Arq Bras CardiolArquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de CardiologiaypnCT9V7q9tYChMkqPsfhFmS0066-782X201400030000200002S0066-782X201400500000810.5935/abc.20140015Artigos OriginaisEstresse Isolado ou Associado ao Etanol Libera Prostanóides
em Aorta de Ratos via α2-AdrenoceptoresBaptistaRafaela de Fátima Ferreira12TaipeiroElane de Fátima2QueirozRegina Helena Costa3ChiesAgnaldo Bruno12CordelliniSandra1Departamento de FarmacologiaInstituto de BiociênciasUniversidade Estadual PaulistaSão PauloSPBrasilDepartamento de Farmacologia - Instituto de
Biociências - Universidade Estadual Paulista - UNESP, São Paulo, SP -
BrasilLaboratório de FarmacologiaFaculdade de Medicina de MaríliaSPBrasilLaboratório de Farmacologia - Faculdade de Medicina
de Marília - FAMEMA, SP - BrasilDepartamento de Análise Clínica - Toxicológica e
Ciência de AlimentosFaculdade de Ciências FarmacêuticasUSPSão PauloSPBrasilDepartamento de Análise Clínica - Toxicológica e
Ciência de Alimentos - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP, São Paulo, SP -
BrasilCorrespondência: Sandra Cordellini. Departamento de Farmacologia,
Instituto de Biociências, UNESP. CEP 18618-970, Rubião Júnior s/n, Botucatu, São
Paulo, SP - Brasil. E-mail: cordelli@ibb.unesp.br
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa, Obtaining funding, Análise estatística, Obtenção
de financiamento, Redação do manuscrito: Baptista RFF, Chies AB, Cordellini S;
Obtenção de dados: Baptista RFF, Taipeiro EF, Queiroz RHC; Análise e interpretação
dos dados: Baptista RFF, Taipeiro EF, Queiroz RHC, Chies AB, Cordellini S; Revisão
crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Baptista RFF, Taipeiro EF,
Chies AB, Cordellini S.
Potencial Conflito de Interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes
Vinculação Acadêmica
Este artigo é parte de tese de Doutorado de Rafaela de Fátima Ferreira Baptista
pela Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" UNESP/Botucatu.
100220140420141023211218200720133009201302102013This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative
Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted
non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the
original work is properly cited. Fundamento:
Estresse e etanol são ambos, independentemente, importantes fatores de risco
cardiovascular.
Objetivo:
avaliar o risco cardiovascular do consumo de etanol e exposição ao estresse,
isolados e em associação, em ratos machos adultos.
Métodos:
Os ratos foram separados em quatro grupos: controle, etanol (20% na água de beber
durante seis semanas), estresse (imobilização 1h dia/5 dias por semana/ 6 semanas)
e estresse/etanol. As curvas de concentração-resposta à noradrenalina - na
ausência e na presença de ioimbina, L-NAME ou indometacina - ou fenilefrina foram
determinadas em aortas torácicas com e sem endotélio. EC50 e resposta máxima (n =
8-12) foram comparadas através de ANOVA de dois fatores (two-way) / método de
Bonferroni.
Resultados:
Estresse ou estresse em associação com o consumo de etanol aumentaram as respostas
máximas de noradrenalina em aortas intactas. Essa hiper-reatividade foi eliminada
pela remoção do endotélio, ou pela presença da indometacina ou ioimbina, mas não
foi alterada pela presença de L-NAME. Enquanto isso, o consumo de etanol não
alterou a reatividade à noradrenalina. As respostas da fenilefrina em aortas com e
sem endotélio também permaneceram inalteradas independentemente do protocolo.
Conclusão:
O estresse crônico aumentou as respostas aórticas dos ratos à noradrenalina. Esse
efeito é dependente do endotélio vascular e envolve a liberação de prostanóides
vasoconstritores através da estimulação de α-2 adrenoceptores endoteliais. Além
disso, o consumo crônico de etanol pareceu não influenciar as respostas de
noradrenalina em aorta de rato, nem modificar o aumento de tais respostas
observadas em consequência da exposição ao estresse.
EstresseConsumo de bebidas alcoólicasNorepinefrinaAgonistas de receptores adrenérgicos alfa 2RatosCAPESIntrodução
O estresse crônico é um importante fator de risco para o desenvolvimento de patologias
cardiovasculares1, tais como
aterosclerose2 disfunção endotelial3 e hipertensão4. No entanto, a gravidade dos danos cardiovasculares causados por exposição
ao estresse depende da natureza do estressor, bem como da sua intensidade e duração5.
A literatura relata que o estresse crônico prejudica a função endotelial, evidenciada
por uma diminuição do relaxamento vascular induzido pela acetilcolina2, bem como uma redução da atividade da óxido
nítrico sintase (NOS) na aorta6. Por sua vez, a
exposição ao estresse agudo reduz a contração induzida por noradrenalina e aumenta o
relaxamento induzido pela acetilcolina na aorta de rato1,7.
O consumo crônico de etanol também pode causar modificações cardiocirculatórias que
contribuem para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares8,9. De acordo com
essa possível associação, o consumo de etanol 20% ao longo de seis semanas aumentou a
resposta do leito vascular mesentérico à fenilefrina em ratos Wistar8. O consumo de etanol também aumentou as respostas
à agonistas simpáticos dentro dos vasos de condutância - vasos cujos mecanismos de
modulação endotelial funcionam de modo diferente daqueles dos vasos de resistência. De
fato, o consumo de etanol a 20% durante seis semanas aumentou as respostas à fenilefrina
na aorta de ratos Wistar9. O consumo de etanol a
36% ao longo de 18 semanas também elevou as respostas da noradrenalina na artéria
mesentérica de ratos10. Além disso, o consumo
crônico de etanol 10% aumentou a resposta da noradrenalina na aorta de ratos machos
Sprague-Dawley11. Por outro lado, o consumo
crônico de etanol 20% diminuiu12 ou não
influenciou13 respostas à fenilefrina em
aortas de rato. Essas diferenças podem ser atribuídas às diferenças entre os protocolos
experimentais ou características do modelo animal14.
Embora tanto o etanol quanto o estresse desempenhem papéis importantes no
desenvolvimento de doença cardiovascular, ainda persistem dúvidas acerca de seus efeitos
sobre a capacidade de resposta vascular especificamente. Estas dúvidas são ainda mais
numerosas quando se consideram os efeitos de ambos os fatores em associação. Assim, o
objetivo deste estudo foi o de abordar estas questões persistentes. Especificamente, o
objetivo desse estudo foi investigar, em ratos adultos, a resposta vascular adaptativa à
agonistas simpáticos induzida pelo consumo de álcool e exposição ao estresse (ambos
isoladamente e em associação) e examinar seu mecanismo.
