Arq. Bras. Cardiol.Arquivos Brasileiros de CardiologiaArq. Bras. Cardiol.0066-782X1678-4170Sociedade Brasileira de CardiologiaBM5m68WbVQJMwkx3vtTcJrjS0066-782X2014000200027S0066-782X20130050302320002710.5935/abc.20130232Artigos OriginaisInfluência do tempo de exposição à obesidade induzida por
dieta hiperlipídica sobre os colágenos tipo I e III miocárdicoSilvaDanielle Cristina Tomaz da1Lima-LeopoldoAna Paula2LeopoldoAndré Soares2CamposDijon Henrique Salomé de1NascimentoAndré Ferreira do1OliveiraSílvio Assis deJunior3PadovaniCarlos Roberto4CicognaAntonio Carlos1Departamento de Clínica MédicaFaculdade de Medicina de BotucatuUniversidade Estadual PaulistaBotucatuSPBrasil Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SPDepartamento de EsportesCentro de Educação Física e DesportosUniversidade Federal do Espírito SantoVitóriaESBrasilDepartamento de Esportes, Centro de Educação Física e
Desportos da Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória, ESEscola de FisioterapiaUniversidade Federal de Mato Grosso do
SulCampo GrandeMSBrasilEscola de Fisioterapia da Universidade Federal de Mato Grosso
do Sul (UFMS), Campo Grande, MS Departamento de BioestatísticaInstituto de Ciências BiológicasUniversidade Estadual PaulistaBotucatuSPBrasilepartamento de Bioestatística do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - BrasilCorrespondência: Antonio Carlos Cicogna - Universidade Estadual de São
Paulo (UNESP), Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Botucatu,
Rubião Júnior, S/N. CEP 18618-000, Botucatu, SP - Brasil. E-mail:
dany.tomaz@gmail.com0911201303201410202157164020420132108201322082013This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative
Commons Attribution Non-Commercial License which permits unrestricted
non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the
original work is properly cited. FUNDAMENTO:
A obesidade é um fator de risco para muitas complicações médicas; a pesquisa
médica demonstrou que as alterações hemodinâmicas, morfológicas e funcionais estão
correlacionadas com a duração e gravidade da obesidade.
OBJETIVO:
O presente estudo determinou a influência do tempo de exposição à obesidade
induzida por dieta com alto teor de gordura no colágenos tipo I e III miocárdico.
MÉTODOS:
Ratos machos com trinta dias de idade, da raça Wistar, foram
distribuídos aleatoriamente em dois grupos: um grupo de controle (C) alimentado
com ração padrão e um grupo de ratos obesos (Ob) alternadamente alimentados com
uma de quatro dietas palatáveis ricas em gordura. Cada dieta foi mudada
diariamente, e os ratos foram mantidos em suas respectivas dietas por 15
(C15 e Ob15) e 30 (C30 e Ob30)
semanas consecutivas. A obesidade foi determinada pelo índice de adiposidade.
RESULTADOS:
O grupo Ob15 foi similar ao grupo C15 em relação à
expressão de colágeno miocárdico tipo I; contudo, a expressão no grupo
Ob30 foi menor do que no grupo C30. O tempo de exposição
à obesidade foi associado com uma redução de colágeno do tipo I no grupo
Ob30, quando comparado com o Ob15. A obesidade não afetou
a expressão do colágeno tipo III.
CONCLUSÃO:
Este estudo mostrou que o tempo de exposição à obesidade por 30 semanas induzida
por uma dieta rica em gordura insaturada causou uma redução na expressão do
colágeno miocárdico tipo I em ratos obesos. No entanto, nenhum efeito foi
observado em relação à expressão do colágeno miocárdico tipo III
ObesidadeDieta hiperlipídica / normasColágeno Tipo IColágeno Tipo IIIMiocárdioFAPESP07/53267-308/50172-4Introdução
A obesidade é uma doença metabólica crônica, caracterizada por um acúmulo excessivo de
tecido adiposo em relação à massa magra. Atualmente, é uma epidemia global e um
importante problema de saúde pública, que afeta tanto os países desenvolvidos quanto os
em desenvolvimento1,2. Comportamentos associados a uma sociedade
industrializada moderna, incluindo um estilo de vida sedentário, hábitos alimentares
inadequados ou uma combinação de ambos, levaram a um aumento da prevalência da
obesidade3.
A obesidade também é considerada um fator de risco para muitas complicações médicas,
entre elas as doenças cardiovasculares4,5. Alterações
hemodinâmicas associadas a alterações hormonais alteram a expressão gênica do miocárdio,
promovendo o remodelamento da matriz extracelular miocárdica6. Estudos usando coelhos tornados obesos tanto através de uma dieta
rica em gordura7 ou através de engenharia
genética, ratos Zucker8, relataram um aumento no
colágeno miocárdico tipo I e III ao longo de 12 e 24 semanas, respectivamente. Em
contraste, Carroll e cols.9 não encontraram
nenhuma mudança na fração de colágeno total em ratos obesos submetidos a uma dieta rica
em gordura durante 12 semanas. Estudos anteriores realizados em nosso laboratório
demonstraram que ratos Wistar tornados obesos por uma dieta de 15
semanas rica em gordura10 e ratos Wistar-
Kyoto tornados obesos por uma dieta de 20 semanas com alto teor de gordura e
carboidratos11 mostraram aumento de colágeno
total miocárdico. Nesses estudos, no entanto, as frações de colágeno tipos I e II não
foram avaliadas.
