Arq Bras Cardiol Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia 9HCfy5GbHn8bsMnsYMDj4FJ S0066-782X2014002000006 S0066-782X2014005040113 00006 10.5935/abc.20140113 Original Articles Gender-Based Differences in Cardiac Remodeling and ILK Expression after Myocardial Infarction Sofia Renato Rodrigues 1 2 Serra Andrey Jorge 1 Silva Jose Antonio Jr 1 Antonio Ednei Luiz 2 Manchini Martha Trindade 1 Oliveira Fernanda Aparecida Alves de 2 Teixeira Vicente Paulo Castro 3 Tucci Paulo José Ferreira 2 Universidade Nove de Julho Programa de Pós-graduação em Ciências da Reabilitação São Paulo SP Brazil Programa de Pós-graduação em Ciências da Reabilitação - Universidade Nove de Julho (Uninove), São Paulo, SP - Brazil Universidade Federal de São Paulo Departamento de Cardiologia São Paulo SP Brazil Departamento de Cardiologia - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Universidade Federal de São Paulo Departamento de Patologia São Paulo SP Brazil Departamento de Patologia - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP - Brazil Mailing Address: Andrey Jorge Serra, Rua Araurari, 159, Vila Esperança. Postal Code 03650-040, São Paulo, SP - Brazil. E-mail: andreyserra@gmail.com, andreyserra@uninove.br

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 01 08 2014 08 2014 103 02 124 130 19 09 2013 18 11 2013 17 01 2014 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

Gender can influence post-infarction cardiac remodeling.

 Objective:

To evaluate whether gender influences left ventricular (LV) remodeling and integrin-linked kinase (ILK) after myocardial infarction (MI).

 Methods:

Female and male Wistar rats were assigned to one of three groups: sham, moderate MI (size: 20-39% of LV area), and large MI (size: ≥40% of LV area). MI was induced by coronary occlusion, and echocardiographic analysis was performed after six weeks to evaluate MI size as well as LV morphology and function. Real-time RT-PCR and Western blot were used to quantify ILK in the myocardium.

 Results:

MI size was similar between genders. MI resulted in systolic dysfunction and enlargement of end-diastolic as well as end-systolic dimension of LV as a function of necrotic area size in both genders. Female rats with large MI showed a lower diastolic and systolic dilatation than the respective male rats; however, LV dysfunction was similar between genders. Gene and protein levels of ILK were increased in female rats with moderate and large infarctions, but only male rats with large infarctions showed an altered ILK mRNA level. A negative linear correlation was evident between LV dimensions and ILK expression in female rats with large MI.

 Conclusions:

Post-MI ILK expression is altered in a gender-specific manner, and higher ILK levels found in females may be sufficient to improve LV geometry but not LV function.

 Atrial Remodeling Myocardial Infarction, Gender Identity Protein-Serine Threonine Kinases/metabolism Rats Introduction

It is well established that premenopausal women have a lower risk of cardiovascular disease than men of the same age1. However, there are conflicting data about gender differences with regard to the adaptive response of the heart during the development of heart failure after myocardial infarction (MI). Thus, although some studies have shown worse cardiac remodeling in male than female rodents post-MI, other researchers have found no gender differences or worse cardiac remodeling in females2 , 3.

The female sex hormone estrogen has been the most frequently studied mechanism for gender-based left ventricular (LV) remodeling post-MI4 - 6. The cardiovascular system is influenced not only by estrogen but also by multiple molecular factors that may determine significant gender differences that already exist in the normal heart7. In fact, the different characteristics of the normal myocardium suggest that different molecular responses occur between males and females in response to MI. In this regard, a wealth of data supports a key role of integrin-linked kinase (ILK) in the ischemic myocardium. ILK is a critical effector in the Akt signaling pathway8 , 9 and has been shown to be up-regulated10 as well as to promote cardiac repair after MI11. Moreover, ILK gene therapy has been shown to improve cardiac remodeling in rats after MI and was associated with increased angiogenesis, reduced apoptosis, and increased cardiomyocyte proliferation12.

Since gender differences in post-MI LV remodeling are unclear, we conducted this study using a rat MI model with a reliable and comprehensive method to examine gender-based differences in myocardial remodeling13 - 15. Given that previous studies have established that ILK influences LV remodeling, we also examined whether gender affects the myocardial expression of ILK after MI.

 Methods Animals and MI surgery

The investigation conforms to the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals published by the US National Institutes of Health (NIH publication no. 85-23, revised 1985) as well as to the policy and UK regulations described in the Journal of Physiology16 and Ethical Principles in Animal Experimentation of the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). The protocol was approved by the Institutional Research Ethics Committee of the Federal University of São Paulo, Brazil. Ten-week-old female and male Wistar rats were subjected to surgical induction of MI or sham operation. Under ketamine (50 mg/kg) plus Xylazin (10 mg/kg) anesthesia the left anterior descending coronary artery was occluded near its origin following a previously described method13 - 15. Sham-operated rats were treated similarly except that the ligature was not tied. Female and male rats were assigned to either a sham group, a moderate MI group (infarct size between 20-39% of LV area), or a large MI group (infarct size ≥ 40% of LV area).

 Assessment of MI size, LV geometry and function

Six weeks after the surgical ligation of the coronary artery or sham operations, the animals were anesthetized as described above and measurements were performed using a 12-MHz transducer connected to a HP Sonos-5500 echocardiograph (Hewlett-Packard, California, USA) as previously described14 , 15. The MI size was measured by transversal 2-dimensional view of the left ventricle on the basal, midtransversal, and apical planes. Measurements of the endocardial perimeter (EP) and length of the infarcted segment (ISe) for each transverse view were obtained in diastole. The infarct size for each segment (ISi), expressed as the proportion of the left ventricle perimeter of each transverse view, was calculated by the equation ISi (%) = ISe/EP x 100. The MI was defined by echocardiography as any segment with increased echogenicity and/or change in myocardial thickening or systolic movement (hypokinesia, akinesia, or dyskinesia). The diastolic (DA) and systolic (SA) transverse areas of the left ventricle were measured by 2-dimensional images at the basal, midview, and apical view. The final value was the arithmetic mean of the measures of the three views. Systolic function was analyzed by the fractional area change (FAC) as a function for the following equation: FAC = DA-SA/DA x 100.

