Introdução
A obesidade é uma doença metabólica crônica definida por um acúmulo excessivo de
tecido adiposo em relação a massa magra tecidual1. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, em 2015, aproximadamente
2,3 bilhões de adultos vão estar com sobrepeso e destes, pelo menos 700 milhões serão
considerados obesos (Índice de Massa Corporal [IMC] > 30 kg/m2) 1. A maior disponibilidade e consumo de dietas
altamente energéticas e palatáveis tem acarretado elevação do peso corporal na
população2-4. Desta forma, obesidade induzida por dieta é o modelo mais
apropriado para estudar as consequências dessa patologia2-4.
A obesidade está associada ao aumento da mortalidade, redução da expectativa de
vida5,6 e doenças cardiovasculares7,8. Estudos clínicos
mostram que a obesidade promove redução da função cardíaca e os mecanismos
patofisiológicos responsáveis por essa alteração não são completamente
esclarecidos9. Em condições aeróbicas
normais, aproximadamente 70% da energia produzida pelo miocárdio deriva do
metabolismo de ácidos graxos e 30% é derivada da via glicolítica10-13. Na
obesidade, o aumento na captação e oxidação de ácidos graxos está associado ao
decréscimo na utilização de glicose pelo miocárdio2,12,14-16. Estas alterações dos substratos energéticos podem ser responsáveis
pela disfunção cardíaca observada em indivíduos obesos2,9,17-21. Em camundongos obesos e diabéticos db/db, a normalização do
metabolismo energético com o aumento na utilização de glicose reverteram a disfunção
contrátil cardíaca20,21. Estes achados corroboram trabalhos que
sugerem que o ATP gerado pela oxidação da glicose é utilizado preferencialmente pela
bomba de cálcio (Ca2+) do retículo sarcoplasmático (SERCA2)12,13,22-24, proteína responsável pela recaptação do
cálcio citosólico. Este trabalho objetivou estudar o balanço energético do miocárdio
com a hipótese de que o aumento na oxidação de ácidos graxos e redução na oxidação de
glicose levam à disfunção cardíaca resultante de um déficit de ATP para a SERCA2.
Esta premissa foi testada com a inibição da via da glicólise através da administração
de iodoacetato (AIA) no miocárdio., droga que inibe a atividade da enzima
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase25. A
inibição da glicólise aumenta a disfunção cardíaca de camundongos obesos.
Métodos
Modelo Animal e Protocolo Experimental
Ratos Wistar machos com 30 dias de idade foram distribuídos de forma aleatória em
dois grupos: controle (C, n = 12) e obeso (Ob, n = 12). O grupo controle foi
alimentado com uma ração padrão contendo 11,2 % de lipídeos, 55,5 % de
carboidratos e 33,3 % de proteínas. O grupo obeso recebeu uma ração rica em
lipídeos contendo 45,2% de lipídeos, 28,6% de carboidratos e 26,2% de proteínas.
Os grupos receberam as dietas por 30 semanas consecutivas. A dieta rica em
lipídeos foi formulada em nosso laboratório e continha ração em pó para ratos da
Agroceres (Agroceres®, Rio Claro, SP, Brasil), alimentos
industrializados, suplemento proteico, vitaminas e minerais. A dieta rica em
lipídeos possuía maior densidade calórica (3,65 kcal/g) em relação à dieta padrão
(2,95 kcal/g) devido à maior quantidade de lipídeos, consistindo de ácidos graxos
saturados (20,2 %) e insaturados (79,8 %). Todos os ratos foram alojados em
gaiolas individuais em uma sala com controle ambiental com temperatura de 23 ± 3
ºC, ciclo de 12 h claro/escuro e humidade relativa de 60 ± 5 %. O consumo
alimentar foi medido diariamente e a água fornecida ad libitum. O peso corporal
inicial e final (PCI e PCF, respectivamente) foram aferidos. O consumo calórico
semanal foi calculado como a média de consumo da semana x o valor calórico de cada
dieta. A eficiência alimentar, capacidade de transformar colorias consumidas em
peso corporal, também foi analisada.