A pesquisa médica demonstrou que anormalidades hemodinâmicas, morfológicas e funcionais
estão correlacionadas com a duração e a gravidade da obesidade12-14. Por causa
da escassez de estudos que avaliaram o efeito do tempo de exposição à obesidade induzida
por dieta rica em gordura nas frações de colágeno tipo I e III miocárdico, o presente
estudo foi planejado para testar a hipótese de que o tempo de exposição à obesidade
promove um aumento progressivo da quantidade de colágeno tipo I e tipo III
miocárdico.
MétodosAnimais e Protocolo Experimental
Depois de um período de 7 dias para aclimatação, ratos machos de 30 dias de idade da
raça Wistar foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle
(C) e obeso (Ob). O grupo C foi alimentado com uma ração padrão (RC Focus 1765,
Agroceres®, Rio Claro, SP, Brasil), contendo 12,3% de quilocalorias de
gordura, 57,9% de carboidratos e 29,8% de proteína, enquanto o grupo Ob foi
alimentado com uma de quatro dietas alternadas, ricas em gordura (RC Focus 2413,
2414, 2415 e 2416, Agroceres ®, Rio Claro, SP, Brasil), contendo 49,2% de
quilocalorias de gordura, 28,9% de carboidratos e 21,9 % de proteína. Cada dieta foi
mudada diariamente, e os ratos foram mantidos em suas respectivas dietas por 15
(Ob15 e C15, n = 22) e 30 (C30 e Ob30,
n = 25) semanas consecutivas. A dieta rica em gorduras foi caloricamente mais rica em
comparação com a dieta padrão (3,65 kcal/g vs. 2,95 kcal/g) devido à composição mais
elevada de gordura. A dieta rica em gorduras consistiu em ácidos graxos saturados e
insaturados, que proporcionava 20% e 80% das calorias derivadas da gordura,
respectivamente.
Os ratos foram alojados em gaiolas individuais em uma sala com ar limpo em ambiente
controlado a 23 (± 3)ºC com ciclo de 12 horas de luz/escuridão e 60 (± 5)% de umidade
relativa. Todos os experimentos e os procedimentos foram realizados de acordo com o
Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo Conselho Nacional
de Pesquisa (1996) e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de
Botucatu (UNESP, Botucatu, SP, Brasil).
Perfis nutricionais, metabólicos e endócrinos
Os perfis nutricionais e metabólicos incluíram o índice de adiposidade, peso corporal
final (PCF) e tolerância à glicose; os perfis endócrinos incluíram as concentrações
de leptina e insulina. Como a obesidade é definida como uma quantidade excessiva de
gordura corporal em relação à massa magra15
foi utilizado um critério baseado no índice de adiposidade para determinar a
obesidade, de acordo com dados de estudos anteriores9,16.
Após um jejum de 12 a 15 horas, os animais foram anestesiados (por via
intraperitoneal com pentobarbital de sódio 50 mg/kg), decapitados, e toracotomizados;
as depósitos de gordura de tecido adiposo foram dissecadas e pesadas. O índice de
adiposidade foi calculado pela seguinte fórmula: índice de adiposidade = (gordura
corporal [GC]/PCF) × 10017. A gordura corporal
foi calculada como a soma do peso das depósitos de gordura individuais, conforme
indicado a seguir: GC = gordura epididimal + gordura retroperitoneal + gordura
visceral.
Como a obesidade pode ser acompanhada por alterações metabólicas e endócrinas18, todos os animais foram submetidos a testes de
tolerância à glicose, leptinemia e hiperinsulinemia. Depois de 15 e 30 semanas de
tratamento, a tolerância à glicose e a resistência à insulina foram avaliadas em
todos os animais com um teste de tolerância à glicose (TTG). Após 4 a 6 horas de
jejum, uma amostra de sangue foi tirada a partir da ponta da cauda do animal e
coletada em um tubo heparinizado. A concentração da glicose no sangue (como a
condição basal) de cada animal foi imediatamente determinada usando um glicosímetro
portátil (Accuchek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN, EUA).
Subsequentemente, 2 g/kg de glicose (Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA)
foi administrada por via intravenosa, e as concentrações de glicose no sangue foram
medidas após 15, 30, 60, 90, e 120 minutos19.
A intolerância à glicose foi avaliada utilizando a área sob a curva (AUC) para a
glicose.
Para análises hormonais, o sangue do tronco foi recolhido em tubos heparinizados e
centrifugado a 3000 g por 15 minutos a 4ºC. As concentrações séricas de leptina e
insulina foram determinadas por ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando kits
disponíveis comercialmente (Linco Research Inc., St. Louis, MO, EUA).
Perfil cardiovascular
Como a obesidade pode estar associada à comorbidades cardiovasculares, o perfil
cardiovascular dos animais também foi avaliado, usando a pressão arterial sistólica,
morfologia do tecido cardíaco e a expressão da proteína do colágeno tipo I e III do
ventrículo esquerdo.
Pressão arterial sistólica
Ao final da experiência, a pressão arterial sistólica foi avaliada usando o método
não invasivo de manguito de cauda, com um eletro-esfigmomanômetro Narco
BioSystems® (International Biomédica, Austin, TX, EUA) 20. A média de duas leituras foi registrada para
cada medição.
Estudos morfológicos
O coração foi removido e dissecado no momento da eutanásia. Os pesos do ventrículo
esquerdo, bem como suas respectivas razões com a tíbia foram determinados como índice
de remodelamento cardíaco.
