Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia kcrNhYm4qwTTJZBxZHztpHg S0066-782X2015000200002 00002 S0066-782X2015005040219 10.5935/abc.20140219 Special Article Multivariate Analysis for Animal Selection in Experimental Research Pinto Renan Mercuri 1 Campos Dijon Henrique Salomé de 2 Tomasi Loreta Casquel 2 Cicogna Antonio Carlos 2 Okoshi Katashi 2 Padovani Carlos Roberto 1 Universidade Estadual Paulista Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Bioestatística Botucatu São Paulo Brazil Departamento de Bioestatística - Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu, São Paulo - Brazil Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Departamento de Clínica Médica Botucatu São Paulo Brazil Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu, São Paulo - Brazil Mailing Address: Renan Mercuri Pinto, Rua Thomaz Ceneviva, 117, Vila Anita. Postal Code 13484-295, Limeira, SP - Brazil E-mail: renanmp@usp.br; renanmp@icloud.com

Author contributions

Conception and design of the research:Pinto RM, Padovani CR. Acquisition of data: Campos DHS, Tomasi LC, Cicogna AC, Okoshi K. Analysis and interpretation of the data: Pinto RM, Campos DHS, Tomasi LC, Cicogna AC, Okoshi K, Padovani CR. Statistical analysis: Pinto RM, Padovani CR. Obtaining financing:Pinto RM, Padovani CR. Writing of the manuscript: Pinto RM, Campos DHS, Tomasi LC, Padovani CR. Critical revision of the manuscript for intellectual content: Pinto RM, Cicogna AC, Okoshi K, Padovani CR. Orientation / Supervision: Padovani CR.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 02 2015 03 02 2015 104 2 97 103 26 06 2014 27 09 2014 30 09 2014 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

Several researchers seek methods for the selection of homogeneous groups of animals in experimental studies, a fact justified because homogeneity is an indispensable prerequisite for casualization of treatments. The lack of robust methods that comply with statistical and biological principles is the reason why researchers use empirical or subjective methods, influencing their results.

 Objective:

To develop a multivariate statistical model for the selection of a homogeneous group of animals for experimental research and to elaborate a computational package to use it.

 Methods:

The set of echocardiographic data of 115 male Wistar rats with supravalvular aortic stenosis (AoS) was used as an example of model development. Initially, the data were standardized, and became dimensionless. Then, the variance matrix of the set was submitted to principal components analysis (PCA), aiming at reducing the parametric space and at retaining the relevant variability. That technique established a new Cartesian system into which the animals were allocated, and finally the confidence region (ellipsoid) was built for the profile of the animals’ homogeneous responses. The animals located inside the ellipsoid were considered as belonging to the homogeneous batch; those outside the ellipsoid were considered spurious.

 Results:

The PCA established eight descriptive axes that represented the accumulated variance of the data set in 88.71%. The allocation of the animals in the new system and the construction of the confidence region revealed six spurious animals as compared to the homogeneous batch of 109 animals.

 Conclusion:

The biometric criterion presented proved to be effective, because it considers the animal as a whole, analyzing jointly all parameters measured, in addition to having a small discard rate.

 Multivariate Analysis Animals Epidemiology Experimental Aortic Valve Stenosis Introduction

Due to lack of statistical knowledge, several researchers choose to use empirical or subjective decision-making methods, ignoring the casualization process, a basic principle for reliability of findings, which influences the results.

A very common example of that influence occurs in the process of sample homogenization, which is important for randomization in research involving animals as an experimental unit. Regarding that process, several researchers usually adopt a fragmented or intentional approach, using only a convenient parameter to classify the group as homogeneous, which results in a biased and inappropriate homogenization, in addition to favoring the possibility of discarding animals due to a simple spurious value rather than to biological dissimilarity.

From the biological viewpoint, the most interesting process of homogenization should jointly consider all parameters assessed in the experimental unit, because most of those are correlated, and the best way to understand the behavior of the animal consists in a set of numerical data representing all its biological characteristics. Thus, statistical methods that consider the animal as a whole rather than in a fragmented way are required, because the organism reacts as a whole to any intervention or treatment.

It is worth noting that, when there is dependence between variables, multivariate analysis of data should be used, because, as such, the significance index of inferential statistics is not inflated, a problem that occurs when several univariate analyses are performed simultaneously1.

This study’s objective was to develop a multivariate statistical model for the selection of a homogeneous group of animals for experimental research that follows biological and statistical principles, in addition to elaborating a computational package to apply that model.

To exemplify the development and application of the criterion, the set of echocardiographic data of animals undergoing surgery for induction of supravalvular aortic stenosis (AoS), provided by the Research Group on Experimental Cardiology of the Botucatu Medical School (FMB) of the State University of São Paulo (Unesp), was used, aiming at overcoming the difficulties in selecting a homogeneous group of animals by using the simple casualization process, for later submission to treatments of interest.

 Methods Animals and experimental protocol

The set of echocardiographic data was obtained from male Wistar rats undergoing surgery for induction of supravalvular AoS and provided by the Research Group on Experimental Cardiology of the FMB - Unesp. This study was approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the FMB - Unesp (protocol number 850/2010). Of the set comprising 115 experimental units, 31 parameters regarding body mass and structural and functional variables of transthoracic echocardiography were used (Table 1).

