Conception and design of the research and Critical revision of the manuscript for intellectual content: Campos CMR, Kulikowski LD, Kim CA; Acquisition of data and Writing of the manuscript: Campos CMR; Analysis and interpretation of the data: Campos CMR, Zanardo EA, Dutra RL.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Congenital heart defects (CHD) are the most prevalent group of structural abnormalities at birth and one of the main causes of infant morbidity and mortality. Studies have shown a contribution of the copy number variation in the genesis of cardiac malformations.
Investigate gene copy number variation (CNV) in children with conotruncal heart defect.
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) was performed in 39 patients with conotruncal heart defect. Clinical and laboratory assessments were conducted in all patients. The parents of the probands who presented abnormal findings were also investigated.
Gene copy number variation was detected in 7/39 patients: 22q11.2 deletion, 22q11.2 duplication, 15q11.2 duplication, 20p12.2 duplication, 19p deletion, 15q and 8p23.2 duplication with 10p12.31 duplication. The clinical characteristics were consistent with those reported in the literature associated with the encountered microdeletion/microduplication. None of these changes was inherited from the parents.
Our results demonstrate that the technique of MLPA is useful in the investigation of microdeletions and microduplications in conotruncal congenital heart defects. Early diagnosis of the copy number variation in patients with congenital heart defect assists in the prevention of morbidity and decreased mortality in these patients.
Congenital heart defects (CHD) are the most common group of structural abnormalities at birth, with an estimated prevalence of 1-5% of life births, constituting one of the main causes of infant morbidity and mortality
Genetic factors are important in the complex etiology of CHD
Conotruncal malformations represent a heterogeneous group of cardiac malformations involving the ventricular outflow tract and the arterial pole of the heart. These malformations compromise the development of the outflow tract of the heart and are responsible for roughly 10-25% of all CHDs diagnosed at birth
Following sequencing of the human genome, a new type of genomic alteration was discovered - the copy number variation - and its association with cardiac malformations was established
Copy number variations (CNVs) are defined as fragments of deoxyribonucleic acid (DNA), greater than or equal to a kilobase (kb), present in variable number in a genome
CNVs are an important part of the genetic diversity in relation to evolution and disease susceptibility; hence, its detection and association with characteristics and phenotypes are an important step to better understand the etiology of the disorder
Molecular analysis with the multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) technique has been used to determine copy number variation. This technique detects several microdeletion/microduplication syndromes associated with CHD and could be used as a diagnostic test to detect relevant variations in the number of copies and identify syndromic patients
This study investigated the presence of copy number variation in children with conotruncal heart defect and their parents, and associated the genetic and clinical findings with those described in the literature.
For the prospective and descriptive study, 39 patients with conotruncal and aortic coarctation congenital heart diseases were included. A convenience sampling was used.
The patients were referred from the outpatient pediatric cardiology and neonatal intensive care unit (ICU) of the
The inclusion criterion was the presence of lesions in the echocardiographic examination:
The study was approved by the Ethics Committee in Research of the School of Medicine, University of São Paulo and by the Ethics Committee of the University Hospital Júlio Müller, Federal University of Mato Grosso. A signed informed consent form was obtained from patients or parents, depending on the age of the patient.
A clinical record was filled for each individual. The assessment of dysmorphic features was subsequently analyzed in photographs or in person by a geneticist.
In patients with copy number variation, a clinical and laboratory evaluation of the parents was included.
Peripheral venous blood of the probands and their families was collected for classical cytogenetics and MLPA.
Blood samples were sent to the cytogenomics laboratory of the School of Medicine of the University of São Paulo, where the MLPA technique was performed.
MLPA reactions were conducted according to the manufacturer's protocol using the kits SALSA P036, P070, P064 and P250 (MRC-Holland®, Amsterdam, the Netherlands) with some modifications for higher yield of the reagents.
The P036 and P070 kits detect subtelomeric changes. The P064 kit is recommended for major microdeletion syndromes, detecting changes in 22q11.2 and other critical regions for some syndromes.
The P250 kit is specific for DiGeorge syndrome, detecting microdeletions/duplications in 22q11.2. It contains probes for other regions involved in the occurrence of heart disease.
A total of 250 ng of genomic DNA (5 ul) from each patient was added to a microtube and taken to the thermocycler (Veriti® ThermalCycler - Life Technologies) for denaturation at 98°C for 15 minutes. Then, a mixture of probes (specific for each kit) and buffer solution were added to the methylated DNA for the hybridization process of the MLPA probes to DNA at 60°C for three hours. Buffered solutions, along with the enzyme ligase were added to the hybridization solution to allow binding of the probes to each specific target region to 54°C for 15 minutes. In the last step, the reagents for PCR were added to the binding solution for the amplification of only the fragments connected by the ligase. Thus, the amplified products were placed in microplates along with a molecular weight marker (LIZ - GS600) and Hi-Di Formamide (Life Technologies) and carried to the automated sequencer ABI 3500 (Life Technologies) for the reactions of fragment analysis.
In all MLPA reactions, at least three normal controls were used. The data were generated by the automated sequencer ABI 3500 (Life Technologies), at the Network of Multiuser Equipment of the immunology laboratory of the
The analysis of the results of the MLPA reaction was performed with the software Gene Marker® (SoftGenetics LLC, State College, PA -
The study included 39 patients with congenital heart disease. Of these, 23 (59%) were males and 16 (41%) were females. Their ages ranged from two days to 19 years, with an average of five years and seven months. Only two mothers reported a previous diagnosis by gestational ultrasound of the fetus with congenital heart disease.
