Arq. Bras. Cardiol. Arquivos Brasileiros de Cardiologia Arq. Bras. Cardiol. 0066-782X 1678-4170 Sociedade Brasileira de Cardiologia c9gPVgfJwnLZVTRJtLz8PHQ S0066-782X2014000500009 S0066-782X2014005000054 00009 10.5935/abc.20140054 Artigos Originais Hipometilação do LINE-1 está Associada ao Risco de Doença Cardíaca Coronariana na População Chinesa Wei Li 1 Liu Shuchuan 2 Su Zhendong 1 Cheng Rongchao 1 Bai Xiuping 1 Li Xueqi 1 Harbin Medical University The Fourth Affiliated Hospital Department of Cardiology Harbin China Department of Cardiology, The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin - China Harbin Medical University The First Affiliated Hospital Department of Hematology Harbin China Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin - China Correspondência: Xueqi Li, No. 37 Yiyuan Street, Nan Gang. Código Postal 150001, Harbin. E-mail: xueqi_li@163.com

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa e Análise e interpretação dos dados: Wei L, Liu S, Su Z, Cheng R, Bai X, Li X; Obtenção de dados: Wei L, Su Z, Cheng R; Análise estatística: Wei L, Bai X, Li X; Redação do manuscrito: Wei L, Liu S, Su Z, Cheng R, Bai X; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Li X.

Potencial conflito de interesse

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Li Wei pelo the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University.

 09 05 2014 10 06 2014 102 05 481 488 20 10 2013 12 12 2013 13 12 2013 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Fundamentos:

O nível de metilação global do ADN de leucócitos no sangue tem sido associado ao risco de doença arterial coronariana (DAC), com resultados inconsistentes em diferentes populações. Faltam dados semelhantes da população chinesa, onde diferentes fatores genéticos, de estilo de vida e ambientais podem afetar a metilação do ADN e sua relação com o risco de DCC.

 Objetivos:

Analisar se a metilação global está associada ao risco de doença coronariana na população chinesa.

 Métodos:

Foram incluídos um total de 334 casos de DCC e 788 controles saudáveis. A metilação global do ADN de leucócitos de sangue foi estimada por meio da análise das repetições do LINE-1 usando pirosequenciamento de bissulfito.

 Resultados:

Em uma análise inicial restrita aos controles o nível do LINE-1 diminui significativamente com a idade avançada, colesterol total elevado, e diagnóstico de diabetes. Na análise de caso-controle, a redução da metilação do LINE-1 foi associada ao aumento do risco de DCC, tendo a análise por quartil revelado uma odds ratio (IC 95%) de 0,9 (0,6-1,4), 1,9 (1,3-2,9) e 2,3 (1,6 3.5) para o terceiro, segundo e primeiro (o mais baixo) quartil (P da tendência < 0,001), respectivamente, em comparação com o quarto (o mais alto) quartil. A metilação inferior (< mediana) do LINE-1 esteve associada a 2,2 vezes (IC 95% = 1,7-3,0) o aumento de risco de doença coronariana. As estimativas de risco de DCC menores relacionadas com o LINE-1 tenderam a ser mais fortes entre os indivíduos com maior tercil de homocisteína (P interação = 0,042) e naqueles com diagnóstico de hipertensão arterial (P interação = 0,012).

 Conclusão:

A hipometilação do LINE-1 está associada ao risco de doença coronariana na população chinesa. Fatores de risco de DCC potenciais tais como a idade avançada, colesterol total elevado, e diagnóstico de diabetes podem ter impacto na metilação global do ADN, exercendo, portanto, o seu efeito sobre o risco de doença coronariana.

 Epigenética, doença cardíaca coronária metilação global LINE-1 DNA de leucócitos do sangue Introdução

A doença arterial coronariana (DAC) constitui 90-95% de todos os casos de doenças cardiovasculares, sendo a principal causa de morte no mundo1 , 2. A idade, o sexo, a dieta, tabagismo, a hipertensão, a diabetes, a dislipidemia, a homocisteína, a obesidade, a história familiar de DCC e fatores genéticos têm demonstrado desempenhar um papel importante na etiologia da DCC2 - 4.

A modificação epigenética, especialmente um padrão aberrante de metilação global do ADN, é cada vez mais reconhecido como um fator chave para o desenvolvimento de doença arterial coronariana. A hipometilação do ADN global pode induzir instabilidade genômica e desregular a transcrição do gene, contribuindo assim para o desenvolvimento de várias doenças humanas, incluindo DCC5. Em modelos animais, a hipometilação global do ADN tem sido associada ao depósito de lipídios na aorta, um preditor de futura aterosclerose6 , 7. Além disso, uma associação entre hipometilação de ADN global e susceptibilidade à aterosclerose subclínica tem sido relatada em adultos jovens8. Também, em indivíduos saudáveis, o nível de metilação global, medido em ADN de leucócitos no sangue tem sido associado a fatores de risco de doença arterial coronariana, tais como a idade avançada, tabagismo, deficiência de folato, hiperhomocisteína, maiores níveis de lipoproteína de baixa densidade e menores níveis de lipoproteína de alta densidade9 - 14. Vários estudos epidemiológicos têm relatado que o nível de metilação global poderia ser um fator de risco determinante de DCC, mas os resultados foram inconsistentes em várias populações15 - 17. Dados semelhantes faltam na população chinesa, onde diferentes fatores genéticos, de estilo de vida e ambientais podem afetar a metilação do ADN e sua relação com o risco de DCC18 , 19.

Cerca de 55% do genoma humano é constituído por elementos repetitivos20, incluindo aproximadamente 500.000 repetições do LINE-1 o que representa aproximadamente 17% do genoma humano21. Por causa da alta representação em todo o genoma e a forte metilação em tecido normal, o LINE-1 tem sido utilizado como um marcador substituto para a estimativa dos níveis de metilação do ADN global22 , 23.

