Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia jVzph6DFYjpGyY3YfFm5Hxj S0066-782X2014002300004 S0066-782X2014005040145 00004 10.5935/abc.20140145 Original Articles Congenital Heart Disease as a Warning Sign for the Diagnosis of the 22q11.2 Deletion Grassi Marcília S. 1 Jacob Cristina M. A. 1 Kulikowski Leslie D. 3 Pastorino Antonio C. 1 Dutra Roberta L. 3 Miura Nana 2 Jatene Marcelo B. 2 Pegler Stephanie P. 1 Kim Chong A. 1 Carneiro-Sampaio Magda 1 FMUSP HC Instituto da Criança São Paulo SP Brazil Instituto da Criança - HC-FMUSP, São Paulo, SP - Brazil FMUSP HC Instituto do Coração São Paulo SP Brazil Instituto do Coração - HC-FMUSP, São Paulo, SP - Brazil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Departamento de Patologia São Paulo SP Brazil Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Mailing Address: Marcília Sierro Grassi. Avenida Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 647, Postal Code 05403.000, São Paulo, SP - Brazil. E-mail: marcilia.grassi@hc.fm.usp.br

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No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 10 10 2014 11 2014 103 5 382 390 06 01 2014 07 07 2014 23 07 2014 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

To alert for the diagnosis of the 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2DS) in patients with congenital heart disease (CHD).

 Objective:

To describe the main CHDs, as well as phenotypic, metabolic and immunological findings in a series of 60 patients diagnosed with 22q11.2DS.

 Methods:

The study included 60 patients with 22q11.2DS evaluated between 2007 and 2013 (M:F=1.3, age range 14 days to 20 years and 3 months) at a pediatric reference center for primary immunodeficiencies. The diagnosis was established by detection of the 22q11.2 microdeletion using FISH (n = 18) and/or MLPA (n = 42), in association with clinical and laboratory information. Associated CHDs, progression of phenotypic facial features, hypocalcemia and immunological changes were analyzed.

 Results:

CHDs were detected in 77% of the patients and the most frequent type was tetralogy of Fallot (38.3%). Surgical correction of CHD was performed in 34 patients. Craniofacial dysmorphisms were detected in 41 patients: elongated face (60%) and/or elongated nose (53.3%), narrow palpebral fissure (50%), dysplastic, overfolded ears (48.3%), thin lips (41.6%), elongated fingers (38.3%) and short stature (36.6%). Hypocalcemia was detected in 64.2% and decreased parathyroid hormone (PTH) level in 25.9%. Decrease in total lymphocytes, CD4 and CD8 counts were present in 40%, 53.3% and 33.3%, respectively. Hypogammaglobulinemia was detected in one patient and decreased concentrations of immunoglobulin M (IgM) in two other patients.

 Conclusion:

Suspicion for 22q11.2DS should be raised in all patients with CHD associated with hypocalcemia and/or facial dysmorphisms, considering that many of these changes may evolve with age. The 22q11.2 microdeletion should be confirmed by molecular testing in all patients.

 DiGeorge Syndrme Crromosome Delection Heart Defects Congenital Hypocalcemia Chromosomes Human Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2008/58238-4 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2009/53864-7 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2009/53105-9 CNPq 302647/2011-2 CNPq 308105/2012-5 This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - processos 2008/58238-4, 2009/53864-7 e 2009/53105-9. CNPq - 302647/2011-2 e 308105/2012-5 PQ2. NAP CRIad 2012. Introduction

The 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2DS) is considered the most frequent chromosomal microdeletion syndrome in humans, with an incidence of 1:4,000-5,000 live births1,2. This syndrome is currently recognized as occurring with a higher frequency than previously estimated, although precise information about its incidence in our country are unknown.

Microdeletions in the 22q11.2 region can occur in various syndromes such as the DiGeorge (DGS), velocardiofacial and the conotruncal anomaly face syndromes. These diseases represent different phenotypes of the same chromosomal abnormality, which are currently grouped and titled 22q11.2DS1,3. This microdeletion is not detected on G-banding karyotyping, a routine cytogenetic exam. The molecular diagnosis of the syndrome is rather established by other techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH) and/or quantitative genomic analysis by multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)4,5.

Congenital heart diseases (CHDs) are one of the most frequent malformations, with an incidence that ranges from 8 to 10 per 1,000 live births, representing an important cause of morbimortality in the first year of life6. The etiology of cardiopathies associated with other types of congenital malformations can be monogenic, as in Holt-Oram, Marfan, Fanconi and Noonan syndromes, or chromosomal, as in Down, 22q1.2DS, 18 trisomy (Edwards) and 13 trisomy (Patau) syndromes7. CHDs with conotruncal defects represent an important characteristic in several genetic syndromes, in particular in 22q11.2DS2. It is estimated that 5% of the patients with cardiopathy have DGS, which is considered the second most common primary immunodeficiency8-11.

Clinical manifestations that should arise suspicion for 22q11.2SD are CHD (75%), abnormal psychomotor development (68%), hypocalcemia-associated seizure (60%), velopharyngeal insufficiency with nasal voice (46%), genitourinary abnormalities (36%), skeletal abnormalities (17%) and facial dysmorphisms (11-17%)2,12-15. The immunological changes associated with 22q11.2DS are variable and secondary to thymic hypoplasia or agenesis, classically named DGS by immunologists1,5,14-17.

The aim of this study is to describe the main cardiopathies, as well as phenotypic, metabolic and immunologic abnormalities in a series of 60 patients with 22q11.2DS.

