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Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de CardiologiaF9FdNVy45kGVgnYCYyHPvFbS0066-782X201400210000700007S0066-782X201400504010310.5935/abc.20140103Original ArticlesCombination Therapy for the Cardiovascular Effects of
Perinatal Lead Exposure in Young and Adult RatsGasparAndréia Fresneda12CordelliniSandra1Universidade Estadual PaulistaInstituto de BiociênciasDepartamento de FarmacologiaBotucatuSPBrazilDepartamento de Farmacologia, Instituto de
Biociências - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP -
BrazilFaculdade da Alta PaulistaTupãSPBrazilFaculdade da Alta Paulista (FAP), Tupã, SP -
BrazilMailing Address: Sandra Cordellini, Rua João Carmelo 145, Jardim
Paraíso. CEP 18610-290, Botucatu, SP - Brazil. Email:
cordelli@ibb.unesp.br
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
2907201409201410303219230300120140304201417042014This is an Open Access article distributed under the terms of the
Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits
unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any
medium, provided the original work is properly cited.Background:
Combination therapy can play a significant role in the amelioration of
several toxic effects of lead (Pb) and recovery from associated
cardiovascular changes.
Objective:
To investigate the effects of combination therapy on the cardiovascular
effects of perinatal lead exposure in young and adult rats
Methods:
Female Wistar rats received drinking water with or without 500 ppm of Pb
during pregnancy and lactation. Twenty-two- and 70-day-old rat offspring who
were or were not exposed to Pb in the perinatal period received
meso-dimercaptosuccinic acid (DMSA), L-arginine, or enalapril and a
combination of these compounds for 30 additional days. Noradrenaline
response curves were plotted for intact and denuded aortas from 23-, 52-,
70-, and 100-day-old rats stratified by perinatal Pb exposure
(exposed/unexposed) and treatment received (treated/untreated).
Results:
Systolic blood pressure was evaluated and shown to be higher in the 23-, 52-,
70-, and 100-day age groups with Pb exposure than in the corresponding
control age groups: 117.8 ± 3.9*, 135.2 ± 1.3*, 139.6 ± 1.6*, and 131.7 ±
2.8*, respectively and 107.1 ± 1.8, 118.8 ± 2.1, 126.1 ± 1.1, and 120.5 ±
2.2, respectively (p < 0.05). Increased reactivity to noradrenaline was
observed in intact, but not denuded, aortas from 52-, 70-, and 100-day-old
exposed rats, and the maximum responses (g of tension) in the respective
Pb-exposed and control age groups were as follows: 3.43 ± 0.16*, 4.32 ±
0.18*, and 4.21 ± 0.23*, respectively and 2.38 ± 0.33, 3.37 ± 0.13, and 3.22
± 0.21, respectively (p < 0.05).
Conclusions:
All treatments reversed the changes in vascular reactivity to noradrenaline
in rats perinatally exposed to Pb. The combination therapy resulted in an
earlier restoration of blood pressure in Pb-exposed rats compared with the
monotherapies, except for enalapril therapy in young rats. These findings
represent a new approach to the development of therapeutic protocols for the
treatment of Pb-induced hypertension.
Epidemiological data show that lead (Pb) plays a role in the development of arterial
hypertension in individuals occupationally exposed to Pb and in the general
population1.
Arterial hypertension induced by Pb exposure during postnatal life is characterized
by an increase in vascular reactivity to catecholamines2, a decrease in beta-adrenergic receptors3, and a decrease in vasodilatory responses to acetylcholine
and sodium nitroprusside4. In contrast, Purdy
et al5 reported no changes in aortic
reactivity to either vasoconstrictors (noradrenaline and phenylephrine) or
vasodilators (acetylcholine and sodium nitroprusside) associated with for Pb-induced
hypertension.
Although great progress has been made with regard to neurochemical and behavioral
alterations induced by perinatal Pb exposure6,7, the cardiovascular effects of Pb exposure
remain unclear.
Studies have focused on the concept that Pb is associated with regulatory processes
involving Ca+2, cyclic GMP, and protein kinase C1,8,9; renin-angiotensin-aldosterone,
kallikrein-kinin, and other autacoidal (e.g., endothelin) and transductional systems
[e.g., nitric oxide (NO)]1,8,10; endothelium and smooth muscle
proliferation11,12; and oxidative stress13.
Despite many years of research, the optimal treatment for toxicity caused by heavy
metal exposure remains to be determined. Chelation therapy is the preferred
treatment for decreasing the toxic effects of metals, although chelators have
largely been restricted to overt, acute poisoning14,15. Several supplements such as vitamins,
sulfur-containing amino acids, antioxidants, and essential minerals are also used to
address metal toxicity15. Combination therapy
is a novel and better approach to the treatment of metal poisoning14,15. Because little experimental evidence is
available, there is a requirement for in-depth investigations in this field.
On the basis of the abovementioned reports, we investigated combination therapies for
the treatment of Pb-induced cardiovascular toxicity. The effects of maternal Pb
exposure during pregnancy and lactation on blood pressure and aortic reactivity were
investigated in young and adult rat offspring, with focus on endothelial and smooth
muscle cells. We then evaluated the therapeutic effects of the following drugs
administered either alone or in combination on the adverse cardiovascular effects of
perinatal Pb exposure in young and adult rats: meso-dimercaptosuccinic acid (DMSA),
a chelating agent and scavenger of reactive oxygen species (ROS)16,17; L-arginine, a precursor of NO18; and enalapril, an angiotensin-converting
enzyme inhibitor.
MethodsAnimals and Pb exposure
Adult Wistar rats were obtained from University of São Paulo facilities and used
as the parent generation. The animals were mated at the age of 90 days (two
females and one male per cage). On pregnancy day 0 (determined by the presence
of sperm in vaginal smears), the females were divided into nonexposed and
Pb-exposed groups and were housed alone. The drinking water in the cages housing
the females was altered with 500 ppm Pb (as Pb acetate) or tap water. A group of
animals received sodium acetate to equalize acetate exposure between groups. The
Pb exposure regimen was chosen on the basis of previous studies6,7,19. To prevent the formation of a Pb
precipitate, 0.5 mL of glacial acetic acid was added while stirring to 1000 mL
of each solution (sodium acetate and Pb). Pb exposure lasted throughout
pregnancy and lactation (Figure 1). At
birth, the number of pups per litter was recorded, following which all litters
were culled to eight pups. Whenever possible, only male rats were kept within
the litter, and females were kept just to maintain equal litter sizes. Pups were
weaned at 22 days of age on tap water and evaluated at 23 and 70 days of age
(Figure 1). Age-matched controls
received sodium acetate during the same periods as that of Pb exposure. Maternal
body weights were measured on pregnancy day 0, the day before delivery, after
delivery, and at weaning. Pup weights were recorded at birth and weekly until
100 days of age.
Experimental design
Lights in the animal room were set on a 12:12-h light-dark cycle, with the
temperature maintained at 22 ± 1°C. The animals were fed with regular laboratory
chow. Animal procedures were performed in accordance with the principles and
guidelines of the National Council for Control of Animal Experimentation
(protocol no. 25/05-CEEA).
Measurement of blood pressure
Beginning at 22 days of life, systolic blood pressure was determined weekly in
conscious rats using the tail-cuff plethysmographic method (Narco Bio-Systems,
Inc., Houston, TX). The rats were prewarmed for approximately 10 min and placed
into a restrainer for blood pressure measurement. Three consecutive recordings
(approximately 1 min apart) were obtained, and the mean of these three
measurements was recorded.
Determination of Pb levels in blood
Whole blood was collected from the hearts of anesthetized (urethane, 1.25 g/kg)
female rats at weaning and pups at 23, 52, 70, and 100 days of age.
Blood was prepared for Pb analysis, which was conducted using a microwave
dissolution procedure utilizing a DGT-100 plus microwave digestion apparatus
(Provecto, Brazil). Nitric acid was added to the digestion vessels containing 1
mL of blood.
Pb levels in whole blood were determined using an atomic absorption
spectrophotometer GBC AA 932 (EEA-flame)20. The recovery of Pb that was externally added to control samples
was found to be consistently greater than 96%. A standard addition method was
applied during determination to eliminate possible matrix interference.
Whole-blood Pb levels were expressed in micrograms per deciliter. The detection
limit was 5 µg/dL.
Therapy
A group of 22- and 70-day-old rats who were or were not exposed to Pb in the
perinatal period received DMSA, L-arginine, enalapril, or the combination of
these compounds for 30 additional days (Figure
1). DMSA was orally administered at 60 mg/kg by gastric gavage two
times a day (30 mg/kg per dose) for 5 days a week. L-arginine (1.0%) was
administered through drinking water consumed ad libitum.
Enalapril was also administered through drinking water (approximately 5
mg/day/rat). Age-matched controls received tap water.
Experimental protocols
Immediately after the blood samples were collected, the thoracic aorta was
excised and trimmed free of adhering fat and connective tissue. Two transverse
rings measuring approximately 4 mm in length were cut and mounted at the optimal
length for recording isometric tension in organ chambers. One ring served as a
control, while the endothelium was mechanically removed from the other by gently
rubbing the luminal surface. These samples constituted the intact and denuded
aortas, respectively. The organ baths contained Krebs-Henseleit solution (7 mL)
comprising (in mM) NaCl (113.0), KCl (4.7), CaCl2 (2.5),
NaHCO3 (25.0), MgSO4 (1.1),
KH2PO4 (1.2), ascorbic acid (0.11), and glucose
(11.1). The bathing fluid was maintained at 37ºC and was saturated with a gas
mixture of 95% O2 and 5% CO2. The preparations were
allowed to equilibrate for at least an hour under a resting tension of 1.5 g,
which is optimal for inducing maximum contraction. Tension was recorded using an
F-60 microdisplacement myograph (Narco Bio-Systems Inc., Houston, Texas, USA)
and displayed on a physiograph. Intact and denuded aortas from rats who were or
were not exposed to Pb were studied in parallel.
Cumulative concentration-effect curves were constructed from the aortic response
to noradrenaline. At the ends of the curves, acetylcholine (10−6 M)
and sodium nitroprusside (10−4 M) were used to test the integrity of
the endothelial and smooth muscle layers, respectively.
Drugs and solutions
The following drugs were used: acetylcholine bromide, DMSA, enalapril maleate,
L-arginine, lead acetate, noradrenaline bitartrate, sodium nitroprusside, and
urethane (all obtained from Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA). All
drugs were dissolved in Krebs-Henseleit solution, and the concentrations were
expressed in molarity. Lead and sodium acetate were dissolved in acidified tap
water as described above. L-arginine and enalapril were dissolved in tap water.