MétodosDesenho experimental
Ratos Wistar machos adultos (100 a 120 dias de idade) foram alojados em gaiolas de
plástico com um ciclo claro escuro de 12 horas (a 23 ± 2˚ C) e alimentados com ração
normal de laboratório. Por seis semanas, os animais foram separados em quatro grupos:
grupo controle, que recebeu água "ad libitum"; grupo de estresse, que foi imobilizado
em um tubo de contenção metálica (1 hora/dia, 5 dias/semana) para restringir
completamente seus movimentos, preservando apenas a respiração; grupo etanol, que
recebeu uma solução de etanol a 20% em vez de água para beber15; e grupo estresse/etanol, que foi submetido ao estresse de
imobilização e recebeu uma solução de etanol a 20%. Os animais dos grupos etanol e
estresse/etanol foram adaptados ao consumo de etanol, aumentando gradualmente a
concentração de etanol na solução (5% na primeira semana, 10% na segunda semana, e
20% a partir da terceira semana em diante).
Todos os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o
Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo National Institutes
of Health dos EUA16 e foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Biociências de Botucatu da
Universidade Estadual Paulista.
Etanol no sangue
Sangue (5 mL por rato) foi coletado da aorta de ratos anestesiados em seringas
contendo heparina. Amostras de sangue (1 mL) foram colocadas em frascos headspace de
10 mL, aos quais foi adicionado 1,0 g de cloreto de sódio, 1,0 mL de água, e 100 mL
de solução padrão interno (acetonitrila, 1 mL L-1). A análise do etanol
foi realizada utilizando um cromatógrafo de fase gasosa GC 17A (Shimadzu, Kyoto,
Japão) equipado com um detector de ionização de chama e um amostrador de headspace
HSS-4A (Shimadzu). Os padrões de calibração (0,10-3,16 mg mL-1) foram
preparados em frascos de headspace. As concentrações de etanol são expressas em mg
mL-1 no sangue.
Anéis aórticos
Os animais foram sacrificados utilizando um dispositivo de guilhotina. Após a
toracotomia, a aorta torácica descendente foi removida e dissecada em segmentos de
3-4 mm (dois anéis). Os anéis foram montados dentro de uma câmara de órgãos de 2 mL
contendo solução de Krebs-Henseleit (NaCl 130, KCl 4,7, CaCl2 1,6,
KH2PO4 1,2, MgSO4 1,2, NaHCO3 15,
glucose 11,1; em mmol/L). Na câmara de órgãos, os anéis foram fixados a um gancho de
aço inoxidável que foi ligado a um suporte estacionário, bem como a um segundo
gancho, o qual foi ligado a um transdutor de força isométrica. A solução de
Krebs-Henseleit foi mantida em pH 7,4 e a 37 °C e borbulhada continuamente com uma
mistura de 95% de O2 e 5% de CO2. A tensão foi monitorada
continuamente e gravada utilizando-se um sistema de aquisição de dados Powerlab 8/30
(ADInstruments, Castle Hill, NSW, Austrália). Antes da curva de concentração-resposta
aos agonistas, os anéis foram equilibrados durante 60 minutos sob uma tensão de
repouso de 1,5 g, que é a tensão ideal para induzir a contração máxima.
O estado funcional do endotélio foi testado no início da curva de
concentração-resposta pela capacidade de acetilcolina 10-4M em induzir
respostas vasodilatadoras em preparações pré-contraídas pela fenilefrina
10-5M. Preparações que apresentaram mais de 80% de relaxamento foram
consideradas como tendo um endotélio intacto, enquanto aquelas que não mostraram
relaxamento foram consideradas completamente desprovidas de endotélio. Alguns anéis
foram submetidos à remoção mecânica do endotélio. Preparações com e sem endotélio
foram estudadas em paralelo.
Ensaio de banho de órgãos
A noradrenalina (10-10 M a 10-4 M, Sigma-Aldrich) ou
fenilefrina (10-10 M a 10-4 M, Sigma-Aldrich) foram
cumulativamente adicionadas ao banho de órgãos, e as respostas evocadas (g) foram
plotadas para se obter uma curva de concentração-resposta. Quando apropriado, as
respostas à noradrenalina também foram determinadas em preparações pré-tratadas por
30 min com 10-4M de L-NAME (Sigma-Aldrich) ou 10-5M de
indometacina (Sigma-Aldrich), - inibidores não-seletivos de NOS e de ciclo-oxigenase
(COX), respectivamente. Em outra série de experimentos, foram determinadas as
respostas à noradrenalina em anéis pré-tratados durante 30 minutos com
10-6 M de ioimbina (Sigma-Aldrich), um antagonista α2-adrenérgico. Os
inibidores e o antagonista foram adicionados durante o último período de
estabilização de 30 minutos e mantiveram-se em contato com a preparação até o final
do experimento.
A regressão não-linear (declive variável) das curvas de concentração-efeito obtida
revelou a Rmax (resposta máxima; ponto mais alto de cada curva de
concentração resposta) e EC50 (logaritmo negativo da concentração que
provocou 50% da resposta máxima). O valor EC50 é indicativo da
sensibilidade à droga estudada.
Determinação de nitritos/nitratos (NO<sub>2</sub>/NO<sub>3</sub>)
Alíquotas de 100 µl das amostras de plasma de diferentes grupos
experimentais foram desproteinadas com 200 µl de etanol absoluto, no
freezer (-20 ºC) por 30 minutos. Também foram submetidas à centrifugação (10.000 rpm
durante 5 minutos) e o sobrenadante foi coletado. A fim de determinar o total de
(NO2/NO3) no plasma, a seguinte mistura foi utilizada como
meio de reação: tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, cofatores (concentração final
de 100 µM de NADPH e FAD 5 mM) e nitrato redutase de Aspergillus
(Sigma) a uma concentração de 0,1 U/mL. As amostras foram então incubadas por 3 horas
em banho-maria a 37 °C antes de serem adicionadas ao reagente de Griess I (1% de
sulfanilamida em 5% de ácido fosfórico) e reagente de Griess II
(naftil-etileno-diamina a 0,1%). Em seguida, o cromóforo do composto foi lido em um
espectrofotômetro a 540 nm. A concentração das amostras foi calculada utilizando-se
uma curva padrão com concentrações conhecidas de NaNO2 (0,40-200
µl) e expressa em mM/L.
