Arq. Bras. Cardiol. Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia vYjf9hBHk3RjLztyFJqw48s S0066-782X2014001900005 S0066-782X2014005040087 00005 10.5935/abc.20140087 Original Articles Resistance Exercise Restores Endothelial Function and Reduces Blood Pressure in Type 1 Diabetic Rats Mota Marcelo Mendonça 1 Silva Tharciano Luiz Teixeira Braga da 1 Fontes Milene Tavares 1 Barreto André Sales 1 Araújo João Eliakim dos Santos 1 Oliveira Antônio Cesar Cabral de 2 Wichi Rogério Brandão 2 Santos Márcio Roberto Viana 1 Universidade Federal de Sergipe Departamento de Fisiologia São Cristóvão SE Brazil Departamento de Fisiologia - Universidade Federal de Sergipe (UFS), São Cristóvão, SE − Brazil Universidade Federal de Sergipe Departamento de Educação Física São Cristóvão SE Brazil Departamento de Educação Física - UFS, São Cristóvão, SE − Brazil Mailing Address: Marcio Roberto Viana Santos, Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe, Avenida Marechal Rondon, s/n, Rosa Elze. Postal Code 49100-000, São Cristóvão, SE − Brazil. E-mail: marciorvsantos@bol.com.br, marcio@infonet.com.br

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 27 06 2014 07 2014 103 1 25 32 29 06 2013 19 11 2013 28 11 2013 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Background:

Resistance exercise effects on cardiovascular parameters are not consistent.

 Objectives:

The effects of resistance exercise on changes in blood glucose, blood pressure and vascular reactivity were evaluated in diabetic rats.

 Methods:

Wistar rats were divided into three groups: control group (n = 8); sedentary diabetic (n = 8); and trained diabetic (n = 8). Resistance exercise was carried out in a squat device for rats and consisted of three sets of ten repetitions with an intensity of 50%, three times per week, for eight weeks. Changes in vascular reactivity were evaluated in superior mesenteric artery rings.

 Results:

A significant reduction in the maximum response of acetylcholine-induced relaxation was observed in the sedentary diabetic group (78.1 ± 2%) and an increase in the trained diabetic group (95 ± 3%) without changing potency. In the presence of NG-nitro-L-arginine methyl ester, the acetylcholine-induced relaxation was significantly reduced in the control and trained diabetic groups, but not in the sedentary diabetic group. Furthermore, a significant increase (p < 0.05) in mean arterial blood pressure was observed in the sedentary diabetic group (104.9 ± 5 to 126.7 ± 5 mmHg) as compared to that in the control group. However, the trained diabetic group showed a significant decrease (p < 0.05) in the mean arterial blood pressure levels (126.7 ± 5 to 105.1 ± 4 mmHg) as compared to the sedentary diabetic group.

 Conclusions:

Resistance exercise could restore endothelial function and prevent an increase in arterial blood pressure in type 1 diabetic rats.

 Rats Exercise Physical endurance Endothelium, vascular / physiology Arterial Pressure / physiology Diabetes Introduction

Diabetes mellitus is a heterogeneous group of metabolic disorders that have in common hyperglycemia associated with secondary cardiovascular system complications1 , 2. Increased blood glucose levels are associated with in vivo and in vitroendothelial dysfunction3 , 4. Endothelial dysfunction is a systemic phenomenon related to an unbalance in the endothelial production of mediators that regulate vascular tone; it contributes partially to increase arterial blood pressure levels5. The endothelial dysfunction in type 1 diabetes mellitus can be considered an early marker of cardiovascular disease6.

Several factors, such as hyperlipidemia, insulin resistance, hyperglycemia and hypertension, can explain the endothelial dysfunction in type 1 diabetes mellitus7. Resistance exercise has been reported to contribute to prevent/treat pathologies that affect the metabolism and cardiovascular function8 - 10. Resistance exercise has proved to have an important therapeutic potential by promoting skeletal muscle mass gain, increased insulin sensitivity and blood glucose reduction in diabetic rats8 , 11. Aerobic exercise also have those effects11 , 12.

Some studies have suggested that aerobic exercise is effective to treat endothelial dysfunction in diabetes13 - 15. However, little is known about the chronic effects of resistance exercise on the arterial blood pressure and endothelial function of type 1 diabetic rats. We raised the hypothesis that long-term resistance exercise can minimize the deleterious effects on the cardiovascular system and on the metabolic control of type 1 diabetes mellitus-induced animals. Thus, this study aimed at assessing the chronic effects of resistance exercise on blood glucose changes, vascular reactivity and arterial blood pressure of diabetic rats.

 Methods Animals and experimental delineation

Male Wistar rats (Rattus norvegicus), aged 3 months, weighing 250-300 g, were used in all experiments. They were kept under controlled temperature (22 ± 1 °C) and 12-hour light-dark cycles, with free access to water and food specific for rodents (Labina, Purina®). All procedures described in this study were approved by the Committee on Ethics and Animal Research of the Universidade Federal de Sergipe (UFS) (protocol number 01/2008). The animals were divided into the following three groups of eight animals each: control group (C); diabetic sedentary (DS); and diabetic trained (DT). In groups C and DS, the animals were kept in their cages and not exposed to exercise, while group DT animals underwent eight weeks of resistance exercise.

 Drugs

The following drugs were used: acetylcholine chloride (ACh); L-phenylephrine (Phe); NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME); alloxan (SIGMA®, USA); and sodium thiopental (Thiopentax, Cristália, Itapira, SP, Brazil).

 Induction of diabetes and blood glucose measurement

Experimental diabetes was induced as described by Da Silva Costa et al16. After a 24-hour fasting period, diabetes was induced by use of a single intravenous dose of alloxan (40 mg/kg - penile vein), two weeks before starting the exercise protocol. The animals with blood glucose level ≥ 200 mg/dL were selected as diabetic. Blood glucose level was measured one week after alloxan administration by using reagent test strips (ACCU-CHEK Advantage II, Roche®, São Paulo, SP, Brazil) coupled to a portable digital glucometer (ACCU-CHEK Advantage II, Roche®, São Paulo, SP, Brazil).