No presente estudo, investigamos a relação entre a metilação do LINE-1 e o risco de DCC em uma população chinesa. Também examinamos a associação entre a metilação do LINE-1 e os potenciais fatores de risco de doença coronariana, incluindo idade, sexo, índice de massa corporal (IMC), colesterol total, triglicérides, homocisteína, tabagismo, hipertensão e diabetes, bem como o seu efeito modificador na estimativa de risco de DCC relacionado com o LINE-1.

 Métodos Participantes do estudo

Este estudo de caso-controle incluiu 334 pacientes com DAC e 788 indivíduos controle do Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin, China desde março de 2007 a setembro de 2010. Todos os participantes eram indivíduos não aparentados da população chinesa da etnia Han, e os controles foram pareados por frequência com os casos por idade (± 5 anos) e sexo. O diagnóstico de doença arterial coronariana foi estabelecido pela evidência angiográfica de ≥ 70% de estenose de uma grande artéria coronária, ou ≥ 50% da principal artéria coronária esquerda. Os controles tinham um questionário de saúde regular e seu exame detalhado pela análise do histórico, exame físico, eletrocardiograma e ecocardiograma revelaram ausência de doença arterial coronariana ou outras doenças cardíacas. Para ambos os grupos de DCC e de controle, foram excluídos os doentes com angina pectoris espástica, doença arterial periférica, e qualquer tipo de doença auto-imune ou câncer. As informações sobre idade, sexo, altura, peso, tabagismo e diagnóstico de hipertensão e diabetes foram obtidas utilizando um questionário estruturado por meio de entrevistas pessoais. Fumante ocasional foi definido como um fumante de pelo menos 1 cigarro por dia durante pelo menos 6 meses. O IMC foi calculado pela fórmula: peso em quilogramas dividido pelo quadrado da altura do corpo em metros (kg/m2). Informações sobre colesterol total em soro, triglicéridos e homocisteína em plasma foram coletadas com base em prontuários médicos. Consentimento informado por escrito foi obtido de cada participante. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de revisão ética do Conselho de Revisão Institucional do hospital participante.

 Análise de metilação do ADN dos elementos repetitivos do LINE-1

O ADN genómico foi extraído de leucócitos de sangue utilizando o kit de extração de ADN de sangue QIAamp (Qiagen, Xangai, China), e em seguida modificado por meio do tratamento com bissulfito de sódio, utilizando o kit de metilação de ADN Zymo EZ (Zymo, CA, EUA), seguindo o protocolo do fabricante. Um método modificado de pirosequenciamento baseado em PCR originalmente descrito por Yang e cols.22 foi realizado para quantificar a metilação dos elementos repetitivos do LINE-1. Resumidamente, a PCR foi realizada num volume de reação de 50 ul contendo 25 ul de GoTaq Green Master Mix (Promega, WI, EUA), 1 pmol de forward primer (TGA TTT GTT AGG TGT GGG ATA TA), 1 pmol de biotina reverse primer (biotina-AAA AAA AAA ATC TTC CCT TTC), e 50 ng de ADN genómico tratados com bissulfito. As condições cíclicas de PCR foram 95°C durante 30 s, 50°C durante/ 30 s e 72 °C durante 30 s para 40 ciclos. O produto da PCR foi ligado a esferas de sefarose estreptavidina (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia). Estas esferas de sefarose contendo o produto de PCR ligado foram purificadas, lavadas, desnaturadas e novamente lavadas. Em seguida, 0,3 mM de primer de pirosequenciamento (AGT TAG GTG TGG GAT ATA GT) foi recozido ao produto purificado de cadeia única da PCR. O pirosequenciamento foi realizado utilizando o Sistema de Pirosequenciamento PSQ HS 96. Para todos os ensaios foram utilizados controles internos para verificar a conversão de bissulfito. Cada amostra foi analisada em duplicado e a sua média foi utilizada na análise final. O grau de metilação do LINE-1 foi expresso em % de 5-Metilcitosina (%5 mC) sobre o total de citosinas (metiladas+ não metiladas).

 Análise estatística

Foi utilizado o teste do qui-quadrado para analisar as diferenças entre as distribuições das variáveis categóricas e o teste t de Student para as diferenças nas médias das variáveis contínuas entre os casos de DCC e controles. Foram utilizados modelos de regressão linear para avaliar as diferenças no LINE-1 entre os controles em relação à idade, sexo, IMC, colesterol total, triglicérides, homocisteína, tabagismo, hipertensão e diabetes. Foi utilizada a regressão logística não condicional para estimar a odds ratio (OR) para DCC e o intervalo de confiança de 95% (IC). Os pontos de corte quartil e a mediana se basearam nas distribuições do LINE-1 entre os controles. Todos os modelos foram ajustados para idade (como uma variável contínua), sexo e tabagismo (não-fumante: sim vs não). Ajustes adicionais por outras potenciais variáveis de confusão, incluindo IMC, colesterol total, triglicérides, homocisteína, hipertensão e diabetes, não alteraram materialmente as estimativas de risco. Portanto, estas variáveis não foram incluídas nos modelos finais. A modificação do efeito por co-variáveis individuais foi avaliada por meio de testes de razão de verossimilhança. Todos os testes foram bidirecionais e um valor de p < 0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Stata 10.1 (Stata Corporation, College Station, TX).

 Resultados

Os fatores de risco potencial dos indivíduos do estudo caso e controle são apresentados na Tabela 1. Não foram encontradas diferenças significativas entre os casos de DCC e os controles nas distribuições de idade, sexo, IMC, ou triglicerídeos. Quando comparados com os controles, os casos de DCC apresentaram maior número/ de fumantes ocasionais, e tenderam a ter níveis mais elevados de colesterol total e de homocisteína. Os casos também apresentaram diagnóstico de hipertensão e diabetes. Os efeitos do nível de metilação do LINE-1 nos potenciais fatores de risco entre os indivíduos do grupo controle são apresentados na Tabela 2. Como era esperado, o nível do LINE-1 reduziu-se significativamente com o aumento da idade (p = 0,016). Observamos também que o colesterol total (p < 0,001) e o diagnóstico de diabetes (p < 0,001) estiveram inversamente associados aos níveis de metilação do LINE-1. Não foram observadas relações estatisticamente significativas entre o nível de metilação do LINE-1 e o sexo, tabagismo, IMC, triglicéridos, homocisteína, ou diagnóstico de hipertensão.