After echocardiography study, the animals received a urethane overdose (i.p. 4.8 g/kg) and the hearts were immediately excised from the thorax and dissected. Samples from remote MI area and the corresponding part in the sham-operated rats were collected, frozen in dry ice, and stored at −80°C until processing.

 Quantitative real-time RT-PCR analysis

Total RNA was isolated from myocardial tissue using TRIzol as previously described17. Reverse transcription was performed in a 200 µl reaction in the presence of 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 3 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 0.5 mM dNTPs, and 50 ng of random primers with 200 units of Moloney murine leukemia virus-reverse transcriptase (Invitrogen). The reaction product was amplified by real-time PCR on the 7000 Sequence Detection System (ABI Prism, Applied Biosystems, Foster City, CA) using the SYBRGreen core reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The primers used were the followings: rat ILK (GenBankTM accession number NM 133409), forward primer 5'-ACCCAACCCTCATCACACACT-3' and reverse primer 5'-GCCTCTTGCCATGTCCAAA-3'; rat GAPDH (GenBankTM accession number NM 017008) forward primer 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3' and reverse primer 5'-GCCCCACGGCCATCA-3'.

 Western blot analysis

Samples were homogenized in lysis buffer containing 0.1M NaCl, 0.01 M Tris-HCl pH 7.6, 0.001M EDTA pH 8.0, 1% NP-40, 10% Glycerol, 10 µM PMSF, 1 mM sodium metavanadate, 0.05 M NAF; 22 nM okadaic acid with protease inhibitor cocktails. The Lowry method was used to determine protein content. Tissue homogenate was diluted in Laemmli buffer and boiled for 5 min; 60µg of protein were loaded on 10% polyacrylamide mini-gels, separated by electrophoresis and transferred to nitrocellulose membranes by electroblotting. Blocking was performed in 5% nonfat milk for 2 h at room temperature. Blots were then probed with an affinity-purified rabbit polyclonal antibody against ILK (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) in TBS-T (50 mM Tris-HCl, 154 mM NaCl, pH 7.5 + 0.1% Tween 20) 2% nonfat milk. After 12 h incubation at room temperature, blots were washed in TBS-T (3 times for 10 min) and incubated for 2 h in biotinylated anti-rabbit immunoglobulins (Vector Laboratories, CA, USA) diluted 1:200 in TBS-T 2% nonfat milk. Blots were washed in TBS-T (3 times for 10 min) and incubated for 1 h in streptavidin-horseradish peroxidase (Vector Laboratories, CA, USA). After washing, the blots were incubated with enhanced chemiluminescence reagents (ECL, Amersham Pharmacia Biotech), exposed to X-ray film (Amersham), and quantified by densitometric analysis. Equal protein loading was shown by stripping and incubation with an anti-GAPDH antibody (1:2000, Proteimax Biotecnologia, Brazil).

 Statistical analysis

Data were analyzed by the SPSS software 13.0 for PC (Analytical Software, Chicago, IL, USA), and values are expressed as mean ± S.D. Shapiro-Wilk and Levene tests were used to verify approximately normal statistic distributions and equality of variances, respectively. Two-way ANOVA followed by Bonferroni post-hoc test was used to detect significant differences in sample normality. Kruskal-Wallis followed by Dunn's multiple comparison tests was applied for no-normality samples. Relationships between ILK levels and LV areas post-MI were determined by Pearson's correlation coefficient. In addition, linear multivariable regression models were performed (1) to evaluate the association between gender and LV structural and functional parameters after IM and (2) to examine the association between ILK protein level and LV areas after IM. Significance for statistical analyses was determined using an alpha level of ≤ 0.05.

 Results Survival after coronary occlusion

A total of 41 male and 28 female rats underwent coronary occlusion. After 24 h, 18 (44%) males and two females (7%) rats died. Six weeks after coronary occlusion, two males and two females died. Moreover, one male and three female rats were excluded for not showing signs of MI.

 MI size, LV geometry and function

Echocardiographic data are shown in Table 1. The size of MI was similar in female and male rats of the moderate and large infarct size groups. The female sham rats showed significant differences in LV chamber dimensions compared with male sham rats. However, when the size of the cavity was indexed by body weight, it did not differ between genders. Six weeks of MI resulted in end-diastolic as well as end-systolic dimensions, which were significantly enlarged. Moreover, LV areas were significantly increased in both female and male rats as a function of the size of MI. In the following analysis, we observed that female gender favorably influences LV chamber remodeling in response to MI. Thus, when considering animals with a large MI, female rats showed a lower diastolic and systolic LV dilation. Indeed, when related to body weight, male rats also exhibited a LV cavity larger than female rats. Data on LV function identified a depression in both female and male rats with moderate and large infarctions. These changes were similar in both genders.

Echocardiographic characteristics of the animals
  Females Males
Sham Moderate MI Large MI Sham Moderate MI Large MI
N 7 9 12 8 8 12
BW (g) 232 ± 23* 227 ± 8# 262 ± 22$ † 343 ± 56 322 ± 12 300 ± 24‡
IM size (%) --- 32 ± 7 47 ± 6 - 33 ± 9 46 ± 6
LVDA (mm2) 2.5 ± 0.4 4.6 ± 0.8‡ 5.4 ± 1‡ $ † 3.2 ± 0.3 5.3 ± 0.6‡ 8.2 ± 0.7$ ‡
LVSA (mm2) 0.8 ± 0.1 3 ± 0.8‡ 3.9 ± 0.9‡ $ † 1.2 ± 0.1 3.4 ± 0.8‡ 5.7 ± 1.1$ ‡
LVDA/BW (mm2/g) 0.011 ± 0.002 0.020 ± 0.003‡ 0.020 ± 0.004‡ † 0.010 ± 0.001 0.016 ± 0.002‡ 0.027 ± 0.002$ ‡
LVSA/BW (mm2/g) 0.003 ± 0.0006 0.013 ± 0.003‡ 0.015 ± 0.004‡ † 0.003 ± 0.0006 0.010 ± 0.002‡ 0.019 ± 0.004$ ‡
FAC (%) 67 ± 2 34 ± 10‡ 26 ± 16‡ 63 ± 4 36 ± 11‡ 29 ± 14‡

BW: body weight; LVDA: left ventricular diastolic area; LVSA: left ventricular systolic area; FAC: fractional area change; MI: myocardial infarction

p < 0.05 compared with sham males;

p < 0.05 compared with moderate MI males

p < 0.05 compared with large MI males;

p < 0.05 compared with the respective sham;

p < 0.05 compared with respective moderate MI size.