Expressão da proteína do colágeno miocárdico tipo I e III
O tecido ventricular esquerdo foi analisado por Western Blot7 para quantificar a expressão da proteína do colágeno tipo I e
III. Resumidamente, os ventrículos isolados dos ratos controle (C15 e
C30, n = 6 em cada grupo) e obesos (Ob15 e Ob30,
n = 6 em cada grupo) foram congelados com nitrogênio líquido e homogeneizados em um
buffer contendo 10 mM Tris (pH 7,4), 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA , 1 mM de EGTA, 1%
de Triton X -100, glicerol a 10%, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,1% e 0,5% de
desoxicolato. O homogeneizado foi centrifugado a 4ºC por 20 minutos a 12000 rpm. O
sobrenadante foi recolhido e o conteúdo total de proteína foi determinado pelo método
de Bradford (Bradford, 1976). As amostras foram submetidas a eletroforese em gel de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) em géis de poliacrilamida (6% ou 10%, dependendo do
peso molecular de proteína). Após a eletroforese, as proteínas foram
eletro-transferidas para a membrana de nitrocelulose (BioRad Biosciences; NJ, USC ).
Os pesos das amostras (50 ug) e as transferências foram monitorados em relação à
igualdade e eficiência, respectivamente, com a utilização de 0,5% de corante de
Ponceau S na membrana de blot. A membrana de blot
foi então bloqueada (usando 5% de leite em pó desnatado, 10 mmol/L Tris-HCl [pH 7,6],
150 mmol/L de NaCl, e 0,1% de Tween 20) por 2 horas à temperatura ambiente e incubada
durante a noite com anticorpos específicos a 4ºC. A ligação do anticorpo primário foi
detectado com a utilização de anticorpos secundários conjugados com peroxidase
(anti-coelho ou anti-camundongo, dependendo da proteína a uma diluição de 1:10000 e
incubados por 1,5 horas à temperatura ambiente), desenvolvidos por quimiluminescência
aumentada (Amersham Biosciences, NJ, EUA) e detectados por autorradiografia. A
análise de quantificação dos blots foi realizada com a utilização do software Scion
Image (Scion, com base em imagem NIH). Anticorpos monoclonais de camundongos para
colágeno tipo I e III (1:10000) e anticorpos monoclonais de camundongos para β-actina
(1:1000) foram obtidos de Abcam (Reino Unido, Cambridge) e Santa Cruz Biotechnology
(CA, EUA), respectivamente. Bandas alvo foram normalizadas para a expressão da
β-actina cardíaca.
A análise estatística
Todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão e os grupos foram
avaliados através da análise de variância (ANOVA) de dois fatores para amostras
independentes. Quando encontradas diferenças significativas (p < 0,05), foi
realizado o teste de Bonferroni post hoc para comparações
múltiplas21. O nível de significância foi
de 5% (α = 0,05).
Resultados
A Figura 1 mostra as características gerais dos
animais nos grupos C15, C30, Ob15 e Ob30. A
dieta de alto teor de gordura causou um aumento no PCF e no índice de adiposidade em
animais obesos em comparação com os respectivos controles em todos os tempos avaliados.
A duração da exposição à obesidade não resultou em uma diferença significativa no PCF e
índice de adiposidade entre os grupos C15 e C30 e entre os grupos
Ob15 e Ob30. Não houve diferença na pressão arterial sistólica
entre os grupos C e Ob nos dois períodos de estudo, e isso também não se alterou com o
tempo de exposição à obesidade. A AUC para a glicose foi maior nos grupos Ob em
comparação com os controles; o tempo de exposição não afetou os níveis de glicose. A
obesidade promoveu um aumento nos níveis de insulina e leptina nos grupos Ob em relação
aos respectivos controles. Os níveis de insulina não se alteraram com o tempo de
exposição à obesidade; o nível de leptina foi maior no grupo Ob30 em
comparação com os grupos Ob15.
Peso corporal final (A), índice de adiposidade (B), leptina (C), insulina (D),
área sob a curva (AUC) do teste de tolerância à glicose intraperitoneal (E),
pressão arterial sistólica (PAS) (F) em ratos controle (barras brancas) e obesos
(barras pretas) após 15 e 30 semanas de tratamento. Os dados são apresentados em
média ± DP, teste de Bonferroni post hoc e ANOVA de 2 fatores. *p < 0,05 vs.
grupo controle; # p < 0,05 Ob<sub>15</sub> vs Ob<sub>30</sub>.
Como mostrado na Figura 2, a presença de obesidade
aumentou o peso do ventrículo esquerdo, assim como a razão VE/comprimento da tíbia no
grupo Ob15, em comparação com o grupo C15. No entanto, a razão
VE/comprimento da tíbia foi semelhante nos grupos Ob30 e C30,
sugerindo que a exposição à obesidade não têm qualquer efeito sobre esta variável.
Dimensões do ventrículo esquerdo. Peso do ventrículo esquerdo (VE) (A), e
razão peso do ventrículo esquerdo/tíbia (B) nos ratos controle (barras brancas) e
obesos (barras pretas) após 15 e 30 semanas de tratamento. Os dados são
apresentados em média ± DP, teste de Bonferroni post hoc e ANOVA de 2 fatores. *p
< 0,05 vs. grupo de controle.
Não houve diferença na expressão do colágeno miocárdico tipo I entre os grupos
Ob15 e C15 (Figura 3); no
entanto, a expressão da proteína foi menor no grupo Ob30 comparada com o
grupo C30. O tempo de exposição a obesidade também resultou em uma redução da
expressão do colágeno tipo I no grupo Ob30 em comparação com o grupo
Ob15. A obesidade não alterou a expressão do colágeno tipo III, e o tempo
de exposição à obesidade não influenciou a expressão desse colágeno.
Análise Western blot do colágeno tipo I e III no coração de ratos controle
(barras brancas) e obesos (barras pretas) após 15 e 30 semanas de tratamento.