Todos os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com o
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, publicado
pelo U.S. National Institutes of Health26,
e também foram aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Medicina de Botucatu
(UNESP, Botucatu, Brasil).
Composição das Dietas Experimentais
As dietas experimentais supriram quantidades suficientes de proteínas, vitaminas e
minerais de acordo com o Nutrient Requirements of Laboratory
Animals (1995). A dieta padrão e as quatro dietas ricas em lipídeos
foram formuladas pela Agroceres (Rio Claro, SP, Brazil). Os ingredientes foram
inicialmente triturados e em seguida misturados com vitaminas e minerais. A
mistura foi peletizada, secada em um secador ventilado a 55 ± 5ºC e em seguida
estocada a -20ºC. A dieta padrão (RC Focus 1765) continha óleo de soja, milho
integral, farelo de trigo, farelo de soja, fosfato dicálcico, cloreto de sódio,
farinha de carne e peixe, aditivo antioxidante, e mistura de vitaminas e minerais.
Enquanto os ingredientes usados para preparar as dietas ricas em lipídeos foram
cloreto de sódio, caseína, leite em pó, proteína concentrada de soja, milho
integral, farinha de biscoito, fosfato dicálcico, carbonato de Ca2+ ,
aditivo emulsificante, antioxidantes, sabores artificiais (queijo, baunilha,
chocolate e bacon) e mistura de vitaminas e minerais. A composição da dieta rica
em lipídeos consistiu de ácidos graxos saturados e insaturados que proveram 20% e
80% das calorias derivadas de gordura, respectivamente9,26.
Determinação de Obesidade
Um critério baseado no índice de adiposidade foi utilizado para determinar a
obesidade de acordo com diversos autores9,26-28. Após a anestesia (pentobarbital sódico 50
mg/kg por via intraperitoneal [i.p.]), os animais foram decapitados,
toracotomizados e tiveram os depósitos de tecido adipose dissecados e pesados. O
índice de adiposidade foi calculado pela seguinte fórmula: índice de adiposidade =
(gordura corporal total (GC)/peso corporal final) x 100. A GC foi calculada pela
soma do peso individual de cada depósito de tecido adiposo: GC = gordura
epididimal + gordura retroperitoneal + gordura visceral9,26.
Comorbidades Associadas à Obesidade
Os modelos experimentais de obesidade induzida em ratos podem apresentar
características semelhantes à obesidade humana tais como hipertensão, intolerância
à glicose, resistência à insulina, dislipidemia, hiperinsulinemia e
hiperleptinemia. Desta forma ambos os grupos foram submetidos a diversas análises,
sendo os testes bioquímicos realizados em dez animais de cada grupo.
Pressão Arterial Sistólica
Na fase final dos experimentos, a pressão arterial sistólica foi medida na cauda
dos ratos usando um método não invasivo27
com um eletro-esfignomanômetro da Narco BioSystems® (International
Biomedical, Austin, TX, EUA). A média de duas medições foi registrada para cada
animal.
Teste Oral de Tolerância à Glicose
Ao fim do período de 30 semanas de alimentação, um teste oral de tolerância à
glicose foi realizado. Os ratos pernoitaram em jejum (12-15h) e amostras de sangue
foram extraídas da extremidade da cauda. A glicose sanguínea foi obtida em
condições basais e depois da administração intraperitoneal [i.p.] de uma dose de
glicose de 2 g/kg9. Amostras de sangue
foram coletadas em 0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após, e foram analisadas com um
glicômetro (Accu-Check Go Kit; Roche Diagnóstica Brasil Ltda, SP, Brasil).
Análise Plasmática de Hormônios
Ao fim dos tratamentos, os animais foram submetidos a 12-15 h de jejum,
anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg intraperitoneal) e eutanasiados
por decapitação. O sangue foi coletado em tubos heparinizados, em seguida foram
centrifugados a 3000 x g por 15 minutos a 4ºC, e estocados a -80ºC. As
concentrações plasmáticas de leptina e insulina foram determinadas por ELISA9 usando kits comerciais específicos (Linco
Research Inc., St. Louis, MO, EUA).