Análise estatística
A concentração de agentes vasoativos que produzia uma resposta que era 50% da
resposta máxima (EC50) foi calculada em cada experiência. Os dados são
apresentados como média ± EPM. As respostas máximas (Rmax) e os valores de
EC50 foram comparados por ANOVA de dois fatores seguido pelo pós-teste
de Bonferroni, em que uma variável foi o consumo do etanol e a outra a exposição ao
estresse de imobilização. O valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente
significativo.
Resultados
As respostas à noradrenalina observadas em aortas intactas de animais expostos a
estresse e estresse/etanol foram maiores do que as observadas em aortas intactas de
animais de controle. Esses desfechos resultaram em valores elevados de Rmax.
Os animais expostos ao etanol isoladamente, no entanto, não demonstraram respostas mais
elevadas do que os controles (Figura 1A). A
presença de L-NAME aumentou a Rmax à noradrenalina em anéis aórticos de
animais dos grupos controle e etanol, permitindo respostas de magnitude semelhante com
preparações retiradas dos grupos estresse e estresse/etanol (Figura 1B).
Curvas de concentração-resposta à noradrenalina obtidas de anéis de aorta
torácica intactos de animais expostos ao consumo de etanol e/ou estresse, na
ausência ou na presença de L-NAME (10<sup>-4</sup>M), indometacina
(10<sup>-5</sup>M) ou ioimbina (10<sup>-6</sup>M). Os valores são expressos em
médias ± EPM. O número de determinações independentes é 8-10. *Indica uma
diferença significativa (p < 0,05) em relação aos animais de controle.
Inversamente, a indometacina aboliu a elevação das respostas à noradrenalina nas aortas
dos grupos estresse e estresse/etanol, resultando, assim, em valores de Rmax
ao nível do grupo de controle (Figura 1C). Da
mesma forma, a ioimbina também aboliu a hiper-reatividade à noradrenalina em aorta
torácica dos animais dos grupos estresse e estresse/etanol (Figura 1D). Finalmente, em relação à EC50, não foram
detectadas diferenças entre os grupos, independentemente da ausência ou presença de
L-NAME, indometacina ou ioimbina (Tabela 1).
Valores de EC50 para noradrenalina, obtidos de anéis aórticos com e sem
endotélio, na presença ou ausência de L-NAME, indometacina ou ioimbina de ratos
machos adultos expostos ou não ao estresse crónico e etanol, sozinhos ou em
combinação
Controle EC50 (x10-7
M)
Estresse EC50 (x10-7
M)
Etanol EC50 (x10-7
M)
Estresse/ etanol EC50
(x10-7 M)
Com endotélio
Solução salina
3,97± 0,06 (10)
3,85 ± 0,04 (10)
4,88 ± 0,06 (10)
4,29 ± 0,08 (10)
L-NAME (10-4 M)
2,48 ± 0,05 (09)
2,36 ± 0,05 (09)
2,60 ± 0,04 (09)
2,64 ± 0,08 (09)
Indometacina (10-5 M)
3,85 ± 0,05 (08)
3,56 ± 0,06 (08)
5,39 ± 0,05 (08)
3,58 ± 0,06 (08)
Ioimbina (10-6 M)
10,76 ± 0,06 (09)
10,19 ± 0,06 (09)
10,23 ± 0,04 (09)
9,00 ± 0,06 (09)
Sem endotélio
Solução salina
0,61 ± 0,10*
(10)
0,83 ± 0,07*
(10)
0,64 ± 0,06 (10)
0,67 ± 0,09*
(10)
L-NAME (10-4 M)
0,77 ± 0,06*
(09)
1,18 ± 0,11*
(09)
1,10 ± 0,07*
(09)
0,90 ± 0,06*
(09)
Indometacina (10-5 M)
0,83 ± 0,05*
(08)
1,88 ± 0,06*
(08)
1,47 ± 0,05*
(08)
1,30 ± 0,08*
(08)
Ioimbina (10-6 M)
1,82 ± 0,05*
(09)
1,94 ± 0,08*
(09)
2,10 ± 0,05*
(09)
2,75 ± 0,07*
(09)
Controle: recebeu água "ad libitum"; etanol: recebeu solução de etanol a 20% em
vez de água potável; estresse: imobilização em um tubo de contenção metálica (1
hora / dia, 5 dias / semana durante 6 semanas); estresse crônico/etanol:
submetido ao estresse de imobilização e exposto a 20% de etanol. Dados
expressos como média ± EPM e, entre parênteses, o número de determinações
independentes.
p < 0,05 em relação à respectiva aorta com endotélio.
A remoção do endotélio aumentou a sensibilidade à noradrenalina em relação à respectiva
aorta com endotélio intacto (Tabela 1). Além
disso, a remoção do endotélio aórtico eliminou a hiper-reatividade à noradrenalina
observada nos grupos estresse e estresse/etanol (Figura
2A). Nenhum dos protocolos alterou a reatividade à noradrenalina em aortas
desnudas (Figuras 2B, 2C e 2D), nem afetaram a
reatividade à fenilefrina (Figuras 3A e 3B) em aortas intactas ou desnudada. EC50
da fenilefrina similares também foram observadas entre os grupos (Tabela 2).
Curvas de concentração-resposta à noradrenalina obtidas de anéis de aorta
torácica desnudos de animais expostos ao consumo de etanol e/ou estresse, na
ausência ou na presença de L-NAME (10<sup>-4</sup>M), indometacina
(10<sup>-5</sup>M) ou ioimbina (10<sup>-6</sup>M). Os valores são expressos em
médias ± EPM. O número de determinações independentes é 8-10.
Curvas de concentração-resposta à fenilefrina obtidas de anéis de aorta
torácica com e sem endotélio de animais expostos ao consumo de etanol e/ou
estresse. Os valores são expressos em médias ± EPM. O número de determinações
independentes é 8-10.