Identification of the parameters measured
Index Identification Description
X1 BM (g) body mass
X2 HR (bpm) heart rate
X3 LVDD (mm) left ventricular diastolic diameter
X4 LVSD (mm) left ventricular systolic diameter
X5 PWDT (mm) left ventricular posterior wall diastolic thickness
X6 PWST (mm) left ventricular posterior wall systolic thickness
X7 IVSDT (mm) interventricular septum diastolic thickness
X8 IVSST (mm) interventricular septum systolic thickness
X9 AOD (mm) aorta diameter
X10 LAD (mm) left atrial diameter
X11 LAD/AOD left atrial diameter to aorta diameter ratio
X12 LVDD/BM (mm/kg) left ventricular diastolic diameter to body mass ratio
X13 LAD/BM (mm/kg) left atrial diameter to body mass ratio
X14 CO (mL/min) cardiac output
X15 CI (mL/min/kg) cardiac index
X16 EFS endocardial fractional shortening
X17 MFS midwall fractional shortening
X18 LVM (g) left ventricular mass
X19 LVMI (g/kg) left ventricular mass index
X20 E wave (cm/s) early diastolic velocity of mitral flow
X21 A wave (cm/s) late diastolic velocity of mitral flow
X22 E/A E wave to A wave ratio
X23 LVRT left ventricular relative wall thickness
X24 LVPWSV (mm/s) left ventricular posterior wall shortening velocity
X25 IVRT (ms) left ventricular isovolumetric relaxation time
X26 R-R (s) interval between two consecutive cardiac cycles
X27 IVRTn left ventricular isovolumetric relaxation time normalized to heart rate
X28 Tei-a (ms) isovolumetric contraction time + ejection time + IVRT
X29 Tei-b (ms) ejection time
X30 MPI myocardial performance index
X31 LVEF left ventricular ejection fraction

The literature has plenty of experimental studies on the development of cardiac remodeling due to pressure overload2 - 6. The AoS model has been widely used to promote the gradual development of left ventricular (LV) hypertrophy in rats5. In that model, pressure overload installs and progressively increases as the animals grow, partially similar to AoS in men. Some advantages of that experimental procedure are the absence of myocardial anatomical lesions and its low operational cost4.

 Induction of supravalvular aortic stenosis

Aortic stenosis was induced according to a previously described method4 - 7. The three- to four-week-old animals, weighing 70-90 g, underwent anesthesia with the association of ketamine chloride (60 mg/kg) and xylidine chloride (10 mg/kg), by intraperitoneal (ip) route. Then median thoracotomy was performed, the ascending aorta dissected and a silver clip (inner diameter of 0.6 mm) placed approximately 3 mm from its root (Figure 1). The thoracic wall was closed, and the sternum, muscle layers and skin were sutured with 5.0-mononylon thread. During surgery, the animals were manually ventilated with positive pressure, 100% oxygen. After the end of surgery, they received, subcutaneously, 1 mL of warm saline solution, and were placed on a warm surface to recover from anesthesia.

Placement of the silver clip in the aortic valve Echocardiographic assessment

Echocardiographic assessment was performed six weeks after AoS induction. To undergo that test, the rats were anesthetized with the association of ketamine chloride (50 mg/kg/ip) and xylidine chloride (10 mg/kg/ip), and put in the left lateral decubitus position. A Vivid S6 echocardiography device (General Electric Medical Systems, Tirat Carmel, Israel) equipped with a 12-MHz electronic transducer was used. To measure the cardiac structures, M-mode images were used and the ultrasound beam was guided by the two-dimensional image with the transducer in the parasternal short axis view. The monodimensional image of the left ventricle was obtained by positioning the M-mode cursor right below the mitral valve plane between the papillary muscles8. The images of the aorta and left atrium were also obtained in the parasternal short axis view with the M-mode cursor positioned at the aortic valve level. Later, the cardiac structures were measured manually with the aid of a pachymeter in at least five consecutive cardiac cycles. The LV diastolic diameter (LVDD), the LV posterior wall diastolic thickness (PWDT) and the interventricular septum diastolic thickness (IVSDT) were measured at the time corresponding to the maximum LV diameter. The LV systolic diameter (LVSD) and the LV posterior wall systolic thickness (PWST) and the interventricular septum systolic thickness (IVSST) were measured at the time corresponding to the minimum LV diameter. The LV systolic function was assessed by calculating the midwall fractional shortening (MFS), {[(LVDD + ½ PWDT + ½ IVSDT) – (LVSD + ½ PWST + ½ IVSST)]/(LVDD + ½ PWDT + IVSDT)}, and the LV posterior wall shortening velocity (LVPWSV), maximum tangent of the posterior wall systolic movement. Studying the LV diastolic function, the peak velocities of mitral flow corresponding to the initial filling phase (E wave) and to the late filling phase, consequent to atrial contraction (A wave), were measured, and the E wave/A wave ratio was calculated. The flows related to the diastolic function were obtained by positioning the transducer on the region corresponding to the tip of the heart in the four-chamber image; the flows were measured on the echocardiographic monitor.