Colesterol, Triglicerol, Ácidos Graxos não Esterificados, Insulina e
Leptina
Ao fim do experimento, os animais foram submetidos a um jejum de 12-15 h,
anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) e eutanasiados por
decapitação. Amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados, o soro foi
separado por centrifugação a 3000 x g por 15 minutos a 4ºC, e em seguida foram
estocados a -80ºC até análises adicionais. O soro foi analisado para os níveis de
glicose (GL), triglicerídeos (TG), colesterol total (CT), ácidos graxos não
esterificados (AGNE) e hormônios (insulina e leptina). As concentrações séricas de
GL, TG e CT foram medidas com um sistema de análise enzimático automático
(Technicon, RA-XTTM System, Global Medical Instrumentation, Minnesota, EUA). Os
níveis de AGNEs foram determinados pelo método de Johnson e Peters (1993) usando
kits de colorimétricos (WAKO NEFA-C, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão).
Os níveis de leptina e insulina foram determinados por ELISA usando kits
comerciais específicos (Linco Research Inc., St. Louis, MO, USA).
Análise da Gordura Corporal
Após anestesia (pentobarbital sódico 50 mg/kg i.p.), decapitação e toracotomia, os
depósitos de tecido adiposo foram dissecados e pesados. O peso de tecido adiposo
total foi calculado como a soma do peso de cada depósito de gordura individual:
gordura epididimal + gordura retroperitoneal + gordura visceral. O índice de
adiposidade foi calculado como: (gordura corporal total/peso corporal final) x 100
9,26.
Estrutura e Função Cardíaca
Os pesos do coração e ventrículo esquerdo (VE) foram determinados como índices de
estrutura cardíaca depois de seus valores absolutos serem normalizados pelo
comprimento da tíbia.
A função do miocárdio foi analisada pelo estudo de músculos papilares isolados do
VE. Este procedimento tem sido usado por diversos pesquisadores9,17,29. Esta técnica
permite a mensuração da capacidade do músculo cardíaco de contrair e realizar
força independente de influências in vivo que podem alterar a
performance mecânica do miocárdio, tais como a frequência dos batimentos,
pré-carga e pós-carga. Resumidamente, no experimento os ratos foram anestesiados
com pentobarbital sódico (50 mg/kg i.p.) e eutanasiados por decapitação. Os
corações foram removidos rapidamente e colocados em uma solução de Krebs-Henseleit
oxigenada a 28ºC. Os músculos papilares dos ratos C (n = 12) e ratos Ob (n = 12)
foram dissecados, e presos entre dois clipes de mola e colocados verticalmente em
uma câmara contendo a solução de Krebs-Henseleit (118,5 mM NaCl; 4,69 mM KCl; 2,5
mM CaCl2; 1,16 mM MgSO4; 1,18 mM KH2PO4; 5,50 mM GL e 24,88 mM NaCO3) mantida a
28ºC por um circulador de água termostatizado. A solução de banho foi borbulhada
com oxigênio 95% e dióxido de carbono 5%, com pH de 7,4. O clipe de mola inferior
foi ligado a um transdutor de força 120T-20B (Kyowa, Tóquio, Japão) por um fino
fio de aço (1/15.000 polegada) que passou através do selo de mercúrio no fundo da
câmara. O clipe de mola superior foi conectado a um fino fio de aço ligado a um
braço alavancado rígido sobre o qual havia um parafuso micrométrico para o ajuste
do comprimento do músculo. A preparação do músculo foi colocada entre dois
eletrodos de platina (Grass E8, GRASS Technologies, An Astro-Med, Inc. Product
Group, West Warwick, RI, EUA) e estimulado a uma frequência de 0,2 Hz (12
pulsos/min) usando pulsos de ondas quadradas de 5 ms de duração. A voltagem foi
regulada para um valor 10% maior que o mínimo necessário para produzir a resposta
mecânica máxima.