Linear multivariable regression analyses were performed to assess the association between gender and structural and functional parameters of LV after MI (Table 2).

Multivariable analysis between gender and structural and functional parameters of the left ventricle after myocardial infarction
  Coeficiente β padronizado Valor de t Valor de p
Gender – MI sizea - 0.13 - 0.93 0,9
Gender – LVDAb 0.530 5.533 < 0.001
Gender – LVSAc 0.483 4.931 < 0.001
Gender – FACd - 0.14 - 0.174 0.8

Model 1: multivariate linear regression for association of gender and myocardial infarction (MI) size;

Model 2: multivariate linear regression for association of gender and left ventricular diastolic area (LVDA) after adjusting for MI size and body weight;

Model 3: multivariate linear regression for association of gender and left ventricular systolic area (LVSA) after adjusting for MI size and body weight;

Model 4: multivariate linear regression for association of gender and fractional area change (FAC) after adjusting for MI size, body weight, LVDA, and LVSA.

The MI size was not significantly associated with gender. However, male gender was significantly associated with larger LV diastolic area (LVDA) and systolic area (LVSA) after adjustment for MI size and body weight. There was no significant association between gender and FAC after adjustment for MI size, LV diastolic and systolic area, and body weight.

 Gender determines differential expression of ILK after MI

There was no significant difference in ILK expression between female and male sham-operated rats (Figure 1A). MI significantly increased ILK mRNA in female rats compared with the corresponding sham-operated female rats. ILK mRNA expression was higher in females with large infarcts than with moderate infarcts; however, this difference was not statistically significant. In male rats, ILK levels were significantly increased in animals with large MI area. More importantly, gender significantly affected ILK mRNA expression after MI. Female rats with moderate and large MI size showed higher ILK levels compared with male rats with moderate and large MI size. In Figure 1B, ILK protein levels examined by Western blot are shown. As observed for the gene expression, gender did not affect ILK content in the myocardial tissue of sham-operated groups. However, ILK protein levels were upregulated as a function of MI size in females. On the other hand, ILK content was not altered in the myocardial tissue of infarcted male rats. Remarkably, given that a significantly higher amount of ILK protein was found in female compared with male rats, gender determined differential expression of ILK after MI.

Quantification of (A) ILK mRNA and (B) ILK protein expression in the myocardium of sham-operated and infarct-operated female and male rats, respectively. ILK levels are plotted as a function of MI size. The sample size is shown into the bars. #p < 0.001 vs. respective sham; *p < 0.001 vs. respective moderate infarction. Correlation between ILK expression and LV geometry

As previously described, female rats with large infarcts showed a lower LV dilatation. In addition, following MI there was increased ILK expression in female rats compared with male rats. Since previous studies with gene therapy approaches have shown that increased myocardial expression of ILK may reduce LV dilation following MI12, correlation analysis between LV areas and ILK levels were performed in female rats with large MI size (Figure 2). We determined that a negative linear correlation existed between LVDA, LVSA and ILK expression. The association between LV areas and ILK remained statistically significant even after the application of a linear multivariable regression model (Table 3). Thus, an increased ILK expression was associated with smaller LVDA as well as LVSA in female rats. However, a similar result was not observed in male rats.

Multivariable analysis between ILK protein expression and left ventricular areas after myocardial infarction in both genders
  Coeficiente β Padronizado Valor de t Valor de p
LVDA (female) 0.716 5.228 < 0.001
LVDA (male) - 0.088 - 0.459 0.6
LVSA (female) 0.749 5.769 < 0.001
LVSA (male) - 0.204 - 1.064 0.2

ADVE: área diastólica do ventrículo esquerdo; ASVE: área sistólica do ventrículo esquerdo.

 Correlation analysis between ILK gene (panels: A-B) and protein (panels: C-D) expression and LV diastolic (LVDA) and systolic (LVSA) areas indexed to body weight in female rats with large MI size. Discussion

It is well known that premenopausal women are less likely to develop coronary heart disease than men of the same age and that heart failure appears to be less common and less severe in premenopausal women than in men1. Although previous studies have shown post-MI gender differences in LV remodeling, the data are inconclusive. Thus, Chen et al18 have reported that female rats had more prominent LV dilatation and systolic dysfunction on echocardiographic analysis four weeks post-MI compared with male rats. In contrast, Litwin et al3 found comparable LV dilatation and systolic dysfunction between female and male rats six weeks post-MI, and similarly Bridgman et al19 found comparable LV dilatation and systolic dysfunction between female and male mice six weeks post-MI. Conversely, we reported that female rats with large MI size resulted in minor LV dilatation six weeks post-MI compared with male rats of similar MI size. These results are in agreement with studies in mice. Cavasin et al2 found that male mice had more pronounced LV dilatation as well as systolic dysfunction 12 weeks post-MI. Similarly, Shioura et al20 found that male mice had more pronounced LV dilatation as well as systolic dysfunction 10 weeks post-MI. The diverse results in the literature comparing post-MI LV remodeling between females and males are unclear. It is possible that the use of different species (e.g., mice or rats), ovariectomized or ovary-intact animals, different observation time points, separation of groups according to MI size, and different ages of the animals could account for the disparate results in the literature.

As determined in our study, although female rats with large MI showed a minor LV cavity compared to male rats with similar MI size, this was not associated with an improved LV systolic function. Thus, these data suggest that despite infarcts of similar size and severe maladaptive remodeling of the LV cavity in male rats, systolic function was comparable between genders.