 Statistical model

The statistical model developed to establish the procedure of exploratory multivariate analysis of data and assess the homogeneity of the batch involves simultaneously all variables measured and considers the entire data variation structure, that is, the variation inside the variables (intravariability) and the variation between variables (intervariability). It is worth noting that the global variation structure can be well represented by descriptive measures of data variability, more specifically, variances and covariances.

In addition, the model is elaborated to use all animals included in the research, in the cardiac remodeling group, which survived the surgical procedure previously described. Thus, there was no specific criterion to determine the number of animals that should participate in the study.

Initially, because the parameters were presented in different measure units, the data were standardized and became dimensionless, that is, each measure was presented as a value that represents how far away it is from the mean of the respective parameter. Then, to build the statistical model, named multihomogen criterion, the matrix structure of variances and covariances of standardized data (variance matrix) was considered, which is equivalent to the correlation matrix (R) of the initial set9.

The multivariate technique used for data analysis consists in the principal components analysis (PCA), whose basic principle relies on the reduction of the parametric space with no loss of the data set variance structure (in the present study, biological characteristics of the animal) and no loss of the general biological information of the animal. That statistical technique, proposed by Karl Pearson in 1901, consists in transforming an initial set of interrelated variables into another set of non-interrelated variables, which is an orthogonal linear combination of the initial set10.

The principal components (PC) are presented in a decreasing order of importance for the data set variance structure, that is, the first explains the maximum possible variance, and the second explains the maximum variance still retained in the set after discounting the effect of the first, and so on, up to the last component. The greater the retention of total variance in a smaller number of linear combinations, the better the practical application of the procedure to experimental data, although that condition is not a deterrent factor for the use of the criterion to identify spurious values11.

An interesting mathematical property of the PC consists in all of them being non-interrelated and, thus, regarding data normality, independent of each other. This ensures a system of orthogonal axes for the graphic representation of animals (experimental units), which can be complemented with statistical inference to identify those that can be ruled out due to the high probability of the occurrence of spurious values as compared to the population of origin.

There are several criteria to determine the number of descriptive axes (PC) considered relevant to the orthogonal system. The present study adopted the Kaiser criterion, also known as the latent root criterion, in which a component accounts for a meaningful amount of variance when it has an eigenvalue greater than 1.0. Therefore such a component is worthy of being retained12.

For the methodological practice of homogenization in experimental or observational research, the desirable situation for biological information, mainly for the graphical visualization of the procedure, consists in having a maximum number of PC (also known as descriptive axes) of three. However, for more than three dimensions (a common situation when assessing a considerable number of characteristics in the experimental unit), the technique remains the same, except for graphical visualization, which becomes unfeasible.

After assigning the animals to the Cartesian system, determined by the descriptive axes selected, the confidence (ellipsoid) region for the mean profile of the animals’ homogeneous responses is built. The 100(1 − α)% confidence region is constructed by using Hotelling T 2 statistics transformed into Fisher-Snedecor’s F distribution13. It is worth considering that the statistical technique used to establish the confidence region involves the construction of inclusion intervals, considering a jointly confidence level for all variables, that enables verifying if the animals are inside or outside the ellipsoid10.

If the response vector of the animal studied is inside the confidence ellipsoid built (that is, if the animal’s generalized Mahalanobis distance from the centroid of an ellipsoid is shorter than the distance from the outline), the animal is classified as belonging to the homogeneous batch; on the contrary (greater distance), it is identified as spurious, and, thus, does not participate in the simple casualization process of treatments14.

By using the statistical procedures approached in this section, the generalized algorithm was developed, as well as the computational package, making the use of the criterion proposed possible. It was named multihomogen package, elaborated for the Rstudio statistical program (made available free of charge on-line: http://www.R-project.org), and can be directly and costlessly obtained by emailing the authors15.

 Results

To use the software developed and characterize the homogeneity of an experimental group of animals, the multihomogen criterion was applied to the set of data relating to the parameters assessed in Wistar rats undergoing AoS in the study previously mentioned. From the quadratic matrix of variance (order 31), involving the correlations, eight descriptive axes were established, corresponding to eight PC selected based on the Kaiser criterion, representing the accumulated variance of the set of data in 88.71% (Table 2).

Eigenvalues corresponding to the components selected based on the Kaiser criterion
  Eigenvalue Explained variance (%) Accumulated variance (%)
λ1 9.400 30.32 30.32
λ2 5.121 16.52 46.84
λ3 3.995 12.89 59.73
λ4 2.541 8.20 67.93
λ5 2.094 6.75 74.68
λ6 1.839 5.93 80.61
λ7 1.456 4.70 85.31
λ8 1.055 3.40 88.71

Based on the new data structure, in the system generated by the eight descriptive axes, the Mahalanobis distances of each animal were determined in relation to the centroid of the set of all 115 animals. The multivariate statistical procedure established an animal’s maximum distance from the centroid for it to be located inside the ellipsoid, built to a 95% confidence level, as being 17.419. Thus, animals whose distance values were greater than that, shown in Figure 2, were considered to be outside the confidence ellipsoid, being indicated as special (spurious) as compared to those inside that ellipsoid.