Blots foram escaneados. Apresentação histográfica das razões colágeno I/β-actina
(A) e colágeno III/β-actina. (B) Dados são apresentados em médias ± DP de seis
animais diferentes por grupo; ANOVA de 2 fatores e teste de Bonferroni post hoc.
*p < 0,05 vs. Grupo controle; # p < 0,05 Ob<sub>15</sub> vs
Ob<sub>30</sub>
Discussão
O principal achado desse estudo foi que o tempo de exposição à obesidade induzida por
uma dieta rica em gordura insaturada afetou a expressão do colágeno tipo I no miocárdio,
mas não teve efeito sobre o colágeno miocárdico tipo III. A obesidade induzida
experimentalmente pela dieta é a que mais se assemelha à obesidade encontrada na
população humana, e tem sido frequentemente utilizada para reproduzir as possíveis
alterações morfológicas, moleculares, bioquímicas e funcionais em diferentes órgãos do
corpo humano9,16,22.
A dieta de alto teor calórico usada nessa experiência continha uma quantidade suficiente
de calorias e sua duração foi suficiente para promover a obesidade em ratos; isso
provavelmente ocorreu devido ao alto teor de gorduras insaturadas da dieta, que contêm
uma densidade energética mais elevada e uma maior capacidade de armazenagem no
corpo.
Esse estudo mostrou que o peso corporal final e o índice de adiposidade de animais
obesos estavam aumentados em comparação com os respectivos controles em todos os
momentos avaliados, e esses dados são consistentes com a literatura22. No entanto, o tempo de exposição à dieta não alterou essas duas
variáveis, que foram semelhantes nos dois períodos de tempo estudados - 15 e 30
semanas.
A carga de glicose nos grupos obesos resultou em intolerância à glicose durante os dois
períodos de tratamento, 15 e 30 semanas. Outro aspecto importante é que o tempo de
exposição à obesidade não influenciou o perfil da glicemia entre os animais obesos, pois
a intolerância à glicose vista nas primeiras 15 semanas manteve-se estável até a 30ª
semana do protocolo experimental. A diminuição da tolerância à glicose, uma fase
intermediária entre a homeostase normal da glicose e diabetes mellitus23 tipo 2 pode estar relacionada com o
desenvolvimento de resistência à insulina nos animais obesos. Em apoio a essa hipótese,
os nossos dados mostram que a obesidade levou à hiperinsulinemia em ambas as avaliações.
Os resultados desse estudo estão de acordo com os autores que observaram que a obesidade
induzida por uma dieta rica em gordura insaturada promove a intolerância à glicose,
hiperinsulinemia e resistência à insulina em um curto período de tempo24-27 e que esses efeitos são prolongados28.
Um aumento das concentrações séricas de leptina após 15 e 30 semanas foi observado em
animais obesos em comparação com os respectivos controles. O tempo de exposição à
obesidade influenciou o nível desse hormônio, com aumentos observados a partir de 15
semanas. As concentrações de leptina estão correlacionadas com a gordura corporal,
influenciando tanto a lipogênese quanto a lipólise29. Nesse estudo, embora o índice de adiposidade permanecesse o mesmo nos
grupos Ob15 e Ob30, as concentrações de leptina foram mais
elevadas no grupo Ob30 comparado com o Ob15. Esse fato
provavelmente ocorreu devido ao surgimento da resistência à ação desse hormônio após a
30ª semana. Outros estudos têm mostrado que longos períodos de obesidade promovem a
resistência à leptina, o que consequentemente conduz ao aumento desse hormônio14,24,30.
Embora o aumento no tecido adiposo tenha levado a alterações metabólicas e hormonais, a
obesidade não resultou em aumento na pressão arterial após 15 e 30 semanas, que se
manteve estável durante os dois períodos de estudo. Os mecanismos responsáveis pela
alteração da pressão arterial incluem a hiperatividade do sistema nervoso simpático31, aumento da atividade do sistema
renina-angiotensina-aldosterona (RAAS)16,32,33 e estresse oxidativo31, que pode resultar em vasoconstrição periférica e aumento da
reabsorção renal de sódio. A ausência de efeito sobre a pressão arterial sugere que a
obesidade não altera os fatores envolvidos no controle da pressão arterial. Esses
resultados estão de acordo com alguns autores que não observaram alterações na pressão
arterial em animais obesos9; mas diferem dos
estudos que mostraram níveis elevados da mesma32-34. No entanto, apesar
de a obesidade não ter alterado a pressão arterial, houve uma ligeira remodelação do
ventrículo esquerdo, provavelmente devido a um aumento dos fatores neuro-hormonais
mencionados acima.
O achado mais importante desse estudo foi que o tempo de exposição à obesidade provocou
uma redução na expressão do colágeno miocárdico tipo I no grupo Ob30
comparado com o grupo Ob15 e, em contraste, não alterou a expressão do
colágeno miocárdio tipo III. Não encontramos estudos que tenham investigado a associação
entre a duração da obesidade e a expressão do colágeno miocárdico tipo I e III. O(s)
mecanismo(s) responsável(eis) pela diminuição da expressão do colágeno tipo I permanecem
obscuros. Uma possível explicação para essa redução pode ser a diminuição da síntese
e/ou um aumento da degradação do colágeno. O tecido adiposo secreta várias substâncias
que estão envolvidas na regulação do colágeno miocárdico, incluindo o hormônio leptina,
que é produzido principalmente nos adipócitos e também é sintetizado por vários tecidos,
incluindo o coração35. Os efeitos da leptina no
coração não foram completamente elucidados, mas acredita-se que influenciam a
hipertrofia de cardiomiócitos e a regulação da produção de vários componentes da matriz
extracelular do miocárdio que agem sobre os fibroblastos cardíacos35. Embora haja controvérsia sobre a associação entre a leptina e o
colágeno miocárdico tipo I tais como o aumento da expressão de procolágeno35-37 e a diminuição da síntese38, há um
consenso entre os autores de que a leptina aumenta a atividade das metaloproteinases
(MMP) 235-38 e a expressão do mRNA do MMP-939,40, participantes da
degradação do colágeno do tipo I. Portanto, é possível que o aumento da atividade tanto
de MMP -2 e MMP-9 seja responsável pela redução do colágeno tipo I no miocárdio. Como
referido acima, o colágeno miocárdico tipo III não se alterou na obesidade. Nenhuma
informação foi encontrada na literatura como uma possível explicação para esse
achado.