Valores de EC50 para fenilefrina obtido de anéis aórticos com e sem endotélio
de ratos machos adultos expostos ou não ao estresse crônico ou etanol, sozinhos ou
em combinação
Controle EC50 (x10-7
M)
Estresse EC50 (x10-7
M)
Etanol EC50 (x10-7
M)
Estresse/etanol EC50
(x10-7 M)
Com endotélio
1,58 ± 0,15 (09)
2,25 ± 0,12 (09)
1,14 ± 0,10 (09)
1,79 ± 0,10 (09)
Sem endotélio
0,88 ± 0,09*
(09)
0,67 ± 0,08*
(09)
0,80 ± 0,04*
(09)
1,10 ± 0,07*
(09)
Controle: recebeu água "ad libitum"; etanol: recebeu solução de etanol a 20% em
vez de água potável; estresse: imobilização em um tubo de contenção metálica (1
hora / dia, 5 dias / semana durante 6 semanas); estresse crônico / etanol:
submetido ao estresse de imobilização e expostos a 20% de etanol. Dados
expressos como média ± EPM e, entre parênteses, o número de determinações
independentes.
p <0,05 em relação à respectiva aorta com endotélio.
A concentração de etanol no sangue atingiu 0,42 ± 0,09 mg / mL em ratos expostos ao
etanol, durante 6 semanas, n = 8, enquanto a concentração atingiu 0,57 ± 0,13 mg/mL no
grupo estresse/etanol, n = 10.
A concentração no plasma de nitrito/nitrato, determinada pela reação de Griess, não foi
significativamente diferente entre os grupos (Figura
4).
Concentração no plasma de nitrito/ nitrato determinado pela reação de Griess
em animais expostos ao consumo de etanol e/ou estresse. Os valores são expressos
em médias ± EPM. O número de determinações independentes é de 10-12.
Discussão
Evidências experimentais e epidemiológicas sugerem que tanto o etanol quanto o estresse
desempenham um papel importante no desenvolvimento de doenças cardiovasculares2,17,18. No entanto, há
divergências na literatura sobre os efeitos do consumo crônico de etanol, bem como a
exposição ao estresse, sobre as respostas vasculares a agentes vasoativos. Além disso, a
literatura é escassa em relação aos riscos cardiovasculares da associação desses
fatores.
Os dados aqui relatados mostram que, independentemente do consumo de etanol, o estresse
induziu hiper-reatividade da aorta à noradrenalina. Essa resposta parece ter sido
dependente da integridade das células endoteliais, já que foi abolida pela remoção do
endotélio. Por outro lado, o consumo crônico de etanol não influenciou as respostas à
noradrenalina em aorta torácica de rato.
O consumo de etanol também não mostrou sinais de ter influenciado a hiper-reatividade à
noradrenalina induzida por estresse. Considerando-se que a ausência do endotélio
potencializa a resposta contrátil à noradrenalina em ratos não expostos a estresse, a
resposta aumentada à noradrenalina observada na aorta intacta de ratos estressados
poderia indicar uma disfunção endotelial nessa condição. Esses achados corroboram os
relatos anteriores mostrando que o estresse promove disfunção endotelial2,3,19,20. No entanto, outros estudos relataram que a
exposição ao estresse pode na verdade aumentar, ao invés de prejudicar, a função
endotelial1,21,22.
Além disso, os dados apresentados corroboram estudos que mostram que o consumo de etanol
a 20% durante 12 semanas, não alterou a resposta à fenilefrina em aorta de ratos
Fisher13. Por outro lado, contradiz estudos
que mostram aumento da resposta à noradrenalina em aorta de ratos Sprague-Dawley, depois
de terem sido expostos a etanol a 10% por 5 meses10.
Além disso, estudos prévios indicam aumento das respostas à fenilefrina na aorta de
ratos Wistar também expostos a etanol 20% durante 6 semanas8,9,15. Curiosamente, apesar
de utilizar exatamente o mesmo protocolo experimental, concentrações mais baixas de
etanol no sangue foram determinadas no presente estudo. É possível que essas
concentrações mais baixas de etanol no sangue não tenham sido suficientes para induzir a
resposta aórtica à norepinefrina ou fenilefrina que foi observada em estudos anteriores.
De fato, o potencial para modificações induzidas por etanol para resposta aórtica à
norepinefrina ou fenilefrina em ratos não foi completamente eliminado pelos resultados
apresentados. Pelo contrário, estas discrepâncias demonstram a necessidade de estudos
complementares, em que diferentes concentrações de etanol no sangue também devem ser
avaliadas.
Muitos estudos têm demonstrado que a modulação do tônus vascular pode envolver
vasoconstritor derivado do endotélio e prostanóides vasodilatadores23. Embora a taxa de produção de metabólitos de COX nas células
normais pareça facilitar os vasodilatadores, é possível que essa taxa varie em resposta
a certos estados patológicos, tais como a hipertensão24.
A fim de investigar o envolvimento de prostanóides nas alterações das respostas à
noradrenalina induzidas pelo estresse, os experimentos foram realizados em aortas
pré-tratadas com indometacina. A presença desse inibidor de COX aboliu o aumento da
resposta máxima à noradrenalina observada na aorta intacta de ratos estressados. Depois
de ter sido restaurada, essa resposta atingiu um valor semelhante à observada em aorta
de rato com endotélio, obtida de ratos do grupo controle na ausência de indometacina.
Esses dados sugerem que a hiper-reatividade da aorta à noradrenalina induzida pelo
estresse de imobilização crônica ocorre devido à liberação de prostanóides
vasoconstritores. A liberação de prostanóides vasoconstritores, foi observada
anteriormente em micro e macrovasos de ratos espontaneamente hipertensos25 e na aorta de ratos hipertensos DOCA-sal23,24.
Uma vez que a influência dos prostanóides vasoconstritores no aumento induzido pelo
estresse de respostas à noradrenalina na aorta de ratos é estabelecida, é pertinente
analisar "como" esse agonista simpático é capaz de ativar esse mecanismo endotelial.
Estudos anteriores relataram que α1 e -α2 adrenoceptores são expressos no músculo liso
ou nas células endoteliais26-28. Além disso, a estimulação dos α2 adrenoceptores
localizados no endotélio libera óxido nítrico (NO)29,30 e/ou
prostanóides29, contrabalançando, assim, os
efeitos vasoconstritores da noradrenalina mediada pelos α1 adrenoceptores presentes na
camada de músculo liso. Também tem sido demonstrado que as respostas da aorta torácica à
clonidina, um agonista seletivo adrenoceptor-α2, podem ser moduladas de forma negativa
pelo NO e positivamente por prostanóides vasoconstritores31.