Fatores potenciais de risco dos sujeitos do estudo
Fatores potenciais de risco Casos, n (%) Controles, n (%) valor de p*
Idade (tercil), anos      
< 59 96 (28,7) 266 (33,8)  
60-65 119 (35,6) 236 (29,9)  
> 65 119 (35,6) 286 (36,3) 0,12
Sexo
Feminino 66 (19,8) 150 (19,0)  
Masculino 268 (80,2) 638 (81,0) 0,78
Fumante ocasional      
Não 156 (47,4) 590 (75,4)  
Sim 173 (52,6) 193 (24,6) < 0,001
Índice de massa corporal (tercil), kg/m2      
< 22,0 97 (29,1) 262 (33,2)  
22,0-25,4 122 (36,5) 264 (33,6)  
25,4 115 (34,4) 262 (33,2) 0,36
Colesterol total (tercil), mmol/L      
< 2,9 57 (17,1) 262 (33,2)  
2,9-4,8 123 (36,8) 263 (33,4)  
> 4,8 154 (46,1) 263 (33,4) < 0,001
Triglicéridos (tercil), mmol/L      
< 1,1 113 (33,8) 265 (33,7)  
1,1-1,6 111 (33,2) 258 (32,8)  
> 1,6 110 (33,0) 263 (33,5) 0,98
Homocisteina (tercil), μmol/L      
< 9 70 (21,6) 241 (32,3)  
9-11 106 (32,7) 252 (33,7)  
> 11 148 (45,7) 254 (34,0) < 0,001
Hipertensão      
Não 128 (38,3) 520 (66,0)  
Sim 206 (61,7) 268 (34,0) < 0,001
Diabetes      
Não 212 (63,5) 638 (81,0)  
Sim 122 (36,5) 150 (19,0) < 0,001
LINE-1 Média (DP) 80,96 (2,40) 81,67 (2,46) < 0,001†

DP: desvio padrão.

Valor de P obtido a partir de um teste x2 comparando casos e controles.

Valor de P obtido de um teste t de Student comparando casos e controles.

 Relação de potenciais fatores de risco para DCC com os níveis de metilação do LINE-1 entre os indivíduos do grupo controle
Potenciais fatores de risco n LINE-1 média (95% IC)* valor de p*
Idade (tercil), anos †      
< 59 266 81,58 (81,33-81,83)  
60-65 236 81,47 (81,22-81,72)  
> 65 286 81,21 (80,97-81,45) 0,016
Sexo ‡
Feminino 150 81,47 (81,14-81,81)  
Masculino 638 81,40 (81,24-81,56) 0,46
Fumante ocasional §      
Não 590 81,59 (81,41-81,76)  
Sim 193 81,05 (80,80-81,31) 0,35
Índice de massa corporal (tercil), kg/m2      
< 22,0 262 81,41 (81,16-81,66)  
22,0-25,4 264 81,24 (80,99-81,48)  
> 25,4 262 81,58 (81,34-81,83) 0,54
Colesterol total (tercil), mmol/L      
< 2,9 262 81,83 (81,57-82,10)  
2,9-4,8 263 81,57 (81,34-81,81)  
> 4,8 263 80,95 (80,72-81,18) < 0,001
Triglicéridos (tercil), mmol/L      
< 1,1 265 81,39 (81,15-81,64)  
1,1-1,6 258 81,43 (81,18-81,68)  
> 1,6 263 81,42 (81,18-81,67) 0,42
Homocisteina (tercil), μmol/L      
< 9 241 81,53 (81,26-81,80)  
9-11 252 81,37 (81,12-81,63)  
> 11 254 81,41 (81,17-81,65) 0,91
Hipertensão      
Não 520 81,53 (81,34-81,72)  
Sim 268 81,25 (81,03-81,47) 0,59
Diabetes      
Não 638 81,59 (81,43-81,75)  
Sim 150 80,85 (80,56-81,14) < 0,001

DCC: Doença cardíaca coronária, IC: Intervalo de confiança. Ajustado para idade, sexo e tabagismo.

Apenas ajustado para sexo e tabagismo.

Apenas ajustado para idade e tabagismo.

Apenas ajustado para idade e sexo.

Os casos de DCC apresentaram redução significativa do nível de metilação do LINE-1 comparando com os controles (média (desvio padrão, DP): 80,96 (2,40) vs 81,67 (2,46), p < 0,001) (Tabela 1). As análises de LINE-1 em quartis, com base na distribuição dos controles, mostram que o nível de metilação LINE-1 esteve inversamente relacionado com o risco de doença coronária (Tabela 3). Em relação aos sujeitos no quarto (o mais alto) quartil de metilação do LINE-1, as ODs (odds ratio) para DCC foram de 0,9 (95% IC, 0,6-1,4), 1,9 (95% IC, 1,3-2,9) e 2,3 (IC 95%, 1,6-3.5) para os indivíduos com metilação do terceiro, segundo e primeiro (o mais baixo) quartil (P tendência < 0,001), respectivamente. Ao utilizar o ponto de corte alternativo com base na mediana, os indivíduos com mais baixa (metilação < mediana) do LINE-1 apresentaramtiveram 2.2-vezes (95% IC, 1.7-3.0) maior risco de doença arterial coronariana em comparação com indivíduos com maior (> mediana) metilação do LINE-1.