 Exercise protocol

Resistance exercise was performed in a squat device according to the model by Tamaki et al17. After one week of adaptation, DT animals underwent training with three sets of ten repetitions, with 60-second rest intervals and intensity of 50% of the load established through the one-repetition maximum (1RM) test, three times a week. For determining the maximum strength, successive loads were added to the equipment, and the animals were electrically stimulated to repeat the exercise. Between load increments, 5-minutes rests were observed to allow the musculature to recover. The maximum load for each animal was the maximum amount of weight allowing the complete movement. Training loads were readjusted every two weeks by using a new 1RM test18. The parameters of electrical stimulation were those described by Cássia Cypriano Ervati Pinter et al19. Electrical stimulation (20 V, 0.3-second duration, 3-second interval)20 with electrodes (Valu Trode, Model CF3200, Axelgaard, Fallbrook, CA, USA) fixed to the animals' tails and connected to an electrical stimulator (BIOSET, Physiotonus Four, Model 3050, Rio Claro, SP, Brazil) was used to make the animals performed their exercise sets.

 Surgical procedure and direct recording of mean arterial blood pressure

For this procedure, the animals were anesthetized with sodium thiopental (45 mg/kg, intraperitoneal), and a polyethylene catheter (PE-10/50, Intramedic, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) with heparin saline (1:20 v/v) was implanted through an inguinal incision in the left femoral artery to record arterial blood pressure. After insertion and fixation, the catheter was exteriorized in the animal's posterior cervical region (scapulae) and the incision, sutured. After finishing the surgical procedures, all animals received a single intramuscular dose (0.2 g/kg) of oxytetracycline hydrochloride (long-lasting antibiotic) and oral sodium diclofenac (10 mg/kg/day). Then, the animals were put into individual cages, where they remained for a minimum period of 24 hours (postoperative recovery).

After the animals recovered and were moving spontaneously, the catheter was coupled to a pressure transducer (Edwards Lifescience®, Irvine, CA, USA), and 30 minutes after the signal stabilized, a 5-minute recording was performed. After recording the mean arterial blood pressure for 24 hours, the animals were anesthetized and prepared for the vascular reactivity experiments.

 Vascular reactivity of the superior mesenteric artery

The tissue was prepared as described by Araujo et al10. Endothelial function was assessed via the ability of 1 µM of ACh to induce relaxation in more than 75% of the previously contracted superior mesenteric artery rings with 1 µM of FEN21.

The vascular reactivity changes were assessed by using concentration-response curves for ACh (10-9-10-4 M), a non-selective muscarinic agonist. To assess the nitric oxide (NO) participation in ACh-induced relaxation, the curves for that agent were also obtained in the presence of L-NAME (100 µM), a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor.

 Statistical analyses

Initially, all data underwent the Kolmogorov-Smirnov test to determine whether the probability distributions were parametric or non-parametric. All data had normal distribution. The values were expressed as mean ± standard error of the mean (SEM). When necessary, Student ttest for independent samples and repeated measures or two-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Bonferroni post-test, were used to assess the significance of the differences between the means. Pearson's correlation was used to determine the association between ACh-induced relaxation and blood glucose levels. The significance level adopted was p < 0.05. The GraphPad Prism statistical software, version 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA), was used for all procedures.

 Results Maximum strength

At the beginning of the experiment, the strength levels were similar in all groups (C: 956.3 ± 63.3 g, n = 8; DS: 1,022.2 ± 32.3 g, n = 8; and DT: 945.4 ± 108.7 g, n=8). After eight weeks, the strength levels of animals in groups C and DS showed no statistically significant difference (1,032.2 ± 44.0 and 1,030.5 ± 61.2 g, respectively). In addition, the resistance exercise promoted an increase in strength levels from 945.4 ± 108.7 g to 1,327.3 ± 98.7 g (p < 0.01).

 Blood glucose levels

Figure 1 shows the effect of resistance exercise on blood glucose levels. Alloxan induced an increase (p < 0.001) in blood glucose concentration in both experimental groups. In addition, resistance exercise caused a reduction (p < 0.05) in blood glucose levels after eight weeks (Figure 1).

Variation of blood glucose levels of rats at the beginning (0) and by the end (8) of eight weeks of training: control group (C); diabetic sedentary group (DS); and diabetic trained group (DT). Data are expressed as mean ± standard error of the mean. The statistical differences were determined by repeated measures analysis of variance followed by Bonferroni post-test. <sup>***</sup> p < 0.001 vs. C 0; <sup>††</sup> p < 0.01 vs. DS 0; and <sup>#</sup> p < 0.05 vs. DT 0. Endothelium-dependent relaxation

Figure 2 shows ACh induced relaxation, depending on its concentration, in isolated rings of the superior mesenteric artery, with intact endothelium in all groups. Neither diabetes, nor resistance exercise interfered with arterial sensitivity, considering that the concentration from which the agonist produces 50% of maximum response (potency - pD2) remained unaltered. However, in group DS, diabetes reduced (p < 0.001) the maximum response (Rmax) as compared to that in group C. That was reversed (p < 0.01) in DT animals. In addition, a strong negative correlation was observed between ACh-induced relaxation and blood glucose levels in groups DS (r = -0.9710; p = 0.001, n = 8) and DT (r = -0.9874; p = 0.001, n = 8) (Figure 3).