DMSA solutions were freshly prepared by dissolving the compound in 5%
NaHCO3.
Data analysis and statistics
The litter was considered to be the experimental unit in all performed analyses.
The concentration of vasoactive agents producing a response that was 50% of the
maximum (EC50) was calculated in each experiment. The
EC50s to noradrenaline are presented as means with 95% confidence
intervals. The maximal response to noradrenaline is presented as means ±
standard errors (SEs). Blood pressure, EC50 values, and maximal
responses were compared by two-way analysis of variance using SigmaStat 3.2
software. Pb and treatment were the factors included in the analysis. A P-value
of <0.05 was considered statistically significant. Tukey's multiple
comparisons test was used to test differences among means. Other parameters
(body weight, number of pups, and Pb determination) are also presented as means
± standard errors and were compared using the Mann-Whitney test, which was
conducted using InStat 4.0 software.
ResultsBody weight, number of pups, blood Pb levels, and blood pressure
Pb exposure did not affect the body weight of the mothers and pups (Table 1) as well as the number of pups per
litter (control: 11.3 ± 0.4, Pb: 10.5 ± 0.5, p > 0.05; number of litters per
group, 10-20).
Body weights of females exposed or not exposed to Pb during pregnancy
and lactation and their male offspring who were treated or not treated
with DMSA, L-arginine, enalapril, or combination therapy
Body weight (g)
Rats
Groups
Pregnancy
Lactation
Post-weaning age
0 day
21 days
1 day
21 days
52 days
70 days
100 days
Dams
Control (n = 20)
272.2 ± 6.2
378.8 ± 9.0
304.6 ± 7.0
276.9 ± 5.6
-
-
-
Pb (n = 20)
269.0 ± 4.9
360.3 ± 8.1
293.1 ± 5.0
275.44 ± 5.3
-
-
-
Male offspring
Control (n = 20)
-
-
6.2 ± 0.2
39.1 ± 0.5
208.3 ± 0.2
323.1 ± 5.3
357.0 ± 2.7
Pb (n = 20)
-
-
5.8 ± 1.7
40.0 ± 1.2
198.6 ± 4.1
327.9 ± 8.6
357.1 ± 3.2
Pb/DMSA (n = 20)
-
-
-
41.2 ± 2.2
195.0 ± 2.2
326.8 ± 6.1
365.7 ± 1.7
Pb/L-arginine (n = 15)
-
-
-
43.0 ± 2.3
205.5 ± 2.3
325.4 ± 2.5
369.9 ± 2.2
Pb/enalapril (n = 15)
-
-
-
42.4 ± 1.8
194.8 ± 4.2
301.7 ± 2.4
351.1 ± 1.8
Combination therapy (n = 20)
-
-
-
43.0 ± 5.5
206.0 ± 8.5
314.7 ± 2.6
360.6 ± 1.2
Values represent means ± standard errors. Pb: 500 ppm lead acetate
during pregnancy and lactation. Treatment: a group of 22- and
70-day-old offspring who were or were not exposed to Pb during the
perinatal period received DMSA, L-arginine, enalapril, or a
combination of these compounds for 30 additional days. DMSA was
orally administered at 60 mg/kg by gastric gavage two times a day
(30 mg/kg per dose) for 5 days a week. L-arginine (1.0%) was
administered through drinking water ad libitum. Enalapril was
administered through drinking water at a dosage of 5 mg/rat/day.
Age-matched controls received tap water. (n) = number of animals per
group.
Pb levels in blood samples from the mothers and the 23-, 52-, 70- and 100-day-old
rats were significantly higher than those in the respective controls (Table 2). After Pb discontinuation, the
blood Pb levels in exposed rats decreased but remained higher than those in
control rats (Table 2). The different
treatment protocols resulted in a significant decrease in blood Pb levels in the
52- and 100-day-old rats (Table 2).
These decreases reached values similar to those observed in control rats of the
same age, except in rats treated with L-arginine, in which blood Pb levels
remained high compared with those in controls (Table 2).
Blood Pb levels in females who were or were not exposed to Pb during
pregnancy and lactation and their male offspring who were or were not
treated with DMSA, L-arginine, enalapril, or combination therapy
Blood Pb levels (μg/dL)
Groups
Females
Male offspring
23 days
52 days
70 days
100 days
Control (n = 5)
< 5.0
< 5.0
< 5.0
< 5.0
< 5.0
Pb (n = 6)
53.39 ± 5.88*
35.61 ± 7.43*
-
-
-
Pb/water (n = 6)
-
-
19.98 ± 6.31*
13.15 ± 0.97*+
11.17 ± 2.11*+
Pb/DMSA (n = 5)
-
-
< 5.0$
-
< 5.0$
Pb/L-arginine (n = 6)
-
-
10.65 ± 2.12*
-
6.55 ± 3.29*
Pb/enalapril (n = 5)
-
-
< 5.0$
-
< 5.0$
Combination therapy (n = 5)
-
-
< 5.0$
-
< 5.0$
Values represent means ± standard errors. Pb: 500 ppm lead acetate
during pregnancy and lactation. Treatment: a group of 22- and
70-day-old offspring who were or were not exposed to Pb during the
perinatal period received DMSA, L-arginine, enalapril, or a
combination of these compounds for 30 additional days. DMSA was
orally administered at 60 mg/kg by gastric gavage two times a day
(30 mg/kg per dose) for 5 days a week. L-arginine (1.0%) was
administered through drinking water ad libitum. Enalapril was
administered through drinking water at a dosage of 5 mg/rat/day.
Age-matched controls received tap water.
p < 0.05 compared with the respective control group;
p < 0.05 compared with Pb-exposed, 23-day-old rats;
p < 0.05 compared with the respective Pb/water group;
(n) = number of animals in each age group.
Systolic blood pressure was not altered by sodium acetate exposure compared with
those after tap water exposure (data not shown). Systolic blood pressure showed
a gradual increase during postnatal development (Figures 2 and 3). Moreover,
the values observed in Pb-exposed rats were significantly higher than those in
controls (Figures 2 and 3).
Arterial blood pressure in 52-day-old rats who were or were not
exposed to Pb in the perinatal period (during pregnancy and lactation)
and were treated or not treated with DMSA, L-arginine, enalapril, or
combination therapy. Treatment: a group of 22-day-old offspring received
DMSA, L-arginine, enalapril, or a combination of these compounds for 30
additional days. DMSA was orally administered at 60 mg/kg by gastric
gavage two times a day (30 mg/kg per dose) for 5 days a week. L-arginine
(1.0%) was administered through drinking water ad libitum. Enalapril was
administered through drinking water at a dosage of 5 mg/rat/day.
Age-matched controls received tap water. Values are expressed as means ±
standard errors. *p < 0.05 compared with controls; #p < 0.05
compared with Pb/water. (n) = animal number per group.
Arterial blood pressure in 100-day-old rats who were or were not
exposed to Pb in the perinatal period (during pregnancy and lactation)
and were treated or not treated with DMSA, L-arginine, enalapril, or
combination therapy. Treatment: a group of 100-day-old offspring
received DMSA, L-arginine, enalapril, or a combination of these
compounds for 30 additional days. DMSA was orally administered at 60
mg/kg by gastric gavage two times a day (30 mg/kg per dose) for 5 days a
week. L-arginine (1.0%) was administered through drinking water ad
libitum. Enalapril was administered through drinking water at a dosage
of 5 mg/rat/day. Age-matched controls received tap water. Values are
expressed as means ± standard errors. *p < 0.05 compared with
controls; #p < 0.05 compared with Pb/water; (n) = animal number per
group.
All treatments decreased the blood pressure of Pb-exposed young rats to levels
near those in unexposed animals. This reversal in blood pressure occurred at the
age of 49, 35, 28, and 28 days, respectively, with L-arginine, DMSA, enalapril,
and combination therapy (Figure 2).
Similar reversals in blood pressure were observed in Pb-exposed adult rats
treated with L-arginine, enalapril, and combination therapy at the age of 84,
84, and 77 days, respectively (Figure 3).
Although DMSA treatment decreased blood pressure in Pb-exposed adult rats, this
value was similar to that observed in both unexposed and Pb-exposed untreated
rats (Figure 3).
Vascular reactivity
The reactivity of intact and denuded aortas in Pb-exposed rats was not altered by
sodium acetate exposure compared with that in aortas from rats that received tap
water (data not shown). Gavage did not cause any change in aortic reactivity
(data not shown). Neither Pb exposure nor the treatments altered the reactivity
of denuded aortas to noradrenaline (Tables
3 and 4).
Maximal responses and EC50 values for the response to noradrenaline
obtained in aortas with and without endothelium that were isolated from
rats who were or were not exposed to Pb in the perinatal period (during
pregnancy and lactation) and were or were not treated with L-arginine or
enalapril
Male offspring
Aorta With Endothelium
Aorta Without Endothelium
1Maximum
response (g of tension)
2EC50 (×10-8 M)
3N
1Maximum
response (g of tension)
2EC50 (x 10-9 M)
3N
Not treated
23-day-old
Control
1.8 ± 0.1
1.3 (0.5 - 3.4)
6
2.6 ± 0.2+
1.4+ (0.3 -
6.4)
8
Pb
2.1 ± 0.2
1.5 (0.4 - 4.9)
6
3.0 ± 0.1+
1.1+ (0.1 -
7.5)
8
52-day-old
Control
2.4 ± 0.3
2.0 (0.4 - 10.8)
7
4.1 ± 0.4+
1.0+ (2.8 -
6.4)
8
Pb
3.4 ± 0.2*
11.0 (6.0 - 20.3)
6
4.5 ± 0.2+
1.0+ (0.3 -
4.2)
8
70-day-old
Control
3.4 ± 0.1
16.0 (7.1 - 35.4)
5
5.2 ± 0.4+
5.0+ (0.7 -
36.0)
7
Pb
4.3 ± 0.2*
4.8 (1.7 - 13.3)
6
5.0 ± 0.3+
1.3+ (0.4 -
4.2)
8
100-day-old
Control
3.2 ± 0.2
8.5 (4.6 - 15.6)
6
5.3 ± 0.3+
5.6+ (1.4 -
21.9)
8
Pb
4.2 ± 0.2*
4.3 (0.9 - 20.7)
6
5.2 ± 0.4+
3.8+ (0.7 -
19.7)
8
L-arginine treatment
52-day-old
Control
2.8 ± 0.1
3.3 (1.5 - 7.3)
5
4.5 ± 0.3+
1.6+ (0.1 -
29.0)
8
Pb
2.7 ± 0.1
10.0 (4.1 - 37.3)
6
4.3 ± 0.3+
8.5+ (1.0 -
27.5)
8
100-day-old
Control
3.3 ± 0.2
8.9 (5.5 -14.5)
8
4.8 ± 0.2+
9.2+ (3.2 -
26.3)
8
Pb
3.2 ± 0.4
8.6 (2.3 - 31.4)
12
4.9 ± 0.5+
0.9+ (0.2 -
7.3)
14
Enalapril treatment
52-day-old
Control
2.7 ± 0.4
3.0 (0.4 - 23.4)
12
4.2 ± 0.3+
0.4+ (0.1 -
8.7)
12
Pb
2.7 ± 0.2
6.15 (1.31 - 28.91)
7
4.2 ± 0.2+
6.2 +(1.0 -
38.0)
8
100-day-old
Control
3.1 ± 0.2
5.4 (1.0 -27.5)
8
5.0 ± 0.4+
4.1+ (0.6 -
25.9)
11
Pb
3.2 ± 0.1
9.4 (3.0 - 30.1)
5
5.6 ± 0.6+
1.2+ (0.2 -
19.3)
14
Values represent means ± standard errors.