No presente estudo, a presença de ioimbina aboliu o aumento induzido pelo estresse de
respostas à noradrenalina na aorta torácica de ratos. Além disso, nem a exposição ao
estresse, nem o consumo de etanol alterou as respostas da aorta torácica à fenilefrina,
um agonista adrenérgico-α1 seletivo. Esses dados sugerem que a estimulação do
adrenoceptor-α2 endotelial pode libertar prostanóides vasoconstritores, aumentando assim
as respostas à noradrenalina em aortas de ratos expostos ao estresse.
A literatura relata a liberação de mediadores que induzem não apenas a contração, mas
também o relaxamento em aorta de ratos com hipertensão DOCA sal23,24,32. Desse modo, não é
ainda claro no presente estudo se apenas os prostanóides vasoconstritores são
responsáveis pelo aumento da resposta à noradrenalina na aorta de animais estressados,
ou se eles agem em conjunto com os mecanismos de L-arginina/NO.
Dada essa dúvida, investigamos o papel da via de L-arginina/NO na resposta à
noradrenalina em aorta de ratos cronicamente estressados (com e sem a associação com o
consumo de etanol). Os resultados mostram que a inibição da NOS por L-NAME aumentou a
Rmax à noradrenalina em aortas torácicas de animais em ambos os grupos de
controle e etanol, permitindo respostas de magnitude semelhante em relação às
preparações retiradas de grupos de estresse e estresse/etanol, na ausência ou na
presença de L-NAME. Esses dados sugerem que não há nenhuma mudança na via de NO induzida
por exposição ao estresse e o consumo crônico de etanol, nem isoladamente, nem em
conjunto. Essa hipótese também é apoiada pela observação de concentrações plasmáticas
similares de nitrito/nitrato entre os diferentes grupos experimentais.
Em resumo, o presente estudo constatou que o estresse crônico aumentou respostas da
aorta de ratos à noradrenalina. Esse efeito é dependente do endotélio vascular e envolve
prostanóides vasoconstritores liberados pela estimulação dos α-2 adrenoceptores
endoteliais. Além disso, o consumo crônico de etanol pareceu não influenciar as
respostas da noradrenalina em aorta de rato, nem modificar o aumento de tais respostas
observadas em consequência da exposição ao estresse.
Agradecimentos
Esse estudo foi financiado pela CAPES. Agradecemos ao Sr. Alisson Douglas Ventura Neves
(Laboratório de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Marília, São Paulo, Brasil)
pela assistência técnica.
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Fontes de Financiamento
O presente estudo foi financiado pelas CAPES
Original ArticlesStress Alone or associated with Ethanol Induces Prostanoid
Release in Rat Aorta via α2-AdrenoceptorBaptistaRafaela de Fátima Ferreira12TaipeiroElane de Fátima2QueirozRegina Helena Costa3ChiesAgnaldo Bruno12CordelliniSandra1Departamento de Farmacologia - Instituto de
Biociências - Universidade Estadual Paulista - UNESP - São Paulo, SP -
BrazilLaboratório de Farmacologia - Faculdade de Medicina
de Marília - FAMEMA, SP - BrazilDepartamento de Análise Clínica - Toxicológica e
Ciência de Alimentos - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP, São Paulo, SP -
BrazilMailing Address: Sandra Cordellini. Departamento de Farmacologia,
Instituto de Biociências, UNESP. Postal Code 18618-970, Rubião Júnior s/n, Botucatu,
São Paulo, SP - Brazil. E-mail: cordelli@ibb.unesp.br
Author contributions
Conception and design of the research, Statistical analysis, Obtaining funding,
Writing of the manuscript: Baptista RFF, Chies AB, Cordellini S; Acquisition of
data: Baptista RFF, Taipeiro EF, Queiroz RHC; Analysis and interpretation of the
data: Baptista RFF, Taipeiro EF, Queiroz RHC, Chies AB, Cordellini S; Critical
revision of the manuscript for intellectual content: Baptista RFF, Taipeiro EF,
Chies AB, Cordellini S.
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Study Association
This article is part of the thesis of Doctoral submitted by Rafaela de Fátima
Ferreira Baptista from Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"
UNESP/Botucatu.
Background:
Stress and ethanol are both, independently, important cardiovascular risk
factors.
Objective:
To evaluate the cardiovascular risk of ethanol consumption and stress exposure,
isolated and in association, in male adult rats.
Methods:
Rats were separated into 4 groups: Control, ethanol (20% in drinking water for 6
weeks), stress (immobilization 1h day/5 days a week for 6 weeks) and
stress/ethanol. Concentration-responses curves to noradrenaline - in the absence
and presence of yohimbine, L-NAME or indomethacin - or to phenylephrine were
determined in thoracic aortas with and without endothelium. EC50 and maximum
response (n=8-12) were compared using two-way ANOVA/Bonferroni method.
Results:
Either stress or stress in association with ethanol consumption increased the
noradrenaline maximum responses in intact aortas. This hyper-reactivity was
eliminated by endothelium removal or by the presence of either indomethacin or
yohimbine, but was not altered by the presence of L-NAME. Meanwhile, ethanol
consumption did not alter the reactivity to noradrenaline. The phenylephrine
responses in aortas both with and without endothelium also remained unaffected
regardless of protocol.
Conclusion:
Chronic stress increased rat aortic responses to noradrenaline. This effect is
dependent upon the vascular endothelium and involves the release of
vasoconstrictor prostanoids via stimulation of endothelial alpha-2 adrenoceptors.
Moreover, chronic ethanol consumption appeared to neither influence noradrenaline
responses in rat thoracic aorta, nor did it modify the increase of such responses
observed as a consequence of stress exposure.
Chronic stress is an important risk factor for the development of cardiovascular
pathologies1 such as atherosclerosis2 endothelial dysfunction3 and hypertension4.
However, the severity of the cardiovascular damage caused by stress exposure depends
on the nature of the stressor, as well as its intensity and duration5.
The literature reports that chronic stress impairs endothelial function, evidenced by
a decrease of acetylcholine-induced vasorelaxation2, as well as a reduction in aortic nitric oxide synthase (NOS)
activity6. In turn, acute stress exposure
reduces noradrenaline-induced contraction and increases acetylcholine-induced
relaxation of rat aorta1,7.
Chronic ethanol consumption may also cause cardiocirculatory modifications that
contribute to the development of cardiovascular diseases8,9. In line
with this possible association, the consumption of 20% ethanol over the course of 6
weeks increased the mesenteric vascular bed response to phenylephrine in Wistar
rats8. Ethanol consumption also increased
responses to sympathetic agonists within vessels of conductance - vessels of which
endothelial mechanisms of modulation work differently from those of resistance
vessels. In fact, consumption of 20% ethanol for 6 weeks increased the aorta
responses to phenylephrine in Wistar rats9.