Os músculos foram contraídos isotonicamente com cargas leves por 60 min e depois
carregados (50g) para contrair isometricamente e esticarem até o máximo das curvas
de comprimento-tensão. Após um período de 5 min durante o qual as preparações
passaram por contrações isotônicas, os músculos foram submetidos de novo a
condições isométricas e o pico da curva de comprimento-tensão
(Lmax) foi cuidadosamente medido. Um período de 15 min de
contração isométrica estável foi aplicado antes do período experimental e durante
o qual uma contração isomérica foi registrada.
Os seguintes parâmetros foram medidos para a contração isométrica na
Lmax: pico de tensão desenvolvida (TD [g/mm2]),
tensão em repouso (TR [g/mm2]), taxa máxima de desenvolvimento da
tensão (+dT/dt [g/mm2/s]), taxa máxima de redução da tensão (-dT/dt
[g/mm2/s]) normalizadas pela área da seção transversal (AST). A
rigidez miocárdica foi determinada pela razão entre a variação de comprimento do
músculo e a tensão em repouso. A tensão em repouso foi analisada com o comprimento
do músculo correspondendo a 90, 92, 94, 96, 98, e 100% da Lmax. A
curva de comprimento-tensão em repouso foi obtida usando uma análise de regressão
exponencial: log (TR) = -51,1118 + 25,5425 log(Lmax)
para o grupo C e log (TR) = -58,1992 + 29,1455
log(Lmax) para o grupo Ob.
Os parâmetros usados para caracterizar o músculo papilar foram o comprimento (mm),
peso (mg), e AST (mm2). Ao fim do experimento, o comprimento do músculo
em Lmax foi medido com um catetômetro (Gartner Scientific
Corporation, Chicago, IL, EUA) e o músculo entre os dois clipes foi secado e
pesado. A área de seção transversal foi calculada com o peso do músculo e o
comprimento, assumindo a uniformidade e a gravidade específica de 1,0. Todos os
dados de força foram normalizados pela área da seção transversal.
Para determinar o mecanismo pelo qual a obesidade induz efeitos inotrópicos
negativos sobre a função contrátil, os músculos papilares foram avaliados sob
condições basais de 2,5 nmol/L de Ca2+ e depois de manobras inotrópicas e
lusitrópicas. Estas manobras foram: contração pós-repouso de 10, 30 e 60 segundos;
aumento extracelular da concentração de Ca2+ de 0,5 para 2,5 nmol/L; mudança da
frequência cardíaca de 0,1 para 2,0 Hz; adição de iodoacetato. A avaliação da via
glicolítica foi realizada utilizando um inibidor específico, ácido iodoacético
10-3 mM/L. A função miocárdica foi registrada aos 5, 10, 15, 20, 25,
30, 35, 40 e 45 min depois da adição de ácido iodoacético na solução nutriente. O
comportamento da TD e da TR depois da administração do inibidor da rota
glicolítica foi acompanhado para a construção do modelo da regressão linear.
Análise estatística
Parâmetros nutricionais, hormonais, morfológicos e análises da função cardíaca
foram apresentados como médias ± desvio padrão e a comparação entre os grupos foi
realizada com o teste t de Student para amostras independentes. O perfil de
glicose dos grupos foi comparado por uma ANOVA de medidas repetidas. Quando
diferenças significativas foram encontradas (p < 0,05), o teste de Bonferroni
post hoc para comparações múltiplas foi realizado. As curvas de regressão do
bloqueio da via glicolítica e rigidez miocárdica foram comparadas pelo teste do
coeficiente angular e regressão linear. A análise estatística foi realizada com o
programa Sigma Plot 3.5 para Windows (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA). A
normalidade das variáveis foi analisada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. O nível
de significância foi de 5%.
Discussão
A dieta foi capaz de levar os animais à obesidade tendo em vista que o índice de
adiposidade foi 39,2% superior ao controle. Os dados desta pesquisa são compatíveis
com os resultados de pesquisas realizadas em nosso laboratório usando a mesma
metodologia9,17,26. Nesta pesquisa foram observadas comorbidades associadas à obesidade
experimental como a intolerância à glicose, hiperinsulinemia e hiperleptinemia. Os
resultados revelaram que o nosso modelo experimental promoveu alterações em
parâmetros metabólicos e hormonais que estão de acordo com os achados de vários
pesquisadores 9,30,31.