 Methods

This is a descriptive, transversal, retrospective and prospective study evaluating all patients with 22q11.2DS followed at the Allergy and Immunology Unit and Genetic Unit at Instituto da Criança of HC-FMUSP between June 2007 until December 2013. Some of the patients were referred from the Pediatric Cardiology Unit of Instituto do Coração (INCOR) - HC-FMUSP after active search at this institution. The sample was composed of 60 children and adolescentes (34 males), with age range from 14 days to 20 years and 3 months (mean 114.2 months, standard deviation 83 months). All the individuals belonged to Brazilian families, and there was no predominance in the cohort of European, African or Oriental descent. The diagnostic criteria adopted were those proposed by the International Union of Immunological Societies-IUIS18, which included compatible clinical signs and presence of the 22q11.2 microdeletion. All patients had normal karyotype by G-banding. Information about patient's identification, clinical history, physical examinatin and results from laboratory and cytogenomic analyses were collected in a protocol form.

The molecular analysis of the microdeletion was conducted at the Cytogenomics Laboratory of the Department of Pathology, with fluorescent in situ hybridization (FISH) using a specific probe for the 22q11.2 region. Commercial probes of unique sequences were used for the specific region in 22q11.2 (probes DGS/VCFS, TUPLE1 and N25 D22S75, Cytocell, Cambridge, UK)4,19and/or MLPA using various kits (P036-E1, P070-B2, P064-B3, MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands - www.mlpa.com). Generated data were analyzed with the software GeneMarker® (Softgenetics, LLC, State College, PA, USA - www.softgenetics.com). These techniques are demonstrated in Figure 1.

Demonstration of the deletion in region 22q11.2. A. FISH technique. B. MLPA technique.

All patients underwent clinical and imaging evaluations at the Pediatric Cardiology Unit.

Immunocompetence was evaluated with complete blood count, measurement of serum immunoglobulin levels (IgG, IgM and IgA) by nephelometry, and determination of lymphocyte subpopulations in peripheral blood (flow cytometry - BD FACSCalibur) at the laboratory of the Central Institute of HC-FMUSP, using as comparison reference values already described20,21.

Other performed tests included serum measurement of parathyroid hormone level (PTH, automated chemiluminescent enzyme immunoassay), ionic calcium, total calcium and phosphorus (automated colorimetric method), triiodothyronine (T3), thyroxine (T4), free thyroxine (free T4) and TSH (automated immunoassay), as well as determination of antithyroglobulin and antithyroperoxidase antibodies (indirect immunofluorescence).

Statistical tests were performed with the software MedCalc 10.2 (MedCalc Software, 2009).

The study was approved by the Ethics Committee for Analysis of Research Project of Hospital das Clínicas - CAPPesq, registration number 0911/11.

 Results

The presence of CHDs was identified in 47 patients (77%) and surgical correction was performed in 34 of these, the most frequent of which were tetralogy of Fallot, ventricular septal defect and pulmonary artery atresy, as described in Table 1 and Graph 1.

Congenital heart diseases in 47 patients with the 22q11.2 deletion syndrome and the surgical corrections performed
Heart diseases N (%) Surgical corrections N (%)
Total 47 (100) 34 (72.3)
Tetralogy of Fallot 18 (38.3) 16 (88.8)
Ventricular septal defect 10 (21.3) 2 (20.0)
Pulmonary atresia 6 (12.7) 6 (100.0)
Truncus arteriosus 4 (8.5) 4 (100.0)
Interrupted aortic arch 4 (8.5) 4 (100.0)
Atrial septal defect 3 (6.4) 1 (33.3)
Transposition of the great arteries 1 (2.1) 1 (100.0)
Anomalous systemic venous drainage 1 (2.1) 0 (0)
Main heart diseases affecting 47 patients with the 22q11.2 deletion syndrome.

Other important phenotypic features found in patients from the overall cohort with 22q11.2DS are shown in Table 2. Facial features, as well as morphology of the ears, mouth, nose and eyes of some patients are shown in Figures 2 and 3.

Phenotypic characteristics of 60 patients with the 22q11.2 deletion syndrome
Phenotypic characteristics N (%)
Elongated face 36 (60.0)
Elongated nose 32 (53.3)
Narrow palpebral fissure 30 (50.0)
Dysplasic overfolded ears 29 (48.3)
Thin lips 25 (41.6)
Elongated fingers 23 (38.3)
Short stature 22 (36.6)
Palatal abnormalities 15 (25.0)
Dental abnormalities 13 (21.6)
Strabismus 10 (16.6)
Clubfoot 8 (13.3)
A) Preschooler with elongated nose. B) Preschooler with narrow palpebral fissure and thin lips. C) School-age child with elongated face and nose. D) Typical facies with narrow palpebral fissure, prominent nose, and mouth with thin lips. Main phenotypic characteristics of patients with the 22q11.2 deletion syndrome. A) Narrow palpebral fissure. B) Elongated face and/or nose. C) Thin lips.

The presence of facial dysmorphisms was not recognized during the neonatal period in many patients, becoming more evident with increasing age, as observed in Figure 4.

Pictures showing evolving features of patients with the 22q11.2 deletion syndrome at different ages. A) Newborn with thin lips and dysplasic ears. These phenotypic features become more characteristic at school age. B) Newborn with facial dysmorphism (elongated face and nose, narrow palpebral fissure, thin lips). C) Infant with elongated face and nose more evident during development

Hypocalcemia was diagnosed in 27 of the 42 patients (64.2%) in whom ionic calcium was measured, 16 (59.3%) of which occurred in the neonatal period. Of these, PTH was measured in 27 patients and was found to be reduced in 7 patients (25.9%). Seizures occurred in 6 patients.