Among the diseases observed, most patients had tetralogy of Fallot, which was present in approximately 56% of the cohort. Other heart diseases included transposition of the great arteries (23%), coarctation of the aorta (10.3%), double outlet right ventricle (7.7%), pulmonary atresia and ventricular septal defect (2.6% ) -
| Type of heart defect | N (%) |
|---|---|
| Tetralogy of Fallot | 22 (56.4%) |
| Transposition of the great arteries | 9 (23%) |
| Coarctation of the aorta | 4 (10.3%) |
| Double outlet right ventricle | 3 (7.7%) |
| Pulmonary atresia and ventricular septal defect | 1 (2.6%) |
| Total | 39 (100%) |
CNVs were not detected in 32/39 patients (82.05%). Familial recurrence of congenital heart disease was observed in 2/32 patients.
Extracardiac abnormalities were observed In 15/32 patients (46.8%) with normal MLPA, and the clinical signs and symptoms observed were: facial dysmorphias, cleft palate, strabismus, stroke, seizure, facial paralysis, hearing loss, vitiligo, epilepsy, autism, subglottic stenosis, asthma, frequent infections of the upper and lower airways, omphalocele, color blindness, feeding difficulties, growth failure, gastroesophageal reflux, cryptorchidism, speech disorder, learning disabilities and hypocalcemia. Frequent airway infections occurred in six cases; other extracardiac changes occurred sporadically in the patients.
Of the 32 patients, five died, and all of these patients who died had been admitted to a neonatal intensive care unit awaiting transfer to a center specialized in heart surgery.
With the MLPA technique using four kits, it was possible to detect microdeletions/microduplications in 7/39 patients (17.9%), including two cases of deletion (19p deletion, 22q deletion) and five cases of duplication (two cases of 15q duplication, 20p duplication, 22q duplication, 8p duplication and 10p duplication).
The ages of the seven patients who presented CNVs ranged from 19 days to 10 years. Three presented with tetralogy of Fallot, two had double outlet right ventricle, one had transposition of the great arteries and one had coarctation of the aorta. All seven patients had extracardiac manifestations.
Of the seven patients, three were admitted to the neonatal intensive care unit and died (
| N | Age | Gender | CHD | Clinical features | CNV | Outcome | Current age/death |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Facial dimorphism | |||||||
| Duodenal Atresia | |||||||
| MC001 | 3 m | F | Co. Aorta | Sick neonatal, Atrophy, cerebral dysplasia Frequent ILA, DNPD | 15q 11.2 dup | Death | 5 m |
| MC003 | 6 y | M | TOF | Facial dysmorphism Asthma | 19p del | Amb | 8 y |
| MC006 | 19 d | M | DORV | Facial dysmorphism | 20p12.2 dup | Death | 23 d |
| MC011 | 2 y | M | TOF | Facial dysmorphism Growth deficit DNPD | 15q dup | Amb | 4 y |
| MC015 | 6 y | F | TOF | Broad forehead Fusiform fingers | 8p23.2 dup and 10p12.31 dup | Amb | 8 y |
| Facial dysmorphism GERD | |||||||
| MC030 | 10 y | M | TGA | Frequent ILA Learning difficulty | Dup2 2q11 | Amb | 12 y |
| MC039 | 5 m | F | DORV | Facial dysmorphism Umbilical hernia Feeding difficulty Growth deficit GERD | 22q11 del | Death | 6 m |
| Velopharyngeal insufficiency Thymic aplasia DNPD |
y: years; amb: ambulatory; CoA: coarctation of the aorta; d: day; CHD: congenital heart defect; del: deletion; dup: duplication; DORV; double-outlet right ventricle; F: female; ILA:infection of the lower airways; m: month; M: male; DNPD: delayed neuropsychomotor development; GERD: gastroesophageal reflux; TGA: transposition of the great arteries; TOF: tetralogy of Fallot.
The investigation of the parents was conducted in six families of patients with abnormal MLPA. Of these, we obtained material from both parents (father and mother) in four families and, in two cases, only material from the mother. None of them presented changes similar to their children's CNVs.
Female patient, child of non-consanguineous parents, father with 30 years of age and mother of indigenous origin, 31 years of age, with four children, the third child had a complex congenital heart disease and died. The child was born by cesarean delivery at 38 weeks gestation, weighing 2,165 g (below the 3rd percentile for age), measuring 44 cm (3rd percentile for age), with head circumference of 32 cm (between the 3rd and 10th percentiles for age) and Apgar 9 and 9. The echocardiography identified severe coarctation of the aorta, patent ductus arteriosus, atrial septal defect and several ventricular septal defects.
At the age of three months, her weight was 3,030 g (between the 3rd and 15th percentiles for age), her length was 49 cm (between the 3rd and 15th percentiles for age) and her head circumference was 36 cm (much below the 3rd percentile for age). The facial changes observed were small, almond-shaped eyes, thin upper lip, micrognathia, microcephaly, presence of neonatal teeth and narrow ear canal.
Other abnormalities also present were duodenal atresia, left appendix, constipation, feeding difficulties, failure to thrive, hypertonia, neuropsychomotor development delay, change in body temperature regulation and frequent airway infections. Cranial computed tomography showed atrophy and cortical dysplasia. The patient died at the age of four months, shortly after being discharged home from the ICU.
Neonate with 19 days of age, male, first child of healthy, non-consanguineous mother and father with 20 and 24 years, respectively. He was born by cesarean delivery at 39 weeks gestation, weighing 3,800 g (75th percentile for age), length of 52 cm (50th percentile for age), head circumference of 34 cm (25th percentile for age) and Apgar 10. Echocardiography diagnosed double outlet right ventricle, large atrial septal defect, rudimentary ventricular chamber, aortic arch hypoplasia, patent ductus arteriosus and aortic stenosis.
Physical examination detected facial findings, such as bitemporal flattening, elongated face, ocular hypertelorism, wide nasal dorsum, flat nasal tip, anteverted nostrils and micrognathia, also presenting short neck, and elongated fingers and feet.
He remained in the ICU and died awaiting transfer to undergo heart surgery.
Male patient, second son of healthy, non-consanguineous parents, mother and father with 32 and 33 years of age, respectively.