EC50: levels producing half-maximum responses; values represent means
with 95% confidence intervals.
N = number of animals.
Pb: 500 ppm lead acetate during pregnancy and lactation. Treatment: a
group of 22- and 70-day-old offspring who were or were not exposed
to Pb during the perinatal period received received L-arginine or
enalapril for 30 additional days. L-arginine (1.0%) was administered
through drinking water ad libitum. Enalapril was administered
through drinking water at a dosage of 5 mg/rat/day. Age-matched
controls received tap water.
p < 0.05 compared with the respective control group;
p < 0.05 compared with the respective aorta with endothelium.
Maximal responses and EC<sub>50</sub> values for the response to
noradrenaline In aortas with and without endothelium that were isolated
from rats who were or were not exposed to Pb during pregnancy and
lactation and were or were not treated with DMSA or combination
therapy
Male offspring
Aorta With Endothelium
Aorta Without Endothelium
1Maximum
response (g of tension)
2EC50 (x 10-8 M)
3N
1Maximum
response (g of tension)
2EC50 (x 10-9 M)
3N
Not treated
52-day-old
Control
2.8 ± 0.4
9.0 (3.6 - 22.9)
8
4.1 ± 0.4+
12.8+ (1.3 -
93.3)
8
Pb
4.0 ± 0.4*
11.5 (5.3 - 25.1)
8
4.8 ± 0.2+
2.7+ (0.4 -
20.2)
6
100-day-old
Control
2.7 ± 0.3
7.9 (2.2 - 28.0)
5
5.1 ± 0.4+
10.5+ (0.3 -
49.1)
7
Pb
4.1 ± 0.2*
15.4 (2.8 - 31.5)
5
5.4 ± 0.4+
15.2+ (0.4 -
69.6)
12
DMSA treatment
52-day-old
Control
2.8 ± 0.3
13.7 (5.7 - 32.7)
6
4.5 ± 0.3+
13.9+ (2.4 -
81.0)
7
Pb
2.7 ± 0.3
9.1 (3.8 - 21.8)
6
4.3 ± 0.4+
1.7+ (0.1 -
67.1)
12
100-day-old
Control
2.3 ± 0.2
18.1 (4.4 - 43.8)
6
4.6 ± 0.4+
35.1+ (3.6 -
141.2)
7
Pb
2.8 ± 0.2
27.6 (11.6 - 55.6)
6
4.3 ± 0.5+
11.8+ (0.1 -
151.7)
14
Combination therapy
52-day-old
Control
3.1 ± 0.2
7.1 (3.7 - 13.5)
5
4.9 ± 0.3+
0.3+ (0.1 -
17.8)
6
Pb
2.4 ± 0.3
5.0 (2.8 - 9.1)
6
3.9 ± 0.6+
10.1+ (0.1-
23.3)
14
100-day-old
Control
3.2 ± 0.3
7.0 (2.2 -22.5)
7
4.8 ± 0.3+
4.7+ (1.2 -
18.0)
6
Pb
2.8 ± 0.2
9.7 (1.6 - 30.3)
6
4.4 ± 0.3+
6.2+ (0.1 -
39.7)
8
Values represent means ± standard errors.
EC50: levels producing half-maximum responses; values represent means
with 95% confidence intervals.
N = number of animals.
Pb: 500 ppm lead acetate during pregnancy and lactation. Treatment: a
group of 22- and 70-day-old offspring who were or were not exposed
to Pb in the perinatal period received DMSA or combination therapy
for 30 additional days. The combination therapy included L-arginine
(1.0%, in drinking water) + enalapril (5 mg/day/rat, in drinking
water) + DMSA (60 mg/kg/day). DMSA was orally administered at 60
mg/kg by gastric gavage two times a day (30 mg/kg per dose) for 5
days a week. Aged matched-controls received tap water
p < 0.05 compared with the respective control group;
p < 0.05 compared with the respective aorta with endothelium.
Removal of the endothelium caused a leftward shift of the noradrenaline response
curve, which was similar in aortas from both controls and Pb-exposed rats,
irrespective of treatment received or not (Tables 3 and 4). This
procedure also resulted in an increase in the maximum response to noradrenaline
in aortas from different experimental groups (Tables 3 and 4). After
removal of the endothelium, the maximum response to noradrenaline was similar in
the aortas from all experimental groups (Tables
3 and 4).
With regard to intact aortas, no change was observed in the maximum response to
noradrenaline in 23-day-old pups exposed to Pb in the perinatal period (Table 3). In contrast, an increase in the
reactivity of intact aortas was observed in 52-, 70-, and 100-day-old rats
exposed to Pb in the perinatal period (Table
3). Independent of the protocol, the noradrenaline sensitivity of
aortas with intact endothelium did not differ (Tables 3 and 4).
The different treatments did not alter the reactivity of intact aortas from
nonintoxicated rats to noradrenaline (Tables
3 and 4). However,
L-arginine, DMSA, enalapril, and combination therapy were effective in
decreasing the Pb-induced increase in maximum aortic response to levels similar
to those in the respective controls (Tables
3 and 4).
Discussion
Public health authorities use high levels to define blood Pb levels of concern in
nonpregnant women, with 40 µg/dL being the adult reference value in many
countries.
We must recognize that a significant proportion of nonpregnant women with blood Pb
levels ≥ 40 µg/dL can become pregnant and potentially expose their infants to the
risk of adverse health effects caused by Pb21. Maternal and fetal blood Pb levels are nearly identical because Pb
crosses the placenta unencumbered. This has provoked a concern about increased blood
Pb levels among all females of childbearing age because a great proportion of
pregnancies are unplanned. Finally, pregnant women without symptoms frequently
remain in contact with the source of exposure during pregnancy and lactation,
particularly in developing countries.
The severity of effects and the extent to which the cardiovascular system is affected
by Pb appear to be influenced most directly by Pb levels, duration of Pb exposure,
and other factors such as the route of exposure and individual life phase22,23. In the present work, we investigated
cardiovascular alterations in rats exposed to Pb in utero and
during lactation that were born to females with blood Pb levels of approximately 50
µg/dL. The Pb exposure regimen had no effect on the weight of the females and the
pups at birth, at weaning, and during postnatal life or on the number of pups per
litter. All animals appeared healthy, and none showed signs of toxicity.
However, the Pb exposure protocol resulted in an increase in systolic blood pressure
in association with changes in vascular reactivity. The sustained increase in blood
pressure observed in weaned, young and adult rats perinatally exposed to Pb confirms
the results of previous reports that showed a positive association between blood Pb
levels and arterial hypertension23,24.
Investigation of the manner in which Pb affects vascular endothelial and smooth
muscle cells was the goal of the present study. Changes in the balance of
endothelial contracting and relaxing factors contribute to arterial hypertension
associated with Pb poisoning. A decrease in NO, which is a vasodilator component,
and an increase in endothelin-3 and natriuretic hormone, which are vasoconstrictor
components, have been reported to be responsible for arterial hypertension in rats
exposed to low levels of Pb8,25-27. Our findings corroborate these reports
because arterial hypertension induced by perinatal Pb exposure was shown to be
associated with an increase in aortic reactivity to noradrenaline. Moreover, this
hyperreactivity was a consequence of endothelial cell dysfunction because removal of
the endothelium abolished this effect.
Another interesting observation was the time-dependent expression of perinatal Pb
exposure-induced changes in vascular reactivity in postnatal life. Fifty-two-, 70-,
and 100-day-old, but not 23-day-old, rats exhibited these changes. It is likely
that, at this age, the hypertensive state induced by perinatal Pb exposure was due
to the presence of circulating factor(s) and hemodynamic changes.
Vascular smooth muscle alterations in Pb-induced hypertension have also been reported
in the literature and were shown to be associated with an increase in intracellular
calcium9,22, an interaction with protein Kinase C9, the inhibition of
Na+/K+-ATPase)28,29, and an inhibitory or stimulatory effect
on various blood pressure-related humoral factors8. However, no smooth muscle changes were observed in aortas from young
or adult rats perinatally exposed to Pb. This controversy could be due to
differences in the Pb exposure protocols related to doses and/or duration of
exposure.
Finally, other reported mechanisms by which Pb could contribute to the development of
arterial hypertension include an increase in the activity of angiotensin-converting
enzyme and an increase in the levels of plasma renin, angiotensin II, aldosterone,
and kininases1.
The ongoing and widespread problem of Pb intoxication is treated by first isolating
the individual from the Pb-contaminated environment, followed by administering a
Pb-chelating agent. However, a new trend in toxic metal therapy has recently
emerged, where combination therapy is used instead of monotherapy with chelating
agents13,14,26,30. Therefore, amino acid supplementation
during chelation therapy has been found to be beneficial in increasing metal
mobilization and facilitating recovery in the presence of several altered
physiological variables24,30.