The underlying mechanisms for a lower post-MI LV dilation in females than in males are not completely understood. It has been reported that female sex hormones (e.g., estrogen) may have protective effects in rats and mice4 - 6. In this respect, we found that myocardial expression of ILK was significantly increased six weeks after MI. To our knowledge, only limited numbers of studies have investigated the effects of MI on ILK expression10, and the molecular mechanism responsible for the differential expression of ILK between genders has not been clarified. Thus, it should be pointed out that female rats with moderate and large MI showed an increase in ILK gene and protein expression compared with male rats with the same MI size. Given that ILK gene and protein levels may have favorable effect on cardiac remodeling, one might expect that higher ILK content could result in a lower LV dilatation response to MI in female rats. The fact that the concentration of ILK is related to a lower LV cavity is further supported by correlation analysis as documented in this study. The assumption that ILK has a key role in preserving LV remodeling is supported by several evidences in the literature. Ding et al12 injected an adenoviral vector expressing ILK into the myocardial tissue of rats following MI and the gene therapy was associated with preserved LV diameter, enhanced angiogenesis and cardiomyocyte proliferation, reduced infarct scar size, reduced fibrosis, and reduced apoptosis. Moreover, studies of MI in mice have shown that thymosin β4, a monomeric G-actin protein, targets the ILK-PINCH-1 pathway leading to the activation of Akt for cardiac protection after ischemic insult21 , 22. These studies have shown several beneficial anti-remodeling effects, including smaller infarct sizes, reduced LV dilatation, and improved cardiac function in thymosin β4-treated MI animals compared with MI only animals.

Unfortunately, we did not investigate the mechanism leading to a differential expression of ILK in post-MI female rats versus male rats; to our knowledge, there is no evidence in the literature on this issue. The mechanisms leading to lower ILK transcription in post-MI males than females as well as translation inhibition in males need to be determined. ILK has been shown to activate multiple cardioprotective signaling pathways that can result in an improved myocardial remodeling post-ischemic injury. In this regard, the myocardial ILK expression was shown to be associated with vascular endothelial growth factor expression and phosphorylation of endothelial nitric oxide synthase after MI23. Moreover, it has been taken into account that cardioprotection in female may occur through the PI3-K/AKT signaling pathway24 , 25. Unfortunately, we were unable to demonstrate that the relationship among vascular endothelial growth factor, endothelial nitric oxide synthase, PI3-K/AKT, and ILK after MI could favorably influence LV remodeling in female rats. This issue is very intriguing and needs to be investigated in future.

 Conclusion

Our study is the first to demonstrate a gender-specific differential expression pattern of ILK following MI. Although increased ILK protein levels were shown to correlate with a minor LV chamber area, we did not find significant differences in LV performance between genders. Further studies are necessary to explore the association among ILK level, LV geometry, and cardiac function. This issue should be addressed as a relationship of cause and effect dependent on gender.

Author contributions

Conception and design of the research: Sofia RR, Antonio EL, Manchini MT, Tucci PJF; Acquisition of data: Silva Jr JA, Antonio EL, Manchini MT, Oliveira FAA, Teixeira VPC; Analysis and interpretation of the data: Sofia RR, Silva Jr JA, Oliveira FAA, Teixeira VPC; Statistical analysis: Serra AJ; Obtaining financing: Tucci PJF; Writing of the manuscript: Sofia RR, Serra AJ; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Serra AJ, Tucci PJF.

Sources of Funding

This study was funded by FAPESP.

Study Association

This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Renato Rodrigues Sofia, from Universidade Federal de São Paulo.

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CEP 03650-040, São Paulo, SP - Brasil. E-mail: andreyserra@gmail.com, andreyserra@uninove.br

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

O gênero pode ser decisivo no remodelamento cardíaco após infarto do miocárdio.

 Objetivo:

Avaliar diferenças de gênero associadas ao remodelamento do ventrículo esquerdo (VE) após infarto do miocárdio (IM) e associadas à modulação de quinases acopladas à integrina (integrin-linked kinases-ILK).

 Métodos:

Ratos Wistar machos e fêmeas foram divididos em 3 grupos: grupo sham, grupo com IM de extensão moderada (tamanho: 20-39% da área do VE); grupo com IM de grande extensão (tamanho: ≥ 40% da área do VE). O IM foi produzido por oclusão coronária e as análises ecocardiográficas foram obtidas após 6 semanas para avaliar a extensão do IM, bem como a morfologia e função do VE. RT-PCR em tempo real e Western blott foram realizados para quantificar a ILK no miocárdio.

 Resultados:

A extensão do IM foi semelhante entre os gêneros. O IM resultou em disfunção sistólica e aumento do tamanho do VE no final da diástole e da sístole em função do tamanho da área necrótica para ambos os sexos. Ratos fêmeas com IM de grande extensão apresentaram dilatação diastólica e sistólica inferior a de ratos machos, mas a disfunção do VE foi semelhante em ambos os sexos. Os níveis gênicos e proteicos de ILK aumentaram em ratos fêmeas com infartos de extensão moderada e grande, mas apenas ratos machos com infartos de grande extensão apresentaram níveis alterados de mRNA do ILK. Uma correlação linear negativa foi observada entre as dimensões do VE e a expressão de ILK em ratos fêmeas com IM de grande extensão.

 Conclusões:

A expressão de ILK pós-IM variou de maneira gênero-especifica, e os níveis mais elevados de ILK observados em fêmeas podem ser suficientes para melhorar a geometria do VE, mas não suficientes para melhorar a função do VE.

 Remodelamento Atrial Infarto do Miocárdio Identidade de Gênero Proteínas Serina-Treonina Quinases/metabolismo Ratos Introdução

Sabe-se que mulheres na pré-menopausa apresentam menor risco de doenças cardiovasculares quando comparado a homens da mesma idade1. No entanto, existem dados conflitantes a respeito das diferenças de gênero em relação à resposta cardíaca adaptativa durante o desenvolvimento de insuficiência cardíaca após infarto do miocárdio (IM). Neste sentido, embora alguns estudos tenham mostrado um remodelamento cardíaco pior em roedores machos pós-IM, outros pesquisadores não encontraram diferenças de gênero ou remodelamento cardíaco pior em fêmeas2 , 3.