He was born by cesarean section at 39 weeks gestation, weighing 3,450 g (50th percentile for age), measuring 49 cm (between the 25th and 50th percentiles for age), with a head perimeter of 33.5 cm (50th percentile for age), and with diagnosis of tetralogy of Fallot.
At the age of six years, he weighed 26,500 g (between percentiles 85th and 97th for age) and measured 123 cm (85th percentile for age).
On physical examination he presented dysmorphic facial features such as wide nasal dorsum, flattened nasal bridge and almond-shaped eyes. Asthma was reported as an extracardiac finding. The neuropsychomotor development was normal.
Male patient, the only child of non-consanguineous and healthy mother and father with 36 and 26 years, respectively, and without reported heart disease in the family. He was born by cesarean section with 30 weeks gestation, weighing 1,015 g (10th percentile for age) and measuring 38 cm (10th percentile for age).
At the age of two years and 11 months, he presented the following anthropometric measurements: weight of 14,000 g (between the 50th and 85th percentiles for age), length of 82 cm (below the 3rd percentile for age) and head circumference of 46 cm (below the 3rd percentile for age).
On echocardiography, he presented tetralogy of Fallot. On physical examination, dysmorphic facial features were detected: ocular hypertelorism, broad nasal dorsum, flattened nasal bridge, anteverted nostrils, long and flat nasolabial philtrum and microcephaly.
The clinical abnormalities evidenced were growth deficit and delayed neuropsychological development.
Female infant, the first child of healthy, non-consanguineous father and mother with 29 and 24 years of age, respectively, without family history of heart disease. During pregnancy, the mother developed gestational diabetes requiring insulin, and the only abnormality observed on gestational ultrasonography was polyhydramnios.
She was born by cesarean section at 37 weeks gestation, weighing 2,500 g (between the 10th and 25th percentiles for age), measuring 44 cm (10th percentile for age), with a head circumference of 33.5 cm (50th percentile for age) and Apgar 8 and 8. At the age of five days, a heart murmur was detected, echocardiography showed double outlet right ventricle, atrial septal defect, ventricular septal defect and mild pulmonary stenosis. She was admitted to the ICU and underwent the first cardiac surgery.
At the age of five months, her weight was 4,200 g (between the 15th and 50th percentiles for age), her length was 55 cm (below the 3rd percentile for age) and her head circumference was 36.5 cm (below the 3rd percentile for age).
The physical examination detected dysmorphic facial features: ocular hypertelorism, large eyes, broad nasal dorsum, flat nasal tip with anteverted nostrils, long nasolabial philtrum, thin upper lip with inverted "V", micrognathia, flattened earlobe, fingers tapered and elongated and umbilical hernia.
Clinical changes highlighted were difficulty of feeding, growth deficit, neuropsychomotor development retardation (she could only hold her head).
Imaging tests showed gastroesophageal reflux and thymic aplasia. An evaluation with an ENT specialist showed velopharyngeal insufficiency. Laboratory exams identified serum calcium within the normal range.
The patient died after heart surgery at the age of six months.
She had a deletion of 3.0 Mb, therefore a typical
Male patient, an only child of a single mother, healthy, 35 years old, without report of heart disease in the family. He was born by cesarean section at 40 weeks and six days gestation, weighing 4,425 g (above the 90th percentile for age) measuring 50 cm (between the 10th and 25th percentiles for age), with head circumference 37.5 cm (above the 97th percentile for age) and Apgar 8 and 10.
The echocardiography showed transposition of the great arteries, atrial septal defect and patent ductus arteriosus. Heart surgery was performed at the tenth day of life.
At the age of 10 years he weighed 40 kg (between the 85th and 90th percentiles for age), measured 142 cm (between the 50th and 85th percentiles for age) and had a head circumference of 52.5 cm.
On physical examination, subtle phenotypic changes were observed, such as broad nasal base, long nasolabial philtrum and thin upper lip, with a diagnosis of gastroesophageal reflux and frequent respiratory infections. The neuropsychomotor development was normal, but he had learning disability.
Female patient, six-years old, an only child of separated parents, no history of consanguinity or heart disease in the family, healthy mother with 23 years of age.
She was born by normal delivery at 40 weeks gestation, weighing 3,150 g (25th percentile for age) with a diagnosis of tetralogy of Fallot, mild tricuspid regurgitation and moderate pulmonary insufficiency. She underwent heart surgery at the age of four.
She currently weighs 20.7 kg (between the 15th and 50th percentiles for age), measures 117 cm (between the 15th and 50th percentiles for age) and has a head circumference of 51 cm. On physical examination were evidenced wide forehead and fusiform fingers. The neuropsychomotor development was normal and did not show other clinical changes.
Recent studies have shown that CNVs occur in significant proportion in patients with CHD. In syndromes involving CHD as part of the clinical spectrum, cardiac malformation is often the first symptom to appear
In the present study we detected CNVs in 7/39 cases: 22q11.2 deletion, 22q11.2 duplication, 15q11.2 duplication, 20p12.2 duplication, 19p deletion, 15q duplication and 8p23.2 duplication with concomitant 10p12.31duplication.