Níveis de metilação do LINE-1 em relação ao risco de CHD
LINE-1 (%5mC) Casos, n (%) Controles, n (%) OR (95% IC)*
Quartil †      
Q4 (> 82,73) 55 (16,5) 197 (25,0) 1,0 (referência)
Q3 (81,52-82,72) 49 (14,7) 194 (24,6) 0,9 (0,6-1,4)
Q2 (80,17-81,51) 101 (30,2) 199 (25,3) 1,9 (1,3-2,9)
Q1 (< 80,16) 129 (38,6) 198 (25,1) 2,3 (1,6-3,5)
      Ptendência< 0,001
Mediana †      
Alta (≥ 81,52) 104 (31,1) 391 (49,6) 1,0 (referência)
Baixa (< 81,52) 230 (68,9) 397 (50,4) 2,2 (1,7-3,0)

%5 mC: % de 5-metilcitosinadas; DCC: Doença cardíaca coronária; IC: Intervalo de confiança, ou, odds ratio.

Ajustado para à idade, sexo e tabagismo.

Os quartis e a mediana das medidas LINE-1 foram baseadas em valores entre os indivíduos do grupo controle.

Quando são estratificadas por potenciais fatores de risco, as estimativas de risco de DCC relacionadas com LINE-1 mais baixas tendem a ser mais elevadas entre os indivíduos com maior tercil de homocisteína (OR = 3.2, 95% IC, 3,2-5,2) e naqueles com diagnóstico de hipertensão arterial (OR = 3.1, 95% IC, 2,1-4,8) (Tabela 4). Foram observadas interações estatisticamente significativas em relação ao risco de doença coronariana entre metilação do LINE-1 e o nível de homocisteína (P interação = 0,042), e entre metilação do LINE-1 e hipertensão (P interação = 0,012). A estratificação por outros fatores de risco potenciais, incluindo a idade (tercil), sexo (feminino, masculino) tabagismo (fumante ocasional: não, sim), IMC (tercil), colesterol total (tercil), triglicéridos (tercil) e diagnóstico de diabetes (não, sim), produziu estimativas de risco comparáveis (dados não mostrados). As interações entre metilação do LINE-1 e estes fatores sobre o risco de DCC não foram estatisticamente significativas (dados não mostrados).

Nível do LINE-1 em relação ao risco de DCC, por nível de homocisteína e diagnóstico de hipertensão
Fatores potenciais de risco LINE-1* Casos, n (%) Controles, n (%) OR (95% IC) †
Homocisteina, μmol/L        
< 9 Alta 24 (34,3) 126 (52,3) 1,0 (referência)
Baixa 46 (65,7) 115 (47,7) 2,2 (1,2-4,0)
9-11 Alta 41 (38,7) 115 (45,6) 1,0 (referência)
Baixa 65 (61,3) 137 (54,4) 1,4 (0,9-2,3)
> 11 Alta 36 (24,3) 135 (53,1) 1,0 (referência)
Baixa 112 (75,7) 119 (46,9) 3,2 (2,0-5,2)
Hipertensão        
Não Alta 51 (39,8) 251 (48,3) 1,0 (referência)
Baixa 77 (60,2) 269 (51,7) 1,5 (1,0-2,3)
Sim Alta 53 (25,7) 140 (52,2) 1,0 (referência)
Baixa 153 (74,3) 128 (47,8) 3,1 (2,1-4,8)

DCC: Doença cardíaca coronária; IC: Intervalo de confiança, ou, odds ratio.

A média de LINE-1 foi medida com base em valores entre os indivíduos do grupo controle. Alta: ≥ 81,52 (% 5 mC); Baixa: < 81,52 (% 5mC).

Ajustado para à idade, sexo e tabagismo.

 Discussão

No presente estudo demonstramos uma relação inversa estatisticamente significativa entre o nível de metilação do LINE-1 e o risco de doença coronariana na população chinesa. O nível de homocisteína e o diagnóstico de hipertensão modificaram esta relação inversa. Considerando-se que a DCC é uma das doenças mais comuns, juntamente com a sua severidade24, o fator de risco de hipometilação global pode ter um impacto considerável na saúde pública. Já que a metilação do DNA é um mecanismo epigenético reversível, este marcador com base no sangue poderia oferecer novas e excitantes oportunidades para a prevenção de base populacional da doença coronariana, asim como para a avaliação de risco25.

Níveis de metilação de DNA globais, avaliados em regiões repetidas de DNA derivado de leucócitos, foram relatados como associados ao risco de doença coronariana em populações norte-americanas, de Singapura e da Índia, com observações inconsistentes15 - 17. Em uma coorte de 712 idosos da população norte-americana, a hipometilação do LINE-1 foi associada ao aumento do risco de cardiopatia isquêmica, tanto na análise transversal como longitudinal15. Isto é consistente com os achados do presente estudo. No entanto, em nossos dados, também houve relações significativas entre as mulheres, assim como em diferentes faixas etárias entre metilação do LINE-1 e o risco de doença coronariana, que aportam mais dados ao que foi anteriormente observado na população americana15. Por outro lado, em uma população de Singapura, níveis mais elevados de metilação de Alu/Sat2 repetidos foram relatados em homens com história de infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral (n = 8) do que nos homens controle (n = 121)16; Em uma população da Índia, em casos com doença arterial coronariana (n = 137) foram relatados níveis mais elevados de metilação de seqüências CCGG do que nos controles (n = 150)17. O estilo de vida diferente, as exposições ambientais, as origens genéticas entre as populações , e as diferenças de tamanho da amostra e elementos repetitivos de DNA alvo de medição dos níveis de hipometilação globais26 - 28, podem ter contribuído para os diferentes resultados entre estes estudos.

O efeito modificador da idade nos níveis de metilação do DNA global, de acordo com os dados anteriores29, pode refletir os efeitos cumulativos que a exposição ambiental pode ter nos fatores de risco de DCC. A hipometilação global en DNA de leucócitos tem sido associada à exposição a vários tipos de poluentes ambientais como os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, a poluição atmosférica, o carbono negro e os sulfatos30 - 32. O presente estudo também mostrou que dois fatores de risco de DCC reconhecidos, o colesterol total elevado e o diagnóstico de diabetes, estiveram relacionados com a redução de níveis de metilação do LINE-1, apoiando ainda mais o papel de hipometilação do DNA no desenvolvimento da doença coronária.