Mahalanobis distance between the animals and the centroid of the group.

As such, spurious animals were those registered under the numbers 5, 19, 43, 53, 64 and 110, being the homogeneous batch formed by the 109 animals inside the confidence region, which can be submitted to the experimental models via the simple casualization process. Of the spurious animals, the one registered as 19 was the most dissimilar to the total group, while that registered as 110 was the least dissimilar.

The conclusion of the assessment of the amount of PC required to retain the relevant variability of this study was that the data set regarding the animals induced to AoS is a complex structure, from the statistical viewpoint. Although its parametric space has been reduced substantially, eight descriptive axes were necessary to form the new Cartesian system, making the graphical visualization of the method impossible.

Despite that limitation, the graph in Figure 2 can visually translate each animal’s behavior regarding the group. The ordinate axis represents the Mahalanobis distance of each animal from the set centroid. Thus, knowing the distance from the centroid to the outline of the ellipsoid (represented by the red horizontal line), the animals with discrepant behavior are evidenced. They should be more deeply assessed to verify their non-homogeneous characteristics regarding the group.

Regarding the development of the statistical model to detect the non-homogeneous animals, there is no limitation to the application of the procedure in the search for spurious animals. From the practical perspective of using the results of the model proposed to new studies, it is worth noting that the process is limited to the study of animals submitted to AoS under experimental conditions similar to the one described. As such, further studies/tests would be necessary to corroborate the reliability of the model for other samples.

In the process of selecting homogeneous groups in experimental research, when using procedures with no concern about the general structure of variability, the number of experimental units (animals) discarded is relevant when compared to the amount of spurious animals identified by the criterion proposed in this study. This can be understood by the fact that the method proposed characterizes the discard by considering the animal, while those with no concern about the general structure of variability consider the discard fragmented according to the variable.

The contribution of the method is explained by the improvement in the quality of homogenization, by ensuring greater reliability to the animals’ biological characteristics in the inclusion of similar animals, thus motivating a smaller discard rate, maximizing the homogeneous batch, for posterior submission to treatments by use of the simple casualization process of the animals.

 Conclusions

The criterion presented, named multihomogen criterion, proved to be effective in selecting homogeneous groups of animals for experimental research, because it considers the biological situation of the animal as a whole, analyzing jointly all parameters measured, in addition to having a small discard rate.

As such, this biometrical tool serves to researchers of the biological and health areas. Regarding specifically cardiac remodeling, in which animals are submitted to AoS, the results of this study confirm the expectations presented initially in the discussions involving the experiments previously conducted by the Research Group on Experimental Cardiology of the FMB - Unesp.

Sources of Funding

This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

This study was partially funded by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Study Association

This article is part of the dissertation of master submitted by Renan Mercuri Pinto, from Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.

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R: a language and environment for statistical computing: reference index Viena Foundation for Statistical Computing 2013 Artigo Especial Análise Multivariada na Seleção de Animais em Pesquisas Experimentais Pinto Renan Mercuri 1 Campos Dijon Henrique Salomé de 2 Tomasi Loreta Casquel 2 Cicogna Antonio Carlos 2 Okoshi Katashi 2 Padovani Carlos Roberto 1 Universidade Estadual Paulista Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Bioestatística Botucatu São Paulo Brasil Departamento de Bioestatística - Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu, São Paulo - Brasil Universidade Estadual Paulista Faculdade de Medicina de Botucatu Departamento de Clínica Médica Botucatu São Paulo Brasil Departamento de Clínica Médica - Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Botucatu, São Paulo - Brasil Correspondência: Renan Mercuri Pinto, Rua Thomaz Ceneviva, 117, Vila Anita. CEP 13484-295, Limeira, SP - Brasil E-mail: renanmp@usp.br; renanmp@icloud.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa:Pinto RM, Padovani CR. Obtenção de dados: Campos DHS, Tomasi LC, Cicogna AC, Okoshi K. Análise e interpretação dos dados: Pinto RM, Campos DHS, Tomasi LC, Cicogna AC, Okoshi K, Padovani CR. Análise estatística: Pinto RM, Padovani CR. Obtenção de financiamento: Pinto RM, Padovani CR. Redação do manuscrito: Pinto RM, Campos DHS, Tomasi LC, Padovani CR. Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Pinto RM, Cicogna AC, Okoshi K, Padovani CR. Orientação/ Supervisão: Padovani CR.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

Muitos pesquisadores buscam métodos para a seleção de grupos homogêneos de animais em pesquisas experimentais, fato que se justifica por ser a homogeneidade pré-requisito indispensável à casualização de tratamentos. A ausência de métodos robustos, que atendam a princípios estatísticos e biológicos, faz com que os pesquisadores utilizem métodos empíricos ou subjetivos, influenciando seus resultados.

 Objetivo:

Desenvolver modelo estatístico multivariado para a seleção de grupo homogêneo de animais para pesquisas experimentais e elaborar pacote computacional que o operacionalize.