Concentration-response curves for acetylcholine (ACh: 10<sup>-9</sup> – 10 <sup>-4</sup> M) in isolated superior mesenteric artery rings, with intact endothelium and pre-contracted with L-phenylephrine (1 μM). The rings were obtained from rats of the groups control (C), diabetic sedentary (DS) and diabetic trained (DT). Data are expressed as mean ± standard error of the mean. The statistical differences were determined by two-way analysis of variance followed by Bonferroni post-test. <sup>**</sup> p < 0.01 and <sup>***</sup> p < 0.001 vs. C; <sup>##</sup> p < 0.01 vs. DS. Correlation between blood glucose levels and the percentage of maximum response of acetylcholine-induced relaxations in superior mesenteric artery rings of the groups diabetic sedentary (A) and diabetic trained (B). Endothelium-dependent relaxation in the presence of L-NAME

Table 1 shows that L-NAME could reduce (p < 0.001) pD2 and Rmax (p < 0.01 and p < 0.001) of ACh-induced relaxations in groups C and DT, respectively. That reduction was not observed in group DS. The presence of L-NAME significantly increased (p < 0.001) the pD2 of ACh-induced relaxations of group DS as compared to group C, without modifying the Rmax. However, L-NAME significantly reduced (p < 0.001) the pD2 and Rmax (p < 0.01) of the ACh-induced relaxations of group DT as compared to group DS.

Potency (pD<sub>2</sub>) and maximum response (Rmax) obtained from concentration-response curves for acetylcholine before and after pretreatment with N<sup>G</sup>-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)
Groups Condition pD2 Rmax
C - L-NAME 7.0 ± 0.0 99.0 ± 2.7
+ L-NAME 5.5 ± 0.1* 70.0 ± 6.2**
DS - L-NAME 7.2 ± 0.0 78.0 ± 1.8
+ L-NAME 6.8 ± 0.1† 72.4 ± 3.1
DT - L-NAME 7.0 ± 0.1 95.0 ± 3.5
+ L-NAME 4.9 ± 0.2* # 50.0 ± 3.6* ##

The superior mesenteric artery rings were obtained from rats of the groups control (C), diabetic sedentary (DS), and diabetic trained (DT). The experiments were performed in the absence of L-NAME (- L-NAME) or presence of 100 μM of L-NAME (+ L-NAME). Data are expressed as mean ± standard error of the mean. The statistical differences were determined by Student t test for independent samples (intragroup) or analysis of variance followed by Bonferroni post-test (intergroup).

* p <0.001 or **p <0.01 for - L-NAME vs. + L-NAME values; † p<0.001 vs. C and # p<0.001 or ## p<0.01 vs. DS.

 Mean arterial blood pressure

Diabetes induction with alloxan increased (p < 0.05) mean arterial blood pressure in group DS. Inversely, resistance exercise reduced (p < 0.05) arterial blood pressure levels of group DT animals (Figure 4).

Mean arterial blood pressure of rats of the groups control (C), diabetic sedentary (DS), and diabetic trained (DT) after eight weeks of resistance exercise. Data are expressed as mean ± standard error of the mean. The statistical differences were determined by repeated measures analysis of variance followed by Bonferroni post-test. * p < 0.05 DS vs. C and # p < 0.05 DT vs. DS. Discussion

According to the results, resistance exercise reduces blood glucose levels, restores endothelial function and decreases arterial blood pressure of type 1 diabetic animals after eight weeks of training.

Resistance exercise is characterized by intermittent movements and a predominantly anaerobic metabolic pathway22 , 23. In this study, resistance exercise was performed in a squat device for rats, and proved to be effective in mimicking the beneficial cardiovascular effects found in humans practicing that type of exercise19 , 20. Tail electrical stimulation was required for the animals to perform the squat movement. The electrical stimulation parameters used in this study have been reported to promote no cardiovascular system changes20. Based on the literature, we suggest that the effects observed in trained diabetic animals are directly related to resistance exercise.

The maximum strength test was used as an indicator of training efficacy. From that perspective, we observed that trained diabetic animals gained muscle strength after eight weeks. This indicates that the training protocol could promote chronic adjustments resulting from resistance exercise. The importance of the therapeutic potential of that type of exercise has been recently emphasized9. Resistance exercise has proved to have a beneficial effect on insulin action improvement, muscle mass gain, fatty mass reduction, blood glucose control and arterial blood pressure reduction in individuals with diabetes24 - 26.

Experimental and clinical evidence has shown that metabolic disorders, mainly the chronic increase in blood glucose levels, are strictly related to cardiovascular complications of diabetes mellitus7 , 26. To better understand the metabolic and cardiovascular complications originating from diabetes, several experimental models of diabetes induced in rats have been widely used by different research groups27. Alloxan has been reported to cause the destruction of a large number of beta-pancreatic cells, hindering insulin production27 , 28. The experimental model of alloxan-induced diabetes is of type 1, with symptoms similar to those found in humans, such as weight loss, polyuria, polydipsia, polyphagia, glycosuria, ketonuria, increased production of oxygen reactive species, decreased blood insulin levels and increased blood glucose levels27 - 29.

The increased blood glucose levels of diabetic animals observed at the beginning of the study were reduced after eight weeks of training. Similarly, Farrell et al8 have shown that treatment with resistance exercise, by the end of eight weeks, reduced blood glucose levels of animals with type 1 diabetes. Studies have shown that muscle contraction during physical exercise stimulates the translocation of glucose transporter type 4 (GLUT4), independently of insulin action, resulting in an increase in peripheral glucose uptake30 , 31. Thus, a possible explanation for blood glucose level reduction in trained animals in this study could relate to a greater activation in the signaling pathways involved in glucose transportation regardless of insulin action, because our animals had insulin deficiency or lack of insulin production, since ours was a type 1 diabetes mellitus model8 , 28 , 32.

According to Gross et al33, increased blood glucose levels cause damages, dysfunctions and even failure of several organs, involving severe micro- and macrovascular changes. In some cases, restoration of normal blood glucose levels reverts cell damages. In others, however, such damages are irreversible, making blood glucose control a physiological parameter of essential importance to prevent the severe chronic complications of diabetes30 - 33. Studies have shown that diabetes mellitus causes changes in endothelium-dependent relaxation of different vascular beds, promoting endothelial dysfunction34 , 35. Endothelial dysfunction is considered a biomarker of cardiovascular risk, and the importance of the endothelium in maintaining vascular health is a consensus in the literature36.