É importante mencionar que o nosso achado pode ter relevância clínica, uma vez que
demonstra que a obesidade de longa duração, comum em pacientes, não acompanhada de
hipertensão arterial, pode causar uma diminuição na complacência ventricular devido à
redução do colágeno tipo I. Esse fenômeno pode resultar em uma melhor adaptação do
coração à obesidade, devido ao fato dessa patologia estar associada ao aumento do volume
de sangue.
Como conclusão, o presente estudo mostra que o tempo de exposição à obesidade induzida
por uma dieta rica em gordura insaturada provoca uma redução na expressão do colágeno
miocárdico tipo I após 30 semanas, mas não se verificaram alterações no colágeno
miocárdico tipo III. Estudos futuros são necessários para determinar o mecanismo
responsável pela diminuição do colágeno miocárdico tipo I e a ausência de efeito sobre o
colágeno tipo III.
Fontes de Financiamento
FAPESP - processo nº 07/53267-3 e 08/50172-4.
Contribuição dos autores
Concepção e desenho da pesquisa: da Silva DCT, Padovani CR, Cicogna AC; Obtenção de
dados: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, de Campos DHS; Análise e
interpretação dos dados: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, de Campos DHS,
Nascimento AF, Oliveira Junior SA, Padovani CR, Cicogna AC; Análise estatística: da
Silva DCT, Padovani CR; Obtenção de financiamento: Cicogna AC; Redação do manuscrito: da
Silva DCT; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: da Silva DCT,
Lima-Leopoldo AP, Nascimento AF, Oliveira Junior SA, Cicogna AC.
Somos gratos a José C. Georgette, Mário B. Bruno, Sandra A. Fabio, Elenize J. Pereira,
Sueli A. Clara, Vitor M. Souza, Camila RC Camacho e Corina J. Correa por seu auxílio
técnico. Esse manuscrito foi revisado e editado por nativos da língua inglesa com
experiência biomédica no BioMed Proofreading (Cleveland, Ohio, EUA).
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cells and neovascularization by NOX2-mediated activation of MMP9Cardiovasc Res2012931170180
Potencial Conflito de Interesses
Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
Fontes de Financiamento
O presente estudo foi financiado pela FAPESP.
Vinculação Acadêmica
Não há vinculação deste estudo com dissertações e teses de pós-graduação.
Original ArticlesInfluence of Term of Exposure to High-Fat Diet-Induced
Obesity on Myocardial Collagen Type I and IIISilvaDanielle Cristina Tomaz da1Lima-LeopoldoAna Paula2LeopoldoAndré Soares2CamposDijon Henrique Salomé de1NascimentoAndré Ferreira do1OliveiraSílvio Assis deJunior3PadovaniCarlos Roberto4CicognaAntonio Carlos1 Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP Departamento de Esportes, Centro de Educação Física e Desportos da
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Vitória, ES Escola de Fisioterapia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
(UFMS), Campo Grande, MS Departamento de Bioestatística do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, SP - Brazil Mailing Address: Antonio Carlos Cicogna - Universidade Estadual de São
Paulo (UNESP), Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Botucatu,
Rubião Júnior, S/N. Postal Code 18618-000, Botucatu, SP - Brazil. E-mail:
dany.tomaz@gmail.comBACKGROUND:
Obesity is a risk factor for many medical complications; medical research has
shown that hemodynamic, morphological and functional abnormalities are correlated
with the duration and severity of obesity.
OBJECTIVE:
Present study determined the influence of term of exposure to high-fat
diet-induced obesity on myocardial collagen type I and III.
METHODS:
Thirty-day-old male Wistar rats were randomly distributed into two groups: a
control (C) group fed a standard rat chow and an obese (Ob) group alternately fed
one of four palatable high-fat diets. Each diet was changed daily, and the rats
were maintained on their respective diets for 15 (C15 and
Ob15) and 30 (C30 and Ob30) consecutive weeks.
Obesity was determined by adiposity index.
RESULTS:
The Ob15 group was similar to the C15 group regarding the
expression of myocardial collagen type I; however, expression in the
Ob30 group was less than C30 group. The time of exposure
to obesity was associated with a reduction in collagen type I in Ob30
when compared with Ob15. Obesity did not affect collagen type III
expression.
CONCLUSION:
This study showed that the time of exposure to obesity for 30 weeks induced by
unsaturated high-fat diet caused a reduction in myocardial collagen type I
expression in the obese rats. However, no effect was seen on myocardial collagen
type III expression.
ObesityHigh-fat dietCollagen Type ICollagen Type IIIMyocardiumIntroduction
Obesity is a chronic metabolic disorder characterized by excessive accumulation of
adipose tissue in relation to lean tissue. Currently, it is a global epidemic and a
major public health problem that affects developed as well as developing
countries1,2. Behaviors associated with a modern industrialized society,
including a sedentary lifestyle, inadequate eating habits or a combination of both,
have led to an increasing prevalence of obesity3.