Currently, several studies have established the relevance of CNVs in the etiology of CHD. Association has been demonstrated of both syndromic CHD and isolated CHD and chromosomal imbalances
The karyotype was normal in all subjects of this research, which was also observed by Thiempont et al
CNVs are also known to be involved in the genesis of neurodevelopmental and neurocognition disorders such as intellectual disability, schizophrenia and autism spectrum
Our study identified five cases of duplication and deletion of only two cases of deletion, similar to the study by Erdogan et al
Initially, the patients in this study appeared to have only CHD, however a more careful clinical examination and phenotypic evaluation showed extracardiac changes possibly part of a syndrome. Several studies have demonstrated the presence of CNVs in non-syndromic CHD
Recently, Warburton et al
The 22q11.2 deletion syndrome (22q11DS), also known as DiGeorge or velocardiofacial syndrome, is considered the most common of the syndromes of human microdeletion and contains multiple genes. The estimated prevalence is 1: 4,000 live births
A submicroscopic chromosomal deletion is detected by FISH, MLPA or chromosomal microarray analysis. The vast majority of cases (90 percent) showing deletion of approximate size of three million bases (Mb) leads to deletion of approximately 45 genes, as presented by the patient of the study
The only patient in this study with 22q11 deletion was initially carrier of isolated conotruncal heart defect. After detailed physical examination, several phenotypic changes that are part of 22q11.2 deletion syndrome were observed. In most studies that have sampled a population of individuals with isolated conotruncal heart defect, it was later observed in a more detailed clinical examination the presence of subtle phenotypic changes not evident at the first examination
The clinical presentation of the 22q11 deletion syndrome can be extremely variable. Early detection of deletion is important for the treatment of anomalies and for investigation of associated malformations and prevention of neuropsychological and immune deficiency problems. In most cases, the 22q11 deletion occurs
The patient in question presented as heart defect a double outlet right ventricle and died after the second surgery. Congenital heart defect is one of the most frequent manifestations of the 22q11.2 deletion syndrome. Furthermore, it is the leading cause of death in most patients with this syndrome.
The identification of genetic factors for CHD is important to provide genetic counseling for parents who plan to have other children. The risk of recurrence for many CHDs is 2-6%, and the recurrence risk of CHD increases significantly when parents are carriers of deletion/duplication
In recent years, dozens of clinically relevant chromosome microdeletions and microduplications have been described in humans, often associated with mental retardation, autism and/or physical malformations. Once these small genomic arrangements are generally below the detection limit of optical microscopy, it is essential to use molecular diagnostic procedures to provide an explanation for the symptoms and signs observed and provide clinical and genetic prognostic for patients and their families. In developed countries, molecular tests, particularly comparative genomic hybridization (CGH) array, have become the gold standard for such laboratory diagnosis. However, these tests are very costly and rely on the availability of expensive equipment which must be updated frequently. As a result of these high costs, patients in developing countries have no access to testing and are often not diagnosed, with great loss to their families
The MLPA is an established technique for detecting known CNVs. The cost of the MLPA is substantially lower than the array CGH and, with respect to fluorescence in situ hybridization (FISH), is fast, easy and economical, with a simple kit capable of performing simultaneous search of multiple anomalies. Therefore, it can be used for detecting variation in the number of copies clinically relevant in patients with apparently non-syndromic CHD, causing early identification of patients with genomic disorders
If the diagnosis of CHD is established early, i.e., intrauterine, better preparation for birth with earlier treatment would improve the prognosis in terms of morbidity and mortality, yet we observe that most mothers of patients in this study, even having performed prenatal and pregnancy ultrasound, were unaware of the diagnosis of fetal cardiac defects. In a state with a shortage of beds in neonatal intensive care units for the treatment of these neonates and which does not offer heart surgeries of greater complexity, these patients are probably dying without diagnosis and treatment. This can be evidenced in our sample, in which all patients who were admitted to the intensive care unit died awaiting transfer to a center specializing in heart surgery, demonstrating the importance of early diagnosis in the impact of high mortality in these individuals.
There is still controversy in the literature about to which group of individuals should be promoted the routine investigation of variation in copy -number in patients with isolated heart defect or in those with other extracardiac changes. What can be seen of consensus that a thorough physical examination looking for dysmorphic signs, especially in children with conotruncal heart defect, can assist in the decision to carry out molecular tests. The benefits provided would be adequate genetic counseling, evaluation and management of problems more effectively, resulting in improved quality of life of the individual and the family.
The MLPA technique is useful in the investigation of microdeletions and microduplications in conotruncal congenital heart defects.
Early diagnosis of CNVs in patients with CHD assists in the prevention of morbidity and reduction of mortality in these patients. A thorough clinical evaluation in every patient with CHD is essential to detect other associated congenital anomalies.
This work highlights the need for the physician, when facing a child with heart defect, to be alert to the possibility of genetic abnormalities, with knowledge of new techniques that enable the diagnosis.
A limitation of this study is the sampling method used, the convenience, as the small sample size, which allows us to consider the results found only for the population in question.
This study was funded by FAPESP 2009-53105 and CNPq: 401910/2010-5
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Carla Marques Campos, from Universidade de São Paulo e Universidade Federal de Mato Grosso.
We thank the cardiologists who allowed their patients to be studied and the patients and parents who agreed to participate.
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
Os defeitos cardíacos congênitos são o grupo de anormalidades estruturais mais prevalentes ao nascimento e uma das principais causas de morbidade e mortalidade infantil. Estudos têm mostrado a contribuição da variação no número de cópias na gênese das malformações cardíacas.
Investigar a variação no número de cópias gênicas em crianças com defeito cardíaco conotruncal.
Variação no número de cópias foi detectada em 7/39 pacientes: deleção 22q11.2, duplicação 22q11.2, duplicação 15q11.2, duplicação 20p12.2, deleção 19p, duplicação 15q e 8p23.2 com duplicação 10p12.31. As características clínicas foram compatíveis com o relatado na literatura associadas com microdeleção/microduplicação encontrada. Nenhuma dessas alterações foi herdada dos pais.
Nossos resultados demonstram que a técnica de MLPA é útil na investigação de microdeleções e microduplicações em defeitos cardíacos congênitos conotruncais. O diagnóstico precoce das variações no número de cópias em pacientes com defeito cardíaco congênito auxilia na prevenção de morbidade e diminuição da mortalidade nesses pacientes.