The group DS animals showed loss of vascular function. However, eight weeks of resistance exercise could restore the vascular function of diabetic animals. That can be due to the reduction in blood glucose levels observed in group DT animals. Our results evidenced that the ACh-induced relaxation had a strong inverse correlation with blood glucose levels. The group DS animals had an increase in blood glucose levels and an important loss in endothelial function, however, the reduction in blood glucose levels is associated with the vascular function restoration of group DT animals. Such results emphasize the findings of several other studies, which indicate resistance exercise as a possible tool to treat and/or prevent diseases with vascular function loss, such as hypertension and diabetes8 , 10 , 19 , 20 , 38.

Diabetes mellitus has been reported to reduce the endothelial production of vasoactive substances responsible for regulating the vascular tone, such as NO and prostaglandins1. To investigate the participation of NO in endothelium-dependent relaxations, concentration-response curves for ACh were obtained in the presence of L-NAME. Under that experimental condition, L-NAME antagonized the ACh-induced relaxation in animals of groups C and DT, but did not change the relaxation in group DS animals, characterizing a reduction in the participation of one of the major endothelium-derived relaxing factors in group DS animals. Those findings are in accordance with the results by Chen et al39, who have reported that ACh-induced Rmax was also reduced in the presence of L-NAME in animals undergoing aerobic exercise for eight weeks.

Group DT animals had a higher percentage of relaxation inhibition in the presence of L-NAME as compared with healthy animals. That phenomenon might have resulted from a possible increase in NO-dependent relaxation caused by resistance exercise. The increase in relaxations observed in this study corroborates other findings, in which there was an increase in aerobic-exercise-mediated NO production in the experimental type 1 diabetes model14.

Studies with humans with type 1 diabetes have also shown that aerobic exercise improved endothelial function in vascular beds not directly involved during exercise13. In this study, the effects observed in the arteries of animals exercising also suggest a possible generalized vascular effect, because the artery analyzed was far from the tissues more active during exercise. That generalized vascular effect has also been observed by Faria et al38, and one single session of resistance exercise increased the NO-dependent relaxation in the caudal artery, reducing arterial blood pressure in spontaneously hypertensive rats.

In addition, in our study, resistance exercise reduced mean arterial blood pressure in DT animals, proving to be effective to treat endothelial dysfunction related to increased blood glucose levels. Recent data from our laboratory have shown that L-NAME-induced hypertensive animals also showed a reduction in arterial blood pressure levels after four weeks of resistance exercise10. The mechanisms responsible for the decrease in arterial blood pressure of animals undergoing resistance exercise can be the reduction in peripheral vascular resistance and the increase in systemic vascular conductance39.

Thus, our results suggest that low-intensity resistance exercise induces metabolic and cardiovascular responses similar to those observed in studies submitting diabetic animals to aerobic exercise14 , 15. Although those modalities of exercise have different characteristics, such as the energetic pathway and movement execution, both promote beneficial cardiometabolic effects that help to treat both types of diabetes mellitus11 , 12.

Thus, this study indicates that the model of resistance exercise used could reduce blood glucose levels, restore endothelial function and reduce arterial blood pressure in diabetic animals. Finally, resistance exercise might cause beneficial vascular and metabolic adjustments for the treatment of type 1 diabetes mellitus dysfunctions in an experimental model40.

 Acknowledgements

We thank the Brazilian Board of Scientific and Technological Development (CNPq), the Coordination for the Improvement of Higher-Level-Education Personnel (CAPES) and the Foundation for Support to Technological Research and Innovation of the State of Sergipe (FAPITEC-SE) for the financial support.

Author contributions

Conception and design of the research: Mota MM, Silva TLTB, Barreto AS, Santos MRV; Acquisition of data: Mota MM, Silva TLTB, Fontes MT, Araújo JES; Analysis and interpretation of the data: Mota MM, Silva TLTB, Fontes MT, Oliveira ACC; Statistical analysis: Mota MM, Silva TLTB, Barreto AS; Obtaining financing: Santos MRV; Writing of the manuscript: Mota MM, Silva TLTB, Wichi RB; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Mota MM, Silva TLTB, Oliveira ACC, Wichi RB, Santos MRV.

Sources of Funding

This study was funded by CNPq, CAPES e FAPITEC/SE.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Marcelo Mendonça Mota, from Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe (UFS).

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E-mail: marciorvsantos@bol.com.br, marcio@infonet.com.br

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

 Fundamento:

Os efeitos do exercício resistido sobre os parâmetros cardiovasculares não são consistentes.

 Objetivos:

Foram avaliados os efeitos do exercício resistido sobre as alterações na glicemia, reatividade vascular e pressão arterial de ratos diabéticos.

 Métodos:

Ratos Wistar foram divididos em três grupos: grupo controle (n = 8), diabético sedentário (n = 8) e diabético treinado (n = 8). O exercício resistido foi realizado no aparelho de agachamento para ratos e consistiu em três séries de dez repetições com uma intensidade de 50%, três vezes por semana, durante 8 semanas. As alterações na reatividade vascular foram avaliadas em anéis de artéria mesentérica superior.

 Resultados:

Foi observada uma redução significativa da resposta máxima dos relaxamentos induzidos por acetilcolina no grupo diabético sedentário (78,1% ± 2) e um aumento do grupo diabético treinado (95 ± 3%), sem alterar a potência. Na presença de NG-nitro-L-arginina metil éster, os relaxamentos induzidos por acetilcolina foram significativamente reduzidos nos grupos controle e diabético treinado, mas não no grupo diabético sedentário. Além disso, foi observado um aumento significativo (p < 0,05) da pressão arterial média no grupo diabético sedentário de 104,9 ± 5 para 126,7 ± 5 mmHg, quando comparado ao grupo controle. Por outro lado, o grupo diabético treinado apresentou redução significativa (p < 0,05) nos níveis da pressão arterial média de 126,7 ± 5 mmHg para 105,1 ± 4 mmHg, quando comparado ao diabético sedentário.