 Métodos:

O conjunto de dados ecocardiográficos de 115 ratos Wistar, machos, com estenose aórtica (EAo) supravalvular foi utilizado para exemplificar o desenvolvimento do modelo. Inicialmente, os dados foram padronizados, tornando-se adimensionais. Em sequência, submeteu-se a matriz de variabilidade do conjunto à análise de componentes principais (ACP) buscando-se reduzir o espaço paramétrico e conservar a variabilidade relevante. Essa técnica estabeleceu um novo sistema cartesiano em que os animais foram alocados e, finalmente, construiu-se a região de confiança (elipsoide) para o perfil de respostas homogêneas dos animais. Os que se situaram no interior do elipsoide foram considerados pertencentes ao grupo homogêneo; caso contrário, espúrios ao grupo.

 Resultados:

A ACP estabeleceu oito eixos descritores que representaram a variabilidade acumulada dos dados em 88,71%. A alocação dos animais no novo sistema e a construção da região de confiança revelou a presença de seis espúrios ao lote homogêneo formado por 109 animais.

 Conclusão:

O critério biométrico proposto mostra-se eficiente, pois considera o animal como um todo, analisando conjuntamente todos os parâmetros mensurados, além de apresentar pequena frequência de descartes.

 Análise Multivariada Animais Epidemiologia Experimental Estenose da Válvula Aórtica Introdução

Devido à falta de conhecimento estatístico, muitos pesquisadores optam por utilizar métodos empíricos ou subjetivos para a tomada de decisão, ignorando o processo de casualização, princípio básico para a fidedignidade dos achados, e, consequentemente, influenciando seus resultados.

Exemplo de influência muito comum ocorre no processo de homogeneização de amostras, que é importante para a randomização em pesquisas envolvendo animais como unidade experimental. Nesse processo, muitos pesquisadores têm o hábito de fazê-la de maneira fragmentada ou intencional, ou seja, utilizando apenas um parâmetro conveniente para classificar o grupo como homogêneo, fator que, além de resultar em homogeneização viesada e inadequada, favorece a possibilidade de descartar animais por um simples valor espúrio do que por dessemelhança biológica.

O processo de homogeneização mais interessante sob o ponto de vista biológico deve considerar conjuntamente todos os parâmetros avaliados na unidade experimental porque esses são, na sua maioria, correlacionados, e a melhor forma de compreender o comportamento do animal está expressa em um conjunto de informações numéricas que represente todas as suas características biológicas. Dessa forma, há necessidade de métodos estatísticos que considerem o animal como um todo e não de maneira fragmentada, já que o organismo reage de maneira conjunta a qualquer intervenção ou tratamento.

Cabe destacar que, quando se tem uma estrutura de dependência entre variáveis, deve-se utilizar a análise multivariada de dados porque, dessa forma, na estatística inferencial não se tem o índice de significância inflacionado, problema ocorrente quando são realizadas várias análises univariadas simultaneamente1.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo estatístico multivariado para a seleção de grupo homogêneo de animais para pesquisas experimentais que atenda a princípios biológicos e estatísticos, e elaborar pacote computacional que o operacionalize.

Para exemplificar o desenvolvimento e a aplicação do critério, foi utilizado o conjunto de dados ecocardiográficos de animais submetidos à cirurgia de indução de estenose aórtica (EAo) supravalvular, cedido pelo grupo de pesquisa em cardiologia experimental da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB), Unesp, buscando-se responder as suas dificuldades em selecionar um grupo homogêneo de animais por simples processo de casualização, para posterior submissão a tratamentos de interesse.

 Métodos Animais e protocolo experimental

O conjunto de dados ecocardiográficos foi obtido de ratos Wistar machos submetidos à cirurgia para indução de EAo supravalvular, sendo este estudo aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais em Experimentação da FMB−Unesp sob o número 850/2010, disponibilizado pelo grupo de pesquisa em cardiologia experimental da referida instituição. Do conjunto, composto por 115 unidades experimentais, foram utilizados 31 parâmetros referentes à massa corporal e às variáveis estruturais e funcionais obtidas pela ecocardiografia transtorácica (Tabela 1).

Identificação dos parâmetros mensurados nos animais
Indice Identificação Descrição
X1 MC (g) Massa corporal
X2 FC (bpm) Frequência cardíaca
X3 DDVE (mm) Diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (VE)
X4 DSVE (mm) Diâmetro sistólico do VE
X5 EDPP (mm) Espessura diastólica da parede posterior do VE
X6 ESPP (mm) Espessura sistólica da parede posterior do VE
X7 EDSIV (mm) Espessura diastólica do septo interventricular
X8 ESSIV (mm) Espessura sistólica do septo interventricular
X9 AO (mm) Diâmetro da aorta
X10 AE (mm) Diâmetro do átrio esquerdo
X11 AE/AO Relação do diâmetro do átrio esquerdo pela aorta
X12 DDVE/MC (mm/kg) Relação de DDVE por MC
X13 AE/MC (mm/kg) Relação de AE por MC
X14 DC (ml/min) Débito cardíaco
X15 IndCard (ml/min/kg) Índice cardíaco
X16 PEE Porcentagem de encurtamento endocárdico
X17 PEM Porcentagem de encurtamento mesocárdico
X18 MVE (g) Massa do VE
X19 IMVE (g/kg) Índice de massa do VE
X20 Onda E (cm/s) Velocidade diastólica inicial do fluxo transvalvular mitral
X21 Onda A (cm/s) Velocidade diastólica final do fluxo transvalvular mitral
X22 E/A Relação onda E pela onda A
X23 ERVE Espessura relativa do VE
X24 VEPP (mm/s) Velocidade de encurtamento da parede posterior do VE
X25 TRIV (ms) Tempo de relaxamento isovolumétrico do VE
X26 R-R (seg) Intervalo entre dois ciclos cardíacos consecutivos
X27 TRIVn TRIV normalizado para a frequência cardíaca
X28 Tei-a (ms) Tempo de contração isovolumétrica + tempo de ejeção + TRIV
X29 Tei-b (ms) Tempo de ejeção
X30 IPM Índice de performance miocárdica
X31 FEVE Fração de ejeção do VE