Os defeitos cardíacos congênitos (DCC) são o grupo de anormalidades estruturais mais comuns ao nascimento, com prevalência estimada de 1-5% dos nascidos vivos, constituindo uma das principais causas de morbidade e mortalidade infantil
Os fatores genéticos são importantes na etiologia complexa dos DCC
As malformações conotruncais representam um grupo heterogêneo de malformações cardíacas envolvendo o sistema de saída dos ventrículos e o polo arterial do coração. Essas malformações comprometem o desenvolvimento das vias de saída do coração e são responsáveis por cerca de 10-25% de todos os DCC diagnosticados ao nascimento
Após o sequenciamento do genoma humano, um novo tipo de alteração genômica foi descoberto - a variação no número de cópias e sua associação com malformações cardíacas foi estabelecida
As variações no número de cópias (CNVs) são definidas como fragmentos de ácido desoxirribonucleico (DNA), maior ou igual a um quilobase (kb), presentes em número variável em um genoma
As CNVs constituem uma parte importante da diversidade genética em relação à evolução e suscetibilidade a doenças; consequentemente, sua detecção e associação com características e fenótipos constituem importante passo para melhor entender a etiologia da afecção
Análise molecular pela técnica de
Este estudo investigou a presença de variação no número de cópias em crianças com cardiopatia conotruncal e seus pais, e relacionou os achados genéticos e clínicos com os descritos na literatura.
Para o estudo prospectivo e descritivo foram incluídos 39 pacientes portadores de cardiopatia congênita do tipo conotruncal e coartação da aorta. A amostragem utilizada foi de conveniência.
Os pacientes eram oriundos do ambulatório de cardiologia pediátrica e unidade de terapia intensiva (UTI) neonatal do Hospital Universitário Júlio Müller e outros hospitais localizados em Cuiabá, Mato Grosso. O período de coleta dos dados foi de março a novembro de 2012.
O critério de inclusão foi a presença das lesões ao exame ecocardiográfico:
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário Júlio Müller da Universidade Federal de Mato Grosso. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido dos pacientes ou pais, dependendo da idade do paciente.
Foi preenchida uma ficha clínica para cada indivíduo. A avaliação de aspectos dismórficos foi analisada posteriormente por meio de fotografias ou pessoalmente por um geneticista.
Nos pacientes com variação no número de cópias foi incluída avaliação clínica e laboratorial de seus pais.
Foi coletado sangue venoso periférico dos probandos e de seus familiares para a realização de citogenética clássica e MLPA.
As amostras de sangue foram encaminhadas para o laboratório de citogenômica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, onde foi realizada a técnica de MLPA.
As reações de MLPA foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante utilizando os
Os
O
Foram utilizados 250 ng de DNA genômico (5 uL) de cada paciente, sendo adicionados a um microtubo e levados ao termociclador (Veriti® ThermalCycler Life Technologies) para desnaturação a 98°C por 15 minutos. Em seguida, uma mistura das sondas (específicas para cada
Em todas as reações de MLPA foram utilizados pelo menos três controles normais. Os dados foram gerados pelo sequenciador automático ABI 3500 (Life Technologies), da Rede de Equipamento Multiusuário no laboratório de imunologia do Instituto do Coração - Incor - HC/FMUSP.
A análise dos resultados da reação de MLPA foi realizada utilizando o
Participaram do estudo 39 pacientes portadores de cardiopatia congênita, dos quais 23 (59%) eram do sexo masculino e 16 (41%) do sexo feminino. A idade variou de dois dias a 19 anos, e a média foi de cinco anos e sete meses. Somente duas mães relataram diagnóstico prévio por meio de ultrassonografia gestacional do feto com cardiopatia congênita.
Entre as cardiopatias observadas, a maioria dos pacientes apresentava tetralogia de Fallot, presente em aproximadamente 56% da casuística. As outras cardiopatias foram: transposição de grandes artérias (23%), coartação da aorta (10,3%), dupla via de saída de ventrículo direito (7,7%), atresia pulmonar e defeito de septo ventricular (2,6%) -
| Tipo de defeito cardíaco | N (%) |
|---|---|
| Tetralogia de Fallot | 22 (56,4%) |
| Transposição de grandes artérias | 9 (23%) |
| Coartação da aorta | 4 (10,3%) |
| Dupla via de saída de ventrículo direito | 3 (7,7%) |
| Atresia pulmonar e defeito do septo ventricular | 1 (2,6%) |
| Total | 39 (100%) |
Não foi detectado CNV em 32/39 pacientes (82,05%). Recorrência familiar de cardiopatia congênita foi verificada em 2/32 pacientes.
Em 15/32 pacientes (46,8%) com MLPA normal, foram observadas anormalidades extracardíacas e os sinais e sintomas clínicos observados foram: dismorfias faciais, fissura palatal, estrabismo, acidente vascular cerebral, convulsão, paralisia facial, déficit auditivo, vitiligo, epilepsia, autismo, estenose subglótica, asma, infecções de vias aéreas inferiores e superiores frequentes, onfalocele, daltonismo, dificuldade de alimentação, déficit de crescimento, refluxo gastroesofágico, criptorquidismo, distúrbio da fala, dificuldade de aprendizado e hipocalcemia. As infecções de vias aéreas frequentes ocorreram em seis casos; as outras alterações extracardíacas ocorreram de forma esporádica nos pacientes.
Dos 32 pacientes, cinco foram a óbito, e todos que foram a óbito estiveram internados em unidade de terapia intensiva neonatal aguardando transferência para um centro especializado em cirurgia cardíaca.
Com a técnica de MLPA utilizando quatro
Dos sete pacientes que apresentaram CNVs, a idade variou de 19 dias a 10 anos. Três apresentavam tetralogia de Fallot, dois tinham dupla via de saída de ventrículo direito, um tinha transposição de grandes artérias e um tinha coartação de aorta. Os sete pacientes apresentavam alterações extracardíacas.