 Conclusões:

O exercício resistido foi capaz de restaurar a funcionalidade endotelial e impedir o aumento da pressão arterial em ratos com diabetes tipo 1.

 Ratos Exercício Resistência Física Endotélio Vascular / fisiologia Pressão Arterial / fisiologia Diabetes Introdução

O diabetes melito é caracterizado como um grupo heterogêneo de desordens metabólicas que apresentam em comum a hiperglicemia associada a complicações secundárias no sistema cardiovascular1 , 2. O aumento nos níveis glicêmicos está associado à disfunção endotelial in vivo e in vitro 3 , 4. A disfunção endotelial é um fenômeno sistêmico e refere se ao desequilíbrio da produção endotelial de mediadores que regulam o tônus vascular e contribui, em parte, para o aumento nos níveis de pressão arterial5. A disfunção endotelial no diabetes melito tipo 1 pode ser considerada um marcador precoce de doenças cardiovasculares6.

Muitos fatores podem explicar a disfunção endotelial no diabetes melito tipo 1, como hiperlipidemia, resistência à insulina, hiperglicemia e hipertensão7. Em adição, a literatura indica que o exercício resistido contribui para a prevenção/o tratamento de patologias que acometem o metabolismo e a função cardiovascular8 - 10. O exercício resistido tem demonstrado ser um importante potencial terapêutico, por promover ganho de massa muscular esquelética, aumento na sensibilidade à insulina e redução da glicemia plasmática em ratos diabéticos8 , 11. Esses efeitos também são apresentados pelo exercício aeróbio11 , 12.

Estudos sugerem que o exercício aeróbio é eficaz no tratamento da disfunção endotelial no diabetes13 - 15. Por outro lado, pouco se sabe sobre os efeitos crônicos do exercício resistido na pressão arterial e na função endotelial de ratos diabéticos do tipo 1. Nós consideramos a hipótese de que a utilização do exercício resistido em longo prazo pode minimizar os efeitos deletérios que acometem o sistema cardiovascular e o controle metabólico apresentados por animais induzidos ao diabetes melito tipo 1. Dentro dessa perspectiva, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos crônicos do exercício resistido sobre as alterações na glicemia, reatividade vascular e pressão arterial de ratos diabéticos.

 Métodos Animais e delineamento experimental

Ratos Wistar machos (Rattus norvegicus), com idade de 3 meses, pesando entre 250 e 300 g, foram utilizados em todos os experimentos. Os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura (22 ± 1 °C) e ciclo claro-escuro de 12 horas, tendo livre acesso à água e à ração específica para roedores (Labina, Purina). Todos os procedimentos descritos no presente trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Federal de Sergipe (UFS), com protocolo número 01/2008. Os animais foram divididos em três grupos com oito animais cada: Grupo Controle (C), Diabético Sedentário (DS) e Diabético Treinado (DT). Os animais dos grupos C e DS foram mantidos em suas caixas sem exposição ao exercício, enquanto que os animais do grupo DT foram submetidos a 8 semanas de exercício resistido.

 Drogas

As drogas utilizadas foram: Cloreto de Acetilcolina (ACh), L-fenilefrina (FEN), NG-nitro-L-Arginina Metil Éster (L-NAME), aloxano − todos da SIGMA® (Estados Unidos) − e tiopental sódico (Thiopentax, Cristália, Itapira, SP, Brasil).

 Indução do diabetes e medida da glicemia

A indução do diabetes experimental foi realizada conforme descrito por Da Silva Costa e cols.16. Os animais, após jejum prévio de 24 horas, foram induzidos ao diabetes por meio da administração de aloxano na dose única de 40 mg/kg intravenosa (veia peniana), 2 semanas antes do início do protocolo de exercício. Os animais com glicemia ≥ 200 mg/dL foram selecionados como diabéticos. A glicemia foi medida 1 semana após o tratamento com aloxano utilizando fitas reagentes (ACCU-CHEK Advantage II, Roche®, São Paulo, SP, Brasil) acoplada a um glicosímetro portátil digital (ACCU-CHEK Advantage II, Roche®, São Paulo, SP, Brasil).

 Protocolo de exercício

O exercício resistido foi realizado em aparelho de agachamento segundo modelo de Tamaki e cols.17. Os animais do DT, após 1 semana de familiarização, foram treinados com três séries de dez repetições, com intervalos de repouso de 60 segundo, e intensidade de 50% da carga estabelecida por meio do teste de 1 Repetição Máxima (1RM), três vezes por semana. Para a determinação da força máxima, cargas sucessivas foram acrescentadas ao equipamento, e os animais foram estimulados eletricamente a executar uma repetição. Entre os incrementos de carga, repousos adequados de 5 minutos foram aplicados na tentativa de permitir a recuperação da musculatura trabalhada. Foi considerada como carga máxima para cada animal aquela que foi realizada com o maior peso e permitiu o movimento completo. As cargas de treinamento foram reajustadas a cada 2 semanas por meio de um novo teste de 1RM18. Os parâmetros de estimulação elétrica foram realizados conforme descrito por de Cássia Cypriano Ervati Pinter e cols.19. Os animais foram estimulados a executar as séries por meio da aplicação de estímulos elétricos (20 V, 0,3 segundo de duração, 3 segundos de intervalo)20 por eletrodos (Valu Trode, Modelo CF3200, Axelgaard, Fallbrook, CA, Estados Unidos) fixados na cauda e conectados a um eletroestimulador (BIOSET, Physiotonus Four, Modelo 3050, Rio Claro, SP, Brasil).