DMSA is a water-soluble compound that forms a strong complex with Pb2+ in
the blood, which is subsequently secreted via the kidney31. Sulfur-containing amino acids such as methionine and
cysteine and metabolically related amino acids increase the bioavailability of
glutathione, which is useful in chelating Pb. This counteracts the toxic effects of
the metal, potentially making these amino acids useful for supportive therapy32,33. Moreover, in metalloregulatory proteins,
metals are often conveniently located at binding sites and are bound to cysteine
residues. Several lines of evidence indicate that cysteine-rich metal-binding
proteins as well as redox-sensitive metal clusters of metalloproteins are natural
sensors of bioradicals such as NO34. In fact,
Misra et al35 showed that NO mediates cadmium
release from metallothionein. Therefore, an increase in NO levels by L-arginine
treatment may displace Pb from its cellular binding sites, as previously reported by
Malvezzi et al24.
Corroborating previous data from our laboratory24, the Pb burden in the body was significantly decreased simply by
eliminating the Pb source, although these levels have not returned to the values
observed in rats not exposed to Pb. However, this procedure was not an effective way
to resolve the changes in vascular reactivity and blood pressure induced by
perinatal Pb exposure. On the basis of these reults, we evaluated the therapeutic
effects of DMSA, L-arginine, and enalapril, either alone or in combination, on both
Pb mobilization and cardiovascular adverse effects of perinatal Pb intoxication.
Body Pb mobilization
Independent of age, DMSA, enalapril and combination therapy, but not L-arginine,
were more effective than the cessation of Pb administration in decreasing blood
Pb levels. These data confirm previous reports from our laboratory demonstrating
that L-arginine treatment is ineffective in decreasing blood Pb levels24. The mobilization of Pb from tissues can
provoke an undesirable redistribution. This may explain the maintenance of high
blood Pb levels after L-arginine treatment, which was shown to be capable of
mobilizing Pb from tissues such as the femur, liver, and kidney24.
Enalapril treatment was also capable of decreasing blood Pb levels to those
observed in nonintoxicated rats. Perhaps this finding can be explained by an
increase in Pb excretion, which results from the usual increase in the
glomerular filtration rate induced by angiotensin-converting enzyme inhibitors
under conditions of low glomerular filtration, similar to that observed in cases
of Pb poisoning36. In fact, Pb also
affects kidney function; the glomerular filtration rate appears to be affected
by the lowest blood Pb levels. A decreased glomerular filtration rate has been
consistently observed in populations with a mean blood Pb level of <20 μg/dL.
Moreover, the increase in blood pressure and decrease in the glomerular
filtration rate are closely related and probably share synergistic effects21.
Blood pressure
Independent of age, all treatments inhibited the increase in blood pressure
induced by perinatal Pb exposure.
However, in contrast to other therapies, DMSA alone was not effective in
completely normalizing the blood pressure of adult rats perinatally exposed to
Pb. This result corroborates previous data from our laboratory showing that
30-day DMSA treatment is unable to completely reverse the sustained increase in
systolic blood pressure observed in rats exposed to Pb during adult life24. Contrasting reports from the literature
have shown that DMSA treatment is capable of abolishing Pb-induced
hypertension16,37. This discrepancy may be due to
differences in the dosing protocols and treatment duration because these
parameters are important for reversing Pb-induced hypertension38. Another possibility can involve
differences in the mechanisms underlying the maintenance of Pb-induced
hypertension that are related to different periods of animal development. This
hypothesis is based on the fact that treatment with DMSA is completely effective
in restoring Pb-induced hypertension in young, but not adult, rats.
L-arginine showed an increased latency in the expression of beneficial effects on
blood pressure in young rats compared with that in adult rats. The opposite was
observed during treatment with enalapril. Moreover, L-arginine treatment was
shown to be more effective than DMSA treatment in the reversal of blood pressure
in adult, but not young, rats. These observations also support the hypothesis
that there are distinct mechanisms for the maintenance of Pb-induced
hypertension during different periods of life.
Finally, combination therapy induced an earlier restoration of blood pressure in
Pb-exposed young rats compared with the monotherapies, except for enalapril
monotherapy. One possible explanation would be the additional effects of
L-arginine, which is an NO precursor, DMSA, which is a chelating agent and
scavenger of ROS, and enalapril, which is a renin-angiotensin system inhibitor,
on blood pressure. Because the heart rate is higher in young animals than in
adult animals, and because the presence of enalapril increases glomerular
filtration, one can expect a higher excretion of Pb in young rats. This fact can
explain the similar efficacy between enalapril and combined therapy in restoring
the blood pressure of young rats exposed to Pb and the higher efficacy of
combination therapy in adult rats.
Vascular reactivity
Independent of postnatal age, all treatments were able to resolve the changes in
vascular reactivity induced by perinatal Pb exposure. We speculate that
Pb-induced changes in vascular reactivity were caused by decreased NO and/or by
a ROS and that the provision of additional NO through administration of the
substrate L-arginine could act as an ROS scavenger and/or directly as a
vasodilator, thus resolving the vascular changes. In addition to its chelating
action, DMSA may also act as a scavenger of ROS that may contribute to the
improvement in changes in vascular reactivity induced by Pb exposure16,39. Some other reported mechanisms by
which Pb can contribute to the development of arterial hypertension are an
increase in the angiotensin-converting enzyme activity and an increase in the
plasma levels of renin, angiotensin II, aldosterone, and kininases1. In the present study, enalapril
normalized the functional changes in vascular reactivity induced by perinatal Pb
exposure. This result corroborates with those of previous studies showing that
strategies interrupting the renin-angiotensin system also decrease
cardiovascular alterations in a variety of hypertensive states, including those
caused by Pb exposure36.
Most conventional chelators are compromised by side effects, particularly their
binding to essential metals, which decreases their efficacy. As a result, there
is no safe and effective treatment for Pb poisoning13,30. Therefore, combination therapy may
play a significant and important role in the abation of several toxic effects of
Pb compared with monotherapies, in addition to their impressive effects in terms
of blood pressure recovery. In this context, this study advances our
understanding of the cardiovascular effects of perinatal Pb exposure and can aid
in the development of a new therapeutic protocol for the treatment Pb-induced
hypertension.
Acknowledgements
We are grateful to Mr. Alaor Aparecido Almeida and CEATOX-IBB-UNESP for aid in the
determination of blood Pb levels and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo-FAPESP (process numbers: 03/06760-5 and 04/00640-0) and Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/PROAP for financial support.
Author contributions
Conception and design of the research, Acquisition of data, Analysis and
interpretation of the data, Statistical analysis and Writing of the manuscript:
Fresneda-Gaspar A, Cordellini S; Obtaining financing and Critical revision of
the manuscript for intellectual content: Cordellini S.
Sources of Funding
This study was funded by FAPESP and CAPES/PROAP.
Study Association
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Andréia Fresneda
Gaspar from UNESP.
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damage and the use of antioxidants in the pathology and treatment of lead
toxicityAltern Med Rev2006112114127Alterações cardiovasculares da exposição perinatal ao
chumbo em ratos jovens e adultos: papel da terapia combinadaGasparAndréia Fresneda12CordelliniSandra1Universidade Estadual PaulistaInstituto de BiociênciasDepartamento de FarmacologiaBotucatuSPBrasilDepartamento de Farmacologia, Instituto de
Biociências - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP -
BrasilFaculdade da Alta PaulistaTupãSPBrasilFaculdade da Alta Paulista (FAP), Tupã, SP -
BrasilCorrespondência: Sandra Cordellini • Rua João Carmelo 145, Jardim
Paraíso. CEP 18610-290, Botucatu, SP - Brasil. Email:
cordelli@ibb.unesp.br
Potencial conflito de interesse
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
Introdução:
A terapia combinada parece desempenhar papel significativo em reduzir os
efeitos cardiovasculares deletérios da exposição ao chumbo (Pb).
Objetivo:
Para investigar esta possibilidade, ratas Wistar receberam Pb (500 ppm na
água de beber) ou água durante a prenhez e a lactação. Ratos com 22 e 70
dias, expostos perinatalmente ao Pb ou não, receberam DMSA, L- arginina,
enalapril e a combinação destes por 30 dias adicionais.
Métodos:
Curvas concentração-efeito à noradrenalina foram obtidas em aortas intactas e
desnudas, de ratos com 23, 52, 70 e 100 dias expostos ou não ao Pb, tratados
ou não.
Resultados:
A pressão arterial sistólica caudal (mmHg) foi avaliada e mostrou-se
aumentada em ratos expostos ao Pb [23, 52, 70 e 100 dias, respectivamente:
controle 107,1±1,8, 118,8±2,1, 126,1±1,1, 120,5±2,2; Pb 117,8±3,9*,
135,2±1,3*, 139,6±1,6* e 131,7± 2,8*]. Observou-se aumento de reatividade à
noradrenalina em aorta intacta, mas não desnudada, de ratos com 52, 70 e 100
dias expostos ao Pb [resposta máxima (g de tensão) 52 dias: Pb 3,43±0,16*,
controle 2,38±0,33; 70 dias: Pb 4,32±0,18*, controle 3,37±0,13; 100 dias: Pb
4,21±0,23*, controle 3,22±0,21]. (*) p < 0,05 em relação ao respectivo
controle.
Conclusões:
Todos os tratamentos restauraram as alterações de reatividade à noradrenalina
em aortas de ratos expostos perinatalmente ao Pb. Exceto pelo enalapril em
ratos jovens, a terapia combinada restaurou mais precocemente a pressão
arterial de ratos expostos ao Pb em relação aos tratamentos isolados. Estes
resultados representam uma nova abordagem no desenvolvimento de protocolos
terapêuticos no tratamento da hipertensão induzida pela exposição ao Pb.
Dados epidemiológicos têm mostrado que o chumbo (Pb) desempenha um papel
importante no desenvolvimento da hipertensão arterial em indivíduos
ocupacionalmente expostos, assim como na população em geral1.
A hipertensão arterial induzida pela exposição ao Pb, durante o período
pós-natal, é caracterizada por um aumento na reatividade vascular às
catecolaminas2, uma diminuição do
número de receptores beta-adrenérgicos3,
e uma redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina e nitroprussiato de
sódio4. Por outro lado, Purdy e
cols.5 relataram que não houve
alterações na reatividade da aorta torácica associada à hipertensão induzida por
Pb, tanto utilizando os vasoconstritores noradrenalina e fenilefrina, como os
vasodilatadores acetilcolina e nitroprussiato de sódio.
Apesar dos grandes avanços científicos relacionados às alterações neuroquímicas e
comportamentais induzidas pela exposição perinatal ao Pb6,7, os efeitos cardiovasculares desta
exposição ainda não foram completamente esclarecidos.