During follow-up of 20 patients with 22q11.2DS through school years and adolescence, we observed that 11 progressed with behavioral and psychiatric abnormalities. The most common finding was attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) in 6 patients, 4 of which had the hyperactive/impulsive type and 2 had the predominantly innatentive type. Other findings included learning disability (15%), anxiety (10%) and mental retardation (5%). Until present, none of the patients has progressed with compulsive-obsessive, schizoaffective or psychotic disorders.

In this study, low total lymphocyte count was found in 40% of the patients (18/45 cases), whereas low CD4+ lymphocytes occurred in 53.3% (16/30) and low CD8+ in 33.3% (10/30), as demonstrated in Graph 2. The evaluation of humoral immunity detected 2 patients with reduced IgM concentrations (29.6 mg/dL and 17.6 mg/dL) and one 9-month-old patient with IgG of 328 mg/dL, currently receiving replacement therapy with intravenous gamma globulin.

Distribution of values of total lymphocytes, CD4<sup>+</sup>, CD8<sup>+</sup> and CD19<sup>+</sup> in patients with the 22q11.2 deletion syndrome. A) Number of total lymphocytes. B) CD4<sup>+</sup> count. C) CD8<sup>+</sup> count. D) CD19<sup>+</sup> count. Each dot ( • ) corresponds to an individual patient. Max: Maximum; Min: Mimum Discussion

Even though 22q11.2SD is considered in the literature to be a relatively frequent chromosomal abnormality, pediatricians, neonatologists and cardiologists in our country have not been recognizing it sistematically, and the publications with significant number of patients, particularly in the first year of life, are scarce1,2. In a study conducted at Hospital das Clínicas of HC-FMUSP with 1,008 patients with primary immunodeficiency, only 32 patients with 22q11.2DS were identified over 33 years10. These data led us to establish an active search of the microdeletion at the Pediatric Cardiology Unit of INCOR, resulting in a duplication of the number of cases over the past two years.

Cardiac malformations, observed in 77% of our cases, are the most critical manifestation of 22q11.2DS and affect between 49% and 95% of the patients according to the literature1,22. A point to be highlighted in this cohort was the higher frequency of tetralogy of Fallot (38.3%) when compared with the literature in which frequencies between 17.6% and 20% have been described22-24. Another point to be emphasized in our study was the occurrence of ventricular septal defect associated with 22q11.2DS; this was the second most frequent CHD, which contrasts with the literature which shows that conotruncal heart defects are the most prevalent.

The recommendation for 22q11.2DS screening highlights that tests for the 22q11.2 chromosome microdeletion should be conducted in all newborns or children with tetralogy of Fallot, truncus arteriosus, interrupted aortic arch, isolated anomalies of the aortic arch and perimembranous ventricular septal defect with aortic arch anomaly. In all other patients with perimembranous ventricular septal defect without aortic arch anomaly or with any other type of CHD in association with characteristic phenotypic manifestations, clinical suspicion for 22q11.2DS should be raised and screening for the microdeletion should be conducted3,6,22,25.

Another fact that draws attention for the importance of early diagnosis of 22q11.2DS, ideally before surgery for correction of the heart defect, is the observation that these patients present increased risk of post-operative complications, even though their mortality is comparable to that in patients with similar cardiopathies but without 22q11.2DS26.

In association with the CHDs mentioned above, the phenotypes found in this study, in particular the peculiar craniofacial dysmorphisms and the hypocalcemia in the neonatal period, are essential to raise diagnostic suspicion of 22q11.2DS. It should be mentioned that most of the clinical features of 22q11.2DS have been described in Caucasoid patients and for the first time, this study describes in details the facial dysmorphisms of the syndrome in the trihybrid Brazilian population, which since the XVI century has been formed by a mixture of Indians, Africans and Portugueses27.

Another interesting point addressed in this study and not yet presented in other descriptions was the evolving aspect of the facies and other dysmorphisms. Even though the dysmorphisms of 22q11.2DS recognized later in life (narrow palpebral fissures, elongated nose, overfolded ears) are already present at birth, the facies of the newborn and young infant draws less attention as a "syndromic facies" for the general pediatrician and/or cardiologist in this phase of life.

Palatal abnormalities occur in 9-16% of the patients with 22q11.2DS and are associated with a high morbidity. It is, therefore, fundamental to examine the palate carefully and include a search for bifid uvula which may suggest the presence of submucosal cleft palate2,14. In this series, we observed that this finding was more frequent than that described in the literature. Goldmuntz et al. in 2005 demonstrated that in addition to cleft palate, about 80% of the patients also present velopharyngeal insufficiency manifesting as nasal voice and compensatory articulation disorders3. Nasal voice is an underappreciated sign for suspicion of 22q11.2DS, probably because it is observed later in life, but it should be considered a warning sign for the occurrence of the syndrome.

Parathyroid hypoplasia or aplasia is very common in 22q11.2DS due to involvement of the third and fourth pharyngeal arches during embryogenesis. In 49% to 60% of the newborns affected by the syndrome, transient hypocalcemia may be present leading to tetany and seizures of difficult control22, data that was similar in the patients in this study. Pediatricians and cardiologists should be attentive during the neonatal period to the presence of hypocalcemia without other apparent physiopathological cause, a manifestation that is highly suggestive of the syndrome.

Another variable manifestation in 22q11.2DS is immunodeficiency, considered to be due to abnormal development of the thymus, denominated DGS in these cases. Around 80% of the patients with DGS have immune system abnormalities. Even though the thymus is hypoplasic or absent in great part of the patients, most present mild to moderate immunodeficiency, independent of other clinical features28,29. A study conducted by Patel et al29 showed that a minority of the patients have low immunoglobulin levels and, in general, between 2% and 3% need immunoglobulin replacement therapy29. In our study, 3 patients had low levels of immunoglobulins and only 1 patient required immunoglobulin replacement therapy.