Obesity is also considered a risk factor for many medical complications, among them
cardiovascular diseases4,5. Hemodynamic changes associated with hormonal
ones alter myocardial gene expression, promoting myocardial extracellular matrix
remodeling6. Studies using either rabbits
made obese by a high-fat diet7 or by genetic
engineering, Zucker rats8, have reported an
increase in myocardial collagen types I and III over 12 and 24 weeks, respectively.
In contrast, Carroll et al9, found no change
in the fraction of total collagen in obese rats subjected to a high-fat diet for 12
weeks. Previous studies carried out in our laboratory showed that
Wistar rats made obese by a 15-week high fat diet10 and Wistar-Kyoto rats made
obese by 20-week high fat and carbohydrate diet11 showed increased myocardial total collagen. In these studies, however,
the fractions of collagen types I and III were not evaluated.
Medical research has shown that hemodynamic, morphological and functional
abnormalities are correlated with the duration and severity of obesity12-14. Because of the scarcity of studies that have evaluated the influence
of time of exposure to high fat diet-induced obesity on the fractions of myocardial
collagen types I and III, this current study was designed to test the hypothesis that
the time of exposure to obesity promotes a progressive increase in the amount of type
I and type III myocardial collagen.
MethodsAnimals and Experimental Protocol
After a 7-day period for acclimatization, 30-day-old male Wistar
rats were randomly assigned to one of two groups: control (C) and obese (Ob). The
C group was fed a standard rat chow (RC Focus 1765, Agroceres®, Rio
Claro, SP, Brazil) containing 12.3% of kilocalories from fat, 57.9% from
carbohydrates, and 29.8% from protein, whereas the Ob group were fed one of four
alternating high-fat diets (RC Focus 2413, 2414, 2415, and 2416,
Agroceres®, Rio Claro, SP, Brazil) containing 49.2% of kilocalories
from fat, 28.9% from carbohydrates, and 21.9% from protein. Each diet was changed
daily, and the rats were maintained on their respective diets for 15
(C15 and Ob15; n = 22) and 30 (C30 and
Ob30; n = 25) consecutive weeks. The high-fat diet was calorically
rich compared to the standard diet (3.65 kcal/g vs. 2.95 kcal/g) due to the higher
fat composition. The high-fat diet consisted of saturated and unsaturated fatty
acids, which provided 20% and 80% of the fat-derived calories, respectively.
Rats were housed in individual cages in an environmentally-controlled clean-air
room at 23 (± 3)ºC with a 12-hour light/dark cycle and 60 (± 5)% relative
humidity. All experiments and procedures were performed in accordance with the
Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, published by the National
Research Council (1996) and were approved by the Faculdade de Medicina de Botucatu
Ethics Committee (UNESP, Botucatu, SP, Brazil).
Nutritional, metabolic and endocrine profiles
Nutritional and metabolic profiles included adiposity index, final body weight
(FBW), and glucose tolerance; endocrine profiles included leptin and insulin
concentrations. As obesity is defined as an excessive amount of body fat in
relation to lean mass15, a criterion based
on the adiposity index was used to determine obesity, according to data from
earlier studies9,16.
After fasting for 12 to 15 hours, animals were anesthetized (using intraperitoneal
sodium pentobarbital 50 mg/kg), decapitated, and thoracotomized; the fat pads of
adipose tissue were dissected and weighed. The adiposity index was calculated by
the following formula: adiposity index = (body fat [BF]/FBW) × 10017. Body fat was calculated as the sum the
weight of the individual fat pads as follows: BF = epididymal fat +
retroperitoneal fat + visceral fat.
As obesity can be accompanied by metabolic and endocrine disturbances18, all animals underwent testing for glucose
tolerance, leptinemia and insulinemia. After 15 and 30 weeks of treatment, glucose
tolerance and insulin resistance were evaluated in all animals through the glucose
tolerance test (GTT). After a 4-to 6-hour fast, a blood sample was taken from the
tip of the animal's tail and collected in a heparinized tube. The blood glucose
(as the basal condition) concentration of each animal was immediately determined
using a handheld glucometer (Accuchek Advantage; Roche Diagnostics Co.,
Indianapolis, IN, USA). Subsequently, 2 g/kg of glucose
(Sigma-Aldrich®, St Louis, MO, USA) was given intravenously and blood
glucose concentrations were measured after 15, 30, 60, 90, and 120 minutes19. Glucose intolerance was evaluated using
the area under the curve (AUC) for glucose.
For hormonal analysis, trunk blood was collected in heparinized tubes and
centrifuged at 3000 g for 15 minutes at 4ºC. Serum leptin and insulin
concentrations were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using
commercially available kits (Linco Research Inc., St. Louis, MO, USA).
Cardiovascular profile
As obesity can be associated with cardiovascular comorbidities, the cardiovascular
profile of the animals was also assessed, using systolic blood pressure, cardiac
tissue morphology and left ventricular collagen types I and III protein
expression.
Systolic blood pressure
At the end of the experiment, the systolic blood pressure was assessed using the
non-invasive tail-cuff method with a Narco
BioSystems®Electro-Sphygmomanometer (International Biomedical, Austin,
TX, USA)20. The average of two readings was
recorded for each measurement.
Morphological studies
The heart was removed and dissected at the time of euthanasia. LV weights, as well
as their respective ratios with the tibia were determined as indexes of cardiac
remodeling.
Myocardial collagen types I and III protein expression
Left ventricular tissue was analyzed by Western Blot7 to quantify collagen types I and III protein expression.