The consumption of 36% ethanol over 18 weeks also elevated the noradrenaline
responses in rat mesenteric artery10.
Moreover, the chronic consumption of 10% ethanol increased noradrenaline response in
the aorta of male Sprague-Dawley11 rats. On
the other hand, the chronic consumption of 20% ethanol either decreased12 or did not influence13 phenylephrine responses in rat aortas. These discrepancies may
be attributed to differences between experimental protocols or characteristics of the
animal model14.
Although both ethanol and stress play important roles in the development of
cardiovascular disease, doubts still persist about their effects upon vascular
responsiveness, specifically. These doubts are even more numerous when considering
the effects of both of these factors in association. Thus, the goal of this study was
to address these persisting questions. Specifically, the aim of this study was to
investigate, in adult rats, the vascular adaptive response to sympathetic agonists
induced by ethanol consumption and exposure to stress (both alone and in association)
and to examine its mechanism.
MethodsExperimental design
Adult male Wistar rats (100 to 120 days old) were housed in plastic cages under a
12 hour light-dark cycle at (23±2ºC) and fed regular lab chow. For the entirety of
the 6 weeks, these animals were separated into four groups: control, which
received water "ad libitum"; stress, which were immobilized in a metallic
containment tube (1 hour/day, 5 days/week) to completely restrict their movements,
preserving only breathing; ethanol, which received a 20% ethanol solution instead
of drinking water15; stress/ethanol, which
was submitted to immobilization stress and received a 20% ethanol solution.
Animals from the ethanol and stress/ethanol groups were adapted to ethanol
consumption by gradually increasing the concentration of ethanol in their solution
(5% in the first week, 10% in the second week and 20% from the third week
onward).
All experiments and procedures were performed in accordance with the Guide
for the Care and Use of Laboratory Animals, published by the U.S.
National Institutes of Health16 and were
approved by the Research Ethics Committee of the Biosciences Institute of
Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
Blood ethanol
Blood (5 mL per rat) was collected from the aorta of anesthetized rats using
heparinized syringes. Samples (1 mL) were placed in 10 mL headspace vials, to
which were added - 1.0 g sodium chloride, 1.0 mL water, and 100 mL internal
standard (acetonitrile, 1 mL L−1). Ethanol analysis was carried out
using a CG-17A gas chromatographer (Shimadzu, Kyoto, Japan) equipped with a
flame-ionization detector and an HSS-4A headspace sampler (Shimadzu). Calibration
standards (0.10-3.16 mg mL−1) were prepared in headspace vials. Ethanol
concentrations are expressed in mg mL−1 blood.
Aorta rings
Animals were killed using a guillotine device. After thoracotomy, the descending
thoracic aortas were removed and dissected in 3-4 mm segments (two rings). The
rings were mounted into a 2-mL organ chamber containing Krebs-Henseleit solution
(NaCl 130; KCl 4.7; CaCl2 1.6; KH2PO4 1.2;
MgSO4 1.2; NaHCO3 15; glucose 11.1; in mmol/L). In the
organ chamber, rings were fixed to a stainless-steel hook that was attached to a
stationary support, as well as to a second hook, which was connected to an
isometric force transducer. The Krebs-Henseleit solution was kept at pH 7.4 and 37
°C and bubbled continuously with a mixture of 95% O2 and 5%
CO2. Tension was monitored continuously and recorded using a
Powerlab 8/30 data-acquisition system (ADInstruments, Castle Hill, NSW,
Australia). Prior to the concentration-response curve to agonists, the rings were
equilibrated for 60 min under a resting tension of 1.5 g, which is optimal for
inducing maximum contraction.
The functional state of the endothelium was tested at the beginning of the
concentration-response curve by the ability of 10-4M acetylcholine to
elicit vasodilator responses in preparations pre-contracted by 10-5M
phenylephrine. Preparations that showed more than 80% of relaxation were
considered as having an intact endothelium, whereas those that showed no
relaxation were considered completely devoid of endothelium. Some rings were
submitted to mechanical endothelium denudation. Preparations with and without
endothelium were studied in parallel.
Organ bath assay
Noradrenaline (10-10 M to 10-4 M; Sigma-Aldrich) or
phenylephrine (10-10 M to 10-4 M; Sigma-Aldrich) were
cumulatively added into the organ bath, and the evoked responses (g) were plotted
to obtain a concentration-response curve. When appropriate, the noradrenaline
responses were also determined in preparations pretreated for 30 min with
10-4M L-NAME (Sigma-Aldrich) or 10-5M indomethacin
(Sigma-Aldrich) - non-selective inhibitors of NOS and cyclooxygenase (COX),
respectively. In another series of experiments, noradrenaline responses were
determined in rings pretreated for 30 min with 10-6 M yohimbine
(Sigma-Aldrich), and α2-adrenoceptor antagonist. The inhibitors and the
antagonist were added during the last 30 min stabilization period and remained in
contact with preparations until the end of the experiment.
Non-linear regression (variable slope) of the obtained concentration-effect curves
revealed the Rmax (maximal response; highest point of each
concentration-response curve) and the EC50 (negative logarithm of the
concentration that evoked 50% of the maximal response). The EC50 is
indicative of sensitivity to the drug studied.
Determination of nitrite/nitrate (NO<sub>2</sub>/NO<sub>3</sub>)
100 µL aliquots of plasma samples from different experimental
groups were deproteinated with 200 µL absolute ethanol, in the
freezer (-20˚ C) for 30 minutes. They were then submitted to centrifugation (10000
rpm for 5 minutes) and the supernatant was collected. In order to determine total
(NO2/NO3) in plasma, the following mixture was used as a
reaction medium: sodium phosphate buffer 20 mM pH 7.4, cofactors (final
concentration 100μM NADPH and FAD 5 mM) and nitrate reductase of Aspergillus
(Sigma) at a concentration of 0.1 U/mL. The samples were then incubated for 3
hours in a water bath at 37° C before being added to Griess Reagent I (1%
sulfanilamide in 5% phosphoric acid) and Griess Reagent II (naftil-ethylenediamine
0.1%). Next, the compound's chromophore was read using a spectrophotometer at 540
nm. The concentration of the samples were calculated using a standard curve with
known concentrations of NaNO2 (0.40 - 200 μl) and
expressed in mM/L.