Dos sete pacientes, três estavam internados em unidade de terapia intensiva neonatal e foram a óbito (
| N | Idade | Sexo | DCC | Alterações clínicas | CNV | Destino | Idade atual/óbito |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Dismorfismo facial Atresia duodenal | |||||||
| MC001 | 3 m | F | Co. aorta | Doente neonatal, Atrofia, displasia cerebral IVAI frequente, RDNPM | Dup15q11.2 | Óbito | 5 m |
| MC003 | 6 a | M | TOF | Dismorfismo facial Asma | Del 19p | Amb | 8 a |
| MC006 | 19 d | M | DVSVD | Dismorfismo facial | Dup 20p12.2 | Óbito | 23 d |
| MC011 | 2 a | M | TOF | Dismorfismo facial Déficit de crescimento RDNPM | Dup 15q | Amb | 4 a |
| MC015 | 6 a | F | TOF | Fronte ampla Dedos das mãos fusiformes | Dup 8p23.2 e dup10p12.31 | Amb | 8 a |
| Dismorfismo facial RGE | |||||||
| MC030 | 10 a | M | TGA | IVAI frequente Dificuldade de aprendizado | Dup2 2q11 | Amb | 12 a |
| Dismorfismo facial Hérnia umbilical | |||||||
| Dificuldade de alimentação | |||||||
| MC039 | 5 m | F | DVSVD | Déficit de crescimento RGE | Del 22q11 | Óbito | 6 m |
| Insuficiência velofaríngea Aplasia de timo RDNPM |
a: anos; amb: ambulatório; Co aorta: coartação de aorta; d: dia; DCC: defeito cardíaco congênito; del: deleção; dup: duplicação; DVSVD; dupla via de saída de ventrículo direito; F; feminino; IVAI: infecção de vias aéreas inferiores; m: mês; M: masculino; RDNPM: retardo no desenvolvimento neuropsicomotor; RGE: refluxo gastroesofágico; TGA: transposição de grandes artérias; TOF: tetralogia de Fallot.
A investigação dos pais foi realizada em seis famílias dos pacientes com alteração no MLPA. Destas, em quatro famílias obtivemos material de ambos os genitores (pai e mãe) e, em dois casos, apenas material materno. Nenhum deles apresentou alterações semelhantes às CNVs de seus filhos.
Paciente do sexo feminino, pais não consanguíneos, pai com 30 anos de idade e mãe de origem indígena, 31 anos, com quatro filhos, o terceiro filho apresentou cardiopatia congênita complexa e foi a óbito. Nasceu de parto cesárea, com 38 semanas de idade gestacional, pesando 2.165 g (abaixo do percentil 3 para a idade), medindo 44 cm (percentil 3 para a idade), perímetro cefálico de 32 cm (entre os percentis 3-10 para a idade) e Apgar 9 e 9. O ecocardiograma identificou coartação grave da aorta, canal arterial pérvio, comunicação interatrial e inúmeras comunicações interventriculares.
Com três meses de idade apresentava peso de 3.030 g (entre os percentis 3-15 para a idade), comprimento de 49 cm (entre os percentis 3-15 para a idade) e perímetro cefálico de 36 cm (muito abaixo do percentil 3 para a idade). As alterações faciais observadas foram: olhos pequenos, amendoados, lábio superior fino, micrognatia, microcefalia, presença de dente neonatal e canal de ouvido estreito.
As outras alterações apresentadas foram: atresia duodenal, apêndice à esquerda, constipação, dificuldade de alimentação, déficit de crescimento, hipertonia, atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, alteração na regulação da temperatura corporal e infecções de vias aéreas frequentes. A tomografia computadorizada de crânio evidenciou atrofia e displasia de cortical. Foi a óbito com quatro meses de idade, logo após receber alta da UTI para casa.
Neonato de 19 dias de vida, sexo masculino, primeiro filho de pais saudáveis, não consanguíneos, de 20 e 24 anos, mãe e pai, respectivamente. Nasceu de parto cesárea, idade gestacional de 39 semanas, peso de 3.800 g (percentil 75 para a idade), comprimento de 52 cm (percentil 50 para a idade), perímetro cefálico de 34 cm (percentil 25 para a idade) e Apgar 10. Diagnóstico ecocardiográfico de dupla via de saída de ventrículo direito, comunicação interatrial ampla, câmara ventricular rudimentar, hipoplasia do arco aórtico, canal arterial persistente e estenose aórtica.
O exame físico detectou alterações faciais, como achatamento bitemporal, face alongada, hipertelorismo ocular, dorso nasal alargado, ponta nasal achatada, narinas antevertidas e micrognatia, observando-se também pescoço curto, dedos das mãos e pés alongados.
Permaneceu internado em UTI e foi a óbito aguardando transferência para realizar cirurgia cardíaca.
Paciente do sexo masculino, segundo filho de pais saudáveis, não consanguíneos, mãe e pai com idades de 32 e 33 anos, respectivamente.
Nasceu de parto cesárea, 39 semanas de idade gestacional, pesando 3.450 g (percentil 50 para a idade), medindo 49 cm (entre os percentis 25-50 para a idade), perímetro cefálico de 33,5 cm (percentil 50 para a idade), com diagnóstico de tetralogia de Fallot.
Aos seis anos idade pesava 26.500 g (entre os percentis 85-97 para a idade) e media 123 cm (no percentil 85 para a idade).
Ao exame físico foram observadas características faciais dismórficas, como dorso nasal alargado, ponte nasal achatada, olhos amendoados. Como alteração extracardíaca relatava asma. O desenvolvimento neuropsicomotor foi normal.
Paciente do sexo masculino, filho único, mãe e pai saudáveis, com 36 e 26 anos, respectivamente, não consanguíneos, sem relato de cardiopatia na família. Nasceu de parto cesárea, com 30 semanas de idade gestacional, pesando 1.015 g (percentil 10 para a idade), medindo 38 cm (percentil 10 para a idade).