Estudos têm focado principalmente nas interações do Pb com: 1) processos
regulatórios envolvendo Ca+2, GMP cíclico, e proteína quinase C1,8,9, 2) renina-angiotensina-aldosterona,
calicreína-cinina, e outros sistemas autacóides (e.g., endotelina) e os sistemas
transducionais (e.g., óxido nítrico-ON)1,8,10, 3) fatores relacionados à
proliferação do endotélio e do músculo liso11,12 e 4) fatores relacionados ao estresse
oxidativo13.
Apesar do grande avanço científico, ainda estamos longe de desenvolver um
tratamento eficaz para a toxicidade causada pela exposição a metais pesados. A
terapia de quelação é o tratamento mais indicado para diminuir os efeitos
tóxicos de metais, embora a utilização de quelantes esteja largamente restrita a
casos de envenenamento agudo14,15. Vários suplementos, tais como
vitaminas, aminoácidos contendo enxofre, antioxidantes e minerais essenciais
também são utilizados no tratamento da toxicidade por metais15. Além disso, a terapia combinada é uma
abordagem mais recente e mais eficaz utilizada para o tratamento de casos de
envenenamento por metais14,15. Considerando a pouca evidência
experimental disponível, existe a necessidade de uma investigação mais
aprofundada nesta área.
Com base em estudos anteriores, nós investigamos a terapia combinada no
tratamento da toxicidade cardiovascular induzida por Pb. Primeiramente, os
efeitos da exposição ao Pb ,durante a prenhez e lactação, sobre a pressão
arterial e reatividade vascular da aorta torácica foram investigados em ratos
jovens e adultos, com foco na células endoteliais e musculares lisas. Em
seguida, avaliamos o potencial terapêutico do ácido dimercaptosuccínico (DMSA,
agente quelante e sequestrante de espécies reativas de oxigênio-EROs)16,17, da L-arginina (precursor de ON)18, e do enalapril (inibidor da enzima
conversora de angiotensina), seja isoladamente ou em combinação, sobre os
efeitos cardiovasculares adversos da exposição perinatal de ratos jovens e
adultos ao Pb.
MétodosAnimais e exposição ao chumbo
Ratos Wistar adultos foram obtidos do biotério da Universidade de São Paulo e
utilizados como geração parental. Os animais foram acasalados aos 90 dias de
idade (duas fêmeas e um macho por gaiola). No primeiro dia de prenhez
(determinado pela presença de esperma nos esfregaços vaginais), as fêmeas
grávidas foram divididas em 2 grupos: um grupo não exposto ao Pb, e outro
exposto ao Pb, e os grupos foram separados. As fêmeas grávidas receberam
água contendo 500 ppm de Pb (na forma de acetato de chumbo), ou apenas água
corrente. Um grupo de animais recebeu acetato de sódio para equalizar a
exposição do grupo experimental ao acetato. O nível de exposição ao Pb foi
escolhido com base em trabalhos anteriores6,7,19. Para impedir a precipitação do
Pb, 0,5 mL de ácido acético glacial foi adicionado às soluções de acetato de
chumbo e acetato de sódio para a preparação de um volume final de 1000 mL de
cada solução. O grupo experimental foi exposto ao Pb durante todo a prenhez
e lactação (Figura 1). O número de
filhotes por ninhada foi registrado e reduzido para 8 filhotes. Sempre que
possível, apenas ratos machos foram mantidos nas ninhadas, e fêmeas foram
mantidas apenas para equalizar o tamanho das ninhadas. Os filhotes foram
desmamados aos 22 dias de idade através da ingestão de água corrente e
avaliados aos 23 e 70 dias de idade (Figura
1). Os grupos controles pareados por idade receberam acetato de
sódio durante os mesmos períodos de exposição ao Pb. Os pesos corporais
maternos foram medidos no primeiro dia de prenhez, no dia anterior ao parto,
logo após o parto, e ao desmame dos filhotes. O peso dos filhotes foi
registrado logo após o nascimento e semanalmente até 100 dias de idade.
Delineamento experimental
A iluminação do biotério foi mantida em ciclos de 12 horas e a temperatura
mantida a 22 ± 1 °C. Os animais foram alimentados com ração. Os experimentos
com animais foram realizados de acordo com os princípios e diretrizes do
Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CEEA), conforme
processo nº 25/05.
Determinação da pressão arterial
A partir dos 22 dias de vida, a pressão arterial sistólica foi determinada
semanalmente em ratos conscientes usando o método de pletismografia de cauda
(Narco Bio-Systems, Inc., Houston, Texas, EUA). Os ratos foram pré-aquecidos
por aproximadamente 10 minutos e confinados para a medição da pressão
arterial. Três determinações consecutivas foram realizadas, com
aproximadamente 1 minuto de intervalo entre elas, obtendo-se a média das
três determinações.
Determinação da concentração sanguínea de Pb
O sangue total foi coletado do coração de fêmeas anestesiadas no período de
desmame e de filhotes com 23, 52, 70, e 100 dias de idade anestesiados com
uretano (1,25 mg/kg de peso).
O sangue foi preparado para análise de Pb por procedimento de dissolução por
microondas utilizando um sistema de digestão por microondas, modelo DGT-100
plus (Provecto, Brasil). Ácido nítrico foi adicionado aos tubos de digestão
contendo 1,0 mL de sangue.
A concentração de chumbo no sangue total foi determinada utilizando um
espectrofotômetro de absorção atômica, modelo GBC AA 932 (EAA-chama)20. A recuperação do chumbo adicionado
às amostras controle foi consistentemente superior a 96%. Um método
adicional padrão foi utilizado para a determinação do teor de chumbo no
intuito de eliminar possível interferência de matriz. A quantidade de chumbo
no sangue total foi expressa em µg/dL, e o limite máximo de detecção foi de
5 µg/dL.
Tratamento
Um grupo de ratos com 22 e 70 dias de idade, expostos ou não ao Pb durante o
período perinatal, receberam DMSA, L-arginina, enalapril, ou a combinação
destes compostos durante 30 dias adicionais (Figura 1). Quando DMSA foi utilizado, uma dose de 60 mg/kg foi
fornecida, via gavagem gástrica, 2 vezes ao dia na dose de 30 mg/kg, 5 dias
por semana. L-arginina a 1,0% foi fornecida na água potável ad
libitum. Enalapril foi fornecido na água potável na dose de
aproximadamente 5 mg/dia/animal. Os controles pareados por idade receberam
água corrente.
Protocolos experimentais
Imediatamente após a coleta de sangue, a aorta torácica foi removida, seguido
da retirada de tecido adiposo e conjuntivo. Dois anéis transversais, cada um
com aproximadamente 4 mm de comprimento, foram cortados e preparados no
comprimento ideal para a determinação da tensão isométrica. Um anel serviu
como controle, ao passo que o endotélio foi removido mecanicamente do outro
anel, esfregando suavemente a superfície luminal das aortas intactas e
lavadas. Os tecidos foram imersos em 7,0 mL de uma solução de
Krebs-Henseleit, com a seguinte composição: 113,0 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl,
2,5 mM de CaCl2, 25,0 mM de NaHCO3, 1,1 mM de
MgSO4, 1,2 mM de KH2PO4, 0,11 mM de
ácido ascórbico e 11,1 mM de glicose. A solução de imersão foi mantida a 37
°C e saturada com uma mistura de 95% de O2 e 5% de
CO2. As preparações foram equilibradas durante pelo menos 1 hora
sob uma tensão de repouso de 1,5 g, que é a tensão ideal para induzir a
contração máxima. A tensão foi registrada em um transdutor de força, modelo
Myograph F-60 (Narco Bio Systems Inc., Houston, Texas, EUA), conectado a um
fisiógrafo. As aortas intactas e desnudas dos animais expostos ou não ao Pb
foram avaliadas em paralelo.
As curvas cumulativas de concentração-efeito foram construídas a partir da
resposta da aorta à noradrenalina. No final das curvas, acetilcolina
(10-6 M) e nitroprussiato de sódio (10-4 M) foram
utilizados para testar a integridade do endotélio e do músculo liso,
respectivamente.
Reagentes
Os seguintes reagentes foram utilizados nos experimentos: brometo de
acetilcolina, DMSA, maleato de enalapril, L-arginina, acetato de chumbo,
bitartarato de noradrenalina, nitroprussiato de sódio e uretano (todos
obtidos da Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA). Todos os reagentes
foram dissolvidos em solução de Krebs-Henseleit, e as concentrações foram
expressas em molaridade. O acetato de chumbo e o acetato de sódio foram
dissolvidos em água corrente acidificada conforme descrito acima. L-arginina
e enalapril foram dissolvidos em água corrente. A solução de DMSA foi
preparada em NaHCO3 a 5% no momento da realização dos
ensaios.
Análise dos dados e testes estatísticos
A prole foi considerada a unidade experimental em todas as análises
efetuadas. A concentração do agente vasoativo que produziu uma resposta
correspondente a 50% da resposta máxima (CE50) foi calculada em
cada experimento. Os valores de CE50 para noradrenalina estão
representados como médias, com um intervalo de confiança de 95%. As
respostas máximas para noradrenalina são apresentados como média ± erro
padrão. A pressão arterial, os valores de CE50 e as respostas
máximas foram comparados utilizando a análise de variância com dois fatores
utilizando o programa SigmaStat 3.2. A exposição ao Pb e os tratamentos com
as drogas foram considerados variáveis na análise. Um valor de p < 0,05
foi considerado significativo. O teste de comparações múltiplas de Tukey foi
utilizado para testar diferenças entre as médias. Os demais parâmetros
(peso, número de filhotes, e quantificação de Pb) são apresentados como
média ± erro padrão, e foram comparados pelo teste de Mann-Whitney
utilizando o programa InStat 4.0.
ResultadosPeso corporal, número de filhotes, concentração sanguínea de Pb e pressão
arterial
A exposição ao Pb não afetou o peso corporal das fêmeas e da prole (Tabela 1), nem o número de filhotes
por ninhada (controle: 11,3 ± 0,4, Pb: 10,5 ± 0,5, p > 0,05; número de
ninhadas por grupo: 10-20).