Briefly, ventricles isolated from control (C15 and C30; n =
6 each group) and obese (Ob15 and Ob30; n = 6 each group)
rats were frozen with liquid nitrogen and homogenized in a buffer containing 10 mM
Tris (pH 7.4), 100 Mm NaCl, 1 mM EDTA, 1 Mm EGTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol,
0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), and 0.5% deoxycholate. The homogenate was
centrifuged at 4ºC for 20 minutes at 12000 rpm. The supernatant was collected and
total protein content was determined by the Bradford Method (Bradford 1976).
Samples were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in
polyacrylamide gels (6% or 10% depending on protein molecular weight). After
electrophoresis, proteins were electro-transferred to nitrocellulose membrane
(BioRad Biosciences; NJ, USC). Sample weights (50 µg) and transfers were monitored
for equality and efficiency, respectively, with the use of 0.5% Ponceau S staining
of the blot membrane. The blotted membrane was then blocked (using 5% nonfat dry
milk, 10 mmol/L Tris-HCl [pH 7.6], 150 mmol/L NaCl, and 0.1% Tween 20) for 2 hours
at room temperature and incubated with specific antibodies overnight at 4ºC.
Binding of the primary antibody was detected with the use of peroxidase-conjugated
secondary antibodies (anti-rabbit or anti-mouse depending on the protein at a
1:10000 dilution and incubated for 1.5 hours at room temperature), developed by
enhanced chemiluminescence (Amersham Biosciences, NJ, USA) and detected by
autoradiography. Quantification analysis of the blots was performed with use of
Scion Image software (Scion, based on NIH Image). Mouse monoclonal antibodies to
collagen types I and III (1:10000) and mouse monoclonal antibodies to β-actin
(1:1000) were obtained from Abcam (UK, Cambridge) and Santa Cruz Biotechnology
(CA, USA), respectively. Targeted bands were normalized to the expression of
cardiac β-actin.
Statistical analysis
All results were reported as mean ± standard deviation and groups were evaluated
using two-way analysis of variance (ANOVA) for independent samples. When
significant differences were found (p < 0.05), Bonferroni post
hoc test for multiple comparisons was carried out21. The level of significance considered was 5% (α = 0.05).
Results
Figure 1 shows the general characteristics of
animals in groups C15, C30, Ob15 and
Ob30. The high-fat diet caused an increase in FBW and in the index of
adiposity in obese animals compared to respective controls at all times evaluated.
The duration of exposure to obesity did not result in a significant difference in FBW
and adiposity index between the C15 and C30 groups and between
the Ob15 and Ob30 groups. There was no difference in systolic
blood pressure between the C and Ob groups in the two study periods and that did not
change with the time of exposure to obesity. The glucose AUC was higher in Ob groups
compared with controls; the time of exposure did not affect glucose levels. Obesity
promoted an increase in insulin and leptin levels in Ob groups compared to respective
controls. Insulin levels did not change with the time of exposure to obesity; leptin
levels were higher in the Ob30 group compared with the Ob15
groups.
Final body weight (A), adiposity index (B), leptin (C), insulin (D), area
under curve (AUC) of intraperitoneal glucose tolerance test (E), systolic blood
pressure (SBP) (F) in control (white bars) and obese rats (black bars) after 15
and 30 weeks of treatment. Date are mean ± SD; two-way ANOVA and Bonferroni
post hoc test. *p < 0.05 vs control group; # p < 0,05 Ob<sub>15</sub>
vs Ob<sub>30</sub>
As shown in Figure 2, the presence of obesity
increased the weight of the left ventricle and as well as LV/tibia length ratio in
the Ob15 group as compared to the C15 group. However, the
LV/tibia length ratio was similar in the Ob30 and C30 groups,
suggesting that exposure to obesity did not have any effect on this variable.
Left ventricle dimensions. Left ventricle (LV) weight (A), and left
ventricle weight/tíbia ratio (B) in control (white bars) and obese rats (black
bars) after 15 and 30 weeks of treatment. Data are mean ± SD; two-way ANOVA and
Bonferroni post hoc test. *p < 0.05 vs control group.
There was no difference in myocardial type I collagen expression between the groups
Ob15 and C15 (Figure
3); however, protein expression was lower in the Ob30 group
compared with the C30 group. The time of exposure to obesity also resulted
in a reduction of collagen type I expression in the Ob30 group as compared
with the Ob15 group. Obesity did not alter collagen type III expression,
and the time of exposure to obesity did not influence expression of this
collagen.
Westem bolt analysis of collagen I and III in the heart of control (white
bars) and obese rats (black bars) after 15 and 30 weeks of treatment. Blots
were scanned. Histographic presentation of collagen I/β-actin (A) and collagen
III/β-actin ratios. (B). Data are mean ± SD from different animals per group;
two-way ANOVA and Bonferroni post hoc test. *p < 0.05 vc control group; #
p < 0,05 Ob<sub>15</sub> vs Ob<sub>30</sub>.
Discussion
The main finding of this study was that the time of exposure to obesity induced by an
unsaturated high-fat diet affected the expression of myocardial collagen type I, but
had no effect on myocardial collagen type III. Obesity that is experimentally induced
by diet most closely resembles obesity found in the human population and it has been
frequently used to reproduce possible morphological, molecular, biochemical and
functional changes in different organs of the human body9,16,22.
The high-calorie diet used in this experiment contained enough calories and was of
sufficient duration to promote obesity in rats; it was likely due to the high
unsaturated fat content of the diet, which has a higher energy density and greater
storage capacity in the body. This study showed that the final body weight and the
index of adiposity of obese animals were increased as compared to respective controls
at all times evaluated, and these data are consistent with the literature22. However, the time of exposure to the diet did
not alter these two variables, which were similar in the two time periods studied -
15 and 30 weeks.
