo, 6 ciclos de PCI diminuíram significativamente os níveis cardíacos de NOx após 30 minutos de isquemia no grupo C-PCI, mas esta diminuição não foi observada no grupo H-PCI. Além disso, o PCI não causou nenhuma diminuição adicional dos níveis de NOx no coração dos animais com hipotireoidismo. Estes resultados demonstraram a ineficiência do PCI em garantir proteção adicional contra lesões de I/R no grupo com hipotireoidismo. Tanto o PCI quanto o hipotireoidismo reduziram os níveis de NOx em resposta a I/R e protegeram o coração contra lesão de I/R, indicando que o NOx é um componente crítico de proteção conferida pelo PCI e hipotireoidismo.

Uma das limitações do estudo é que não medimos a atividade da NO sintase, que pode ter um papel importante na cardioproteção proporcionada pelo PCI em ratos com hipotireoidismo18,32. Além disso, nossos resultados são limitados a ratos machos, embora o hipotireoidismo seja mais prevalente no sexo feminino33.

 Conclusão

O hipotireoidismo restabeleceu a PDFVE, PVED, e ±dp/dt após a I/R no coração de ratos, o que pode ser devido à diminuição dos níveis de NOx e NOx após o período de I/R. Apesar do PCI proporcionar proteção por si só, esta variável não esteve associada a diminuição mais pronunciada dos níveis de NOx e não proporcionou proteção adicional ao grupo com hipotireoidismo. O efeito protetor abolido após o PCI no grupo com hipotireoidismo pode estar relacionado ao comprometimento das vias do NO.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo Endocrine Research Center - Research Institute for Endocrine Sciences - Shahid Beheshti University of Medical Sciences.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Sajad Jeddi pela Shahid Beheshti University of Medical Sciences.