A obesidade não causou remodelações estruturais na frequência cardíaca ou pressão
arterial sistólica. Os dados diferem de estudos que observaram que a obesidade
induzida por dieta rica em lipídeos causa hipertrofia cardíaca9,26,32,33 e aumento da pressão arterial34. A alteração nessas variáveis não sugere que e
a obesidade não causou mudanças significativas em neuro-hormônios capazes de promover
a proliferação celular, vasoconstrição e retenção hidrossalina.
Neste estudo a função miocárdica foi avaliada in vitro com o uso de
músculos papilares isolados do VE. Preparações de músculos papilares permitem a
mensuração da capacidade do músculo cardíaco de contrair e relaxar independente de
influências in vivo que podem alterar a performance mecânica do
miocárdio, tais como mudanças de frequência e carga cardíaca. A estimulação
inotrópica permite a identificação de alterações nas fases de contração e relaxamento
que não podem ser detectadas em condições basais e isso ajuda na compreensão dos
mecanismos envolvidos nas alterações da função miocárdica. Os animais utilizados em
ambos os grupos possuíam a área seccional transversa semelhantes e isto permite
evitar a influência da área seccional transversa sobre os resultados35. Os resultados demonstraram que a obesidade
não causou a deterioração da função cardíaca nem da rigidez do miocárdio, tanto em
condições basais como com a estimulação inotrópica. Este comportamento é similar ao
encontrado por outros autores que utilizaram corações isolados de coelhos com 12
semanas de idade36 e miócitos isolados de
camundongos obesos com 14 semanas de idade37.
Entretanto, outros pesquisadores encontraram resultados divergentes onde foi
encontrada uma redução da função mecânica de miócitos isolados de camundongos com 12
semanas38, estes autores também observaram
uma elevação da performance contrátil basal do músculo papilar nos camundongos obesos
com 7 semanas. Leopoldo e cols.9 não
observaram alterações na função miocárdica basal de ratos com 15 semanas, entretanto
estes autores encontraram diferenças entre o grupo controle e o grupo obeso após a
utilização de bloqueadores para SERCA2 e canal de Ca2+ tipo L.
O bloqueio da via glicolítica com o iodoacetado sobre a função miocárdica mostrou que
a inclinação da curva de tensão desenvolvida em animais obesos foi similar ao grupo
controle, entretanto esta inclinação na curva de tensão de repouso dos animais obesos
foi significativamente menor do que no controle. Contrário às expectativas, estes
resultados sugerem que os ratos do grupo controle possuem maior rigidez miocárdica do
que os ratos obesos. Este comportamento pode estar relacionado a uma maior elevação
do cálcio citoplasmático resultante possivelmente de uma menor recaptura pela SERCA2
e ou maior afinidade entre o cálcio e a troponina C. A menor contratura observada em
ratos obesos sugere que a priorização pelo miocárdio por ácidos graxos em relação à
glicose aumentou a disponibilidade de energia para a SERCA2 e promoveu uma proteção
ao miocárdio durante o bloqueio da via glicolítica. Isto indica que em situações em
que ocorre o aumento nas concentrações de ácidos graxos, a SERCA2 também utiliza
energia proveniente da beta-oxidação. Desta forma, neste experimento, a obesidade
promoveu alterações metabólicas que resultaram em uma proteção miocárdica.
A TR e a TD apresentaram comportamentos distintos, sendo que o fato da TD ter sido
igual entre os grupos pode estar relacionado à taxa da quantidade de cálcio que se
difunde em relação a que é removida do citosol durante um ciclo cardíaco. De acordo
com Katz39, a razão é de aproximadamente 150,
o que mostra que a quantidade de cálcio que é removida é menor em relação a que se
difunde para o interior da célula39. A SERCA2
é a maior responsável pela recaptação dos íons de cálcio nos roedores40 e utiliza ATP para a sua atividade, assim um
déficit de energia para essa estrutura poderia causar consequências mais deletérias
para a diástole do que para a sístole40.