Dos possíveis mecanismos pelos quais o gênero pode afetar o remodelamento do ventrículo esquerdo (VE) pós-IM, o hormônio sexual feminino estrógeno tem sido o mais frequentemente estudado4 - 6. O sistema cardiovascular é influenciado não só pelo estrógeno, mas também por múltiplos fatores moleculares que podem determinar diferenças significativas entre os sexos, e que estão presentes no coração saudável7. De fato, as diferentes características do miocárdio normal levam ao pressuposto lógico de que diferentes respostas moleculares ocorrem entre os sexos em resposta ao IM. Neste sentido, vários estudos indicaram o papel fundamental de quinases acopladas à integrina (integrin-linked kinases-ILK) no miocárdio isquêmico. ILK é um efetor crucial na via de sinalização de Akt,8 , 9 é regulado positivamente10 e é capaz de promover a regeneração cardíaca após IM11. Além disso, a terapia gênica com ILK melhora o remodelamento cardíaco em ratos pós-IM e está associada com o aumento da angiogênese, redução da apoptose, e aumento da proliferação de cardiomiócitos12.

Visto que as diferenças de gênero associadas ao remodelamento do VE pós-IM não são claras, realizamos este estudo utilizando um modelo de ratos com IM através de um método confiável e abrangente para examinar as diferenças de gênero no remodelamento do miocárdio13 - 15. Considerando que estudos anteriores têm demonstrado que ILK influencia o remodelamento do VE, também examinamos o efeito do gênero sobre a expressão de ILK no miocárdio pós-IM.

 Métodos Animais e cirurgia para indução de IM

O presente estudo está de acordo com o Manual de Cuidados e Uso de Animais de Experimentação publicado pelo National Institutos of Health (NIH) dos EUA (publicação No. 85-23, revisada em 1985), e de acordo com a política e regulamentação do Reino Unido descrita no Journal of Physiology 16 e Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo, Brasil. Ratos Wistar machos e fêmeas com 10 semanas de idade foram submetidos à cirurgia para indução de infarto do miocárdio ou à cirurgia sham. Após anestesia com cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), a artéria coronária descendente anterior esquerda foi ocluída perto da sua origem, utilizando um método anteriormente descrito13 - 15. Ratos sham-operados foram tratados da mesma forma, exceto que a ligadura não foi amarrada. Ratos machos e fêmeas foram divididos em um grupo sham, um grupo experimental com IM de extensão moderada (tamanho do infarto: 20-39% da área do VE), ou um grupo com IM de grande extensão (tamanho do infarto: ≥ 40% da área do VE).

 Avaliação da extensão do IM, geometria e função do VE

Seis semanas após a oclusão da artéria coronária ou cirurgias sham, os animais foram anestesiados conforme descrito acima e as avaliações foram realizadas utilizando um transdutor de 12 MHz acoplado a um ecocardiógrafo modelo HP Sonos-5500 (Hewlett-Packard, Califórnia, EUA) como previamente descrito14 , 15. A extensão do IM foi medida utilizando um corte transversal 2D do VE nos planos basal, médio e apical. As medições do perímetro do endocárdio (PE) e comprimento do segmento infartado (CSI) para cada corte transversal foram obtidos em diástole. A extensão do infarto para cada segmento (ESI), representada como a proporção do perímetro do VE em cada corte transversal, foi calculada pela equação: ESI (%) = CSI/PE × 100. O IM foi definido por ecocardiografia como qualquer segmento com ecogenicidade aumentada e/ou alteração da espessura do miocárdio, ou movimento sistólico (hipocinesia, acinesia, ou discinesia). As áreas transversais diastólica (ADVE) e sistólica (ASVE) do ventrículo esquerdo foram medidas por meio de imagens 2D usando cortes basais, médios, e apicais. O valor final correspondeu à média aritmética das medidas dos 3 cortes. A função sistólica foi avaliada pela variação da área fracional (VAF) de acordo com a seguinte equação: VAF = AD-AS/AD × 100.

Após as análises ecocardiográficas, os animais receberam uma overdose de uretano (i.e., 4,8 g/kg) e os corações foram imediatamente removidos do tórax e dissecados. Amostras de área remota do IM e a parte correspondente dos ratos sham-operados foram recolhidas, congeladas em gelo seco, e armazenadas a -80 °C até o processamento.

 Análise em tempo real por RT-PCR quantitativa

O RNA total foi isolado a partir de tecido do miocárdio utilizando TRIzol como anteriormente descrito17. A transcrição reversa foi realizada num volume de 200 µL na presença de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 3 mM de MgCl2 , 10 mM de ditiotreitol, 0,5 mM de dNTP, e 50 ng de iniciadores aleatórios com 200 unidades da transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (Invitrogen). O produto da reação foi amplificado por PCR em tempo real utilizando um sistema de detecção modelo 7000 (ABI Prism, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e o kit de reação SYBRGreen core (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os iniciadores utilizados foram: ILK de rato (número de acesso GenBankTM: NM 133409), iniciador forward 5'-ACCCAACCCTCATCACACACT-3' e iniciador reverse 5'-GCCTCTTGCCATGTCCAAA-3'; GAPDH de rato (número de acesso GenBanTMk: NM 017008), iniciador forward: 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3' e reverse: 5'-GCCCCACGGCCATCA-3'.