Since in patients with 22q11.2DS the initial manifestation may be hyperactivity, anxiety and depression, the authors emphasize the importance of an early diagnosis and a multiprofessional follow-up appropriate for these patients. The diagnosis of ADHD, anxiety disorders, mood disorders and disorders of the autism spectrum can occur in one third to half of the children with the deletion. Mood abnormalities and psychotic disorders can increase significantly during early adulthood, it is therefore fundamental to monitor carefully the occurrence of psychiatric symptoms during adolescence and early adulthood30. These patients may also present poor academic performance, which is an important aspect to be addressed with the educational institutions.

It is imperative to disseminate warning signs for the 22q11.2DS among general pediatricians, neonatologists and pediatric cardiologists. Even though the pioneering proposal of Instituto da Criança and adopted by the Ministry of Health for detection of primary immunodeficiencies in the first year of life already includes 4 signs associated with the diagnosis of 22q11.2DS (CHD, in particular anomalies of the great vessels; lymphopenia < 2,500/mm; hypocalcemia with or without seizures; and absence of a thymic image on chest radiograph)31,32 it would be important to establish specific warning signs for this syndrome, adding phenotypic abnormalities and velopharyngeal insufficiency to the ones described above.

The current study has limitations peculiar to a transversal descriptive study, but highlights the main clinical and laboratorial findings of a highly selected population. The description of this population, however, allows us to identify and understand the demographic features of the studied group and the morbidity profile of the 22q11.2DS, and may offer data for a more adequate health policy for these patients.

The management of children with 22q11.2DS requires interaction of a multidisciplinary team of pediatrician, cardiologist, geneticist, and in some circumstances, endocrinologist, neurologist, plastic surgeon, psychologist and speech therapist.

 Conclusion

Considering that in our country 2.5 million children are born each year, we estimate that 500 to 750 new cases of 22q11.2DS should be identified yearly, which indicates that the syndrome is currently underdiagnosed. It is therefore crucial to maintain an alert for the occurrence of the syndrome in the presence of CHD associated with hypocalcemia, facial dysmorphisms, velopharyngeal insufficiency, thymic hypoplasia or absence on chest radiograph, and confirm the diagnosis by identification of the microdeletion.

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Drew LJ Crabtree GW Markx S Stark KL Chaverneff F Xu B et al The 22q11.2 microdeletion: fifteen years of insights into the genetic and neural complexity of psychiatric disorders Int J Dev Neurosci 2011 29 3 259 281 Carneiro-Sampaio M, Jacob CM, Leone CR. A proposal of warning signs for primary immunodeficiencies in the first year of life. Pediatr Allergy Immunol. 2011;22(3):345-6. Carneiro-Sampaio M Jacob CM Leone CR A proposal of warning signs for primary immunodeficiencies in the first year of life Pediatr Allergy Immunol 2011 22 3 345 346 Hospital das Clínicas/FMUSP. Instituto da Criança. (São Paulo).12 sinais de alerta para Imunodeficiências Primárias no 1º anos de vida. [Citado em 2013 ago 26]. Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/saude/visualizar_texto.cfm.dtxt=41993 Hospital das Clínicas FMUSP Instituto da Criança São Paulo 12 sinais de alerta para Imunodeficiências Primárias no 1º anos de vida Citado em 2013 ago 26 Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/saude/visualizar_texto.cfm.dtxt=41993

Author contributions

Conception and design of the research and Statistical analysis: Grassi MS, Jacob CMA, Pastorino AC, Carneiro-Sampaio M; Acquisition of data: Grassi MS, Jacob CMA, Pastorino AC, Miura N, Jatene MB, Pegler SP, Carneiro-Sampaio M; Analysis and interpretation of the data: Grassi MS, Jacob CMA, Kulikowski LD, Pastorino AC, Dutra RL, Carneiro-Sampaio M; Obtaining financing: Jacob CMA, Pastorino AC, Carneiro-Sampaio M; Writing of the manuscript: Grassi MS, Jacob CMA, Kulikowski LD, Pastorino AC, Carneiro-Sampaio M; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Jacob CMA, Kulikowski LD, Pastorino AC, Kim CA, Carneiro-Sampaio M.

Sources of Funding

This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - processos 2008/58238-4, 2009/53864-7 e 2009/53105-9. CNPq - 302647/2011-2 e 308105/2012-5 PQ2. NAP CRIad 2012.

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

 Cardiopatias Congênitas como um Sinal de Alerta para o Diagnóstico da Deleção do 22q11.2 Grassi Marcília S. 1 Jacob Cristina M. A. 1 Kulikowski Leslie D. 3 Pastorino Antonio C. 1 Dutra Roberta L. 3 Miura Nana 2 Jatene Marcelo B. 2 Pegler Stephanie P. 1 Kim Chong A. 1 Carneiro-Sampaio Magda 1 FMUSP HC Instituto da Criança São Paulo SP Brasil Instituto da Criança - HC-FMUSP, São Paulo, SP - Brasil FMUSP HC Instituto do Coração São Paulo SP Brasil Instituto do Coração - HC-FMUSP, São Paulo, SP - Brasil Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Departamento de Patologia São Paulo SP Brasil Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP - Brasil Correspondência: Marcília Sierro Grassi. Avenida Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 647, CEP 05403.000, São Paulo, SP - Brasil. E-mail: marcilia.grassi@hc.fm.usp.br

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

Alertar para o diagnóstico da síndrome da deleção 22q11.2 (SD 22q11.2) em pacientes com cardiopatias congênitas.