Na literatura, encontra-se número considerável de estudos experimentais para o desenvolvimento da remodelação cardíaca por sobrecarga pressórica2 - 6. O modelo de EAo tem sido muito utilizado por promover o desenvolvimento gradual de hipertrofia ventricular esquerda em ratos5. Nesse modelo, a sobrecarga pressórica se instala e acentua-se progressivamente à medida que os animais crescem, assemelhando-se, em parte, à EAo no homem. Destacam-se como algumas vantagens, nesse procedimento experimental, a ausência de lesões anatômicas no miocárdio e o baixo custo operacional4.

 Indução de estenose aórtica supravalvular

A EAo foi induzida de acordo com o método previamente descrito4 - 7. Os animais com três a quatro semanas de vida e pesando 70-90 g, após anestesia com cloridrato de quetamina (60 mg/kg) e cloridrato de xilidino (10 mg/kg), via intraperitoneal (ip), foram submetidos à toracotomia mediana. A aorta ascendente foi dissecada e um clipe de prata com 0,6 mm de diâmetro interno foi colocado a aproximadamente 3 mm da sua raiz (Figura 1). A parede torácica foi fechada, sendo o esterno, as camadas musculares e a pele suturados com fio mononáilon 5.0. Durante a cirurgia, os animais foram ventilados manualmente com pressão positiva, oxigênio a 100%. Concluído o ato cirúrgico, os ratos receberam, por via subcutânea, 1 ml de soro fisiológico aquecido e foram colocados em superfície aquecida até retornarem da anestesia.

Alocação do clipe de prata na válvula aórtica. Avaliação ecocardiográfica

A análise ecocardiográfica foi realizada após seis semanas da indução de EAo. Para a realização do exame, os ratos foram anestesiados com cloridrato de quetamina (50 mg/kg/ip) e cloridrato de xilazina (10 mg/kg/ip), e posicionados em decúbito lateral esquerdo. Utilizou-se o ecocardiógrafo modelo Vivid S6 (General Electric Medical Systems, Tirat Carmel, Israel), equipado com transdutor eletrônico de 12 MHz. Para medir as estruturas cardíacas, foram utilizadas imagens em modo M com o feixe de ultrassom orientado pela imagem bidimensional com o transdutor na posição paraesternal eixo menor. A imagem monodimensional do ventrículo esquerdo (VE) foi obtida posicionando o cursor do modo M logo abaixo do plano da válvula mitral entre os músculos papilares8. As imagens da aorta e do átrio esquerdo também foram obtidas na posição paraesternal eixo menor com o cursor do modo M posicionado ao nível da válvula aórtica. Posteriormente, as estruturas cardíacas foram medidas manualmente com o auxílio de um paquímetro em pelo menos cinco ciclos cardíacos consecutivos. O diâmetro diastólico do VE (DDVE) e a espessura diastólica da parede posterior do VE (EDPP) e do septo interventricular (EDSIV) foram medidos no momento correspondente ao diâmetro máximo da cavidade. O diâmetro sistólico do VE (DSVE) e a espessura sistólica da parede posterior do VE (ESPP) e do septo interventricular (ESSIV) foram medidos no momento correspondente ao diâmetro mínimo da cavidade. Para avaliar a função sistólica do VE foram calculadas a porcentagem de encurtamento mesocárdico (PEM), {[(DDVE + ½ EDPP + ½ EDSIV) – (DSVE + ½ ESPP + ½ ESSIV)]/(DDVE + ½ EDPP + EDSIV)} e a velocidade de encurtamento da parede posterior do VE (VEPP), tangente máxima do movimento sistólico da parede posterior. No estudo da função diastólica do VE foram medidos os picos das velocidades do fluxo transvalvular mitral correspondentes à fase de enchimento inicial (onda E) e à fase de enchimento tardio, consequente à contração atrial (onda A), bem como o cálculo da relação onda E/onda A. Para a obtenção dos fluxos relacionados à função diastólica, o transdutor foi posicionado na região correspondente à ponta do coração na imagem denominada quatro câmaras; a medida dos fluxos foi realizada no monitor do ecocardiógrafo.