 Análise por Western blotting

As amostras foram homogeneizadas em tampão de extração contendo 0,1 M de NaCl, 0,01 M de Tris-HCl (pH 7,6), 0,001 M de EDTA (pH 8,0), 1% de NP-40, 10% de glicerol, 10 µM de PMSF, 1 mM de metavanadato de sódio, 0,05 M de NAF e 22 nM de ácido ocadáico juntamente com coquetéis de inibidores da protease. O método de Lowry foi usado para a quantificação de proteína. O tecido homogeneizado foi diluído em tampão de Laemmli e fervido durante 5 minutos, e as proteínas (60 µg) foram separadas por eletroforese utilizando mini gel de poliacrilamida a 10% e transferidas para uma membrana de nitrocelulose por eletrotransferência. O bloqueio foi realizado com 5% de leite desnatado durante 2 horas à temperatura ambiente. As membranas foram sondadas com um anticorpo policlonal anti-ILK de coelho purificado por cromatografia de afinidade (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) em tampão TBS-T (50 mM de Tris-HCl, 154 mM de NaCl (pH 7,5), em 0,1% de Tween 20), acrescido de 2% de leite desnatado. Após 12 horas de incubação à temperatura ambiente, as membranas foram lavadas em TBS-T (3 vezes de 10 minutos) e incubadas durante 2 horas com imunoglobulina biotinilada anti-coelho (Vector Laboratories, CA, EUA), diluída a 1:200 em TBS-T acrescido de 2% de leite desnatado. As membranas foram lavadas em TBS-T (3 vezes de 10 minutos) e incubadas durante 1 hora em estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (Vector Laboratories, CA, EUA). Após a lavagem, os reagentes de quimiluminescência (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) foram aplicados às membranas, que em seguida foram expostas a um filme de raios-X (Amersham) e as proteínas foram quantificadas por análise de densitometria. Igual quantidade de proteína foi retirada por stripping e a membrana foi novamente incubada com um anticorpo anti-GAPDH (1:2000, Proteimax Biotecnologia, Brasil).

 Análise estatística

Os dados foram analisados utilizando o software SPSS 13.0 (Analytical Software, Chicago, Chicago, IL, EUA), e os valores foram expressos como média ± desvio padrão (DP). Os testes de Shapiro-Wilk e Levene foram utilizados para verificar a distribuição estatística aproximadamente normal e a homogeneidade das variâncias, respectivamente. Análise de variância a dois fatores seguida pelo pós-teste de Bonferroni foram usados para detectar diferenças significativas na normalidade da amostra. O teste de Kruskal-Wallis seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn foram aplicados para amostras não-normais. As correlações entre os níveis de ILK e as áreas do VE pós-IM foram determinadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. Além disso, modelos de regressão linear multivariada foram desenvolvidos (1) para avaliar a correlação entre gênero e os parâmetros estruturais e funcionais do VE pós-IM e (2) a correlação entre os níveis proteicos de ILK e as áreas do VE pós-IM. A significância das análises estatísticas foi determinada utilizando um nível alfa ≤0,05.

 Resultados Sobrevida após oclusão coronária

Um total de 41 ratos machos e 28 ratos fêmeas foram submetidos a oclusão coronária. Vinte e quatro horas após a oclusão, 18 ratos machos (44%) e 2 ratos fêmeas (7%) morreram. Seis semanas após a oclusão coronária, 2 ratos machos e 2 fêmeas morreram. Além disso, 1 macho e 3 fêmeas foram excluídos por não apresentarem sinais de IM.

 Extensão do IM, geometria e função do VE

Os dados ecocardiográficos estão apresentados na Tabela 1. A extensão do IM foi semelhante em ratos machos e fêmeas para os grupos com infarto moderado e grande. As fêmeas sham apresentaram diferenças significativas nas dimensões da câmara do VE em comparação com os ratos machos sham. No entanto, quando o tamanho da câmara do VE foi analisado em função do peso corporal, este parâmetro não diferiu entre os sexos. Seis semanas após o IM, as dimensões cardíacas no final da diástole e no final da sístole estavam significativamente aumentadas. Além disso, as áreas do VE foram significativamente aumentadas em ratos machos e fêmeas, em função da extensão do IM. Na análise realizada, observamos que o sexo feminino influenciou favoravelmente o remodelamento do VE em resposta ao IM. Assim, ao considerar os animais com IM de grande extensão, as fêmeas apresentaram uma menor dilatação diastólica e sistólica do VE. De fato, quando avaliados de acordo com o peso corporal, os ratos machos apresentaram uma câmara do VE maior que a das fêmeas. Além disso, ratos machos e fêmeas com infartos de extensão moderada e grande apresentaram uma diminuição na função do VE, e essa diminuição foi semelhantes em ambos os sexos.

Características ecocardiográficas dos animais
  Fêmeas Machos
Placebo IM de moderada extensão IM de ampla extensão Placebo IM de moderada extensão IM de ampla extensão
N 7 9 12 8 8 12
Peso corpóreo (g) 232 ± 23* 227 ± 8# 262 ± 22$ † 343 ± 56 322 ± 12 300 ± 24‡
Extensão do IM (%) --- 32 ± 7 47 ± 6 - 33 ± 9 46 ± 6
ADVE (mm2) 2,5 ± 0,4 4,6 ± 0,8‡ 5,4 ± 1‡$† 3,2 ± 0,3 5,3 ± 0,6‡ 8,2 ± 0,7$ ‡
ASVE (mm2) 0,8 ± 0,1 3 ± 0,8‡ 3,9 ± 0,9‡$† 1,2 ± 0,1 3,4 ± 0,8‡ 5,7 ± 1,1$ ‡
ADVE/PC (mm2/g) 0,011 ± 0,002 0,020 ± 0,003‡ 0,020 ± 0,004‡ † 0,010 ± 0,001 0,016 ± 0,002‡ 0,027 ± 0,002$ ‡
ASVE/PC (mm2/g) 0,003 ± 0,0006 0,013 ± 0,003‡ 0,015 ± 0,004‡ † 0,003 ± 0,0006 0,010 ± 0,002‡ 0,019 ± 0,004$ ‡
VAF (%) 67 ± 2 34 ± 10‡ 26 ± 16‡ 63 ± 4 36 ± 11‡ 29 ± 14‡

PC: peso corpóreo; ADVE: área diastólica do ventrículo esquerdo; ASVE: área sistólica do ventrículo esquerdo; VAF: variação da área fracional; IM: infarto do miocárdio;

p < 0,05 em comparação com ratos machos sham-operados;

p < 0,05 em comparação com ratos machos com IM de extensão moderada;

p < 0,05 em comparação com ratos machos com IM de grande extensão;

p < 0,05 em comparação com os respectivos animais sham;

p < 0,05 em comparação com IM de extensão moderada.