 Objetivo:

Descrever as principais cardiopatias, alterações fenotípicas, metabólicas e imunológicas em uma série de 60 pacientes com a SD22q11.2.

 Métodos:

Foram incluídos 60 pacientes com SD22q11.2 avaliados entre 2007 e 2013 (M:F = 1,3; idades entre 14 dias a 20 anos e 3 meses) em um centro pediátrico de referência para imunodeficiências primárias. O diagnóstico foi feito pela detecção da microdeleção 22q11.2 através de FISH (n = 18) e/ou MLPA (n = 42), associados a dados clínicos e laboratoriais. Foram analisadas as cardiopatias, aspectos fenotípicos evolutivos da fácies, a hipocalcemia e alterações imunológicas associadas.

 Resultados:

Cardiopatias congênitas ocorreram em 77% dos casos, sendo que a tetralogia de Fallot ocorreu em 38,3%. Correção cirúrgica da cardiopatia foi realizada em 34 pacientes. Os dismorfismos craniofaciais foram detectados em 41 pacientes: face (60%) e/ou nariz alongados (53,3%), fenda palpebral estreita (50%), orelhas displásicas com hiperdobramento (48,3%), lábios finos (41,6%), dedos alongados (38,3%) e baixa estatura (36,6%). Hipocalcemia foi observada em 64,2% com redução do nível de paratormônio (PTH) em 25,9%. Observou-se número reduzido de linfócitos totais, CD4 e CD8 em 40%, 53,3%, e 33,3%, respectivamente. Detectou-se hipogamaglobulinemia em um paciente e redução das concentrações de imunoglobulina M (IgM) em outros dois pacientes.

 Conclusão:

Deve-se suspeitar da SD22q11.2 em todos os portadores de cardiopatia congênita com hipocalcemia e/ou dismorfismos faciais, ressaltando-se que muitas dessas alterações podem ser evolutivas. A microdeleção 22q11.2 deve ser confirmada por testes moleculares em todos os pacientes.

 Síndrome de DiGeorge Deleção Cromossômica Cardiopatias Congenitas Hipocalcemia Cromossomos Humanos Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2008/58238-4 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2009/53864-7 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo 2009/53105-9 CNPq 302647/2011-2 CNPq 308105/2012-5 O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - processos 2008/58238-4, 2009/53864-7 e 2009/53105-9. CNPq - 302647/2011-2 e 308105/2012-5 PQ2. NAP CRIad 2012. Introdução

A síndrome da deleção 22q11.2 (SD22q11.2) é considerada a síndrome de microdeleção cromossômica mais frequente em seres humanos, com uma incidência de 1:4.000-5.000 nascidos vivos1,2. Sabe-se hoje que esta síndrome ocorre com frequência superior à previamente estimada, mas dados precisos sobre sua incidência em nosso país ainda são desconhecidos.

As microdeleções na região 22q11.2 podem estar presentes em diferentes síndromes, como a síndrome de DiGeorge (SDG), síndrome velocardiofacial, e síndrome da anomalia facial conotruncal. Estas doenças representam diferentes fenótipos da mesma alteração cromossômica, sendo hoje agrupadas e denominadas SD22q11.21,3. Esta microdelação não é detectada pelo cariótipo por bandeamento G, exame citogenético rotineiro. O seu diagnóstico molecular é realizado por outras técnicas tais como testes de FISH (fluorescence in situ hybridization) e/ou triagem genômica quantitativa por MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)4,5.

As cardiopatias congênitas (CHDs) representam uma das malformações mais frequentes cuja incidência varia de 8 a 10 por 1.000 nascidos vivos e constituem uma importante causa de morbimortalidade no primeiro ano de vida6. Cardiopatias associadas a outros tipos de malformações congênitas podem ser de etiologia monogênicas como nas síndromes de Holt-Oram, Marfan, Fanconi ou Noonan, ou cromossômica, como nas síndromes de Down, SD22q1.2, trissomia do 18 (síndrome de Edwards) e trissomia do 13 (síndrome de Patau)7. As CHDs com defeitos conotruncais constituem importante característica presente em diferentes síndromes genéticas, especialmente na SD22q11.22. Estima-se que 5% dos pacientes com cardiopatia apresentem SDG, considerada a segunda imunodeficiência primária mais comum8-11.

As manifestações clínicas para a suspeita diagnóstica da SD22q11.2 são CHD (75%), desenvolvimento psicomotor anormal (68%), convulsão decorrente de hipocalcemia (60%), insuficiência velofaríngea com voz anasalada (46%), anormalidades genitourinárias (36%), anormalidades esqueléticas (17%) e dismorfismos faciais (11-17%).2,12-15 As alterações imunológicas da SD22q11.2 são variáveis e decorrentes da hipoplasia ou agenesia do timo, classicamente denominados como SDG pelos imunologistas1,5,14-17.

O presente trabalho tem como objetivo descrever as principais cardiopatias, alterações fenotípicas, metabólicas e imunológicas em uma série de 60 pacientes com a SD22q11.2.

Métodos

Trata-se de um estudo descritivo, transversal, retrospectivo e prospectivo onde foram avaliados todos os pacientes com SD22q11.2 em seguimento entre junho de 2007 e dezembro de 2013 nas Unidades de Alergia e Imunologia e de Genética do Instituto da Criança do HC-FMUSP. Alguns pacientes provenientes da Unidade de Cardiologia Pediátrica do Instituto do Coração (INCOR) - HC-FMUSP foram encaminhados após busca ativa nesta instituição. A casuística foi composta por 60 crianças e adolescentes (34 masculinos), com idade entre 14 dias e 20 anos e 3 meses (média de 114,2 meses e desvio padrão de 83 meses). Todos os indivíduos pertenciam a famílias brasileiras e a amostra não apresentou predomínio de ascendência europeia, africana ou oriental. Os critérios diagnósticos utilizados foram propostos pela International Union of Immunological Societies-IUIS18, incluindo sinais clínicos compatíveis com a síndrome e presença da microdeleção 22q11.2. Todos os pacientes apresentavam cariótipo prévio normal por bandeamento G. Dados de identificação, história clínica, exame físico e resultados de exames laboratoriais e citogenômicos foram coletados em um protocolo.