Peso corporal de fêmeas expostas ou não ao chumbo durante a
prenhez e lactação e da prole do sexo masculino tratados ou não com
DMSA, L-arginina, enalapril, ou terapia combinada
Peso corporal (g)
Animais
Grupos
Prenhez
Lactação
Idade pós-desmame
0 dia
21 dias
1 dia
21 dias
52 dias
70 dias
100 dias
Fêmeas
Controle (n = 20)
272,2 ± 6,2
378,8 ± 9,0
304,6 ± 7,0
276,9 ± 5,6
-
-
-
Pb (n = 20)
269,0 ± 4,9
360,3 ± 8,1
293,1 ± 5,0
275,44 ± 5,3
-
-
-
Prole do sexo masculino
Controle (n = 20)
-
-
6,2 ± 0,2
39,1 ± 0,5
208,3 ± 0,2
323,1 ± 5,3
357,0 ± 2,7
Pb (n = 20)
-
-
5,8 ± 1,7
40,0 ± 1,2
198,6 ± 4,1
327,9 ± 8,6
357,1 ± 3,2
Pb/DMSA (n = 20)
-
-
-
41,2 ± 2,2
195,0 ± 2,2
326,8 ± 6,1
365,7 ± 1,7
Pb/L-arginina (n = 15)
-
-
-
43,0 ± 2,3
205,5 ± 2,3
325,4 ± 2,5
369,9 ± 2,2
Pb/enalapril (n = 15)
-
-
-
42,4 ± 1,8
194,8 ± 4,2
301,7 ± 2,4
351,1 ± 1,8
Terapia combinada (n = 20)
-
-
-
43,0 ± 5,5
206,0 ± 8,5
314,7 ± 2,6
360,6 ± 1,2
Os valores representam médias ± erro padrão. Pb: 500 ppm de
acetato de chumbo durante a prenhez e lactação. Tratamento: um
grupo de animais de 22 e 70 dias de idade, exposto ou não ao Pb
durante a vida perinatal, recebeu DMSA, L-arginina, enalapril,
ou a combinação desses compostos por 30 dias adicionais. Quando
administrado, DMSA na dose de 60 mg/kg foi fornecido, via
gavagem gástrica, 2 vezes ao dia (30 mg/kg) durante 5 dias por
semana. L-arginina a 1,0% foi fornecida ad libitum em água
potável. Enalapril foi fornecido em água potável na dose de 5
mg/dia/animal. Os grupos controle pareados por idade receberam
água corrente. N = número de animais por grupo.
Os níveis sanguíneos de Pb nas fêmeas e nos filhotes com 23, 52, 70, e 100
dias de idade foram significativamente maiores comparados com os respectivos
controles (Tabela 2). Após a
interrupção do tratamento com Pb, os níveis sanguíneos de Pb nos animais
expostos diminuíram, mas permaneceram mais altos do que os níveis observados
no grupo controle (Tabela 2). Após a
utilização dos diferentes protocolos de tratamento, observamos a diminuição
significante dos níveis sanguíneos de Pb nos animais com 52 e 100 dias de
idade (Tabela 2). Esta diminuição
alcançou valores semelhantes àqueles observados nos grupos controle da mesma
idade, exceto para o tratamento com L-arginina, onde estes níveis
permaneceram altos em relação ao controle (Tabela 2).
Concentração sanguínea de chumbo em fêmeas expostas ou não ao
chumbo durante a prenhez e lactação e da prole do sexo masculino
tratados ou não com DMSA, L-arginina, enalapril, ou terapia
combinada
Concentração sanguínea de chumbo (μg/dl)
Grupos
Fêmeas
Idade pós-natal da prole
23 dias
52 dias
70 dias
100 dias
Controle (n = 5)
< 5,0
< 5,0
< 5,0
< 5,0
< 5,0
Pb (n = 6)
53,39 ± 5,88*
35,61 ± 7,43*
-
-
-
Pb/água (n = 6)
-
-
19,98 ± 6,31*
13,15 ± 0,97*+
11,17 ± 2,11*+
Pb/DMSA (n = 5)
-
-
< 5,0$
-
< 5,0$
Pb/L-arginina (n = 6)
-
-
10,65 ± 2,12*
-
6,55 ± 3,29*
Pb/enalapril (n = 5)
-
-
< 5,0$
-
< 5,0$
Terapia combinada (n = 5)
-
-
< 5,0$
-
< 5,0$
Os valores representam médias ± erro padrão. Pb: 500 ppm de
acetato de chumbo durante a prenhez e lactação. Tratamento: um
grupo de animais de 22 e 70 dias de idade, exposto ou não ao Pb
durante a vida perinatal, recebeu DMSA, L-arginina, enalapril,
ou a combinação desses compostos por 30 dias adicionais. Quando
administrado, DMSA na dose de 60 mg/kg foi fornecido, via
gavagem gástrica, 2 vezes ao dia (30 mg/kg) durante 5 dias por
semana. L-arginina a 1,0% foi fornecida ad libitum em água
potável. Enalapril foi fornecido em água potável na dose de 5
mg/dia/animal. Os controles pareados por idade receberam água
corrente.
p < 0,05 em relação aos respectivos grupos controle.
p < 0,05 em relação aos ratos de 23 dias de idade expostos ao
Pb.
p < 0,05 em relação aos respectivos grupos expostos ao Pb.
N = número de animais por grupo.
A pressão arterial sistólica não foi alterada pela exposição ao acetato de
sódio em comparação com os animais que receberam água corrente (dados não
apresentados), mas apresentou aumento gradual durante o desenvolvimento
pós-natal (Figuras 2 e 3). Além disso, os valores observados em
ratos expostos ao Pb foram significativamente maiores quando comparados ao
grupo controle (Figuras 2 e 3).
Pressão arterial em ratos com 52 dias de idade expostos ou não ao
chumbo durante a prenhez e lactação, tratados ou não com DMSA,
L-arginina, enalapril, ou terapia combinada. Tratamento: um grupo de
animais com 22 dias de idade recebeu DMSA, L-arginina, enalapril, ou
a combinação desses compostos por 30 dias adicionais. Quando
administrada, DMSA foi fornecida na dose de 60 mg/kg, via gavagem
gástrica, 2 vezes ao dia (30 mg/kg) durante 5 dias por semana.
L-arginina a 1,0% foi fornecida ad libitum em água potável.
Enalapril foi fornecido em água potável na dose de 5 mg/dia/animal.
Os controles pareados por idade receberam água corrente. Os valores
representam média ± erro padrão. <sup>*</sup>p < 0,05 em relação
ao grupo controle; <sup>#</sup>p < 0,05 em relação ao grupo
exposto ao Pb; N = número de animais por grupo.
Pressão arterial em ratos com 100 dias de idade expostos ou não
ao chumbo durante a prenhez e lactação, tratados ou não com DMSA,
L-arginina, enalapril, ou terapia combinada. Tratamento: um grupo de
animais com 70 dias de idade recebeu DMSA, L-arginina, enalapril, ou
a combinação desses compostos por 30 dias adicionais. Quando
administrada, DMSA na dose de 60 mg/kg foi fornecida, via gavagem
gástrica, 2 vezes ao dia (30 mg/kg) durante 5 dias por semana.
L-arginina a 1,0% foi fornecida ad libitum em água potável.
Enalapril foi fornecido em água potável na dose de 5 mg/dia/animal.
Os controles pareados por idade receberam água corrente. Os valores
representam média ± erro padrão. <sup>*</sup>p < 0,05 em relação
ao controle; <sup>#</sup>p < 0,05 em relação ao grupo exposto ao
Pb; N = número de animais por grupo.
Todos os tratamentos resultaram na diminuição da pressão arterial de ratos
jovens expostos ao Pb para valores muito próximos aos de animais não
expostos. Esta diminuição na pressão arterial aconteceu aos 49, 35, 28, e 28
dias de idade utilizando L-arginina, DMSA, enalapril e terapia combinada,
respectivamente (Figura 2). Em relação
aos ratos adultos expostos ao Pb, foi observada diminuição semelhante da
pressão arterial utilizando L-arginina, enalapril, e a terapia de combinação
aos 84, 84, e 77 dias de idade, respectivamente (Figura 3). Embora o tratamento com DMSA tenha diminuído
a pressão sanguínea de ratos adultos expostos ao Pb, este valor foi
semelhante ao observado em animais não tratados com DMSA, tanto os expostos
como os não expostos ao Pb (Figura
3).
Reatividade vascular
A reatividade vascular de aortas torácicas intactas e desnudas não foi
alterada pela exposição dos animais ao acetato de sódio, em comparação com
as aortas de animais que receberam água corrente (dados não apresentados). A
gavagem gástrica não causou qualquer alteração na reatividade vascular da
aorta (dados não apresentados). A exposição ao Pb e os tratamentos com as
drogas não alteraram a reatividade vascular de aortas desnudas à
noradrenalina (Tabelas 3 e 4).
Respostas máximas e valores de CE<sub>50</sub> para noradrenalina
obtidos em aortas torácicas com e sem endotélio isoladas de ratos,
expostos ou não ao chumbo durante a prenhez e lactação, e tratados
ou não com L-arginina ou enalapril
Ratos
Grupos
Aorta Com Endotélio
Aorta Sem Endotélio
1Resposta máxima (g de tensão)
2CE50 (x 10-8
M)
3N
1Resposta máxima (g de tensão)
2CE50 (x 10-9
M)
3N
Não tratados
23 dias
Controle
1,8 ± 0,1
1,3 (0,5 - 3,4)
6
2,6 ± 0,2+
1,4+ (0,3 -
6,4)
8
Pb
2,1 ± 0,2
1,5 (0,4 - 4,9)
6
3,0 ± 0,1+
1,1+ (0,1 -
7,5)
8
52 dias
Controle
2,4 ± 0,3
2,0 (0,4 - 10,8)
7
4,1 ± 0,4+
1,0+ (2,8 -
6,4)
8
Pb
3,4 ± 0,2*
11,0 (6,0 - 20,3)
6
4,5 ± 0,2+
1,0+ (0,3 -
4,2)
8
70 dias
Controle
3,4 ± 0,1
16,0 (7,1 - 35,4)
5
5,2 ± 0,4+
5,0+ (0,7 -
36,0)
7
Pb
4,3 ± 0,2*
4,8 (1,7 - 13,3)
6
5,0 ± 0,3+
1,3+ (0,4 -
4,2)
8
100 dias
Controle
3,2 ± 0,2
8,5 (4,6 - 15,6)
6
5,3 ± 0,3+
5,6+ (1,4 -
21,9)
8
Pb
4,2 ± 0,2*
4,3 (0,9 - 20,7)
6
5,2 ± 0,4+
3,8+ (0,7 -
19,7)
8
Tratados com L-arginina
52 dias
Controle
2,8 ± 0,1
3,3 (1,5 - 7,3)
5
4,5 ± 0,3+
1,6+ (0,1 -
29,0)
8
Pb
2,7 ± 0,1
10,0 (4,1 - 37,3)
6
4,3 ± 0,3+
8,5+ (1,0 -
27,5)
8
100 dias
Controle
3,3 ± 0,2
8,9 (5,5 -14,5)
8
4,8 ± 0,2+
9,2+ (3,2 -
26,3)
8
Pb
3,2 ± 0,4
8,6 (2,3 - 31,4)
12
4,9 ± 0,5+
0,9+ (0,2 -
7,3)
14
Tratados com Enalapril
52 dias
Controle
2,7 ± 0,4
3,0 (0,4 - 23,4)
12
4,2 ± 0,3+
0,4+ (0,1 -
8,7)
12
Pb
2,7 ± 0,2
6,15 (1,31 - 28,91)
7
4,2 ± 0,2+
6,2+ (1,0 -
38,0)
8
100 dias
Controle
3,1 ± 0,2
5,4 (1,0 -27,5)
8
5,0 ± 0,4+
4,1+ (0,6 -
25,9)
11
Pb
3,2 ± 0,1
9,4 (3,0 - 30,1)
5
5,6 ± 0,6+
1,2+ (0,2 -
19,3)
14
Valores representam médias ± erro padrão.