Análises de regressão linear multivariada foram realizadas para avaliar a correlação entre o gênero e os parâmetros estruturais e funcionais do VE pós-IM (Tabela 2).

Análise multivariada entre o gênero e os parâmetros estruturais e funcionais do ventrículo esquerdo após infarto do miocárdio
  Coeficiente β padronizado Valor de t Valor de p
Gênero- extensão do IMa - 0,13 - 0,93 0,9
Gênero- ADVEb 0,530 5.533 < 0,001
Gênero- ASVEc 0,483 4.931 < 0,001
Gênero- VAFd - 0,14 - 0,174 0,8

Modelo 1: regressão linear múltipla para a associação do gênero e extensão do infarto do miocárdio (IM);

Modelo 2: regressão linear múltipla para a associação do gênero e da área diastólica do ventrículo esquerdo (ADVE) após ajuste dos dados para a extensão do MI e peso corpóreo;

Modelo 3: regressão linear múltipla para a associação do gênero e área sistólica do ventrículo esquerdo (ASVE) após ajuste dos dados para a extensão do IM e peso corpóreo;

Modelo 4: regressão linear múltipla para a associação do gênero e variação de área fracional (VAF), após ajuste dos dados para o tamanho do IM, peso corpóreo, ADVE e ASVE.

A extensão do IM não se correlacionou significativamente com o gênero. No entanto, o sexo masculino foi significativamente associado com maior área diastólica e sistólica do VE após o ajuste dos dados para a extensão do IM e peso corpóreo. Não houve correlação significativa entre gênero e VAF após o ajuste dos dados para a extensão do IM, área diastólica e sistólica do VE, e peso corpóreo.

 O gênero determina a expressão diferencial de ILK pós-IM

Não houve diferença significativa na expressão de ILK entre ratos machos e fêmeas sham-operados (Figura 1A). O IM aumentou significativamente a expressão do mRNA de ILK em ratos fêmeas em comparação com as fêmeas sham-operadas correspondentes. A expressão do mRNA do ILK foi maior em fêmeas com IM de grande extensão em comparação com fêmeas com infartos moderados, mas esta diferença não foi significante. Em ratos machos, os níveis de ILK foram significativamente maiores em animais com IM de grande extensão. Notavelmente, o gênero afetou significativamente a expressão de mRNA de ILK pós-IM. As fêmeas com IM de tamanho moderado e grande apresentaram níveis mais elevados de ILK comparados com animais do sexo masculino com estas mesmas áreas de IM. A Figura 1B mostra os níveis proteicos de ILK detectados por Western blotting. Tal como foi observado com os resultados do nível de expressão gênica, o gênero não afetou os níveis de ILK no tecido do miocárdio nos grupos sham-operados. No entanto, os níveis proteicos de ILK foram regulados positivamente em função da extensão do IM para o sexo feminino. Por outro lado, os níveis de ILK não foram alterados no tecido do miocárdio em ratos machos infartados. Notavelmente, o gênero foi um fator determinante para a expressão diferencial de ILK pós-IM, considerando que um nível proteico significativamente maior de ILK foi observado em fêmeas em comparação com ratos machos.

Quantificação dos níveis de mRNA (A) e proteicos (B) de ILK no miocárdio de ratos machos e fêmeas sham-operados e submetidos a infarto, respectivamente. Os níveis de ILK estão representados em função da extensão do IM. O tamanho da amostra é indicado nas barras. # p < 0,001 em relação aos animais sham-operados; * p < 0,001 em relação aos animais com IM de extensão moderada. Correlação entre a expressão de ILK e a geometria do VE

Como anteriormente comentado, as fêmeas apresentaram uma dilatação menor do VE considerando IMs de grande extensão. Além disso, houve aumento da expressão de ILK pós-IM nas fêmeas em comparação com ratos machos. Visto que estudos anteriores com abordagens de terapia gênica demonstraram que a expressão aumentada de ILK no miocárdio pode reduzir a dilatação do VE pós-IM12, a análise de correlação entre as áreas do VE e os níveis de ILK foi realizada em ratos fêmeas com IM de grande extensão (Figura 2). Houve uma correlação linear negativa entre as áreas transversais diastólica e sistólica do VE e a expressão de ILK. Esta correlação manteve-se significativa mesmo após a aplicação de um modelo de regressão linear multivariada (Tabela 3). Assim, o aumento da expressão de ILK está associado com ADVE e ASVE menores em ratos fêmeas. No entanto, este resultado não foi observado em ratos machos.

Análise de correlação entre a expressão gênica de ILK (Painel: A-B) e proteica de ILK (Painel: C-D) e as áreas diastólica (ADVE) e sistólica (ASVE) do ventrículo esquerdo em função do peso corporal em ratos fêmeas com IM de grande extensão Análise multivariada entre a expressão proteica de ILK e área do ventrículo esquerdo após infarto do miocárdio em ambos os sexos
  Coeficiente β Padronizado Valor de t Valor de p
ADVE (fêmeas) 0,716 5.228 < 0,001
ADVE (machos) - 0,088 - 0,459 0,6
ASVE (fêmeas) 0,749 5.769 < 0,001
ASVE (machos) - 0,204 - 1.064 0,2

ADVE: área diastólica do ventrículo esquerdo; ASVE: área sistólica do ventrículo esquerdo.