 Modelo estatístico

O modelo estatístico desenvolvido para estabelecer o procedimento de análise exploratória multivariada de dados e verificar a homogeneidade do lote envolve simultaneamente todas as variáveis mensuradas e leva em consideração toda a estrutura de variação existente nos dados, ou seja, a variação dentro das variáveis (intravariabilidade) e a variação entre as variáveis (intervariabilidade). Destaca-se que a estrutura global de variação pode ser bem representada por medidas descritivas de variabilidade dos dados, mais especificamente, variâncias e covariâncias.

Além disso, o modelo é elaborado tendo em vista aproveitar todos os animais incluídos na pesquisa do grupo de remodelação cardíaca que sobreviveram ao processo cirúrgico descrito anteriormente. Dessa forma, não houve critério específico para determinação do número de animais que deveriam participar do estudo.

Inicialmente, pelo fato de os parâmetros se apresentarem em unidades de medida diferentes, os dados foram padronizados, tornando-se adimensionais, ou seja, cada medida foi apresentada como um valor que representa o quanto ela se afasta da média no respectivo parâmetro. Em seguida, para construção do modelo estatístico, intitulado critério multihomogen, tomou-se a estrutura matricial de variâncias e covariâncias dos dados padronizados (matriz de variabilidade), que equivale à matriz de correlação (R) do conjunto inicial9.

A técnica multivariada empregada na sequência para a análise dos dados consiste na análise dos componentes principais (ACP), cujo princípio básico fundamenta-se na redução do espaço paramétrico sem perda da estrutura de variabilidade conjunta dos dados (no presente estudo, características biológicas do animal) e prejuízo da informação biológica geral do animal. Essa técnica estatística, proposta por Karl Pearson em 1901, consiste em transformar um conjunto inicial de variáveis correlacionadas entre si em outro conjunto de variáveis não correlacionadas, que são combinações lineares ortogonais do inicial10.

Os componentes principais (CP) são apresentados por ordem decrescente de importância para a estrutura conjunta de variabilidade dos dados, isto é, o primeiro explica o máximo possível dessa variabilidade, o segundo, o máximo da variabilidade ainda retida no conjunto após o desconto do efeito do primeiro, e assim sucessivamente, até o último componente. Quanto maior for a retenção da variação total em um número menor de combinações lineares, melhor será a aplicação prática desse procedimento aos dados experimentais, embora essa condição não seja fator impeditivo para a utilização do critério para identificar valores espúrios11.

Uma propriedade matemática interessante dos CP consiste em todos serem mutuamente não correlacionados e, portanto, no que se refere à aderência à normalidade dos dados, independentes entre si. Esse fato assegura um sistema de eixos ortogonais para a representação gráfica dos animais (unidades experimentais) e que pode ser complementado com inferência estatística para identificar os que podem ser descartados por apresentarem alta probabilidade de ocorrência de valores espúrios à população de origem.

Nesse sentido, existem diversos critérios para determinar o número de eixos descritores (CP) considerados relevantes para o sistema ortogonal. No presente estudo adotou-se o critério de Kaiser, também conhecido como critério da raiz latente, no qual se toma como representativo o CP que contém informação acumulada no respectivo autovalor superior à unidade. Trata-se de componentes que condensam uma considerável variabilidade dos dados12.

Para conduta da prática metodológica de homogeneização em pesquisas experimentais ou observacionais, a situação desejável para a informação biológica, principalmente para a visualização gráfica do procedimento, consiste em ser o número de CP (também denominados eixos descritores), no máximo, três. Porém, para dimensões acima de três (situação comum quando se tem um número considerável de características avaliadas na unidade experimental), a técnica permanece exatamente a mesma, salvo a visualização gráfica, que se torna inviável.

Após alocação dos animais no sistema cartesiano, determinado pelos eixos descritores selecionados, constrói-se a região (elipsoide) de confiança para o perfil médio de resposta homogênea dos animais. A construção da região de 100 (1 − α)% de confiança fica determinada com a utilização da estatística T 2 de Hotelling transformada na distribuição F de Fisher-Snedecor13. Deve também ser considerado que a técnica estatística utilizada para estabelecer a região de confiança envolve a construção de intervalos de inclusão, considerando um nível de confiança conjunto para todas as variáveis, que possibilita verificar se os animais estão ou não dentro do elipsoide10.

Nesse sentido, se o vetor de respostas do animal em estudo situar-se no interior do elipsoide de confiança construído (isto é, se a distância generalizada de Mahalanobis do animal ao centroide do elipsoide for menor que a distância do contorno), o animal é classificado como pertencente ao lote homogêneo; caso contrário (distância maior), é identificado como espúrio e, consequentemente, não participa do processo de casualização simples dos tratamentos14.

Por meio dos procedimentos estatísticos abordados nesta seção, desenvolveu-se o algoritmo generalizado e, consequentemente, o pacote computacional, facilitando a operacionalização do critério proposto. Elaborado para o programa estatístico Rstudio (disponibilizado gratuitamente on-line: http://www.R-project.org), foi intitulado pacote multihomogen e pode ser obtido diretamente (sem custo financeiro) com os autores via e-mail 15.