Statistical analysis
The concentration of vasoactive agents producing a response that was 50% of the
maximum (EC50) was calculated in each experiment. Data are presented as
mean ± SEM. The maximal responses (Rmax) and EC50 values
were compared by two-way ANOVA followed by Bonferroni's post-test, as one variable
was ethanol consumption and the other, exposure to immobilization stress. P <
0.05 was considered statistically significant.
Results
The noradrenaline responses observed in intact aortas taken from animals exposed to
both stress and stress/ethanol in combination, were higher than those observed in
intact aortas taken from control animals. These outcomes resulted in increased values
of Rmax. Animals exposed to ethanol alone, however, did not demonstrate
higher responses than controls (Figure 1A). The
presence of L-NAME increased the noradrenaline Rmax in aortic rings taken
from control and ethanol groups, permitting responses of similar magnitude with
preparations taken from stress and stress/ethanol groups (Figures 1B). Inversely, indomethacin abolished the elevation of
noradrenaline responses in aortas from stress and stress/ethanol groups, thereby
resulting in values of Rmax at the level of the control group (Figure 1C). Similarly, yohimbine also abolished
the hyper-reactivity to noradrenaline in thoracic aorta taken from stress and
stress/ethanol animals (Figure 1D). Finally,
regarding EC50, no differences were detected among groups regardless of
absence or presence of L-NAME, indomethacin or yohimbine (Table 1).
Concentration-response curves to noradrenaline obtained from intact
thoracic aorta rings taken from animals exposed to ethanol consumption and/or
stress, in the absence or presence of L-NAME (10<sup>-4</sup> M), indomethacin
(10<sup>-5</sup> M) or yohimbine (10<sup>-6</sup> M). Values are expressed
as means ± SEM. The number of independent determinations was 8-10. *Indicates a
significant difference (p < 0.05) in relation to the control
animals.
Values of EC50 to noradrenaline obtained from aortic rings with and without
endothelium, in presence of absence of L-NAME, indomethacin or yohimbine from
adult male rats exposed or not to chronic stress and ethanol, alone or in
combination
Control EC50 (x10-7 M)
Stress EC50 (x10-7 M)
Ethanol EC50 (x10-7 M)
Stress/ethanol EC50 (x10-7
M)
With endothelium
Saline
3.97± 0.06 (10)
3.85 ± 0.04 (10)
4.88 ± 0.06 (10)
4.29 ± 0.08 (10)
L-NAME (10-4 M)
2.48 ± 0.05 (09)
2.36 ± 0.05 (09)
2.60 ± 0.04 (09)
2.64 ± 0.08 (09)
Indomethacin (10-5 M)
3.85 ± 0.05 (08)
3.56 ± 0.06 (08)
5.39 ± 0.05 (08)
3.58 ± 0.06 (08)
Yohimbine (10-6 M)
10.76 ± 0.06 (09)
10.19 ± 0.06 (09)
10.23 ± 0.04 (09)
9.00 ± 0.06 (09)
Without endothelium
Saline
0.61 ± 0.10* (10)
0.83 ± 0.07* (10)
0.64 ± 0.06 (10)
0.67 ± 0.09* (10)
L-NAME (10-4 M)
0.77 ± 0.06* (09)
1.18 ± 0.11* (09)
1.10 ± 0.07* (09)
0.90 ± 0.06* (09)
Indomethacin (10-5 M)
0.83 ± 0.05* (08)
1.88 ± 0.06* (08)
1.47 ± 0.05* (08)
1.30 ± 0.08* (08)
Yohimbine (10-6 M)
1.82 ± 0.05* (09)
1.94 ± 0.08* (09)
2.10 ± 0.05* (09)
2.75 ± 0.07* (09)
Control: received water “ad libitum”; ethanol: received ethanol solution 20%
instead of drinking water; stress: immobilization in a metallic containment
tube (1 hour/day, 5 days/week for 6 weeks); chronic stress/ethanol:
submitted to immobilization stress and exposed to 20% ethanol. Data
expressed as mean ± SEM and, between parentheses, the number of independent
determinati ons.
p < 0.05 in relation to the respective aorta with endothe lium.
The removal of the endothelium increased the sensitivity to noradrenaline in relation
to the respective aorta with intact endothelium (Table 1). Moreover, the removal of the endothelium eliminated the aortic
hyper-reactivity to noradrenaline observed in stress and stress/ethanol groups (Figure 2A). None of the protocols altered the
reactivity to noradrenaline in denuded aortas (Figures
2B, 2C and 2D), nor did they affect the reactivity to phenylephrine (Figures 3A and 3B) in intact or denuded aortas. Similar phenylephrine EC50
were also observed among the groups (Table
2).
Concentration-response curves to noradrenaline obtained from denuded
thoracic aorta rings taken from animals exposed to ethanol consumption and/or
stress, in the absence or presence of L-NAME (10<sup>-4</sup> M), indomethacin
(10<sup>-5</sup> M) or yohimbine (10<sup>-6</sup> M). Values are expressed
as means ± SEM. The number of independent determinations was 8-10.
Concentration-response curves to phenylephrine obtained from rings of
thoracic aorta with and without endothelium taken from animals exposed to
ethanol consumption and/or stress. Values are expressed as means ± SEM. The
number of independent determinations was 8-10.
Values of EC50 to phenylephrine obtained from aortic rings with and without
endothelium from adult male rats exposed or not to chronic stress or ethanol,
alone or in combination
Control EC50 (x10-7 M)
Stress EC50 (x10-7 M)
Ethanol EC50 (x10-7 M)
Stress/Ehanol EC50 (x10-7
M)
With endothelium
1.58 ± 0.15 (09)
2.25 ± 0.12 (09)
1.14 ± 0.10 (09)
1.79 ± 0.10 (09)
Without endothelium
0.88 ± 0.09* (09)
0.67 ± 0.08* (09)
0.80 ± 0.04* (09)
1.10 ± 0.07* (09)
Control: received water “ad libitum”; ethanol: received ethanol solution 20%
instead of drinking water; stress: immobilization in a metallic containment
tube (1 hour/day, 5 days/week for 6 weeks); chronic stress/ethanol:
submitted to immobilization stress and exposed to 20% ethanol. Data
expressed as mean ± SEM and, between parentheses, the number of independent
determinations.
P < 0.05 in relation to the respective aorta with endothelium.
Blood ethanol concentration reached 0.42 ± 0.09 mg/mL in rats exposed to ethanol for
6 weeks, n=8, while concentrations reached 0.57 ± 0.13 mg/mL in the stress/ethanol
group, n = 10.