Aos dois anos e 11 meses apresentava os seguintes dados antropométricos: peso de 14.000 g (entre os percentis 50-85 para a idade), altura de 82 cm (abaixo do percentil 3 para a idade) e perímetro cefálico de 46 cm (abaixo do percentil 3 para a idade).
Ao ecocardiograma, apresentava tetralogia de Fallot. Ao exame físico foram detectadas características faciais dismórficas: hipertelorismo ocular, dorso nasal alargado, ponte nasal achatada, narinas antevertidas, filtro nasolabial longo com os pilares apagados e microcefalia.
As alterações clínicas evidenciadas foram déficit de crescimento e retardo no desenvolvimento neuropsicomotor.
Lactente do sexo feminino, primeira filha de pais saudáveis, não consanguíneos, com idades de 29 e 24 anos, mãe e pai, respectivamente, sem relato de cardiopatia na família. Durante a gestação, a mãe apresentou diabetes gestacional, tendo havido uso de insulina, e a única alteração observada na ultrassonografia gestacional foi polidrâmnio.
Nasceu de parto cesárea com 37 semanas de idade gestacional, pesando 2.500 g (entre os percentis 10-25 para a idade), medindo 44 cm (percentil 10 para a idade), perímetro cefálico de 33,5 cm (percentil 50 para a idade) e Apgar de 8 e 8. Com cinco dias de vida, foi detectado sopro cardíaco, o ecocardiograma evidenciou dupla via de saída de ventrículo direito, comunicação interatrial, comunicação interventricular ampla e estenose pulmonar discreta. Foi internada em UTI e realizada a primeira cirurgia cardíaca.
Aos cinco meses de idade pesava 4.200 g (entre os percentis 15-50 para a idade), media 55 cm (abaixo do percentil 3 para a idade) e o perímetro cefálico era de 36,5 cm (abaixo do percentil 3 para a idade).
Ao exame físico foram detectadas características faciais dismórficas: hipertelorismo ocular, olhos grandes, dorso nasal alargado, ponta nasal achatada com narinas antevertidas, filtro nasolabial longo, lábio superior fino e em formato de "V" invertido, micrognatia, lóbulo da orelha achatado, dedos das mãos afilados e alongados, e hérnia umbilical.
As alterações clínicas evidenciadas foram dificuldade de alimentação, déficit de crescimento, retardo no desenvolvimento neuropsicomotor (somente sustentava a cabeça).
Os exames de imagem evidenciaram refluxo gastroesofágico e aplasia de timo. Avaliação com otorrinolaringologista diagnosticou insuficiência velofaríngea. Os exames laboratoriais identificaram cálcio sérico dentro da normalidade.
Foi a óbito logo após cirurgia cardíaca com seis meses de idade.
O paciente apresentava uma deleção de 3,0 Mb, portanto deleção típica
Paciente do sexo masculino, filho único, mãe solteira, saudável, 35 anos, sem relato de cardiopatia na família, nasceu de parto cesárea, com 40 semanas e seis dias de idade gestacional, pesando 4.425 g (acima do percentil 90 para a idade), medindo 50 cm (entre os percentis 10-25 para a idade), com perímetro cefálico de 37,5 cm (acima do percentil 97 para a idade) e Apgar 8 e 10.
O ecocardiograma detectou transposição de grandes artérias, comunicação interatrial e persistência do canal arterial. A cirurgia cardíaca foi realizada com dez dias de vida.
Aos 10 anos pesava 40 kg (entre os percentis 85-90 para a idade), altura 142 cm (entre os percentis 50-85 para a idade) e perímetro cefálico de 52,5 cm.
Ao exame físico foram observadas alterações fenotípicas sutis, como base nasal alargada, filtro nasolabial longo e lábio superior fino, com diagnóstico de refluxo gastroesofágico e frequentes infecções de vias aéreas. O desenvolvimento neuropsicomotor foi normal, mas apresentava dificuldade de aprendizado.
Paciente do sexo feminino, com seis anos de idade, filha única de pais separados, sem história de consaguinidade ou cardiopatia na família, mãe saudável, 23 anos.
Nasceu de parto normal, com 40 semanas de idade gestacional, pesando 3.150 g (percentil 25 para a idade), com diagnóstico de tetralogia de Fallot, insuficiência tricúspide leve e insuficiência pulmonar moderada. Foi submetida a cirurgia cardíaca com quatro anos de idade.
Atualmente, está com peso de 20,7 kg (entre os percentis 15-50 para a idade), altura de 117 cm (entre os percentis 15-50 para a idade) e perímetro cefálico de 51 cm. Ao exame físico foram evidenciados fronte ampla e dedos fusiformes. O desenvolvimento neuropsicomotor foi normal e não manifestava outras alterações clínicas.
Estudos recentes têm mostrado que CNVs ocorrem em significativa proporção de pacientes com DCC. Em síndromes envolvendo DCC como parte do espectro clínico, a malformação cardíaca é frequentemente o primeiro sintoma a surgir
No presente estudo detectamos CNVs em 7/39 casos: deleção 22q11.2, duplicação 22q11.2, duplicação 15q11.2, duplicação 20p12.2, deleção 19p, duplicação 15q e duplicação 8p23.2 concomitante com duplicação 10p12.31.
Atualmente, vários estudos têm estabelecido a relevância de CNVs na etiologia de DCC. Demonstrou-se associação tanto de DCC sindrômico como DCC isolado e desequilíbrios cromossômicos
O cariótipo resultou normal em todos os indivíduos dessa pesquisa, o que também foi observado por Thiempont e cols.
CNVs são também conhecidas por estarem envolvidas na gênese de patologias do neurodesenvolvimento e neurocognição, como deficiência intelectual, esquizofrenia e espectro autístico
Nosso estudo identificou cinco casos de duplicação e apenas dois casos de deleção, de modo semelhante ao estudo realizado por Erdogan e cols.