 Procedimento cirúrgico e registro direto da pressão arterial média

Neste procedimento, os animais foram anestesiados com tiopental sódico (45 mg/kg, intraperitoneal), e cateteres de polietileno (PE-10/50, Intramedic, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, Estados Unidos), preenchidos com solução salina heparinizada (1:20 v/v), foram implantados, através de incisão inguinal, na artéria femoral esquerda, para o registro da pressão arterial. Após a inserção e fixação, o cateter foi exteriorizado na região cervical posterior do animal (scapulae) e incisão suturada. Após as suturas das incisões e o término dos procedimentos cirúrgicos, todos os animais receberam cloridrato de oxitetraciclina (antibiótico de ação prolongada) em dose única (0,2 g/kg) por via intramuscular e diclofenaco sódico na dose de 10 mg/kg/dia por via oral; em seguida, eles foram colocados em caixas individuais, onde permaneceram por um período mínimo de 24 horas (recuperação pós-operatória).

Após recuperação pós-operatória com os animais apresentando mobilidade espontânea, o cateter foi acoplado a um transdutor de pressão (Edwards Lifescience®, Irvine, CA, USA) e, após 30 minutos de estabilização do sinal, foram registrados 5 minutos para análise dos dados. Após 24 horas da coleta dos registros de pressão arterial média os animais foram anestesiados e preparados para os experimentos de reatividade vascular.

 Reatividade vascular da artéria mesentérica superior

A preparação do tecido foi realizada conforme descrito por Araujo e cols.10. A funcionalidade do endotélio foi verificada pela habilidade, medida em percentagem, de 1 µM de ACh em relaxar mais do que 75% dos anéis pré-contraídos com 1 µM de FEN21.

As alterações na reatividade vascular foram avaliadas por meio da obtenção de curvas concentração-resposta para ACh (10-9-10-4 M), um agonista muscarínico não seletivo. Para avaliar a participação do óxido nítrico nos relaxamentos induzidos por ACh, as curvas para esse agente foram também obtidas na presença de L-NAME (100 µM), um inibidor da Óxido Nítrico Sintetase (NOS).

 Análises estatísticas

Inicialmente, todos os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov, com o intuito de determinar se suas distribuições de probabilidade apresentavam-se como paramétricas ou não paramétricas. Todos os dados apresentaram uma distribuição normal. Os valores foram expressos como a média ± Erro Padrão da Média (EPM). Quando necessário, os testes t de Student para amostras independentes e a Análise de Variância (ANOVA) para medidas repetidas ou de duas vias, seguidas do pós-teste de Bonferroni, foram realizados para avaliar a significância das diferenças entre as médias. A correlação de Pearson foi utilizada para determinar a associação entre o relaxamento induzido por ACh e a glicemia. Os valores foram considerados estatisticamente significativos quando p < 0,05. Para todos esses procedimentos, foi utilizado o programa estatístico GraphPad Prism versão 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, Estados Unidos).

 Resultados Força máxima

Pôde ser observado que, no início dos experimentos, os níveis de força foram similares em todos os grupos (C: 956,3 ± 63,3 g, com n = 8; DS: 1.022,2 ± 32,3 g, com n = 8; e DT: 945,4 ± 108,7 g, com n=8). Após 8 semanas de experimento, os animais dos grupos C e DS não apresentaram diferenças estatisticamente significativas em seus níveis de força (1.032,2 ± 44,0 e 1030,5 ± 61,2 g, respectivamente). Além disso, é possível observar que o exercício resistido promoveu um aumento (p < 0,01) nos níveis de força de 945,4 ± 108,7 para 1.327,3 ± 98,7 g.

 Glicemia

O efeito do exercício resistido está demonstrado na Figura 1. Pode ser observado que o aloxano induziu ao aumento (p < 0,001) da glicemia em ambos os grupos experimentais. Além disso, é possível observar que o exercício resistido promoveu redução (p < 0,05) da glicemia após 8 semanas de tratamento (Figura 1).

Variação da glicemia de ratos no início (0) e ao final (8) de 8 semanas de treinamento: grupos controle (C); diabético sedentário (DS) e diabético treinado (DT). Os dados são expressos como média ± erro padrão da média. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de variância para medidas repetidas seguidas pelo pós-teste de Bonferroni. <sup>***</sup> p < 0,001 vs. C 0; <sup>††</sup> p < 0,01 vs. DS 0; e <sup>#</sup> p > 0,05 vs. DT 0. Relaxamento dependente do endotélio

Como demonstrado na Figura 2, a ACh induziu ao relaxamento dependente da concentração em anéis isolados de artéria mesentérica superior, com endotélio intacto em todos os grupos. Nem o diabetes, nem o exercício resistido interferiu na sensibilidade arterial, tendo em vista que a pD2 (concentração a partir da qual o agonista produz uma resposta igual a 50% da resposta máxima) permaneceu inalterada. No entanto, no grupo DS, o diabetes promoveu redução (p < 0,001) na Rmáx quando comparado ao grupo C. Esse feito foi revertido (p < 0,01) nos animais treinados que receberam aloxano (DT). Além disso, a Figura 3 mostra uma forte correlação negativa entre o relaxamento induzido por ACh e a glicemia nos grupos DS (r = -0,9710; p = 0,001, com n = 8) e DT (r = -0,9874; p = 0,001, com n = 8).

Curvas concentração-resposta para acetilcolina (ACh: 10-9 – 10 -4 M) em anéis isolados da artéria mesentérica superior, com endotélio intacto e pré-contraídas com L-fenilefrina (1 μM). Os anéis foram obtidos de ratos dos grupos controle (C); diabético sedentário (DS) e diabético treinado (DT). Os dados representam as médias ± erro padrão da média. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de variância de duas vias seguida do pós-teste de Bonferroni. <sup>**</sup> p < 0,01 e <sup>***</sup> p <0,001 vs. C; <sup>##</sup> p < 0,01 vs. DS. Correlação entre o percentual de resposta máxima dos relaxamentos induzidos por acetilcolina e glicemia em anéis de artéria mesentérica dos grupos diabético sedentário (A) e diabético treinado (B). Relaxamento dependente do endotélio na presença de L-NAME

Como observado na Tabela 1, o L-NAME foi capaz de reduzir (p < 0,001) a potência ao agonista (pD2) e a Rmáx (p < 0,01 e p < 0,001) dos relaxamentos induzidos por ACh nos grupos C e DT, respectivamente. Essa redução não foi observada no DS. Entre os grupos, a presença de L-NAME aumentou significativamente (p < 0,001) a pD2dos relaxamentos induzidos por ACh do grupo DS em relação ao grupo C, sem modificar a resposta máxima. Por outro lado, o L-NAME reduziu significativamente (p < 0,001) a pD2 e a Rmáx (p < 0,01) dos relaxamentos induzidos por ACh no grupo DT quando comparado ao grupo DS.