Em nossos dados, /não foi registrada associação entre a metilação do LINE-1 e o nível de homocisteína ou diagnóstico de hipertensão, o que difere de alguma forma do que foi observado anteriormente10 , 33. No entanto, observou-se que tanto o nível de homocisteína quanto o diagnóstico de hipertensão modificaram a relação inversa entre metilação do LINE-1 e o risco de doença coronariana. Mais estudos são necessários para replicar estas descobertas e elucidar o mecanismo subjacente do nível de homocisteína e o diagnóstico de hipertensão em seu papel modificador na associação entre a hipometilação global e o risco de doença coronariana.

Nosso estudo teve as vantagens de se basear em uma amostra relativamente grande de amostra, diagnosticar a doença arterial coronariana por evidência angiográfica e efetuar uma análise quantitativa precisa, utilizando a metodologia de pirosequenciamento, o que é adequado para aferir as mudanças sutis na metilação do DNA. A principal limitação do presente estudo foi a natureza retrospectiva do desenho do estudo, ou seja, a coleta de amostras de sangue de pacientes com doença coronariana ocorreu após o diagnóstico de DCC. Se o diagnóstico de doença arterial coronariana tivesse tido qualquer impacto directo ou indirecto na metilação global do DNA através da mudança de estilo de vida ou da exposição ambiental do sujeito, poderíamos ter observado uma associação confusa ou enviesada entre a metilação do LINE-1 e o risco de doença coronariana. No entanto, observaram-se estimativas de risco semelhantes, quando a análise de regressão logística foi restrita restringida a 212 casos de DCC recém-diagnosticados, em comparação com os controles (dados não mostrados). Além disso, nossos achados de que os níveis de metilação do LINE-1 eram reduzidos em indivíduos controle com fatores de risco de DCC, tais como a idade avançada, colesterol total elevado, e diagnóstico de diabetes, indicam que a metilação reduzida do LINE-1 nos sujeitos controle de alto risco pode resultar de condições relacionadas com o risco de doença coronariana. Além disso, nas análises longitudinais do estudo de Baccarelli e cols.31, tem-se observado um menor aumento do risco aumentado de cardiopatia isquêmica relacionado ao LINE-1.

 Conclusão

Os resultados do presente estudo corroboram que a hipometilação do DNA global medido em LINE-1 repetido está associada ao risco de doença coronariana na população chinesa. Fatores potenciais de risco de DCC tais como a idade avançada, o colesterol total elevado e o diagnóstico de diabetes podem ter impacto na metilação global do DNA, exercendo através deles o seu efeito sobre o risco de doença coronariana.

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Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

 Original Articles LINE-1 Hypomethylation is Associated with the Risk of Coronary Heart Disease in Chinese Population Wei Li 1 Liu Shuchuan 2 Su Zhendong 1 Cheng Rongchao 1 Bai Xiuping 1 Li Xueqi 1 Department of Cardiology, The Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin - China Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin - China Mailing Address: Xueqi Li, No. 37 Yiyuan Street, Nan Gang. Postal Code 150001, Harbin. E-mail: xueqi_li@163.com

Author contributions

Conception and design of the research and Analysis and interpretation of the data: Wei L, Liu S, Su Z, Cheng R, Bai X, Li X; Acquisition of data: Wei L, Su Z, Cheng R; Statistical analysis: Wei L, Bai X, Li X; Writing of the manuscript: Wei L, Liu S, Su Z, Cheng R, Bai X; Critical revision of the manuscript for intellectual content: Li X.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Li Wei, from the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University.

Potential Conflict of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

 Background:

Global methylation level in blood leukocyte DNA has been associated with the risk of coronary heart disease (CHD), with inconsistent results in various populations. Similar data are lacking in Chinese population where different genetic, lifestyle and environmental factors may affect DNA methylation and its risk relationship with CHD.

 Objectives:

To examine whether global methylation is associated with the risk of CHD in Chinese population.

 Methods:

A total of 334 cases with CHD and 788 healthy controls were included. Global methylation in blood leukocyte DNA was estimated by analyzing LINE-1 repeats using bisulfite pyrosequencing.

 Results:

In an initial analysis restricted to control subjects, LINE-1 level reduced significantly with aging, elevated total cholesterol, and diagnosis of diabetes. In the case-control analysis, reduced LINE-1 methylation was associated with increased risk of CHD; analysis by quartile revealed odds ratios (95%CI) of 0.9 (0.6-1.4), 1.9 (1.3-2.9) and 2.3 (1.6-3.5) for the third, second and first (lowest) quartile (Ptrend < 0.001), respectively, compared to the fourth (highest) quartile. Lower (<median) LINE-1 methylation was associated with a 2.2-fold (95%CI = 1.7-3.0) increased risk of CHD. The lower LINE-1-related CHD risk estimates tended to be stronger among subjects with the highest tertile of homocysteine (Pinteraction = 0.042) and those with diagnosis of hypertension (Pinteraction = 0.012).

 Conclusion:

LINE-1 hypomethylation is associated with the risk of CHD in Chinese population. Potential CHD risk factors such as older age, elevated total cholesterol, and diagnosis of diabetes may have impact on global DNA methylation, whereby exerting their effect on CHD risk.

 Epigenetics Coronary heart disease Global methylation LINE-1 Blood leukocyte DNA Introduction

Coronary heart disease (CHD) constitutes 90-95% of all cases with cardiovascular diseases, which rank the leading cause of death in the world1 , 2. Age, sex, diets, cigarette smoking, hypertension, diabetes, dyslipidemia, homocysteine, obesity, family history of CHD and genetic factors have been characterized to play a major role in the CHD etiology2 - 4.