The concentration in plasma of nitrite/nitrate, determined by the Griess Reaction,
was not significantly different among groups (Figure
4).
Plasma concentration of nitrite/nitrate determined by the Griess Reaction
taken from animals exposed to ethanol consumption and/or stress. Values are
expressed as means ± SEM. The number of independent determinations was
10-12.
Discussion
Experimental and epidemiological evidence suggests that both ethanol and stress play
an important role in the development of cardiovascular diseases2,17,18. However, there
are discrepancies in the literature about the effects of chronic ethanol consumption,
as well as exposure to stress, on the vascular responses to vasoactive agents.
Furthermore, the literature is scarce regarding the cardiovascular risks of the
association of these factors.
The data reported herein have shown that, regardless of ethanol consumption, stress
induced aortic hyper-reactivity to noradrenaline. This response appears to have been
dependent upon endothelial cell integrity, as it was abolished by the removal of the
endothelium. On the other hand, chronic ethanol consumption did not influence the
noradrenaline responses in rat thoracic aorta. Ethanol consumption also showed no
signs of influence in the stress-induced noradrenaline hyper-reactivity. Considering
that the absence of endothelium potentiates the contractile response to noradrenaline
in rats not exposed to stress, the heightened response to noradrenaline observed in
intact aorta from stressed rats could indicate an endothelial dysfunction in this
condition. These findings corroborate previous reports showing that stress promotes
endothelial dysfunction2,3,19,20. However, other
studies reported that exposure to stress may actually enhance, rather than impair,
endothelial function1,21,22.
Additionally, the presented data corroborate studies showing that the consumption of
20% ethanol for 12 weeks did not alter the phenylephrine responses in aorta of Fisher
rats13. On the other hand, it contradicts
studies showing increased response to noradrenaline in aorta taken from
Sprague-Dawley rats after being exposed to 10% ethanol for 5 months10. Moreover, previous studies have reported
increased phenylephrine responses in aorta taken from Wistar rats also exposed to 20%
ethanol for 6 weeks8,9,15. Interestingly, although using exactly the same experimental protocol,
lower blood ethanol concentrations were determined in the present study. It is
possible that these lower blood ethanol concentrations were not sufficient to elicit
the aortic responses to norepinephrine or phenylephrine that have been seen in
previous research. Indeed, the potential for ethanol-induced modifications to aortic
responses to norepinephrine or phenylephrine in rats was not completely discarded by
the present findings. Rather, these discrepancies demonstrate the need for
complementary studies, in which differences of blood ethanol concentrations should
also be assessed.
Many studies have shown that the modulation of vascular tonus may involve
endothelium-derived vasoconstrictor and vasodilator prostanoids23. Although the rate of production of COX metabolites in normal
cells appears to facilitate vasodilators, it is possible that this rate may vary in
response to certain disease states, such as hypertension24.
In order to investigate the involvement of prostanoids in the stress-induced
modifications of noradrenaline responses, experiments were performed in aortas
pretreated with indomethacin. The presence of this COX inhibitor abolished the
increase of the maximum response to noradrenaline observed in intact aorta of
stressed rats. After being restored, this response reached a value similar to that
observed in rat aorta with endothelium taken from control rats in the absence of
indomethacin. These data suggest that the aortic hyper-reactivity to noradrenaline
induced by chronic immobilization stress occurs due to the release of vasoconstrictor
prostanoids. The release of vasoconstrictor prostanoids has been previously observed
in micro and macrovessels of spontaneously hypertensive rats25 and in the aorta of DOCA-salt hypertensive rats23,24.
Once the influence of vasoconstrictor prostanoids in the stress-induced increase of
noradrenaline responses in rat aorta is established, it is pertinent to examine "how"
this sympathetic agonist is able to activate this endothelial mechanism. Previous
studies report that α1 and α2-adrenoceptors are expressed
either in smooth muscle or in endothelial cells26-28. Furthermore, the
stimulation of α2-adrenoceptors located in the endothelium releases nitric
oxide (NO)29,30 and/or prostanoids29,) thus counterbalancing the vasoconstrictive effects of noradrenaline
mediated by α1-adrenoceptors present in the smooth muscle layer. It has
also been shown that thoracic aortic responses to clonidine, a selective
α2 adrenoceptor agonist, may be modulated negatively by NO and
positively by vasoconstrictive prostanoids31.
In the present study, the presence of yohimbine abolished the stress-induced increase
of noradrenaline responses in rat thoracic aorta. Moreover, neither exposure to
stress nor ethanol consumption altered the thoracic aorta responses to phenylephrine,
a selective α1-adrenoceptor agonist. These data suggest that endothelial
α2-adrenoceptor stimulation may release vasoconstrictor prostanoids,
thus increasing the noradrenaline responses in aortas from stress-exposed rats.
The literature reports the release of mediators that induce not only contraction, but
also relaxation in aorta of DOCA salt hypertensive rats23,24,32. Therefore, it is
not yet clear in the present study whether only vasoconstrictor prostanoids are
responsible for the increased response to noradrenaline in aorta of stressed animals,
or if they act in conjunction with L-arginine/NO mechanisms.
Given this uncertainty, we investigated the role of the L-arginine/NO pathway in the
aortic response to noradrenaline in chronically stressed rats (with and without
association with ethanol consumption). The results show that the inhibition of NOS by
L-NAME increased the noradrenaline Rmax in thoracic aortas taken from
animals in both the control and ethanol groups, permitting responses of similar
magnitude regarding preparations taken from stress and stress/ethanol groups, in the
absence or presence of L-NAME. These data suggest that there is no change in the
NO-pathway induced by exposure to stress and chronic ethanol consumption, either
alone, or in combination. This hypothesis is also supported by the observation of
similar plasma concentrations of nitrite/nitrate among the different experimental
groups.
In summary, the present study found that chronic stress increased rat aortic
responses to noradrenaline. This effect is dependent upon the vascular endothelium
and involves vasoconstrictor prostanoids released by stimulation of endothelial
alpha-2 adrenoceptors. Moreover, chronic ethanol consumption appeared to neither
influence noradrenaline responses in rat thoracic aorta, nor did it modify the
increase of such responses observed in consequence of stress exposure.
Acknowledgments
This study was supported by CAPES. We thank Mr. Alisson Douglas Ventura Neves
(Laboratory of Pharmacology, Faculty of Medicine of Marília, São Paulo, Brazil) for
the technical assistance.