Valores de potência (pD<sub>2</sub>) e resposta máxima (Rmáx) obtidos de curvas concentração-resposta para acetilcolina antes e após o pré-tratamento com N<sup>G</sup>-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME)
Grupos Condição p D2 Rmáx
C - L-NAME 7,0 ± 0,0 99,0 ± 2,7
+ L-NAME 5,5 ± 0,1* 70,0 ± 6,2**
DS - L-NAME 7,2 ± 0,0 78,0 ± 1,8
+ L-NAME 6,8 ± 0,1† 72,4 ± 3,1
DT - L-NAME 7,0 ± 0,1 95,0 ± 3,5
+ L-NAME 4,9 ± 0,2* # 50,0 ± 3,6* ##

Os anéis foram obtidos de ratos dos grupos controle (C); diabético sedentário (DS) e diabético treinado (DT). Os experimentos foram realizados na ausência L-NAME (- L-NAME) e na presença de 100 μM de L-NAME (+ L-NAME). Os dados representam as médias ± erro padrão da média. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste t de Student para amostras independentes (intragrupo) ou pela análise de variância seguida do pós-teste de Bonferroni (intergrupo).

*p <0,001 ou **p <0,01 para valores - L-NAME vs. + L-NAME; † p<0,001 vs. C e # p<0,001 ou ## p<0,01 vs. DS.

 Pressão arterial média

A indução do diabetes com aloxano promoveu aumento (p < 0,05) da pressão arterial média no grupo DS. Inversamente, o exercício resistido reduziu (p < 0,05) a pressão arterial dos animais treinados que receberam aloxano (Figura 4).

Pressão arterial média de ratos dos grupos controle (C); diabético sedentário (DS) e diabético treinado (DT) após 8 semanas de exercício resistido. Os dados representam as médias ± erro padrão da média. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de variância para medidas repetidas seguidas pelo pós-teste de Bonferroni. <sup>*</sup> p < 0,05 DS vs. C e <sup>#</sup> p < 0,05 DT vs. DS. Discussão

Os resultados indicam que o exercício resistido em animais diabéticos do tipo 1 promove redução da glicemia, restaura a função endotelial e diminui a pressão arterial após 8 semanas de treinamento.

No presente estudo, foi utilizado o exercício resistido, que é descrito como um tipo de exercício físico caracterizado por movimentos intermitentes e por uma via metabólica predominantemente anaeróbia22 , 23. O exercício resistido foi realizado em um aparelho de agachamento para ratos, que já demonstrou ser eficaz em mimetizar os benéficos efeitos cardiovasculares encontrados em humanos praticantes dessa modalidade de exercício19 , 20. Para que o animal execute o movimento de agachamento é necessária a eletroestimulação caudal. É descrito na literatura que os parâmetros de eletroestimulação usados neste estudo não promovem alterações no sistema cardiovascular20. Com base na literatura, sugerimos que os efeitos observados nos animais diabéticos treinados são diretamente relacionados ao exercício resistido.

O teste de força máxima foi usado como um indicador de eficácia do treinamento. Dentro dessa perspectiva, observamos que os animais diabéticos treinados ganharam força muscular após 8 semanas. Isso indica que o protocolo de treinamento foi capaz de promover ajustes crônicos provenientes do exercício resistido. Recentemente, esteve em destaque o importante potencial terapêutico dessa modalidade de exercício9. O exercício resistido demonstra ter um efeito benéfico na melhora da ação insulínica, no ganho de massa muscular, na redução da massa gorda, no controle glicêmico e na redução da pressão arterial em indivíduos com diabetes24 - 26.

Evidências experimentais e clínicas demonstram que os distúrbios metabólicos, principalmente a hiperglicemia crônica, estão estritamente relacionados com as complicações cardiovasculares provenientes do diabetes melitos7 , 26. Para uma melhor compreensão das complicações metabólicas e cardiovasculares provenientes do diabetes, diversos modelos experimentais de diabetes induzidos em ratos têm sido amplamente utilizados por diversos grupos de pesquisa27. É relatado que o aloxano causa a destruição de grande parte das células betapancreáticas, o que impossibilita a produção de insulina, necessária para demanda do organismo27 , 28. O modelo experimental de diabetes induzido pelo aloxano é do tipo 1 e apresenta sintomas semelhantes aos encontrados em humanos, como perda de peso, poliúria, polidipsia, polifagia, glicosúria, cetonúria, aumento da produção das espécies reativas de oxigênio, hipoinsulinemia e hiperglicemia27 - 29.

Os níveis elevados de glicemia apresentados pelos animais diabéticos no início do estudo foram reduzidos após 8 semanas de treinamento. Da mesma forma, Farrell e cols.8 demonstraram que o tratamento com o exercício resistido, ao final de 8 semanas, reduziu a glicemia de animais com diabetes do tipo 1. A literatura indica que a contração muscular realizada durante o exercício físico estimula a translocação de proteínas transportadoras de glicose (GLUT4), independentemente da ação da insulina, o que resulta no aumento da captação de glicose periférica30 , 31. Portanto, uma possível explicação para a redução da glicemia dos animais treinados no presente estudo pode estar relacionada a uma maior ativação das vias de sinalização envolvidas no transporte de glicose independentes da ação de insulina, uma vez que nossos animais apresentam deficiência ou ausência na produção de insulina, por se tratar de um modelo de diabetes melito tipo 18 , 28 , 32.