Epigenetic modification, especially aberrant global DNA methylation pattern, is increasingly recognized as a key factor in the development of CHD. Global DNA hypomethylation may induce genomic instability and deregulate gene transcription, thereby contributing to the development of various human diseases including CHD5. In animal models, global DNA hypomethylation has been associated with aortic lipid deposition, a predictor of future atherosclerosis6 , 7. Further, an association between global DNA hypomethylation and susceptibility to subclinical atherosclerosis has been reported in young adults8. In addition, in healthy subjects, global methylation level measured in blood leukocyte DNA has been associated with risk factors for CHD, such as aging, cigarette smoking, folate deficiency, hyperhomocysteinemia, higher levels of low density lipoprotein and lower levels of high density lipoprotein9 - 14. Several epidemiological studies have reported that global methylation level could be a determinant risk factor for CHD, but the results were inconsistent in various populations15 - 17. Similar data are lacking in Chinese population where different genetic, lifestyle and environmental factors may affect DNA methylation and its risk relationship with CHD18 , 19.

About 55% of human genome consists of repetitive elements20, including approximately 500,000 LINE-1 repeats which represent approximately 17% of the human genome21. Because of high representation throughout the genome and heavy methylation in normal tissue, LINE-1 has been used as a surrogate marker for estimating global DNA methylation levels22 , 23.

In the present study, we have investigated the relationship between LINE-1 methylation and the risk of CHD in a Chinese population. We also examined the association between LINE-1 methylation and potential risk factors for CHD including age, sex, body mass index (BMI), total cholesterol, triglyceride, homocysteine, smoking status, hypertension and diabetes, as well as their modifying effect on the LINE-1-related risk estimate for CHD.

 Methods Study participants

This case-control study enrolled 334 patients with CHD and 788 control subjects from the Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin, China from March 2007 to September 2010. All participants were unrelated individuals from the Chinese Han population, and the controls were frequency-matched to the cases by age (± 5 years) and sex. The diagnosis of CHD was established by angiographic evidence of ≥70% stenosis of 1 major coronary artery, or ≥ 50% of the left main coronary artery. The controls filled a regular health survey and their detailed examination by history analysis, physical examination, electrocardiography, and echocardiography revealed absence of CHD or other heart diseases. For both CHD and control groups, subjects with spastic angina pectoris, peripheral artery disease, and any kind of autoimmune-related disease or cancers were excluded. Information on age, sex, height, weight, cigarette smoking, and diagnosis of hypertension and diabetes was obtained by using a structured questionnaire through in-person interviews. An ever-smoker was defined as a smoker of at least 1 cigarette per day for at least 6 months. BMI was calculated using the formula: body weight in kilograms divided by the square of body height in meters (kg/m2). Information on serum total cholesterol, triglyceride and plasma homocysteine was collected on the basis of medical records. Written informed consent was obtained from each participant. The study protocol was approved by the ethics review committee of the Institutional Review Board of the participant hospital.

 DNA methylation analysis of LINE-1 repetitive elements

Genomic DNA was extracted from blood leukocytes using the QIAamp DNA Blood Extraction kit (Qiagen, Shanghai, China), and then modified by treatment with sodium bisulfite using the Zymo EZ DNA Methylation kit (Zymo, CA, USA), following the manufacturer's protocol. A modified method of PCR-based pyrosequencing originally described by Yang et al22 was performed to quantitate methylation of the LINE-1 repetitive elements. In brief, PCR was carried out in a 50-μl reaction volume containing 25 μl of GoTaq Green Master mix (Promega, WI, USA), 1 pmol of forward primer (TTT TGA GTT AGG TGT GGG ATA TA), 1 pmol of biotinylated reverse primer (biotin-AAA ATC AAA AAA TTC CCT TTC), and 50 ng of bisulfite-treated genomic DNA. PCR cycling conditions were 95°C for 30 s, 50°C for 30 s and 72°C for 30 s for 40 cycles. PCR product was bound to streptavidin sepharose beads (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). These sepharose beads containing the bound PCR product were purified, washed, denatured and washed again. Then, 0.3-μM pyrosequencing primer (AGT TAG GTG TGG GAT ATA GT) was annealed to the purified single-stranded PCR product. Pyrosequencing was performed using the PSQ HS 96 Pyrosequencing System. For all assays we used built-in controls to verify bisulfite conversion. Each sample was assayed in duplicate and their average was used in final analysis. The degree of LINE-1 methylation was expressed as % 5-methylated cytosines (%5mC) over total (methylated + unmethylated) cytosines.

 Statistical analysis

Chi-square test was used to examine the differences in the distributions of categorical variables and Student's t-test for the differences in means of continuous variables between CHD cases and control subjects. Linear regression models were used to evaluate LINE-1 differences among controls in relation to age, sex, BMI, total cholesterol, triglyceride, homocysteine, smoking status, hypertension and diabetes. Unconditional logistic regression was used to estimate odds ratio (OR) for CHD and 95% confidence interval (CI). Quartile and median cut-points were based on LINE-1 distributions among controls. All models were adjusted for age (as a continuous variable), sex, and smoking status (ever-smoker: yes vs no). Further adjustment by other potential confounding variables, including BMI, total cholesterol, triglyceride, homocysteine, hypertension and diabetes, did not materially alter the risk estimates. Therefore, these variables were not included in the final models. Effect modification by individual covariates was assessed using likelihood-ratio tests. All tests were two-sided and a P value of <0.05 was considered significant. Statistical analyses were conducted using the Stata 10.1 (Stata Corporation, College Station, TX).

 Results

The potential risk factors of study subjects by case and control status are shown in Table 1. No significant differences between CHD cases and control subjects were found in the distributions of age, sex, BMI, or triglyceride. When compared with the controls, CHD cases were more likely to be ever-smoker, and tended to have higher levels of total cholesterol and homocysteine. Cases also were likely to have diagnosis of hypertension and diabetes.