O estudo molecular da microdeleção foi realizado no Laboratório de Citogenômica do Departamento de Patologia, utilizando a técnica de FISH (fluorescent in situ hybridization) com sonda específica para a região 22q11.2. Foram utilizadas sondas comerciais de sequências únicas para a região específica em 22q11.2 (DGS/VCFS, TUPLE1 e N25 D22S75, Cytocell, Cambridge, UK)4,19 e/ou a técnica de MLPA (multiplex ligation dependent probe amplification) utilizando diferentes kits (P036-E1, P070-B2, P064-B3, MRC-Holland, Amsterdam, Holanda - www.mlpa.com). Os dados gerados foram analisados por meio do software GeneMarker® (Softgenetics, LLC, State College, PA, USA - www.softgenetics.com). Estas técnicas estão demonstradas na Figura 1.

Demonstração da deleção na região 22q11.2 A. Técnica de FISH. B. Técnica de MLPA.

Todos os pacientes foram avaliados clinicamente e por métodos de imagem pela Unidade de Cardiologia Pediátrica.

Para a avaliação de imunocompetência, foram realizados hemograma completo, dosagem sérica de imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) por nefelometria, e determinação das subpopulações de linfócitos em sangue periférico (citometria de fluxo - BD FACSCalibur) no laboratório do Instituto Central do HC-FMUSP, utilizando-se como comparação valores de referência já descritos20,21.

Outros exames realizados incluíram dosagens séricas de paratormônio (PTH, método imunoenzimático quimioluminescente automatizado), cálcio iônico, cálcio total e fósforo (método automatizado colorimétrico), tri-iodotironina (T3), tiroxina (T4), tiroxina livre (T4 livre) e TSH (método de imunoensaio automatizado), e dosagem de anticorpos antitireoglobulina e antiperoxidase (imunofluorescência indireta).

Os testes estatísticos foram realizados por meio do software MedCalc 10.2 (MedCalc Software, 2009).

O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projeto de Pesquisa do Hospital das Cliínicas - CAPPesq, sob o número 0911/11.

 Resultados

As CHDs foram identificadas em 47 pacientes (77%) e a correção cirúrgica foi realizada em 34 destes, sendo que as cirurgias mais frequentes foram para correção de tetralogia de Fallot, comunicação interventricular e atresia da artéria pulmonar, conforme descrito na Tabela 1 e Gráfico 1.

Cardiopatias congênitas encontradas em 47 pacientes com a síndrome da deleção 22q11.2 e as correções cirúrgicas realizadas
Cardiopatias N (%) Correções cirúrgicas - N (%)
Total 47 (100) 34 (72,3)
Tetralogia de Fallot 18 (38,3) 16 (88,8)
Comunicação interventricular 10 (21,3) 2 (20,0)
Atresia pulmonar 6 (12,7) 6 (100,0)
Truncus arteriosus 4 (8,5) 4 (100,0)
Interrupção do arco aórtico 4 (8,5) 4 (100,0)
Comunicação interatrial 3 (6,4) 1 (33,3)
Transposição das grandes artérias 1 (2,1) 1 (100,0)
Drenagem anômala venosa sistêmica 1 (2,1) 0 (0)
Principais cardiopatias em 47 pacientes com a síndrome da deleção 22q11.2.

Outras características fenotípicas importantes encontradas na amostra geral de pacientes com a SD22q11.2 estão destacadas na Tabela 2. Aspectos da face, assim como morfologia das orelhas, boca, nariz e olhos de alguns pacientes são mostrados nas Figuras 2 e 3.

Características fenotípicas encontradas em 60 pacientes com a síndrome da deleção 22q11.2
Características fenotípicas N (%)
Face alongada 36 (60,0)
Nariz alongado 32 (53,3)
Fenda palpebral estreita 30 (50,0)
Orelhas displásicas com hiperdobramento 29 (48,3)
Lábios finos 25 (41,6)
Dedos alongados 23 (38,3)
Baixa estatura 22 (36,6)
Alterações do palato 15 (25,0)
Anomalias dentárias 13 (21,6)
Estrabismo 10 (16,6)
Pé torto congênito 8 (13,3)
A) Pré-escolar com nariz alongado. B) Pré-escolar com fenda palpebral estreita e lábio fino. C) Escolar com face e nariz alongados. D) Fácies típico com fenda palpebral estreita, nariz proeminente, boca com lábios finos. Principais características fenotípicas dos pacientes com a síndrome da deleção 22q11.2 A) Fenda palpebral estreita. B) Face e/ou nariz alongado. C) Lábios finos.

Em muitos casos, a presença de dismorfismos faciais não foi reconhecida no período neonatal e se tornou mais evidente com o avançar da idade, como se pode observar na Figura 4.

Fotos evolutivas de pacientes com a síndrome da deleção 22q11.2 em diferentes idades A) Recém-nascido com lábios finos e orelhas displásicas, tornando‑se mais características as alterações fenotípicas na fase escolar. B) Recém-nascido com dismorfismo facial (face e nariz alongados, fenda palpebral estreita, lábios finos) C) Lactente com face e nariz alongados, mais evidentes na evolução.