The glucose load in the obese groups resulted in glucose intolerance during the two
treatment periods, 15 and 30 weeks. Another important aspect is that time of exposure
to obesity did not influence the glycemic profile between obese animals, as glucose
intolerance seen in the first 15 weeks remained stable until the 30th week
of the experimental protocol. Impaired glucose tolerance, an intermediate stage
between normal glucose homeostasis and type 2 diabetes mellitus23, may be related to the development of insulin resistance in
obese animals. In support of this assumption, our data show that obesity led to
hyperinsulinemia at both evaluations. The results of this study are in agreement with
authors who observed that obesity induced by a diet high in unsaturated fat promotes
glucose intolerance, hyperinsulinemia and insulin resistance in a short period of
time24-27 and these effects are prolonged28.
An increase in leptin serum concentrations after 15 and 30 weeks was seen in obese
animals compared with their controls. The time of exposure to obesity influenced the
level of this hormone, with increases seen from 15 weeks onward. Leptin
concentrations are correlated with body fat, thereby influencing both lipogenesis and
lipolysis29. In this study, although the
index of adiposity remained the same in the Ob15 and Ob30
groups, leptin concentrations were higher in the Ob30 compared with the
Ob15. This fact was likely due to the emergence of resistance to the
action of this hormone after the 30th week. Other studies have shown that
long periods of obesity promote leptin resistance, which consequently leads to an
increase in this hormone14,24,30.
Although the increase in adipose tissue led to metabolic and hormonal alterations,
obesity did not result in an increase in blood pressure after 15 and 30 weeks, which
remained stable over the two periods studied. The mechanisms responsible for altering
blood pressure include hyperactivity of the sympathetic nervous system31, increased activity of the
renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS)16,32,33 and oxidative stress31, which can result in peripheral vasoconstriction and increased
renal sodium reabsorption. The lack of effect on blood pressure suggests that obesity
does not alter those factors involved in blood pressure control. These results are in
agreement with some authors who observed no change in blood pressure in obese
animals9; but differ from studies that
showed elevated levels of this parameter32-34. However, although
obesity did not alter blood pressure, there was a slight remodeling of the left
ventricle, probably due to an increase in the neurohormonal factors mentioned
above.
The most important finding of this study was that the time of exposure to obesity
caused a reduction in myocardial collagen type I expression in the Ob30
group compared with the Ob15 group and, in contrast, did not modify the
expression of myocardial collagen type III. We found no studies that investigated the
association between the duration of obesity and expression of myocardial collagen
types I and III. The mechanisms responsible for the decrease in collagen type I
expression remain unclear. A possible explanation for this reduction may be due to
the decrease in synthesis and/or an increase in degradation of collagen. Adipose
tissue secretes several substances that are involved in the regulation of myocardial
collagen, including the hormone leptin, which is produced mainly by adipocytes and is
also synthesized by various tissues including the heart35. The effects of leptin on the heart have not been fully
elucidated, but it has been thought to influence cardiomyocyte hypertrophy and
regulate production of various components of the extracellular matrix of the
myocardium that act on cardiac fibroblasts35.
Although there is controversy about the association between leptin and myocardial
collagen type I, such as increased expression of procollagen35-37 and
decreased synthesis38, there is an agreement
among authors that leptin increases the activity of metalloproteinases (MMP-2) 235-38 and mRNA expression of MMP-939,40, participants in
myocardial collagen type I degradation. Therefore, it is possible that increased
activity of both MMP-2 and MMP-9 is responsible for the reduction in myocardial
collagen type I. As stated above, myocardial collagen type III did not change in
obesity. No information was found in the literature as a possible explanation for
this finding.
Importantly, our finding may have clinical relevance, as it shows that long-term
obesity, common in patients, not accompanied by arterial hypertension, can cause a
decrease in ventricular compliance due to the reduction in collagen type I. This
phenomenon may result in a better adaptation of the heart to obesity because this
pathology is associated with increased blood volume.
In conclusion, this study shows that the time of exposure to obesity induced by an
unsaturated high-fat diet causes a reduction in myocardial collagen type I expression
after 30 weeks, but no changes were seen in myocardial collagen type III. Future
studies are needed to determine the mechanism responsible for the decrease in
myocardial collagen type I and the lack of effect on collagen type III.
Sources of Funding:
FAPESP - process n. 07/53267-3 and 08/50172-4.
Author contributions
Conception and design of the research: da Silva DCT, Padovani CR, Cicogna AC;
Acquisition of data: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, de Campos DHS;
Analysis and interpretation of the data: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS,
de Campos DHS, Nascimento AF, Oliveira Junior SA, Padovani CR, Cicogna AC;
Statistical analysis: da Silva DCT, Padovani CR; Obtaining funding: Cicogna AC;
Writing of the manuscript: da Silva DCT; Critical revision of the manuscript for
intellectual content: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Nascimento AF, Oliveira Junior
SA, Cicogna AC.
We are grateful to José C. Georgette, Mário B. Bruno, Sandra A. Fabio, Elenize J.
Pereira, Sueli A. Clara, Vitor M. Souza, Camila R. C. Camacho and Corina J. Correa
for their technical assistance. This manuscript has been proofread and edited by
native English speakers with a related biomedical background in BioMed Proofreading
(Cleveland, Ohio, USA).
Potential Conflict of Interest
No potential conflict of interest
relevant to this article was reported.
Sources of Funding
This study was funded by FAPESP.
Study Association
This study is not associated with any thesis or dissertation work.