Inicialmente, os pacientes deste estudo pareciam ter apenas DCC, contudo exame clínico e avaliação fenotípica mais cuidadosa evidenciaram alterações extracardíacas possíveis de fazerem parte de uma síndrome. Vários estudos têm demonstrado a presença de CNVs em DCC não sindrômico
Recentemente, Warburton e cols.
A síndrome da deleção 22q11.2 (SD22q11), também conhecida como síndrome de DiGeorge ou velocardiofacial, é considerada a mais comum das síndromes de microdeleção humana e contém múltiplos genes. A prevalência estimada é de 1:4.000 nascidos vivos
Uma deleção cromossômica submicroscópica é detectada por FISH, MLPA ou análise cromossômica por
O único paciente deste estudo com deleção 22q11 era inicialmente portador de cardiopatia conotruncal isolada. Após exame físico detalhado, foram observadas várias alterações fenotípicas que fazem parte da síndrome da deleção 22q11.2. Na maioria dos trabalhos que têm como amostra uma população de indivíduos com cardiopatia conotruncal isolada observa-se posteriormente, em exame clínico mais detalhado, a presença de alterações fenotípicas sutis não evidentes no primeiro exame
A apresentação clínica da síndrome da deleção do 22q11 pode ser extremamente variável. Detecção precoce da deleção é importante para o tratamento das anomalias e para a investigação de malformações associadas e prevenção dos problemas neuropsicológicos e imunodeficiência. Na maioria dos casos, a deleção 22q11 ocorre
A paciente em questão apresentava como defeito cardíaco a dupla via de saída de ventrículo direito e foi a óbito após a segunda cirurgia. Defeito cardíaco congênito é uma das mais frequentes manifestações da síndrome da deleção 22q11.2; além disso, é a maior causa de óbito na grande maioria dos pacientes com essa síndrome.
A identificação de etiologia genética para o DCC é importante para proporcionar aconselhamento genético para pais que planejam ter outros filhos. O risco de recorrência para muitos DCC é de 2-6%, e o risco de recorrência de DCC aumenta significantemente quando os pais são portadores de deleção/duplicação
Nos últimos anos, dezenas de microdeleções e microduplicações cromossômicas clinicamente relevantes têm sido descritas em seres humanos, frequentemente associadas com deficiência mental, autismo e/ou malformações físicas. Uma vez que esses pequenos arranjos genômicos são geralmente abaixo do limite de detecção da microscopia óptica, é essencial utilizar procedimentos de diagnóstico molecular para fornecer uma explicação para os sintomas e sinais observados e proporcionar prognósticos clínicos e genéticos para os pacientes e seus familiares. Nos países desenvolvidos, testes moleculares, particularmente
O MLPA é uma técnica estabelecida para detecção de conhecidas CNVs. O custo do MLPA é substancialmente menor que o CGH
Se o diagnóstico do DCC é realizado precocemente, isto é, intraútero, melhor preparação para o nascimento com o tratamento mais cedo melhoraria o prognóstico em termos de morbidade e mortalidade, contudo observamos que a maioria das mães dos pacientes, neste estudo, mesmo tendo realizado pré-natal e ultrassom gestacional, desconhecia o diagnóstico de defeito cardíaco fetal. Em um estado que apresenta escassez de leitos de unidade de terapia intensiva neonatal para o tratamento desses recém-nascidos e não dispõe de cirurgias cardíacas de maior complexidade, esses pacientes provavelmente estão indo a óbito sem diagnóstico e tratamento. Isso pôde ser evidenciado em nossa amostra, pela qual todos os pacientes que estavam internados em unidade de terapia intensiva foram a óbito aguardando transferência para um centro especializado em cirurgia cardíaca, demonstrando a importância do diagnóstico precoce no impacto da alta morbimortalidade desses indivíduos.
Ainda há controvérsias na literatura sobre em qual grupo de indivíduos deve ser promovida a investigação rotineira para variação no número de cópias - em pacientes com defeito cardíaco isolado ou naqueles que apresentam outras alterações extracardíacas. O que se pode observar de consenso é que uma avaliação física minuciosa à procura de sinais dismórficos, principalmente em crianças portadoras de defeito cardíaco conotruncal, pode auxiliar na decisão de realizar testes moleculares. Os benefícios proporcionados seriam aconselhamento genético adequado, avaliação e manejo dos problemas de forma mais eficaz, ocasionando melhoria na qualidade de vida do indivíduo e da família.
A técnica de MLPA é útil na investigação de microdeleções e microduplicações em defeitos cardíacos congênitos conotruncais.
O diagnóstico precoce das CNVs em pacientes com DCC auxilia na prevenção de morbidade e diminuição da mortalidade nesses pacientes. Uma avaliação clínica minuciosa em todo paciente com DCC é imprescindível para detectar outras anomalias congênitas associadas.
Este trabalho ressalta a necessidade de o médico, frente a uma criança com defeito cardíaco, estar atento à possibilidade de alterações genéticas, com conhecimento das novas técnicas que possibilitam esse diagnóstico.
A limitação deste estudo se deve tanto ao método de amostragem empregado, o de conveniência, quanto ao pequeno número amostral, que permite considerar os resultados encontrados apenas para a população em questão.
Concepção e desenho da pesquisa e Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Campos CMR, Kulikowski LD, Kim CA; Obtenção de dados e Redação do manuscrito: Campos CMR; Análise e interpretação dos dados: Campos CMR, Zanardo EA, Dutra RL.
O presente estudo foi financiado pela FAPESP 2009-53105 e CNPq: 401910/2010-5.
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Carla Marques Rondon Campos pela Universidade de São Paulo e Universidade Federal de Mato Grosso.
Nós agradecemos aos cardiologistas que permitiram que os seus pacientes fossem estudados e aos pacientes e pais que aceitaram participar do estudo.