Hipocalcemia foi diagnosticada em 27 dos 42 pacientes (64,2%) nos quais a dosagem de cálcio iônico foi realizada; destes, 16 (59,3%) ocorreram no período neonatal. Ainda nestes grupo, a dosagem do PTH foi realizada em 27 pacientes, sendo que em 7 pacientes (25,9%) a concentração de PTH estava reduzida. As crises convulsivas ocorreram em 6 pacientes.

Durante seguimento ambulatorial de 20 pacientes com SD22q11.2 durante a fase escolar e na adolescência, observamos que 11 evoluíram com alterações comportamentais e psiquiátricas. O achado mais comum foi o transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) em 6 pacientes, sendo que a forma mais frequente foi a hiperativa/impulsiva em 4 pacientes, seguida da forma com predomínio de sintomas de desatenção em dois pacientes. Outros achados nesta fase incluíram dificuldade do aprendizado (15%), ansiedade (10%) e retardo mental (5%). Até o presente momento, nenhum paciente evoluiu com transtorno obsessivo-compulsivo, esquizoafetivo ou psicótico.

Neste estudo, redução na contagem dos linfócitos totais esteve presente em 40% dos pacientes (18/45 casos), redução de linfócitos CD4+ em 53,3% (16/30) e de CD8+ em 33,3% (10/30), conforme demonstrado no Gráfico 2. Na avaliação da imunidade humoral, foram detectados 2 pacientes com redução das concentrações de IgM (29,6 mg/dL e 17,6 mg/dL) e 1 paciente de 9 meses com IgG de 328 mg/dL, atualmente recebendo terapêutica de reposição com gamaglobulina endovenosa.

Distribuição dos valores de linfócitos totais, CD4<sup>+</sup>, CD8<sup>+</sup> e CD19<sup>+</sup> em pacientes com a síndrome da deleção 22q11.2 A) Número de linfócitos totais. B) Número de CD4<sup>+</sup>. C) Número de CD8<sup>+</sup>. D) Número de CD19+. Cada ponto ( • ) corresponde a um único paciente. Max: Máximo; Min: Mínimo. Discussão

Embora a SD22q11.2 seja considerada uma anomalia cromossômica relativamente frequente na literatura, em nosso país os cardiologistas, neonatologistas e pediatras não a tem reconhecido de forma sistemática, sendo raras as publicações com número significativo de pacientes principalmente no primeiro ano de vida1,2. Um estudo realizado no Hospital das Clínicas do HC-FMUSP que analisou 1.008 pacientes com imunodeficiência primária em um período de 33 anos, foram identificados apenas 32 pacientes com SD22q11.210. Estes dados nos levaram a uma busca ativa da microdeleção na Unidade de Cardiologia Pediátrica do INCOR, resultando na duplicação do número de casos identificados nos últimos dois anos.

As malformações cardíacas, observadas em 77% dos nossos casos, constituem a manifestação mais crítica da SD22q11.2, acometendo entre 49% a 95% dos pacientes conforme dados na literatura1,22. Um dado a ser destacado nesta casuística foi a frequência mais elevada da tetralogia de Fallot (38,3%) em relação à literatura, a qual descreve frequências entre 17,6% e 20%22-24. Outro dado a ser ressaltado em nosso estudo foi a presença da comunicação interventricular associada à SD22q11.2, sendo esta a segunda CHD encontrada com mais frequência, diferindo da literatura que mostra que as cardiopatias conotruncais são mais destacadas.

A recomendação para a pesquisa da SD22q11.2 destaca que sejam realizados os testes para a microdeleção do cromossomo 22q11.2 em todos os recém-nascidos ou crianças com tetralogia de Fallot, truncus arteriosus, interrupção do arco aórtico, anomalias isoladas do arco aórtico e defeito perimembranoso do septo ventricular com anomalia do arco aórtico. Nos demais pacientes com defeito perimembranoso do septo ventricular sem a anomalia do arco aórtico ou com outros tipos de CHD, associados a manifestações fenotípicas características, deve-se levantar a suspeita clínica da SD22q11.2 e ser realizada a pesquisa da microdeleção3,6,22,25.

Outro fato que chama a atenção para a importância do diagnóstico precoce da SD22q11.2, idealmente antes da cirurgia de correção da cardiopatia, é a observação de que estes pacientes apresentam alto risco de complicações pós-operatórias comparados com pacientes com as mesmas cardiopatias sem a presença da SD22q11.2, apesar da sua mortalidade ser semelhante26.

Em associação com as CHDs acima descritas, os fenótipos encontrados neste estudo, em especial os dismorfismos craniofaciais peculiares e a hipocalcemia no período neonatal, podem ser essenciais para a suspeita diagnóstica de SD22q11.2. Cabe salientar que a maior parte das descrições clínicas de SD22q11.2 foi realizada em pacientes caucasoides e pela primeira vez este relato descreve com detalhes os dismorfismos faciais na população tri-híbrida brasileira, resultante da mistura, desde o século XVI, de índios, africanos e portugueses27.

Outro ponto interessante abordado no presente estudo e ainda não apresentado em outras descrições foi o aspecto evolutivo da fácies e de outros dismorfismos. Embora os dismorfismos associados à SD22q11.2 reconhecidos mais tardiamente (fendas palpebrais estreitas, nariz alongado, orelhas com hiperdobramento) já estivessem presentes ao nascimento, a fácies do recém-nascido e do lactente jovem chama menos atenção como uma "fácies sindrômica" para o pediatra geral e/ou cardiologista nesta fase da vida.