 Discussão

Sabe-se que mulheres na pré-menopausa são menos susceptíveis ao desenvolvimento de doença cardíaca coronária, e insuficiência cardíaca parece ser menos frequente e menos grave do que em homens1. Embora estudos anteriores tenham mostrado diferenças de gênero no remodelamento do VE pós-IM, os dados são inconclusivos. Chen e cols.18 relataram que ratos fêmeas estudadas com ecocardiografia apresentaram dilatação do VE e disfunção sistólica maiores que ratos machos após 4 semanas de IM. Em contraste, Litwin e cols.3 verificaram dilatação do VE e disfunção sistólica comparáveis entre ratos fêmeas e machos 6 semanas pós-IM. Similarmente, Bridgman e cols.19 observaram dilatação do VE e disfunção sistólica comparáveis entre camundongos machos e fêmeas 6 semanas pós-IM. Por outro lado, observamos que ratos fêmeas com IM de grande extensão apresentaram menor dilatação do VE 6 semanas pós-IM em comparação com ratos machos com IM de extensão similar. Estes resultados estão de acordo com estudos em camundongos. Cavasin e cols.2 observaram que camundongos machos apresentaram dilatação do VE e disfunção sistólica mais acentuada 12 semanas pós-IM. Da mesma forma, Shioura e cols.20 verificaram que camundongos machos apresentaram dilatação do VE e disfunção sistólica mais acentuadas 10 semanas pós-IM. Ainda não é possível explicar os resultados incoerentes da literatura comparando o remodelamento do VE pós-IM entre machos e fêmeas. É possível que o emprego de diferentes espécies de animais (por exemplo, camundongos e ratos), ovariectomizadas ou com ovário intacto, os diferentes tempos de observação, a separação dos grupos de acordo com a extensão do IM, e as diferentes idades dos animais possa ter contribuído para os resultados divergentes da literatura.

Conforme observado em nosso estudo, embora ratos fêmeas com IM de grande extensão tenham apresentado a câmara do VE menor em comparação com os ratos machos com IM de extensão similar, esta diferença não se correlacionou com a melhora da função sistólica. Assim, estes dados sugerem que, apesar dos infartos de extensão semelhante, a função sistólica foi semelhante entre os sexos, apesar do remodelamento cardíaco adverso mais grave da câmara ventricular esquerda em ratos machos.

Os mecanismos ligados a uma menor dilatação do VE em fêmeas em comparação com machos pós-IM não estão completamente esclarecidos. Tem sido relatado que os hormônios sexuais femininos (e.g., estrógeno) podem ter efeitos protetores em ratos e camundongos4 - 6. Neste respeito, verificamos que a expressão de ILK no miocárdio foi significativamente aumentada 6 semanas pós-IM. Até onde sabemos, poucos estudos têm investigado os efeitos do IM na expressão de ILK10, e as respostas ou mecanismos moleculares envolvidos na expressão diferencial de ILK por gênero não foram esclarecidos. Assim, deve-se salientar que ratos fêmeas com IM de moderada e grande extensão apresentaram um aumento na expressão gênica e proteica de ILK comparado com ratos machos com extensão semelhante de IM. Considerando que os níveis gênicos e proteicos de ILK podem ter implicações no remodelamento cardíaco favorável, pode-se esperar que os níveis aumentados de ILK resultem em uma menor dilatação do VE em resposta ao IM em ratos fêmeas. O fato da concentração de ILK estar relacionada com uma menor câmara do VE é corroborado pela análise de correlação, conforme documentado no presente estudo. O pressuposto de que ILK tem um papel fundamental na preservação do remodelamento do VE é apoiado por várias linhas de evidência. Ding e cols.12 injetaram um vetor de adenovírus expressando ILK no tecido do miocárdio de ratos pós-IM, o que resultou na preservação do diâmetro do VE, aumento da angiogênese, proliferação de cardiomiócitos, redução do tamanho da cicatriz do infarto, e diminuição da fibrose e da apoptose. Além disso, estudos de IM em camundongos mostraram que a timosina β4, uma proteína monomérica de G-actina, que interage com ILK-PINCH-1, levou à ativação de Akt e proteção cardíaca após dano isquêmico21 , 22. Estes estudos têm mostrado vários efeitos benéficos anti-remodelamento, incluindo infartos de menor extensão, diminuição da dilatação do VE, e melhora da função cardíaca em animais com IM tratados com timosina β4 em comparação com animais com IM não tratados.

No presente estudo, nós não investigamos o mecanismo que leva a maior expressão diferencial de ILK pós-IM em fêmeas em comparação com animais machos, e até onde sabemos, não há dados da literatura a este respeito. Sendo assim, os mecanismos que levam à menor transcrição de ILK em ratos machos pos-IM quando comparado com as fêmeas, bem como os mecanismos de inibição da tradução em animais machos, precisam ser esclarecidos. O ILK é capaz de ativar múltiplas vias de sinalização cardioprotetoras que podem resultar em um melhor remodelamento do miocárdio após uma lesão isquêmica. A este respeito, a expressão de ILK no miocárdio está associada à expressão do fator de crescimento vascular endotelial e à fosforilação de óxido nítrico sintase endotelial pós-IM23. Além disso, deve-se considerar que a cardioproteção em fêmeas pode ocorrer pela via de sinalização intracelular PI3K/AKT24 , 25. O presente estudo não demonstrou a relação entre o fator de crescimento endotelial vascular, óxido nítrico sintase endotelial, PI3K/AKT, e ILK pós-IM e o remodelamento do VE mais favorável em fêmeas do que em machos. Esta questão é muito interessante e deve ser investigada no futuro.

 Conclusão

Este é o primeiro estudo a demonstrar um padrão de expressão diferencial gênero-específica de ILK pós-MI. Embora o aumento dos níveis proteicos de ILK esteja correlacionado com a menor área da câmara do VE, não encontramos diferenças significativas no desempenho do VE em função do gênero. Mais estudos são necessários para explorar a associação entre o nível de ILK, a geometria do VE, e a função cardíaca. Esta questão deve ser tratada como uma relação de causa e efeito dependente do gênero.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Sofia RR, Antonio EL, Manchini MT, Tucci PJF; Obtenção de dados: Silva Jr JA, Antonio EL, Manchini MT, Oliveira FAA, Teixeira VPC; Análise e interpretação dos dados: Sofia RR, Silva Jr JA, Oliveira FAA, Teixeira VPC; Análise estatística: Serra AJ; Obtenção de financiamento: Tucci PJF; Redação do manuscrito: Sofia RR, Serra AJ; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Serra AJ, Tucci PJF.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPESP.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Renato Rodrigues Sofia pela Universidade Federal de São Paulo.