Segundo Gross e cols.33, a hiperglicemia causa danos, disfunções e até falência de vários órgãos, envolvendo severas alterações micro e macrovasculares. Em alguns casos, a restauração da normoglicemia reverte os danos celulares. Em outros, no entanto, esses danos são irreversíveis, o que torna o controle glicêmico um parâmetro fisiológico de essencial importância, para evitar as sérias complicações crônicas do diabetes30 - 33. Estudos têm demonstrado que o diabetes melito promove alterações no relaxamento dependente do endotélio em diferentes leitos vasculares, promovendo disfunção endotelial34 , 35. A disfunção endotelial é considerada um biomarcador de risco cardiovascular, e a importância do endotélio, na manutenção da saúde vascular, é consenso na literatura36.

Os animais diabéticos não exercitados do presente estudo apresentaram perda da funcionalidade vascular. Por outro lado, 8 semanas de exercício resistido foram capazes de restaurar a função vascular dos animais diabéticos. Tal situação pode ser justificada em virtude da redução nos níveis glicêmicos observada nos animais diabéticos exercitados. Uma vez que nossos resultados evidenciam que o relaxamento induzido por ACh tem forte correlação inversa com os níveis glicêmicos. Os animais diabéticos não exercitados apresentaram um aumento dos níveis glicêmicos e uma importante perda da funcionalidade endotelial, em contrapartida, a redução da glicemia está associada à restauração da função vascular apresentada pelos animais diabéticos exercitados. Esses resultados reforçam os achados de vários outros estudos, que apontam o exercício resistido como uma possível ferramenta para o tratamento e/ou prevenção de doenças que apresentam perda da funcionalidade vascular, como a hipertensão e o diabetes8 , 10 , 19 , 20 , 38.

É relatado, na literatura, que o diabetes melito reduz a produção endotelial de substâncias vasoativas responsáveis pelo controle do tônus vascular, como o óxido nítrico e as prostaglandinas1. Para investigar a participação do NO nos relaxamentos dependentes do endotélio, foram obtidas curvas concentração-resposta para ACh, na presença de L-NAME. Nessa condição experimental, foi observado que L-NAME antagonizou os relaxamentos induzidos por ACh nos animais do C e DT, mas não modificou os relaxamentos dos animais do grupo DS, caracterizando uma redução na participação de um dos principais fatores relaxantes derivados do endotélio nos animais diabéticos sedentários. Esses achados estão de acordo com os resultados apresentados por Chen e cols.39, que demonstraram que as Rmáx induzidas por ACh também foram reduzidas na presença de L-NAME nos animais submetidos ao exercício aeróbio por 8 semanas.

Interessantemente, os animais diabéticos exercitados apresentaram um percentual de inibição mais pronunciado nos relaxamentos realizados na presença de L-NAME quando comparados aos animais saudáveis. Tal fenômeno pode ter ocorrido em decorrência de um possível aumento no relaxamento dependente de NO proporcionado pelo exercício resistido. O aumento dos relaxamentos apresentados neste estudo corrobora outros achados, nos quais houve um aumento na produção de NO mediada pelo exercício aeróbio no modelo experimental de diabetes tipo 114.

Estudos com humanos portadores de diabetes tipo 1 também demonstraram que o exercício aeróbio melhorou a função endotelial em leitos vasculares que não estão diretamente envolvidos durante o exercício13. Em nosso estudo, os efeitos observados nas artérias dos animais exercitados sugerem também um possível efeito vascular generalizado, pois a artéria analisada encontrava-se distante dos tecidos mais ativos durante execução do exercício. Esse efeito vascular generalizado também foi observado por Faria e cols.38, sendo que uma única sessão de exercício resistido aumentou o relaxamento dependente de NO na artéria caudal, reduzindo a pressão arterial em ratos espontaneamente hipertensos.

Em adição, observamos, em nosso estudo, que o exercício resistido reduziu a pressão arterial média nos animais diabéticos exercitados, demonstrando ser eficaz no tratamento da disfunção endotelial relacionada à hiperglicemia. Dados recentes do nosso laboratório demonstraram que animais hipertensos induzidos por L-NAME também apresentaram uma redução nos valores de pressão arterial após 4 semanas de exercício resistido10. A redução da resistência vascular periférica e o aumento na condutância vascular sistêmica podem ser os mecanismos responsáveis pela queda da pressão arterial apresentada pelos animais submetidos ao exercício resistido39.

Dessa forma, nossos resultados sugerem que o exercício resistido de baixa intensidade induz a respostas metabólicas e cardiovasculares semelhantes às observadas em estudos que utilizaram animais diabéticos submetidos ao exercício aeróbio14 , 15. Mesmo se tratando de modalidades de exercício com características diferentes, tais como a via energética e a execução do movimento, ambas promovem efeitos cardiometabólicos benéficos, que auxiliam no tratamento do diabetes melito tipos 1 e 211 , 12.

Assim, este estudo indica que o modelo de exercício resistido utilizado foi capaz de reduzir a glicemia, restaurar a funcionalidade endotelial e reduzir a pressão arterial em animais diabéticos. Finalmente, é possível que o exercício resistido promova ajustes vasculares e metabólicos benéficos para o tratamento das disfunções presentes no diabetes melito tipo 1 em um modelo experimental40.

 Agradecimentos

Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Fundação de Apoio à Pesquisa e à Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe (FAPITEC-SE) pelo apoio financeiro.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Mota MM, Silva TLTB, Barreto AS, Santos MRV; Obtenção de dados: Mota MM, Silva TLTB, Fontes MT, Araújo JES; Análise e interpretação dos dados: Mota MM, Silva TLTB, Fontes MT, Oliveira ACC; Análise estatística: Mota MM, Silva TLTB, Barreto AS; Obtenção de financiamento: Santos MRV; Redação do manuscrito: Mota MM, Silva TLTB, Wichi RB; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Mota MM, Silva TLTB, Oliveira ACC, Wichi RB, Santos MRV.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq, CAPES e FAPITEC/SE.

Vinculação acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Marcelo Mendonça Mota pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe (UFS).