CE50: concentração capaz de produzir 50% da resposta
máxima e os valores representam as médias com intervalos de
confiança de 95%.
N = número de animais.
Pb: 500 ppm de acetato de chumbo durante a prenhez e lactação.
Tratamento: um grupo de ratos com 22 e 70 dias de idade exposto
ou não ao Pb durante o período perinatal recebeu L-arginina ou
enalapril durante 30 dias adicionais. L-arginina a 1,0% foi
fornecida ad libitum em água potável. Enalapril foi fornecido em
água potável na dose de 5 mg/dia/animal. Os controles pareados
por idade receberam água corrente.
p < 0,05 em relação ao respectivo grupo controle.
p < 0,05 em relação a respectiva aorta com endotélio.
Respostas máximas e valores de CE<sub>50</sub> para noradrenalina
obtidos em aortas com e sem endotélio isolados de ratos, expostos ou
não ao chumbo durante a prenhez e lactação, e tratadas ou não com
DMSA ou terapia combinada
Ratos
Grupos
Aorta Com Endotélio
Aorta Sem Endotélio
1Resposta máxima (g de tensão)
2CE50 (x 10-8
M)
3N
1Resposta máxima (g de tensão)
2CE50 (x 10-9
M)
3N
Não tratados
52 dias de idade
Controle
2,8 ± 0,4
9,0 (3,6 - 22,9)
8
4,1 ± 0,4+
12,8+ (1,3 -
93,3)
8
Pb
4,0 ± 0,4*
11,5 (5,3 - 25,1)
8
4,8 ± 0,2+
2,7+ (0,4 -
20,2)
6
100 dias de idade
Controle
2,7 ± 0,3
7,9 (2,2 - 28,0)
5
5,1 ± 0,4+
10,5+ (0,3 -
49,1)
7
Pb
4,1 ± 0,2*
15,4 (2,8 - 31,5)
5
5,4 ± 0,4+
15,2+ (0,4 -
69,6)
12
Tratados com DMSA
52 dias de idade
Control
2,8 ± 0,3
13,7 (5,7 - 32,7)
6
4,5 ± 0,3+
13,9+ (2,4 -
81,0)
7
Pb
2,7 ± 0,3
9,1 (3,8 - 21,8)
6
4,3 ± 0,4+
1,7+ (0,1 -
67,1)
12
100 dias de idade
Control
2,3 ± 0,2
18,1 (4,4 - 43,8)
6
4,6 ± 0,4+
35,1+ (3,6 -
141,2)
7
Pb
2,8 ± 0,2
27,6 (11,6 - 55,6)
6
4,3 ± 0,5+
11,8+ (0,1 -
151,7)
14
Terapia combinada
52 dias de idade
Control
3,1 ± 0,2
7,1 (3,7 - 13,5)
5
4,9 ± 0,3+
0,3+ (0,1 -
17,8)
6
Pb
2,4 ± 0,3
5,0 (2,8 - 9,1)
6
3,9 ± 0,6+
10,1+ (0,1-
23,3)
14
100 dias de idade
Control
3,2 ± 0,3
7,0 (2,2 -22,5)
7
4,8 ± 0,3+
4,7+ (1,2 -
18,0)
6
Pb
2,8 ± 0,2
9,7 (1,6 - 30,3)
6
4,4 ± 0,3+
6,2+ (0,1 -
39,7)
8
Valores são médias ± erro padrão.
CE50: concentração capaz de produzir 50% da resposta
máxima e os valores representam as médias com intervalos de
confiança de 95%.
N = número de animais.
Pb: 500 ppm de acetato de chumbo durante a prenhez e lactação.
Tratamento: um grupo de ratos com 22 e 70 dias de idade expostos
ou não ao Pb durante o período perinatal recebeu DMSA ou a
terapia combinada durante 30 dias adicionais. Terapia combinada:
L-arginina (1.0%, em água potável) + enalapril (5 mg/dia/animal,
em água potável) + DMSA (60 mg/kg/dia). DMSA foi fornecido via
gavagem gástrica 2 vezes ao dia (30 mg/kg). Os controles
pareados por idade receberam água corrente.
p < 0,05 em relação ao valores obtidos nos respectivos grupos
controles.
p < 0,05 em relação aos valores da respetiva aorta com
endotélio.
A remoção do endotélio causou um deslocamento da curva para a esquerda para a
noradrenalina, e este deslocamento foi semelhante em aortas de animais do
grupo controle e dos grupos expostos ao Pb (tratados e não tratados) (Tabelas 3 e 4). Este procedimento também resultou no aumento da
resposta máxima à noradrenalina em aortas de animais pertencentes aos
diferentes grupos experimentais (Tabelas
3 e 4). Após a remoção do
endotélio, a resposta máxima de aortas torácicas à noradrenalina foi
semelhante em todos os grupos experimentais (Tabelas 3 e 4).
No que diz respeito às aortas intactas, nenhuma alteração na resposta máxima
à noradrenalina foi observada em filhotes com 23 dias de idade expostos ao
Pb durante o período perinatal (Tabela
3). Em contrapartida, o aumento da reatividade da aorta intacta
foi observado em ratos aos 52, 70, e 100 dias de idade expostos ao Pb no
período perinatal (Tabela 3).
Independente do protocolo de tratamento, a reatividade à noradrenalina não
diferiu em aortas com endotélio (Tabelas
3 e 4).
Os diferentes tratamentos não alteraram a reatividade à noradrenalina de
aortas intactas de animais não expostos ao Pb (Tabelas 3 e 4).
No entanto, a L-arginina, DMSA, enalapril, e a terapia de combinação foram
eficazes em restabelecer o aumento induzido por Pb na resposta máxima da
aorta a valores semelhantes aos dos respectivos controles (Tabelas 3 e 4).
Discussão
Autoridades de saúde pública utilizam concentrações altas (40 µg/dL) para a
definição dos critérios de contaminação por Pb no sangue de mulheres não
grávidas, que é o valor de referência em adultos em muitos países.
Devemos reconhecer que uma fração significativa de mulheres não grávidas com
níveis sanguíneos de Pb ≥ 40 µg/dL poderá ficar grávida e potencialmente expor
seus filhos aos efeitos do Pb, adversos à saúde21. Os níveis sanguíneos maternos e fetais de Pb são quase idênticos
porque este metal é capaz de atravessar a placenta livremente. Isso tem gerado
preocupação com relação aos elevados níveis sanguíneos de Pb entre mulheres em
idade fértil, pois muitas gestações não são planejadas. Além disso, as mulheres
grávidas assintomáticas permanecem frequentemente em contato com a fonte de
exposição durante a prenhez e lactação, especialmente em países em
desenvolvimento.
A gravidade dos efeitos e o grau em que o sistema cardiovascular é afetado por Pb
parecem ser influenciados mais diretamente pela concentração e duração da
exposição ao Pb e por outros fatores, incluindo a via de exposição e a fase de
vida de cada indivíduo22,23. No presente estudo, investigamos as
alterações cardiovasculares em filhotes durante o período de gestação e
lactação, provenientes de fêmeas com níveis sanguíneos de Pb em torno de 50
µg/dL. O regime de exposição ao Pb não teve nenhum efeito sobre o peso das
fêmeas, ou sobre o peso dos filhotes ao nascimento, no desmame, no período
pós-natal, ou no número de filhotes por ninhada. Todos os animais pareciam
saudáveis e nenhum deles mostrou sinais de toxicidade.
No entanto, os diferentes protocolos de exposição ao Pb resultaram no aumento da
pressão arterial sistólica associada a alterações na reatividade vascular. O
aumento contínuo da pressão arterial em filhotes desmamados, ratos jovens, e
adultos com exposição perinatal ao Pb confirmaram os resultados de estudos
anteriores que demostraram uma correlação positiva entre os níveis sanguíneos de
Pb e hipertensão arterial23,24.
No presente estudo, objetivamos investigar os efeitos do Pb sobre as células
endoteliais vasculares e células musculares lisas. Alterações no equilíbrio
entre os fatores de contração e de relaxamento derivados do endotélio contribuem
para a hipertensão arterial associada ao saturnismo. A diminuição dos níveis de
um componente vasodilatador (ON) e o aumento dos níveis de componentes
vasoconstritores (endotelina-3 e o hormônio natriurético) já foram reportados
como sendo responsáveis pela hipertensão arterial em ratos expostos a baixas
concentrações de chumbo8,25-27. Sendo assim, nossos resultados
corroboram estes estudos, pois observamos que a hipertensão arterial induzida
pela exposição perinatal ao Pb está associada a um aumento na reatividade
vascular da aorta à noradrenalina. Além disso, esta hiper-reatividade é
consequência de uma disfunção das células endoteliais, considerando que a
remoção do endotélio aboliu este efeito.
Outra observação interessante foi a ocorrência tempo-dependente, no período
pós-natal, de alterações na reatividade vascular induzidas pela exposição
perinatal ao Pb, visto que ratos com 52, 70, e 100 dias de idade, mas não
filhotes de 23 dias de idade, apresentaram estas alterações. Provavelmente, aos
23 dias de vida pós-natal, o estado hipertensivo induzido pela exposição
perinatal ao Pb seja devido à presença de fator(es) circulante(s) e à alterações
hemodinâmicas.