As anomalias do palato ocorrem em 9-16% dos pacientes com SD22q11.2 e cursam com morbidade elevada. Portanto, é fundamental a realização de um exame cuidadoso do palato, incluindo a pesquisa de úvula bífida que pode indicar a presença da fenda palatina submucosa2,14. Nesta série, observamos que este achado foi mais frequente do que o descrito na literatura. Goldmuntz et al. em 2005 demonstraram que além da presença de fenda palatina, cerca de 80% dos pacientes apresentavam também insuficiência velofaríngea, manifestando-se com voz anasalada e distúrbios compensatórios da articulação3. A voz anasalada é pouco valorizada para a suspeita diagnóstica, provavelmente por ser observada mais tardiamente, mas constitui mais um sinal de alerta para a síndrome.

A hipoplasia ou aplasia da glândula paratireoide é muito comum na SD22q11.2, devido ao acometimento na embriogênese do terceiro e quarto arcos faríngeos. Em 49% a 60% dos recém-nascidos com a síndrome, a hipocalcemia transitória pode estar presente, causando tetania e convulsões de difícil controle22, dados que se mostraram semelhantes nos pacientes aqui descritos. Os pediatras e cardiologistas devem ficar atentos no período neonatal para a presença de hipocalcemia sem outra causa fisiopatológica aparente, pois esta manifestação é altamente sugestiva da síndrome.

Outra manifestação variável na SD22q11.2 é a imunodeficiência, tida como decorrente da alteração do desenvolvimento do timo, sendo nestes casos ainda denominada como SDG. Aproximadamente 80% dos pacientes com a SDG têm alterações no sistema imunológico. Apesar de grande parte dos pacientes apresentarem timo hipoplásico ou ausente, a maioria apresenta imunodeficiência leve a moderada, independe de outras características clínicas.28,29 Um estudo realizado por Patel e cols.29 mostrou que níveis baixos de imunoglobulinas estão presentes em uma minoria de pacientes e que, em geral, entre 2% e 3% necessitam de reposição de imunoglobulina29. Em nosso estudo, 3 pacientes apresentavam níveis baixos de imunoglobulinas e apenas 1 apresentava indicação de reposição de imunoglobulina.

Como em portadores de SD22q11.2 as alterações iniciais podem ser a hiperatividade, ansiedade e depressão, os autores enfatizam a importância do diagnóstico precoce e do seguimento multiprofissional adequado a estes pacientes. O diagnóstico de TDAH e de transtornos de ansiedade, de humor e do espectro do autismo podem ocorrer entre um terço e metade das crianças com a deleção. As alterações do humor e os transtornos psicóticos podem aumentar de forma significativa durante a idade adulta jovem, sendo fundamental a monitorização cuidadosa dos sintomas psiquiátricos durante a adolescência e início da idade adulta30. Estes pacientes também podem ter baixo rendimento escolar, o que se torna um aspecto importante a ser abordado nas instituições de ensino.

É imperativo que se disseminem sinais de alerta para SD22q11.2 entre pediatras gerais, neonatologistas e cardiologistas pediátricos. Embora a proposta pioneira do Instituto da Criança e adotada pelo Ministério da Saúde para detecção de imunodeficiências primárias no primeiro ano de vida já inclua 4 sinais associados ao diagnóstico da SD22q11.2 (CHD, em especial as anomalias dos vasos da base; linfopenia < 2.500/mm; hipocalcemia com ou sem convulsão; e ausência de imagem tímica à radiografia de tórax)31,32 seria importante o estabelecimento de sinais de alerta específicos para esta síndrome, acrescentando-se aos acima descritos as alterações fenotípicas e insuficiência velofaríngea.

O presente estudo apresenta limitações peculiares de um estudo descritivo transversal, mas ressalta os principais achados clínicos e laboratoriais em uma população altamente selecionada. A descrição desta população permite identificar e conhecer as características demográficas do grupo estudado e o perfil de morbidade da SD22q11.2, fornecendo dados para uma política de saúde mais adequada a estes pacientes.

No manejo da criança portadora da SD22q11.2 é necessária a atuação conjunta de uma equipe multidisciplinar composta por pediatra, cardiologista, geneticista, e eventualmente também endocrinologista, neurologista, cirurgião plástico, psicólogo e fonoaudiólogo.

 Conclusão

Considerando-se que em nosso país nascem anualmente 2,5 milhões de crianças, estimamos que 500 a 750 novos casos de SD22q11.2 deveriam estar sendo identificados a cada ano, o que indica que a síndrome vem sendo subdiagnosticada. Desta maneira, é crucial manter um alerta para o diagnóstico da síndrome na presença de CHD associada a hipocalcemia, dismorfismos faciais, insuficiência velofaríngea, hipoplasia ou ausência tímica na radiografia de tórax, e necessariamente confirmar o diagnóstico pela identificação da microdeleção.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Análise estatística: Grassi MS, Jacob CMA, Pastorino AC, Carneiro-Sampaio M; Obtenção de dados: Grassi MS, Jacob CMA, Pastorino AC, Miura N, Jatene MB, Pegler SP, Carneiro-Sampaio M; Análise e interpretação dos dados: Grassi MS, Jacob CMA, Kulikowski LD, Pastorino AC, Dutra RL, Carneiro-Sampaio M; Obtenção de financiamento: Jacob CMA, Pastorino AC, Carneiro-Sampaio M; Redação do manuscrito: Grassi MS, Jacob CMA, Kulikowski LD, Pastorino AC, Carneiro-Sampaio M; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Jacob CMA, Kulikowski LD, Pastorino AC, Kim CA, Carneiro-Sampaio M.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - processos 2008/58238-4, 2009/53864-7 e 2009/53105-9. CNPq - 302647/2011-2 e 308105/2012-5 PQ2. NAP CRIad 2012.

Vinculação acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.