Potential risk factors of study subjects
Potential risk factors Cases, n (%) Controls, n (%) p value*
Age (tertile), years      
< 59 96 (28.7) 266 (33.8)  
60-65 119 (35.6) 236 (29.9)  
> 65 119 (35.6) 286 (36.3) 0.12
Sex      
Female 66 (19.8) 150 (19.0)  
Male 268 (80.2) 638 (81.0) 0.78
Ever-smoker      
No 156 (47.4) 590 (75.4)  
Yes 173 (52.6) 193 (24.6) < 0.001
Body mass index (tertile), kg/m2      
< 22.0 97 (29.1) 262 (33.2)  
22.0-25.4 122 (36.5) 264 (33.6)  
> 25.4 115 (34.4) 262 (33.2) 0.36
Total cholesterol (tertile), mmol/L      
< 2.9 57 (17.1) 262 (33.2)  
2.9-4.8 123 (36.8) 263 (33.4)  
> 4.8 154 (46.1) 263 (33.4) < 0.001
Triglyceride (tertile), mmol/L      
< 1.1 113 (33.8) 265 (33.7)  
1.1-1.6 111 (33.2) 258 (32.8)  
> 1.6 110 (33.0) 263 (33.5) 0.98
Homocysteine (tertile), μmol/L      
< 9 70 (21.6) 241 (32.3)  
9-11 106 (32.7) 252 (33.7)  
> 11 148 (45.7) 254 (34.0) < 0.001
Hypertension      
No 128 (38.3) 520 (66.0)  
Yes 206 (61.7) 268 (34.0) < 0.001
Diabetes      
No 212 (63.5) 638 (81.0)  
Yes 122 (36.5) 150 (19.0) < 0.001
Mean LINE-1 (SD) 80.96 (2.40) 81.67 (2.46) < 0.001†

SD: standard deviation.

P value obtained from a X2-test comparing cases and controls.

P value obtained from a Student's t-test comparing cases and controls.

The effects of potential risk factors on LINE-1 methylation level among control subjects are shown in Table 2. As expected, LINE-1 level reduced significantly with increasing age (p = 0.016). We also observed that total cholesterol (p < 0.001) and diagnosis of diabetes (p < 0.001) were inversely associated with LINE-1 methylation levels. No statistically significant relationships were observed between LINE-1 methylation level and sex, smoking status, BMI, triglyceride, homocysteine, or diagnosis of hypertension.

Relation of potential CHD risk factors to LINE-1 methylation levels among control subjects
Potential risk factors n LINE-1, mean (95% CI)* P value*
Age (tertile), years †      
< 59 266 81.58 (81.33-81.83)  
60-65 236 81.47 (81.22-81.72)  
> 65 286 81.21 (80.97-81.45) 0.016
Sex ‡
Female 150 81.47 (81.14-81.81)  
Male 638 81.40 (81.24-81.56) 0.46
Ever smoker §      
No 590 81.59 (81.41-81.76)  
Yes 193 81.05 (80.80-81.31) 0.35
Body mass index (tertile), kg/m2      
< 22.0 262 81.41 (81.16-81.66)  
22.0-25.4 264 81.24 (80.99-81.48)  
> 25.4 262 81.58 (81.34-81.83) 0.54
Total cholesterol (tertile), mmol/L      
< 2.9 262 81.83 (81.57-82.10)  
2.9-4.8 263 81.57 (81.34-81.81)  
> 4.8 263 80.95 (80.72-81.18) < 0.001
Triglyceride (tertile), mmol/L      
< 1.1 265 81.39 (81.15-81.64)  
1.1-1.6 258 81.43 (81.18-81.68)  
> 1.6 263 81.42 (81.18-81.67) 0.42
Homocysteine (tertile), μmol/L      
< 9 241 81.53 (81.26-81.80)  
9-11 252 81.37 (81.12-81.63)  
> 11 254 81.41 (81.17-81.65) 0.91
Hypertension      
No 520 81.53 (81.34-81.72)  
Yes 268 81.25 (81.03-81.47) 0.59
Diabetes      
No 638 81.59 (81.43-81.75)  
Yes 150 80.85 (80.56-81.14) < 0.001

CHD: Coronary heart disease; CI: Confidence interval.

Adjusted for age, sex, and smoking status.

Only adjusted for sex and smoking status.

Only adjusted for age and smoking status.

Only adjusted for age and sex.

CHD cases had significantly reduced LINE-1 methylation level than controls (mean (standard deviation, SD): 80.96 (2.40) vs 81.67 (2.46), p < 0.001) (Table 1). Analyses of LINE-1 in quartiles, based on the distribution in controls, show that the LINE-1 methylation level was inversely associated with the risk of CHD (Table 3). Relative to subjects in the fourth (highest) quartile of LINE-1 methylation, ORs for CHD were 0.9 (95% CI, 0.6-1.4), 1.9 (95% CI, 1.3-2.9) and 2.3 (95% CI, 1.6-3.5) for the subjects with methylation in the third, second and first (lowest) quartile (P trend < 0.001), respectively. When using the alternative cut-point based on the median, individuals with lower (<median) LINE-1 methylation had a 2.2-fold (95% CI, 1.7-3.0) increased risk of CHD compared with subjects with higher (> median) LINE-1 methylation.

LINE-1 methylation levels in relation to CHD risk
LINE-1 (%5mC) Cases, n (%) Controls, n (%) OR (95% CI)*
Quartile †      
Q4(> 82.73) 55 (16.5) 197 (25.0) 1.0 (reference)
Q3(81.52-82.72) 49 (14.7) 194 (24.6) 0.9 (0.6-1.4)
Q2(80.17-81.51) 101 (30.2) 199 (25.3) 1.9(1.3-2.9)
Q1(< 80.16) 129 (38.6) 198 (25.1) 2.3 (1.6-3.5)
      Ptrend < 0.001
Median †      
High(≥ 81.52) 104 (31.1) 391 (49.6) 1.0 (reference)
Low(< 81.52) 230 (68.9) 397 (50.4) 2.2 (1.7-3.0)

%5mC: % 5-methylated cytosines; CHD: coronary heart disease; CI: confidence interval; OR: odds ratio.

Adjusted for age, sex, and smoking status.

The quartiles and the median of LINE-1 measures were based on values among control subjects.