Alterações da musculatura lisa vascular na hipertensão induzida por Pb também têm
sido relatadas na literatura, e estão associadas com: 1) aumento das
concentrações de cálcio intracelular9,22, 2) interação com a proteína quinase
C9, 3) inibição da
Na+/K+-ATPase)28,29, e 4) efeito inibitório ou estimulador
sobre vários fatores humorais relacionados à pressão arterial8. No entanto, nenhuma alteração na
musculatura lisa foi observada em aortas torácicas de ratos jovens e adultos
expostos ao Pb no período perinatal. Esta controvérsia pode ser devida à
diferenças nos protocolos de exposição ao Pb relacionadas às doses e/ou ao tempo
de exposição.
Além disso, outros mecanismos pelos quais o Pb pode contribuir para o
desenvolvimento da hipertensão arterial envolvem o aumento da atividade da
enzima conversora de angiotensina e o aumento nos níveis plasmáticos de renina,
angiotensina II, aldosterona e quininases1.
O problema contínuo e generalizado de intoxicação por Pb é inicialmente tratado
pela remoção do indivíduo do ambiente contaminado e, posteriormente, pela
administração de um agente quelante de Pb. Uma nova tendência na terapia de
quelação de metais tóxicos surgiu recentemente, através da utilização de terapia
combinada, ao invés de monoterapia com agentes quelantes13,14,26,30. Desta forma, o suplemento de
aminoácidos durante a terapia de quelação contribui para aumentar a mobilidade
do metal e garantir o restabelecimento de algumas variáveis fisiológicas
alteradas24,30.
DMSA é um composto hidrossolúvel que forma um complexo forte com o
Pb+2 no sangue, e em seguida é secretado pelos rins31. Aminoácidos de enxofre, tais como a
metionina e cisteína, bem como outros aminoácidos metabolicamente relacionados,
podem aumentar a biodisponibilidade da glutationa, que possui atividade quelante
de Pb, neutralizando os seus efeitos tóxicos e podendo ser utilizados como
terapia de suporte32,33. Além disso, os metais presentes em
proteínas metaloreguladoras são frequentemente localizados em sítios de ligação
e ligados a resíduos de cisteína. Vários estudos indicam que as proteínas
ligantes de metais, ricas em cisteína, bem como centros metálicos de
metaloproteínas sensíveis à reações redox, são sensores naturais de radicais
biológicos, tais como ON34. Neste
sentido, Misra e cols.35 mostraram que o
ON medeia a liberação de cádmio presente na metalotioneína. Assim, um aumento
dos níveis de ON através do tratamento com L-arginina pode deslocar o Pb de seus
sítios de ligação celular, conforme anteriormente descrito por Malvezzi e
cols. 24.
Corroborando os dados anteriores de nosso laboratory24, a carga de Pb no corpo foi reduzida significativamente
através da remoção da fonte de Pb, embora estes níveis não tenham atingido os
valores observados em animais não expostos ao Pb. No entanto, este procedimento
foi ineficaz para restabelecer a reatividade vascular e as alterações na pressão
arterial induzidas pela exposição perinatal ao Pb. Levando em consideração estes
resultados, foi avaliado o potencial terapêutico de DMSA, L-arginina, e
enalapril, tanto isoladamente como em combinação, sobre a mobilização de Pb e
sobre os efeitos cardiovasculares adversos da intoxicação perinatal por Pb.
Mobilidade do chumbo
Independentemente da idade, DMSA, enalapril, e a terapia de combinação, mas
não a L-arginina, foram mais eficazes do que a interrupção da administração
de Pb na diminuição dos níveis sanguíneos de Pb. Estes dados corroboram
resultados anteriores de nosso laboratório que demonstraram que o tratamento
com L-arginina foi ineficaz na diminuição dos níveis sanguíneos de Pb24. A mobilização de Pb a partir de
tecidos pode provocar uma redistribuição indesejável do metal. Isto pode
explicar a manutenção de níveis elevados de Pb no sangue após o tratamento
com L-arginina, pois L-arginina é capaz de mobilizar Pb a partir de tecidos
como fémur, fígado, e rins24.
O tratamento com enalapril também foi capaz de reduzir os níveis sanguíneos
de Pb, e estes níveis atingiram valores semelhantes àqueles observados em
animais não intoxicados. Talvez este resultado possa ser explicado pelo
aumento na excreção de Pb como resultado do aumento da taxa de filtração
glomerular induzida por inibidores da enzima conversora de angiotensina, em
condições de baixa filtração glomerular, como observado em condições de
intoxicação por Pb36. De fato, Pb
também afeta as funções renais, e a taxa de filtração glomerular parece ser
afetada em baixos níveis sanguíneos de Pb. A diminuição da taxa de filtração
glomerular foi observada de forma sistemática em populações com uma média do
nível sanguíneo de Pb <20 μg/dL. Além disso, o aumento da pressão
arterial e o comprometimento da taxa de filtração glomerular estão
estreitamente relacionados e, provavelmente, possuem efeitos sinérgicos
entre si21.
Pressão sanguínea
Independente da idade, todos os tratamentos foram capazes de reduzir o
aumento da pressão arterial induzido pela exposição perinatal ao Pb.
No entanto , ao contrário das outras terapias, o DMSA isoladamente não foi
totalmente eficaz em normalizar a pressão sanguínea de ratos adultos com
exposição perinatal ao Pb. Esse resultado corrobora dados anteriores de
nosso laboratório que indicaram que o tratamento com DMSA durante 30 dias
foi incapaz de abolir completamente o aumento sustentado da pressão arterial
sistólica observado em ratos expostos ao Pb durante a vida adulta24. Em contrapartida, outros estudos
demonstraram que o tratamento com DMSA foi capaz de abolir a hipertensão
induzida por Pb16,37. Esta discrepância nos resultados
pode ser devida à diferenças nos protocolos experimentais relacionados às
doses e duração do tratamento, visto que estes parâmetros são importantes em
reverter a hipertensão induzida por Pb38. Outra possibilidade pode estar relacionada à diferenças nos
mecanismos de manutenção da hipertensão induzida por Pb em diferentes
períodos de desenvolvimento dos animais. Esta hipótese baseia-se no fato de
que o tratamento com DMSA foi eficaz no restabelecimento integral da
hipertensão induzida por Pb em ratos jovens, mas não em adultos.
A L-arginina causou um aumento no tempo de latência para a geração de um
efeito benéfico sobre a pressão arterial em ratos jovens quando comparados
com ratos adultos. O oposto foi observado para o tratamento com enalapril.
Além disso, o tratamento com L-arginina mostrou-se mais eficaz do que o
tratamento com DMSA em reverter a pressão arterial de adultos, mas não de
ratos jovens. Estas observações também suportam a hipótese da ocorrência de
mecanismos distintos atuando na manutenção da hipertensão induzida por Pb em
diferentes períodos de vida.
Além disso, a terapia combinada induziu um restabelecimento mais precoce da
pressão sanguínea de ratos expostos ao Pb em comparação com todos os
tratamentos realizados isoladamente, exceto para o tratamento com enalapril
em ratos jovens. Uma explicação possível seria os efeitos aditivos da
L-arginina, um precursor de ON, do DMSA, um agente quelante e sequestrante
de EROs, e do enalapril, um inibidor do sistema renina-angiotensina, sobre a
pressão arterial. Considerando que a frequência cardíaca é maior em animais
jovens do que em adultos, e que a presença de enalapril aumenta a filtração
glomerular, pode-se esperar uma maior excreção de Pb em ratos jovens. Este
fato pode explicar a eficácia semelhante de enalapril e da terapia combinada
no restabelecimento da pressão arterial em ratos jovens expostos ao Pb, e a
maior eficácia da terapia de combinação em ratos adultos.
Reatividade vascular
Independente da idade pós-natal, todos os tratamentos foram capazes de
restabelecer as alterações na reatividade vascular induzidas pela exposição
perinatal ao Pb. Especula-se que tais alterações podem ser causadas pela
diminuição dos níveis de ON e/ou de uma forma de ERO, e que o fornecimento
adicional de ON através da administração de L-arginina poderia atuar como
sequestrante de ERO e/ou diretamente como vasodilatador, desta forma
restabelecendo as alterações vasculares. Além disso, além da atividade
quelante, DMSA apresenta atividade sequestrante de ERO, o que pode
contribuir para restabelecer tais alterações na reatividade vascular16,39. Alguns outros mecanismos
relacionados ao Pb que poderiam contribuir para o desenvolvimento da
hipertensão arterial envolvem o aumento da atividade da enzima conversora de
angiotensina, e o aumento nos níveis plasmáticos de renina, angiotensina II,
aldosterona, e quininases1. No
presente estudo, o enalapril foi capaz de normalizar as alterações
funcionais na reatividade vascular induzida pela exposição perinatal ao Pb.
Sendo assim, os resultados do presente estudo corroboram resultados de
estudos anteriores que mostraram que os tratamentos capazes de interromper o
sistema renina-angiotensina também podem reduzir as alterações
cardiovasculares em diversos estados hipertensivos, incluindo os decorrentes
da exposição ao Pb36.
A maioria dos agentes quelantes convencionais possuem efeitos secundários,
especialmente no que diz respeito à sua ligação a metais essenciais em
sistemas biológicos, o que reduz a sua eficácia. Até o momento, não há
nenhum tratamento eficaz e seguro disponível para o tratamento de
intoxicação por Pb13,30. Assim, a terapia combinada pode
desempenhar um papel importante em diminuir os efeitos tóxicos do Pb em
comparação com tratamentos isolados, além de ser capaz de restabelecer a
pressão arterial. Neste contexto, o presente estudo contribuiu para elucidar
os efeitos cardiovasculares da exposição perinatal ao Pb e pode auxiliar no
desenvolvimento de novos tratamento terapêuticos para o controle da
hipertensão induzida por Pb.
Agradecimentos
Somos gratos ao Sr. Alaor Aparecido Almeida e ao CEATOX-IBB-UNESP pelos ensaios
de quantificação de Pb no sangue e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo-FAPESP (processo número: 03/06760-5 e 04/00640-0) e à Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-PROAP, pelo apoio financeiro.
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa, Obtenção de dados, Análise e interpretação
dos dados, Análise estatística e Redação do manuscrito:Fresneda-Gaspar A,
Cordellini S; Obtenção de financiamento e Revisão crítica do manuscrito
quanto ao conteúdo intelectual importante: Cordellini S.
Fontes de financiamento
O presente estudo foi financiado pela FAPESP e CAPES/PROAP.
Vinculação acadêmica
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Andréia Fresneda Gaspar pela
UNESP