 Resultados

A título de operacionalizar o software desenvolvido e caracterizar a homogeneidade de um grupo experimental de animais, o critério multihomogen foi aplicado ao conjunto de dados relativos aos parâmetros avaliados nos ratos Wistar submetidos à EAo do estudo mencionado anteriormente. A partir da matriz quadrática de variabilidade (de ordem 31), envolvendo as correlações, foram estabelecidos oito eixos descritores, correspondentes aos oito CP selecionados pelo critério de Kaiser, que representaram a variância acumulada do conjunto de dados em 88,71% (Tabela 2).

Autovalores correspondentes aos componentes selecionados pelo critério de Kaiser
  Autovalor Variância explicada (%) Variância acumulada (%)
λ1 9,400 30,32 30,32
λ2 5,121 16,52 46,84
λ3 3,995 12,89 59,73
λ4 2,541 8,20 67,93
λ5 2,094 6,75 74,68
λ6 1,839 5,93 80,61
λ7 1,456 4,70 85,31
λ8 1,055 3,40 88,71

A partir da nova estrutura dos dados, no sistema gerado pelos oito eixos descritores foram determinadas as distâncias de Mahalanobis de cada animal em relação ao centroide do conjunto de todos os 115 animais. O procedimento estatístico multivariado estabeleceu o valor máximo da distância de um animal ao centroide para que ele se localize no interior do elipsoide, construído para o nível de 95% de confiança, como sendo 17,419. Portanto, os animais cujos valores das distâncias apresentaram-se superiores a esse, destacados na Figura 2, foram considerados fora do elipsoide de confiança e, consequentemente, apontados como especiais (espúrios) em relação aos situados no interior.

Distância de Mahalanobis entre os animais e o centroide do grupo.

Dessa forma, foram considerados animais espúrios ao grupo os registrados sob os números 5, 19, 43, 53, 64 e 110, ficando então o lote homogêneo formado pelos 109 animais inseridos na região de confiança, que podem ser submetidos a modelos experimentais por simples processo de casualização. Nos animais não incluídos para a homogeneização, o registrado sob número 19 consiste no mais dessemelhante do grupo total, enquanto o 110 é o menos dessemelhante.

Avaliando a quantidade de CP necessários para reter a variabilidade relevante deste estudo, conclui-se que o conjunto de dados referente aos animais induzidos à EAo é uma estrutura complexa do ponto de vista estatístico. Embora seu espaço paramétrico tenha se reduzido substancialmente, foram necessários oito eixos descritores para compor o novo sistema cartesiano, impossibilitando a visualização gráfica do método.

Apesar dessa limitação encontrada, o gráfico representado pela Figura 2 consegue traduzir visualmente o comportamento de cada animal em relação ao grupo. O eixo das ordenadas apresenta a distância de Mahalanobis de cada animal ao centroide do conjunto. Dessa forma, conhecendo a distância do centroide à casca do elipsoide de confiança (representada pela linha horizontal vermelha), fica confortável apontar os animais com comportamento discrepante. A eles cabe um aprofundamento para verificar características não homogêneas ao grupo.

Quanto ao desenvolvimento do modelo estatístico para detecção de animais não homogêneos ao grupo de estudos, não há qualquer limitação para a aplicação do procedimento na busca por animais espúrios. Sob o aspecto prático da utilização dos resultados do modelo proposto em novos estudos, deve ser considerado que o processo se limita a estudos de animais submetidos à EAo em condições experimentais semelhantes à descrita. Dessa forma, seriam necessários mais estudos/testes para corroborar a confiabilidade do modelo para outras amostras.

No processo de seleção de grupos homogêneos em pesquisas experimentais, ao utilizar procedimentos sem qualquer preocupação com a estrutura geral de variabilidade, o número de descartes de unidades experimentais (animais) tem relevância quando comparado à quantidade de animais espúrios apontados pelo critério proposto neste trabalho. Isso pode ser entendido pelo fato de o método proposto caracterizar o descarte considerando o animal, enquanto os despreocupados com a estrutura geral de variabilidade consideram o descarte fragmentado por variável.

A contribuição do método explica-se pelo melhoramento na qualidade de homogeneização, por assegurar maior fidelidade às características biológicas da inclusão de animais semelhantes e, por consequência, motivar pequena frequência de descartes, maximizando o lote homogêneo, para posterior submissão aos tratamentos por processo simples de casualização dos animais.

 Conclusões

O critério apresentado, intitulado critério multihomogen, mostra-se eficiente para a seleção de grupos homogêneos de animais em pesquisas experimentais, pois considera a situação biológica do animal como um todo, analisando conjuntamente todos os parâmetros mensurados, além de apresentar pequena frequência de descarte.

Dessa forma, a presente ferramenta biométrica serve de subsídio a pesquisadores das áreas biológicas e da saúde. Especificamente dentro da linha de remodelação cardíaca, em que os animais são submetidos à EAo, os resultados do presente estudo corroboraram as expectativas apresentadas inicialmente nas discussões envolvendo os experimentos previamente realizados pelo Grupo de Pesquisa em Cardiologia Experimental da FMB - Unesp.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado por Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

O presente estudo foi parcialmente financiado por Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Renan Mercuri Pinto pela Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.