When stratified by potential risk factors, the lower LINE-1-related CHD risk estimates tended to be stronger among subjects with the highest tertile of homocysteine (OR = 3.2, 95% CI, 3.2-5.2) and those with diagnosis of hypertension (OR = 3.1, 95 %CI, 2.1-4.8) (Table 4). Statistically significant interactions in relation to CHD risk were observed between LINE-1 methylation and homocysteine level (P interaction = 0.042), and between LINE-1 methylation and hypertension (P interaction = 0.012). Stratification by other potential risk factors including age (tertile), sex (female, male), smoking status (ever-smoker: no, yes), BMI (tertile), total cholesterol (tertile), triglyceride (tertile), and diagnosis of diabetes (no, yes), produced comparable risk estimates (data not shown). The interactions between LINE-1 methylation and these factors on CHD risk were not statistically significant (data not shown).

LINE-1 level in relation to CHD risk, by homocysteine level and diagnosis of hypertension
Potential risk factors LINE-1* Cases, n (%) Controls, n (%) OR (95% CI) †
Homocysteine, umol/L
< 9 High 24 (34.3) 126 (52.3) 1.0 (reference)
Low 46 (65.7) 115 (47.7) 2.2 (1.2-4.0)
9-11 High 41 (38.7) 115 (45.6) 1.0 (reference)
Low 65 (61.3) 137 (54.4) 1.4 (0.9-2.3)
> 11 High 36 (24.3) 135 (53.1) 1.0 (reference)
Low 112 (75.7) 119 (46.9) 3.2 (2.0-5.2)
Hypertension
No High 51 (39.8) 251 (48.3) 1.0 (reference)
Low 77 (60.2) 269 (51.7) 1.5 (1.0-2.3)
Yes High 53 (25.7) 140 (52.2) 1.0 (reference)
Low 153 (74.3) 128 (47.8) 3.1 (2.1-4.8)

CHD: coronary heart disease; CI: confidence interval; OR: odds ratio.

The median of LINE-1 measure was based on values among control subjects. High: ≥ 81.52 (%5mC); Low: < 81.52 (%5mC).

Adjusted for age, sex, and smoking status.

 Discussion

In the present study, we demonstrated a statistically significant, inverse relationship between LINE-1 methylation level and CHD risk in the Chinese population. Homocysteine level and diagnosis of hypertension modified this inverse relationship. Considering that CHD is one of the most common diseases, along with its severity24, the risk factor of global hypomethylation could have a sizable impact on public health. Because DNA methylation is a reversible epigenetic mechanism, this blood-based marker could offer exciting new opportunities for population-based CHD prevention as well as risk assessment25.

Global DNA methylation levels, assessed in repeat regions from leukocyte-derived DNA, have been reported to be associated with risk of CHD in American, Singapore, and Indian populations, with inconsistent observations15 - 17. In a cohort of 712 elderly men from American population, LINE-1 hypomethylation was associated with increased risk for ischemic heart disease in both cross-sectional and longitudinal analyses15. This is consistent with the findings in the present study. However, in our data, there were also significant relationships among women as well as in different age groups between LINE-1 methylation and CHD risk, which provide further data to what was previously observed in the American population15. On the other hand, in a Singapore population, higher methylation levels of Alu/Sat2 repeats were reported in males with a history of myocardial infarction or stroke (n = 8) than in control males (n = 121)16; In an Indian population, higher methylation levels of CCGG sequences were reported in cases with coronary artery disease (n = 137) than in controls (n = 150)17. The different lifestyle, environmental exposures, and genetic backgrounds among the populations, and differences in sample size and repetitive elements of DNA targeted for measuring global hypomethylation levels26 - 28, might contributed to the different findings across these studies.

The modifying effect of age on global DNA methylation levels, consistent with previous data29, may reflect age-related cumulative effects of enviromental exposures to risk factors for CHD. Global hypomethylation in leukocyte DNA has been associated with exposure to multiple types of enviromental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons, particulate air pollution, black carbon and sulfates30 - 32. The present study also showed that two recognized CHD risk factors, elevated total cholesterol and diagnosis of diabetes, were related to reduced LINE-1 methylation levels, further supporting a role of DNA hypomethylation in the development of CHD.

In our data, there was a lack of association between LINE-1 methylation and homocysteine level or diagnosis of hypertension, which differs somewhat from what was observed previously10 , 33. However, we observed that both homocysteine level and diagnosis of hypertension modified the inverse relationship between LINE-1 methylation and CHD risk. Further studies are warranted to replicate these findings and to elucidate the underlying mechanism of homocysteine level and diagnosis of hypertension on their modifying role in the association between global hypomethylation and CHD risk.

Our study had the advantages of being based on a relatively large sample size, diagnosis of CHD by angiographic evidence, and accurate quantitative analysis using pyrosequencing methodology, which is suitable for measuring subtle changes in DNA methylation. The chief limitation of the present study was the retrospective nature of the study design, i.e., the collection of blood samples from CHD patients took place after their CHD diagnosis. If the diagnosis of CHD had any direct or indirect impact on global DNA methylation through changing subject's lifestyle or environmental exposure, we could have observed a confounded or biased association between LINE-1 methylation and CHD risk. However, similar risk estimates were observed when the logistic regression analysis was restricted to 212 newly diagnosed CHD cases as compared to controls (data not shown). Moreover, our finding that LINE-1 methylation levels were reduced in control subjects with CHD risk factors such as older age, elevated total cholesterol, and diagnosis of diabetes, indicates that reduced LINE-1 methylation in high-risk control subjects may result from exposures related to the risk of CHD. In addition, in the longitudinal analyses in the study by Baccarelli et al31, lower LINE-1-related increased risk of ischemic heart disease has been observed.

 Conclusion

The findings of the present study support global DNA hypomethylation measured in LINE-1 repeats is associated with the risk of CHD in the Chinese population. Potential CHD risk factors such as older age, elevated total cholesterol and diagnosis of diabetes may have impact on global DNA methylation, whereby exerting their effect on CHD risk.

Sources of Funding

There were no external funding sources for this study.